Простые и доступные анализы на вылупление яиц в Caenorhabditis elegans: адаптируемые форматы для скрининга на наркотики

Краткое содержание

В данном исследовании представлена гибкая и стандартизированная платформа анализа для вылупления яиц у Caenorhabditis elegans , интегрирующая несколько экспериментальных форматов. Этот подход повышает воспроизводимость, масштабируемость и доступность, обеспечивая надёжную оценку эффектов лекарств и процессов развития, оставаясь при этом экономически эффективным и легко адаптируемым как для исследовательских, так и для образовательных условий.

Аннотация

Анализы на вылупление яиц (EHA) широко используются для оценки влияния химических соединений на ранние стадии развития нематод, особенно в антигельминтологических исследованиях. Однако существующие методологии существенно различаются по формату, сложности и воспроизводимости и часто представляются как фиксированные протоколы, а не как адаптируемые экспериментальные фреймворки. В данном исследовании мы создаём простую, доступную и гибкую платформу для анализов вылупления яиц у Caenorhabditis elegans , интегрируя и непосредственно сравнивая три экспериментальные конфигурации: (i) контролируемая инкубация в микроцентрифугных пробирках с последующим посевом на агарных пластинах, (ii) прямое воздействие на агарных пластинах с лекарственными средствами, и (iii) жидкостные анализы на основе многоколодцев. Для иллюстрации анализа использовались два представительных соединения: одно подавляет вылупление яиц, другое не оказывающее обнаруживаемого эффекта. Каждая конфигурация обладает уникальными преимуществами в области экспериментального управления, пропускной способности и доступности. Метод на основе микроцентрифугных трубок позволяет точно контролировать воздействие лекарств и поддерживает количественные фармакологические анализы. Анализы на основе агара предлагают упрощённую и недорогую альтернативу, подходящую для непрерывного воздействия и образовательных условий. Многозарядные форматы обеспечивают масштабируемый, стандартизированный скрининг, соответствующий современным процессам обнаружения лекарств. Напрямую сравнивая эти форматы, мы показываем, как методологический выбор влияет на воспроизводимость анализа, динамику воздействия лекарств и биологическую интерпретацию, особенно в отношении специфических факторов, таких как защитная роль скорлупы яиц и вариации развития в экспрессии молекулярных мишеней. В целом, данная работа устанавливает анализы вылупления яиц в C. elegans как универсальную и масштабируемую платформу, адаптируемую к различным применениям, включая антигельминтический скрининг, токсикологическую оценку, исследования развития и учебные лаборатории, тем самым способствуя более широкому и рациональному использованию этой методологии.

Введение

Анализы на вылупление яиц (EHA) давно признаны основой методологии в нематологии для оценки активности яичников и ранних эффектов развития химических соединений. Изначально разработанные для паразитических нематод, эти анализы количественно оценивают ингибирование эмбрионации или появления личинок в контролируемых условиях in vitro, обеспечивая надёжные и биологически значимые конечные показатели, такие как процент вылупления или анализ концентрации-ответ (например, EC₅₀ или IC₅₀)1,2,3,4,5,6,7.

Классические подходы на основе яиц у паразитических нематод, таких как Haemonchus contortus и Trichostrongylus colubriformis, широко применяются для оценки эффективности синтетических препаратов и натуральных продуктов, а также для мониторинга антигельминтической^{устойчивости 1,2,6,8,9,10}. Эти методологии охватывают широкий спектр показателей — от прямой оценки жизнеспособности и вылупления яиц до оценки развития личинок после культивирования фекалий. В совокупности они сыграли центральную роль в связи воздействия лекарств с репродуктивным выходом и потенциалом передачи паразитов. Однако такие подходы часто требуют сложной подготовки образцов из заражённых хозяев, длительных инкубационных периодов и специализированной инфраструктуры, что может ограничивать их доступность, масштабируемость и межлабораторную воспроизводимость.

Использование Caenorhabditis elegans в качестве модельного организма стало мощной стратегией для преодоления ряда ограничений, связанных с паразитическими нематодами. Короткий жизненный цикл, генетическая управляемость, простота культивирования и сохранение ключевых молекулярных мишеней, общих для паразитических видов, делают его особенно подходящим для фармакологических, токсикологических и развивающихся исследований. Важно отметить, что эмбриогенез у C. elegans происходит быстро и высоковоспроизводимо, что позволяет использовать анализы на жизнеспособность и вылупление яиц в качестве количественных и надёжных показателей ранних процессов развития и их нарушений ксенобиотиками 11,12,13,14,15,16,17.

Кроме того, наличие хорошо охарактеризованных мутантных штаммов позволило получить механистическое понимание действия и устойчивости препаратов. Предыдущие исследования показали, что устойчивость к биоактивным соединениям может проявляться в зависимости от стадии, при этом эмбриональная и личиночная стадии демонстрируют разную чувствительность. Например, изменения в глутаматергической сигнализации связаны с устойчивыми фенотипами у личинок, тогда как вылупление яиц осталось^{неизменным} 14,18,19,20. Это подчёркивает специфический характер чувствительности к лекарствам и говорит о том, что эмбриональные стадии могут включать разные мишени или различие в доступности по сравнению с более поздними стадиями развития.

Помимо паразитологии, анализы жизнеспособности яйцеклеток у C. elegans становятся всё более актуальными в токсикологии и раннем открытии лекарств. Эти анализы применялись не только для оценки антигельминтической активности, но и для оценки токсичности развития и эмбриональных дефектов, вызванных лекарственными средствами, с результатами, которые могут коррелировать с более высокими профилями токсичности^{организмов (15,16}). В то же время наличие скорлупы яичницы создаёт важные биологические ограничения, поскольку она действует как защитный и селективный барьер проницаемости, окружающий^{эмбрион 21,22}. В результате некоторые биоактивные молекулы могут не достичь эмбриона, несмотря на то, что на более поздних стадиях развития^{проявляют активность} 14,19,23,24. Доступ к эмбриону, вероятно, зависит от физико-химических свойств каждого соединения, включая размер молекулы и полярность. Это может способствовать различиям между активностью, наблюдаемой в анализах вылупления яиц, и активностью на поздних стадиях развития. Это различие подчёркивает важность чёткого определения как экспериментального контекста, так и биологической конечной точки измерения.

Методологически анализы на вылупление яиц у Caenorhabditis elegans реализованы с использованием широкого спектра экспериментальных форматов, включая жидкую инкубацию синхронизированных яиц, прямое воздействие агарных пластин с лекарственными средствами и многосволочные анализы, адаптированные для средне- и высокопроизводительного^{скрининга} 11,13,14,16,19,23,24.

Жидкие и микропластинчатые форматы широко применяются в фармакологических скрининговых исследованиях, поскольку они обеспечивают гомогенные условия воздействия, способствуют точному контролю концентраций лекарств и позволяют количественно анализировать отношения концентрации и ответ. Параллельно были широко разработаны аналогичные многоколодочные стратегии для паразитических нематод — от обычных 96-луночных пластинчатых тестов до сверхвысокопроизводительных платформ с использованием форматов 384 ямы ^4,5. Вместе эти подходы подчёркивают универсальность и масштабируемость тестов вылупления яиц у разных видов нематод, а также их адаптивность к разнообразным экспериментальным условиям — от мелкомасштабных механистических исследований до крупномасштабного скрининга соединений.

Каждый формат имеет свои преимущества и ограничения в плане экспериментального управления, воспроизводимости, пропускной способности и доступности. Анализы на жидкой основе обеспечивают однородные условия воздействия и хорошо подходят для количественного фармакологического анализа, тогда как анализы на основе агара позволяют непрерывное воздействие на протяжении всего развития, но при этом добавляют вариативность, связанную с диффузией препарата и биодоступностью. Форматы Multiwell, в свою очередь, обеспечивают параллелизацию и снижают потребление реагентов, что соответствует современным стратегиям скрининга.

Несмотря на широкое распространение, анализы на вылупление яиц часто представляются как фиксированные протоколы, а не как гибкая методологическая основа. Прямые сравнения форматов редки, а рекомендации по выбору наиболее подходящей конфигурации для конкретных приложений — от механистических исследований до высокопроизводительных скринингов или учебных сред — остаются ограниченными.

В этом исследовании мы предлагаем простую, доступную и адаптируемую платформу для анализов вылупления яиц у C. elegans, интегрируя и сравнивая три экспериментальные конфигурации: (i) контролируемая инкубация в микроцентрифугных трубках с последующим посевом на агарных пластинах, (ii) прямое воздействие на агарных пластинах с лекарственными средствами, и (iii) многоскважинные жидкостные анализы.

Систематически оценивая эти конфигурации, мы стремимся создать практическую структуру, которая выделяет компромиссы между экспериментальным управлением, простотой и масштабируемостью. Эта интегрированная перспектива объединяет классические паразитологические методологии с современными методами скрининга на основе моделей, позиционируя анализы на вылупление яиц не как единый стандартизированный метод, а как универсальную платформу, адаптируемую к различным исследовательским контекстам, включая открытие антигельминтических препаратов, токсикологическую оценку, биологию развития и образовательные приложения.

Протокол

1. Сорта и культура Caenorhabditis elegans

1. Используйте штамм дикого типа N2 (Бристоль) и/или трансгенный штамм PD4251 (ccIs4251; dpy-20(e1282)) для разработки и валидации^{методологии 25,26}. PD4251 экспрессирует GFP, облегчая визуализацию и возможные применения визуализации при необходимости, при этом демонстрируя реакции вылупления яиц и развития, неотличимые от наблюдаемых у дикого штамма N2 в экспериментальных условиях, использованных в^{данном исследовании 27}.
2. Получите штаммы (например, штамм дикого типа N2) в Генетическом центре Caenorhabditis (CGC), поддерживаемом Управлением исследовательских инфраструктурных программ Национального института здравоохранения (P40 OD010440).
3. Содержать червей в стандартных лабораторных условиях при 18–25 °C на свежеприготовленных агарных тарелках Nematode Growth Medium (NGM), засеянных Escherichia coli OP50 в качестве пищи. Приготовьте NGM, растворив 16 г агара, 3 г NaCl и 2,5 г бактопептона в 975 мл дистиллированной или ультрачистой воде. Стерилизуйте с помощью автоклавирования. После охлаждения среды до 55 °C добавьте стерильные растворы буфера с фосфатом калия (25 мл, 1 мл, pH 6,0), CaCl₂ (1 мл, 1 м), MgSO₄ (1 мл, 1 м) и холестерина (1 мл, 5 мг/мл в абсолютном этаноле). Тщательно перемешайте и вылейте тарелки в стерильных условиях.
4. Выполнять рутинное обращение, размножение и обслуживание согласно установленным процедурам, описанным в WormBook и связанных^{исследованиях} 24,26,28,29. Поддерживайте червей в условиях без голодания, обеспечивая постоянную доступность бактериального пищи и избегая переполненных тарелок. Держите культуры в рекомендуемом температурном диапазоне (18–25 °C) и избегайте чрезмерно сухих условий, так как они могут ускорить обезвоживание агаров.
5. Общие вопросы перед началом анализа
   1. Заранее определите все экспериментальные параметры, включая температуру (18–25 °C), время инкубации (4–8 ч), влажность (50–70%) и процедуры обработки.
   2. Подготовьте все материалы перед началом анализа, чтобы обеспечить правильное согласование времени и координацию рабочего процесса.
   3. Поддерживайте стабильные экспериментальные условия для всех репликатов, чтобы минимизировать вариабельность.

2. Подготовка тестовых соединений и контролей

1. В день эксперимента приготовьте все соединения свеже. Растворить запасы в буфере M9 (22 мМ KH₂PO₄, 42 мМ Na₂HPO₄, 86 мМ NaCl, 1 мМ MgSO₄) или стерильной дистиллированной воде, в зависимости от совместимости соединения и условий анализа^30,31.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор водной среды может влиять на активность соединений в анализах C. elegans . Например, такие соединения, как серотонин, могут иметь разные эффективные концентрации при приготовлении в стерильной дистиллированной воде по сравнению с буфером M9. Поэтому совместимость транспортных средств и биологический ответ следует эмпирически оценивать при оптимизации анализов. Кроме того, для соединений с низкой водорастворимостью могут использоваться соответствующие средства, такие как диметилсульфоксид (DMSO) или этанол. Конечные концентрации растворителя должны оставаться низкими (обычно ниже 0,2% v/v), чтобы избежать токсичности. Предыдущие исследования на C. elegans показали, что концентрации DMSO до 0,5% вызывают минимальные эффекты при стандартных^{лабораторных условиях 17}.
2. Подготовьте как минимум пять концентраций на соединение для построения кривых концентрации–отклика и оценки значений IC₅₀ или IC₉₀ . Используйте последовательное разбавление с 2–3-кратным шагом концентрации в качестве отправной точки и корректируйте конечный диапазон концентраций в зависимости от ожидаемой мощности, растворимости и экспериментального ответа каждого соединения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если тестовые соединения чувствительны к свету, все этапы подготовки следует выполнять при тусклом освещении, чтобы предотвратить разрушение. Это включает приготовление запасных растворов, разбавлений и агаровых пластин с лекарственными средствами. По возможности пластины следует накрывать алюминиевой фольгой и хранить в темноте. Аналогично, многоколодцевые пластины следует держать закрытыми (например, фольгой или непрозрачными крышками) во время инкубации. Рекомендуется использовать закрытые контейнеры или влажные камеры, ограничивающие воздействие света, чтобы сохранить стабильность соединения на протяжении всего эксперимента.
3. Включайте в каждый эксперимент следующие методы контроля: контроль только в буфере (M9 или вода) и контроль транспортных средств (например, DMSO или этанол в той же концентрации, используемой в обработке).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор растворителя имеет решающее значение. ДМСО и этанол широко применяются, поскольку они растворяют гидрофобные соединения, оставаясь при этом биосовместимыми при низких концентрациях. Альтернативные методы, такие как Tween 20 или циклодекстрины, могут рассматриваться для улучшения растворимости. Препаратные растворы следует применять сразу после подготовки, так как стабильность со временем может варьироваться и влиять на воспроизводимость.

3. Получение синхронизированных яиц C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляция яиц C. elegans была подробно описана в предыдущих^{исследованиях 29,32}. Здесь обобщены основные этапы с небольшими изменениями для оптимизации извлечения чистых, свободных от мусора яиц, подходящих для анализов вылупления.

1. Коллекция гравидных червей
   1. Начните с 3–5 NGM-пластин, содержащих слияющиеся культуры тяжёлых^{взрослых особей 25,26}. Предпочитают пластины с большим количеством гравидных червей и видимыми яйцами, что указывает на активное размножение, избегая переполненных или голодающих культур. Точные подсчета червей обычно не определяются на этом этапе, так как протоколы изоляции яиц у C. elegans обычно опираются на совместные репродуктивные культуры, а не на точные подсчёты животных. Для общего сравнения: каждая пластина диаметром 60 мм должна содержать несколько сотен взрослых животных.
   2. Добавьте дистиллированную воду на каждую тарелку и аккуратно промывайте червей в конической трубке объёмом 15 мл. Избегайте соскребания поверхности агара, чтобы минимизировать мусор.
   3. Центрифуга при 266 × г до 3 минут (18–25 °C) для гранулирования червей. Удалите супернатант, содержащий бактерии.
   4. Снимите супернатант и повторите этап мытья три раза. Каждый раз аккуратно суспендируйте гранулу, чтобы улучшить удаление остаточных бактерий.
2. Изоляция яйцеклетки с помощью отбеливания
   1. Суспензировать червячную гранулу в свежеприготовленном отбеливающем растворе (1,2% NaOCl и 0,5 M NaOH; конечный объём 5 мл). Приготовьте раствор непосредственно перед использованием, чтобы обеспечить активность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно отбеленные образцы определялись как препараты, в которых взрослые туши были разрушены/переварены, в то время как целые яйца оставались морфологически нормальными и жизнеспособными. Чрезмерно отбеленные образцы идентифицировались по повреждённым или лизированным яйцам, аномальной морфологии яйца, снижению частоты вылупления или отсутствию жизнеспособных личинок после^{инкубации 25}.
   2. Энергично перемешивайте трубку, способствуя растворению взрослых тел и выпуску яйцеклеток. Постоянно смешивайте во время инкубации, чтобы обеспечить равномерную экспозицию.
   3. Внимательно следите за реакцией и не превышайте 5 минут. Проверьте визуально: взрослые тела должны быть в основном растворены, а яйца остаться целыми.
   4. Внимательно следите за реакцией и остановите её через 5 минут, добавляя холодную стерильную дистиллированную воду (желательно 10 °C) до конечного объёма 14 мл. Не позволяйте инкубации превышать это время, чтобы предотвратить повреждение яйца.
   5. Закройте трубку и аккуратно переверните несколько раз, чтобы быстро разбавить раствор отбеливателя. Выполните этот шаг без задержек, чтобы сохранить жизнеспособность яйцеклетки.
   6. Центрифугуйте при 266 × г в течение 3 минут (18–25 °C) и аккуратно сбросьте супернатант.
   7. Помойте яичную гранулу три раза стерильной дистиллированной водой, чтобы полностью удалить остатки отбеливателя. Обеспечивайте тщательную подвеску между промывками. Заново суспензировать яйца в 5 мл буфера M9 или стерильной воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отбеливание гравидных гермафродитов даёт стерильную яйцеклеточную готовность, подходящую для синхронных анализов. При отсутствии пищи вылупившиеся личинки проходят остановку развития L1 и возобновляют развитие синхронно после кормления.
3. Этап очистки (флотация сахарозы)
   1. Выполните этот шаг, если после отбеливания видны остатки червяков.
   2. Приготовьте раствор сахарозы с 30%, разбавляя 60% стерильный раствор сахарозы (например, смешайте равные объемы: 5 мл 60% сахарозы с 5 мл дистиллированной воды).
   3. Добавьте раствор сахарозы в гранулу и аккуратно перемешайте инверсией. Избегайте вихря.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку этот этап очистки короткий и за ним следуют немедленные процедуры промывания для удаления остаточной сахарозы, никаких заметных эффектов на жизнеспособность яйцеклеток в условиях, использованных в данном исследовании, не наблюдалось. В отличие от этого, удаление остатков червя значительно улучшает визуализацию яйцеклеток, точность подсчёта и равномерность воздействия препарата на образцы.
   4. Центрифуга при 266 × г в течение 5 минут (18–25 °C).
   5. Определите яичную кладку как тонкое белое кольцо сверху раствора. Немедленно соберите 4 мл супернатанта, содержащего яйца, аккуратно двигая кончик пипетки по кольцу.
   6. Выполняйте этот шаг быстро, так как яйца начинают опускаться вскоре после центрифугирования под действием гравитации.
   7. Переведите собранный супернатант в чистую трубку с стерильной дистиллированной водой. Промойте яйца дважды холодной стерильной водой, чтобы удалить остатки сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необязательный, но настоятельно рекомендуется. Удаление мусора улучшает визуализацию и точность подсчёта яиц, а также обеспечивает более равномерное воздействие тестовых соединений, предотвращая задержку яиц в остаточном материале червя.
4. Приготовление раствора яичного бульона
   1. Аккуратно перемешайте суспензию яйца перед пробой, так как яйца быстро осадываются.
   2. Поместите три капли по 20 мкл на стекло и посчитайте яйца под стереомикроскопом.
   3. Вычислите среднее значение и отрегулируйте концентрацию до 50–100 яиц на 100 мкл с помощью буфера M9. Перемешайте снова перед аликотами, чтобы сохранить равномерное распределение.
   4. Aliquot — необходимый объём суспензии яйца для каждого экспериментального состояния согласно выбранному протоколу.

4. Форматы анализов по вылуплению яиц

1. Кратковременное воздействие яйцеклеток в микроцентрифугных трубках (формат с высоким контролем)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта экспериментальная конфигурация основана на ранее описанных^{процедурах 25} с адаптациями для улучшения контроля условий воздействия и воспроизводимости.
   1. Подготовка агарных тарелок для анализов на вылупление яиц
      1. Готовьте тарелки для агар без лекарств, используя только агар и дистиллированную воду (1,7 г агар в воде 100 мл). Не добавляйте питательные вещества или бактерии, так как цель — оценить вылупление яиц без вмешательства пищевых источников. Наливайте примерно 3 мл агара на чашу Петри 35 мм, чтобы поддерживать единую глубину агара во всех экспериментах.
      2. Подготовьте тарелки за 12–24 часа до использования. Избегайте превышения этого временного окна, так как чрезмерное сушение снижает жизнеспособность яиц и влияет на движение личинок.
      3. После затвердевания разделите каждую пластину на четыре квадранта для облегчения подсчёта.
      4. Храните тарелки при 8–10 °C в герметичных условиях, чтобы предотвратить обезвоживание. Дайте пластинам уравновеситься до комнатной температуры перед использованием.
   2. Переложите 500 мкл суспензии яйца в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл для каждого состояния. Аккуратно перемешивайте между этапами пипетирования, чтобы предотвратить осаждение яиц, так как яйца быстро оседают под действием гравитации. Поддержание однородной суспензии крайне важно для обеспечения сопоставимого количества яиц в разных условиях.
   3. Добавьте 500 мкл раствора или соответствующего контроля к суспензии на 500 мкл яйца. Инкубировать при 22 °C в течение 4–8 часов. Заранее определите время инкубации и поддерживайте его постоянным между экспериментами (например, 6 ч), так как вариации этого времени напрямую влияют на воздействие препарата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте растворы обработки в 2 раза выше желаемой конечной концентрации, чтобы разбавление после смешивания с яйцовой суспензией дало запланированную конечную рабочую концентрацию.
   4. Поддерживайте непрерывное мягкое перемешивание во время инкубации с помощью трубчатого вращательного механизма (например, вертикального вращения 5–20 об/мин) или качающейся платформы. Убедитесь, что трубки находятся в постоянном движении, чтобы предотвратить осаждение яиц и обеспечить равномерное воздействие. Этот этап критически важен, поскольку статические условия приводят к накоплению яйцеклеток и гетерогенному воздействию лекарств.
   5. Центрифугуйте трубки при 3 420 × г в течение 3 минут (18–25 °C) после инкубации. Определите гранулу, которая выглядит как небольшое белое отложение на стенке трубы. Ориентируйте трубки последовательно (например, отмечайте одну сторону) перед центрифугированием, чтобы облегчить быструю локализацию гранул и предотвратить случайную потерю при удалении супернатата.
   6. Аккуратно удалите супернатант, не трогая гранулу. Промой яйца три раза буфером M9, чтобы устранить остатки соединений. Подвесьте окончательную гранулу в 240 мкл буфера M9.
   7. Нанесите подвеску на агарные пластины, выдавая 20 мкл на квадрант. Используйте три пластины на каждое условие. Дайте каплям полностью высохнуть перед перемещением или переворачиванием тарелок, чтобы предотвратить смещение яиц по поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с большего общего объёма суспензии яиц, чем строго требуется, чтобы компенсировать потерю яйца во время промывания и обеспечить достаточный размер финальной пробы для подачи и подсчёта. Чтобы упростить процедуру и сократить использование агарных пластин, особенно в учебных условиях, перемещайте восстановленные яйца непосредственно в многоколодовую пластину, а не на агарные тарелки. Отрегулируйте конечный объём до 200 мкл на скважину и заполните неиспользуемые скважины стерильной водой, чтобы минимизировать испарение.
2. Прямое воздействие яйцеклеток на агарных пластинах с лекарствами
   1. Приготовьте агарный раствор, содержащий только агар и стерильную дистиллированную воду (1,7 г агар на 100 мл). Нагревайте до полного растворения и храните раствор в жидком виде. Дайте агару остыть до 50–55 °C перед добавлением любого соединения и контролируйте температуру с помощью лабораторного термометра. Этот шаг критически важен для сохранения стабильности соединения и обеспечения единородного включения, как описано^{выше 28}. Подготовьте не менее пяти концентраций на соединение для анализа концентрации и оценки IC₅₀ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте бактериальные продукты. При отсутствии пищи вылупившиеся личинки вступают в синхронную остановку развития L1, препятствуя переходу к более поздним личиночным стадиям в течение периода анализа^26,33.
   2. Добавьте соответствующее количество раствора лекарства или управления транспортным средством в охлаждённый агар. Аккуратно перемешивайте, медленно инверсируйте, чтобы обеспечить однородное распределение. Избегайте вихрей или интенсивного встряхивания, чтобы предотвратить образование пузырей.
   3. Сразу же налейте примерно 3 мл агара в чашки Петри толщиной 35 мм. Работайте постепенно, чтобы поддерживать стабильную температуру и толщину пластины. Подготовьте не менее 3–5 тарелок на каждое условие.
   4. Хранение и обращение с пластинами следующим образом: Дать пластинам затвердеть при комнатной температуре на ровной поверхности. Храните пластины вверх, чтобы конденсация не попадала на поверхность агара.
   5. Подготовьте эксперимент: посейте 50–100 яиц прямо на тарелки агара. Поддерживайте постоянные экспериментальные параметры, включая температуру, время инкубации, влажность и время подготовки пластины. Используйте как минимум пять концентраций для анализа концентрации и ответа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте тарелки за 12–24 часа до использования. Избегайте пересушения, так как это может повлиять на жизнеспособность яиц и движение личинок. Обмотайте пластины, чтобы уменьшить обезвоживание и защитить от света при работе с светочувствительными веществами. Храните тарелки в чистой, желательно увлажнённой среде (например, в герметичном контейнере с влажной бумагой), чтобы минимизировать изменчивость.
3. Анализ для вылупления яиц в многоколодных пластинах (средний и высокопроизводительный формат)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот формат широко используется как в исследованиях C. elegans, так и паразитических нематод для средне- и высокопроизводительного скрининга, что позволяет параллельно оценивать несколько соединений и концентраций в стандартизированных условиях.
   1. Подготовка пластин скважины и экспериментальное проектирование: используйте пластины с 96 лунками (или альтернативный формат в зависимости от потребностей в пропускной способности). Заранее подготовьте компоновку пластин и определите концентрации препаратов (расположенные по столбцам), репликаты (по строкам) и контрольные элементы, включая буферные (M9 или вода) и транспортные контроли (например, DMSO или этанол при той же конечной концентрации, используемой в обработках).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте прозрачные плоскодонные многокамерные пластины для прямой визуализации и подсчёта в каждой яме под прозрачным светодиодом с помощью стереомикроскопа. Яйца и вылупившиеся личинки L1 количественно измеряются непосредственно в скважинах без этапов передачи, что минимизирует потерю образца и артефакты обработки.
   2. Заранее заправьте каждую скважину соответствующим объёмом раствора или контроля. Используйте одинаковые объёмы во всех скважинах.
   3. Добавление суспензии для яиц
      1. Приготовьте хорошо гомогенизированную суспензию яйца с определённой концентрацией (см. раздел 2).
      2. Добавьте равный объём суспензии яйца в каждую яму, содержащую раствор препарата. Используйте итоговый объём 200 мкл на каждую скважину.
      3. Отрегулируйте плотность яиц как минимум до 30 яиц в каждой колодце (желательно 30–100). Не превышайте 100 яиц на колодцу, так как перенаселенность значительно усложняет ручное количественное измерение. Отдельные яйца становятся трудноразличимыми, а подвижные личинки L1 активно плавают по колодцу, снижая точность подсчёта и увеличивая разнообразие экспериментов.
      4. Аккуратно перемешайте суспензию яйца перед отпуском, чтобы обеспечить равномерное распределение.
   4. Аккуратно загружайте тарелку. Избегайте появления воздушных пузырьков. Регулярно меняйте кончики между условиями, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение. Аккуратно постучите по пластине, чтобы всё содержимое осело на дне колодцев.
   5. Условия инкубации: Инкубировать пластину при 20–22 °C в контролируемых и влажных условиях в общей сложности 24 часа после изоляции яиц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать вариабельность, избегая использования внешних скважин или заполняя их буфером для уменьшения испарения. Инкубировать пластины в увлажнённой камере (например, герметичной ёмкости с влажной бумагой) и защищать от света при работе с чувствительными к свету веществами. Избегайте ненужных движений во время инкубации. Поддерживайте согласованное время подготовки яйцеклеток и воздействия препарата во всех репликах, поскольку вариации могут влиять на стадию развития и интерпретацию данных.

5. Оценка и подсчёт

1. Оценить вылупление яиц через 24 часа после изоляции, убедившись, что условия контроля достигли полного вылупления при заданной температуре. Рассчитайте эту точку времени с момента сбора яйцеклеток, чтобы обеспечить достаточное развитие эмбриона. Считайте, что все яйца, которые остаются невылупившими на данном этапе, подвержены лечению.
2. Изучайте образцы под стереомикроскопом. Для каждого состояния (агарные пластины или многоколодцы) количественно определите количество невылупившихся яиц и количество вылупившихся личинок L1.
3. Просканируйте всю зону наблюдения, включая края плит и границы скважин, так как подвижные личинки L1 могут распределяться неравномерно и накапливаться в этих областях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите прямой подсчёт под стереомикроскопом для быстрой оценки без дополнительного оборудования. Поддерживайте единообразную плотность яиц в разных условиях, используйте не менее 3–5 технических повторений на каждое условие и проведите минимум три независимых эксперимента с использованием разных яиц для обеспечения надёжных сравнений.

6. Получение и документация изображений

1. Получайте изображения с помощью стереомикроскопа с цифровой камерой. Для агарных пластин фиксируйте каждый квадрант; Для многокамерных пластин фиксируйте каждую отдельную яму. Убедитесь, что все участки пойманы, включая края пластин и границы колодцев, где могут накапливаться личинки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные окуляры и объективы с размером 10x, которые варьируются от 0,6x до 5x (общее увеличение от 6x до 50x), широко используются и позволяют чётко визуализировать как яйца, так и личинки L1 в зоне подсчёта. Используйте передаваемое светодиодное освещение. Поддерживайте постоянные настройки захвата камеры (яркость, экспозиция и контраст) во всех экспериментальных условиях для обеспечения стабильного качества изображения и надёжного сравнения образцов.
2. Используйте соответствующее программное обеспечение для получения изображений. Обрабатывайте и анализируйте изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Поддерживать одинаковые параметры анализа во всех экспериментальных условиях, включая яркость, контраст, увеличение, одинаковую область/поле сбора и критерии подсчёта.
3. Количественно определите количество невылупившихся яиц и личинок L1 по полученным изображениям. Личинки вылупились только после полного выхода из яичной скорлупы. Яйца, содержащие частично вылупившиеся личинки, следует классифицировать как невылупившиеся. Применяйте одинаковые критерии классификации во всех экспериментальных условиях.
4. Инкубировать пластины или многоколодные пластины дополнительно 12–24 часа при 16–18 °C, чтобы оценить, обратимо ли наблюдаемое торможение вылупления яиц. При определённых экспериментальных условиях яйца, оставшиеся невылупленными на этом этапе, считаются затронутыми обработкой.

7. Анализ данных

1. Вычислим ингибирование вылупления яиц как:
   Доля невылупившихся яиц = (Количество невылупившихся) / (общее количество яиц + личинки)
2. Проведите как минимум 3–5 независимых экспериментов с разными партиями яиц. Выражайте данные как среднее ± стандартное отклонение (среднее ± SD).
3. Генерируйте кривые концентрации и отклик с помощью нелинейной регрессии и определяйте значения IC₅₀ .
4. Проведите статистические сравнения условий с помощью t-теста Стьюдента и определите статистическую значимость в p < 0,05.
5. Анализируйте данные с помощью соответствующего статистического программного обеспечения.

8. Применение анализов для вылупления яиц с использованием трансциннамальдегида и линалилацетата

ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование не сосредоточено на конкретном соединении, а использует представительные агенты для иллюстрации того, как каждый экспериментальный формат может быть реализован, контролирован и интерпретирован в сопоставимых условиях. Транс-циннамальдегид (TCA) был выбран в качестве иллюстративного соединения, поскольку он ранее был охарактеризован и стабильно обеспечивает устойчивое, воспроизводимое ингибирование вылупления яиц в трёх представленных здесь конфигурациях анализа. Важно, что целью включения TCA было продемонстрировать внедрение протокола и репрезентативное поведение концентрации и ответа, а не установление относительной мощности или сравнительной эффективности между форматами.

1. Экспериментальная установка и подготовка соединения
   1. Подготовьте тарелки для агаров (3 мл на блюдо 35 мм) за 12–24 часа вперёд, используя среду только из агара (1,7% в дистиллированной воде). Маркируйте пластины, разделите их на четыре квадранта для облегчения подсчёта, храните в герметичных условиях для предотвращения обезвоживания и уравновесьте до комнатной температуры перед использованием.
   2. Приготовьте свежие растворы набора трансциннамальдегида (TCA) в DMSO и разведите их в стерильной воде или агаре, чтобы получить восемь конечных концентраций (0,05–0,7 мМ). Поддерживайте конечную концентрацию DMSO ниже 0,2% во всех условиях. Включите воду, агар и/или DMSO в качестве негатива и управления транспортом соответственно.
   3. Проверьте линалилацетат при 5 мМ как отрицательный контроль соединения, чтобы оценить способность анализа различать активные и неактивные соединения при идентичных экспериментальных условиях.
   4. Подготовьте синхронизированные суспензии яиц, как описано выше, и отрегулируйте плотность до 50–100 яиц на 100 мкл. Используйте равные объёмы и сопоставимое количество яиц во всех форматах для обеспечения согласованности условий.
2. Применение экспериментальных форматов с использованием эталонного соединения
   1. Кратковременное воздействие в микроцентрифугных трубках (формат с высоким контролем)
      1. Смешайте 500 мкл суспензии из яиц с 500 мкл раствора, содержащим 0,05–0,7 мМ TCA. Инкубировать трубки в течение 6 часов при 18–20 °C и поддерживать время инкубации стабильно во всех экспериментах.
      2. Во время инкубации поддерживайте трубки под непрерывным мягким перемешиванием с помощью вращательного механизма.
      3. Центрифугуйте трубки при 3 420 × г в течение 3 минут (18–25 °C) после экспозиции и аккуратно удалите супернатант. Промыйте яйца три раза дистиллированной водой, чтобы удалить остатки соединений и ограничить воздействие в течение определённого инкубационного периода.
      4. Повторно подвесьте финальную гранулу в дистиллированной воде объёмом 240 мкл и зафиксируйте подвеску на агарные пластины с объёмом 20 мкл на квадрант, используя три пластины в каждом состоянии. Инсижируйте пластины при 16–18 °C в течение 24 часов после изоляции яиц.
   2. Прямое воздействие на агаровые пластины, содержащие лекарства
      1. Подготовьте агарные пластины с лекарственным средством, добавив растворы TCA в агар, охлаждённый до 50–55 °C, и аккуратно перемешав для обеспечения однородного распределения. Налейте примерно 3 мл агар на одну тарелку и готовьте тарелки за 12–24 часа до использования.
      2. Семена яйца напрямую на поверхность пластин с плотностью, сопоставимой с используемыми в других форматах (50–100 яиц на 100 мкл). Не выполняйте этапы мытья в такой конфигурации.
      3. Инсибируйте пластины при 16–18 °C до 24 часов после изоляции яиц.
   3. Многожелудочный пластинчатый анализ (средне- и высокопроизводительный формат)
      1. Предварительно загрузить пластины на 96 лунок с помощью лекарственных растворов и контроля. Добавьте суспензии из яиц, чтобы получить итоговый объём 200 мкл на скважину и плотность от 50 до 100 яиц на колодцу.
      2. Обеспечьте однородное распределение во время загрузки, избегая пузырьков и поддерживая стабильные объёмы по скважинам. Инкубировать пластины при 20–22 °C во влажных условиях в течение 24 часов после выделения яиц.
3. Получение и количественная оценка изображений
   1. Оценивайте вылупление яиц через 24 часа после изоляции, после завершения вылупления в контролируемых условиях. Считайте количество невылупившихся яиц и личинок L1 под стереомикроскопом для каждого состояния. Внимательно изучайте края плит и границы колодцев, так как личинки могут накапливаться в этих областях.
   2. Снимайте изображения с помощью стереомикроскопа с цифровой камерой для целей документации. Записывайте каждый квадрант для агарных пластин и систематически снимайте каждую скважину для многоколодных пластин. Используйте программное обеспечение для анализа изображений, когда это необходимо, для поддержки количественной оценки.
   3. Инкубировать пластины в течение дополнительных 12–24 часов после получения изображения, чтобы оценить, обратимо ли наблюдаемое торможение штриховки.
   4. Проведите все эксперименты с использованием как минимум трёх независимых биологических репликатов.

Результаты

TCA обеспечила явное концентрационно-зависимое ингибирование вылупления яиц во всех экспериментальных форматах, как показано на рисунке 1. Представлены репрезентативные кривые концентрации и отклика для каждой конфигурации анализа: микроцентрифугальные трубки (рисунок 1A), прямое воздействие на агарных пластинах (рисунок 1B) и многозарядные пластины (рисунок 1C).

Обсуждение

В данном исследовании представлена простая и адаптивная платформа для анализов вылупления яиц у Caenorhabditis elegans, структурированная вокруг трёх взаимодополняющих экспериментальных форматов, различающихся по контролю, динамике экспозиции и масштабируемости. Вместо определения единого оптимального протокола наши результаты подтверждают точку зрения, что анализы на вылупление яиц должны рассматриваться как гибкая методологическая основа, адаптируемая к конкретным эксперимента...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бактериологический агар	Britania	B0101406	должен быть приготовлен свежим (1,7 гр в 100 мЛ H2O)
Раствор белильной извести	N/A	N/A	1,2 % (об./об.) NaOH и 0,5 M NaOH
Центрифуга	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
Центрифуга	BiofugePICO to eppendorf tube	Heraeus 75003235
Цифровая камера	ToupCam	TP605100A	Промышленная цифровая камера. Регулируемая фокусная длина USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	ММ: 78,13
Линалил ацетат	SIGMA	No.CAS: 115-95-7	должен быть приготовлен свежим
Питательная среда Лизогенно-гнойная бульон (LB)	N/A	N/A	10 г Бакто-триптона, 5 г экстракта дрожжей, 10 г NaCl на 1 Л дистиллированной воды
Буфер M9	N/A	N/A	3 г KH2PO4, 6 г Na2HPO4, 5 г  NaCl, 0,25 г MgSO4 на 1 Л дистиллированной воды
Мини ротатор	BioSan	Bio RS-24
Питательная среда для нематод (NGM)	N/A	N/A	3 г NaCl, 17 г агар, 2,5 г  Бакто-пептон на 1 Л дистиллированной воды. Стерилизуют путем автоклавирования. Дополняется 1 мЛ холестерина (5 мг/мЛ),  1 мЛ CaCl2 (1 М), 25 мЛ буфера калия фосфата (1 М, pH 6,0) и 1 мЛ  MgSO4 (1 М)
Чаша Петри (3 - 5 мм)	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
Чаша Петри (90 мм x 15 мм)	ExtraGene	1026160305	Только для лабораторного использования, Полистирол.
Пипетка	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	Версия 12.0
Стереомикроскоп	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	Тринокулярный стереомикроскоп (общее увеличение 10x–40x; светодиодное падающее и проходящее освещение)
Сахароза	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60 % (об./об.) сахарозы
Пластина для культур тканей 96 лунок	Biofil	TCP 012096	Полистирол, Крышка с низким уровнем испарения.
ToupView	ToupTek Photonics	N/A
Транс-циннальдегид (TCA)	Santa Cruz Biotechnology	J1712	Должен быть приготовлен свежим