Сетевая фармакология и экспериментальные исследования β-ситостерола в лечении хронической обструктивной болезни лёгких с помощью глюкокортикоидного рецептора

Краткое содержание

β-ситостерол облегчал ХОБЛ и усилил эффективность дексаметазона, при этом глюкокортикоидный рецептор опосредовал этот эффект. Кроме того, β-ситостерол снижал воспаление, окисляющий стресс и старение клеток как у бронхиальных эпителиальных клеток, стимулируемых КСЭ, так и у мышей, вызванных ХОБЛ, вызванных дымом сигарет.

Аннотация

Хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ) — это распространённое респираторное заболевание, характеризующееся устойчивым воспалением, окислительным стрессом и прогрессирующим снижением функции легких. Терапевтический потенциал β-ситостерола при ХОБЛ остаётся неясным. Целью этого исследования было изучение защитных эффектов β-ситостерола против ХОБЛ и прояснения его основного механизма. Скрининг базы данных выявил глюкокортикоидный рецептор (GR) как потенциальную мишень β-ситостерола. Были установлены модель мышей с ХОБЛ, вызванной дымом сигарет, и модель клеток BEAS-2B, стимулированная экстрактом сигаретного дыма (CSE). Функция лёгких, маркеры, связанные с повреждением лёгких, воспаление, окислительный стресс и клеточная старение оценивались с помощью (RT-qPCR), DCFH-DA флуоресцентных зондовых тестов и наборов для обнаружения старения. Также оценивались эффекты β-ситостерола отдельно или в сочетании с дексаметазоном (DEX). β-ситостерол значительно улучшил функцию лёгких, нормализовал маркеры, связанные с повреждением лёгких, а также ослабил воспаление, окисляющий стресс и старение клеток как в клетках BEAS-2B, стимулируемых КСЭ, так и у мышей, воздействовавших от сигаретного дыма. Эти защитные эффекты сопровождались повышенной экспрессией GR. Кроме того, β-ситостерол повысил чувствительность к DEX, а совместное лечение β-ситостеролом и DEX привело к большему улучшению функции лёгких, маркерам повреждения лёгких, воспалению, уровням реактивных кислородных форм и старению клеток, чем само лечение DEX. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что β-ситостерол облегчает патологические изменения, связанные с ХОБЛ, по крайней мере частично, за счёт повышения экспрессии ГР и повышения терапевтической эффективности ХОБЛ, что подчеркивает его потенциал как адъювантной стратегии лечения ХОБЛ.

Введение

Хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ) — это прогрессирующее респираторное заболевание, характеризующееся устойчивым воспалением дыхательных путей, повреждением альвеоляр и необратимой обструкцией воздушного потока, что ухудшает функцию дыхания и снижает качество^жизни. Его распространённость значительно увеличивается с возрастом, и риск для людей в возрасте шестидесяти пяти лет и старше примерно в пять раз выше, чем у людей младше^{сорока 2} лет. Эта демографическая тенденция связана с увеличением заболеваемости, смертности и^{инвалидности 3}. Эпидемиологические прогнозы показывают, что к 2030 году ХОБЛ может стать четвёртой по величине причиной смерти в мире, составляя около 5% всех ^{смертей (4,5,6}). В настоящее время выявленными факторами риска являются генетическая чувствительность, дисплазия лёгких, воздействие твердых частиц, хронический бронхит и респираторные^{инфекции 7}.

Среди факторов риска самый важный патогенный фактор ХОБЛ 8 является сигаретный^дым. Он содержит тысячи химических веществ, способных вызывать повреждение эпителия бронхов, способствовать инфильтрации воспалительных клеток и приводить к ремоделированию лёгкой^{ткани 9}. Длительное воздействие может вызвать устойчивое и необратимое повреждение эпителия, способствовать выделению большого количества провоспалительных хемокинов, значительно увеличить выработку (ROS) и индуцировать апоптоз^{клеток 10}. Многие исследования показали, что повышенные уровни провоспалительных хемокинов, таких как интерлейкин-8 (IL-8) и фактор некроза опухолей α (TNF-α), а также повышенная выработка ROS и клеточное старение, тесно связаны с тяжестью ХОБЛ^11,12. Это подчёркивает необходимость препаратов, способных эффективно и безопасно модулировать эти ключевые патогенные факторы для оказания защитного и терапевтического эффекта при ХОБЛ.

Фитостеролы — это естественные биоактивные соединения, широко распространённые в мембранах клеток растений. Среди них β-ситостерол является самым распространённым и широко распространён в растительных продуктах, богатых липидами, таких как овощи, орехи, семена и оливковое^масло 13,14,15,16. Исследования подтвердили, что введение β-ситостерола в дозах до 1000 мг/кг у крыс и мышей не связано с цитотоксичностью или^{генотоксичностью 17}. Кроме того, исследования показали, что β-ситостерол обладает антиоксидантными свойствами благодаря своему воздействию на антиоксидантные ферменты и эстрогенные рецепторы^{человека 18}.

β-ситостерол обладает широким спектром фармакологических эффектов, включая противовоспалительные¹⁹,^{антипиретические 20}, анальгетик²¹ и противодиабетические^{эффекты 13}. Он также проявил терапевтический потенциал в различных моделях заболеваний, таких как колит и воспаление^{кишечника 22}, и обладает антиатеросклеротическими²³ и иммуномодуляторными^{свойствами 24}. Кроме того, у него благоприятный профиль безопасности. Учитывая эти характеристики, β-ситостерол вызвал значительный интерес как потенциальный кандидат в препарат. Однако его точная роль и механизмы при ХОБЛ остаются в значительной степени неясными.

Поэтому настоящее исследование было направлено на изучение потенциальных терапевтических эффектов и основных механизмов β-ситостерола при ХОБЛ. В частности, была использована модель повреждения клеток BEAS-2B, вызванная экстрактом сигаретного дыма (CSE), для оценки того, может ли β-ситостерол эффективно облегчить клеточное повреждение, опосредованное CSE, тем самым выявить новую кандидатскую молекулу для терапевтических стратегий ХОБЛ.

Протокол

Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами по базовой и клинической фармакологии и токсикологии для экспериментальных и клинических^{исследований 25}. Все экспериментальные протоколы на животных были утверждены Комитетом по этике животных Второй аффилированной больницы Медицинской школы Чжэцзянского университета (Одобрение No 20230102), и все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике животных. Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами ARRIVE.

Скрининг ключевых компонентов и целей с помощью сетевой фармакологии

Активные компоненты Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. и Adenophora stricta Miq. были извлечены из базы данных фармакологии традиционных китайских медицинских систем (TCMSP; дата обращения: 12 марта 2024 года). Кандидатные соединения были отбранены по следующим критериям ADME: пероральная биодоступность (OB) ≥ 30%, подобие препарату (DL) ≥ 0,18 и проницаемость Caco-2 ≥ −0,4²⁵. Соединения, соответствующие всем трём критериям, были сохранены в качестве кандидатов в качестве активных ингредиентов для последующих анализов.

Каноническая структура β-ситостерола Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES) была получена из PubChem (доступ 18 марта 2024) и импортирована в SwissTargetPrediction (дата обращения: 21 марта 2024) для прогнозирования цели. Homo sapiens был выбран в качестве целевого вида. Потенциальные мишени предсказывались на основе 2D и 3D структурного сходства между β-ситостеролом и известными лигандами в базе данных. Прогнозируемые цели с вероятностью выше 0 сохранялись, а дублирующиеся записи удалялись.

Гены, связанные с ХОБЛ, были извлечены из базы данных терапевтических целей (TTD; дата обращения: 25 марта 2024) и сравнительной токсикогеномной базы данных (CTD; дата обращения: 28 марта 2024 года) с использованием ключевого слова «хроническое обструктивное заболевание лёгких». После удаления дублирующих генов гены, связанные с ХОБЛ, были пересечени с предсказанными мишенями β ситостерола для выявления кандидатов, потенциально участвующих в терапевтическом эффекте β-ситостерола на ХОБЛ.

Молекулярное соединение β-ситостерола и GR

Трёхмерная структура β-ситостерола в формате SDF была извлечена из базы данных PubChem (дата обращения: 2 июня 2026 года), а кристаллическая структура глюкокортикоидного рецептора (GR) была получена из Исследовательской коллаборатории по Белковому банку структурной биоинформатики (RCSB PDB; доступ 3 июня 2026 года). После стандартной подготовки структур лиганда и рецепторов молекулярное стыковывание проводилось с помощью онлайн-платформы CB-Dock2 (дата обращения: 3 июня 2026 года). Подготовленные файлы лиганда и рецепторов были загружены на платформу, а расчёты стыковки проводились с использованием стандартных параметров.

Функциональный анализ генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG)

Все предсказанные целевые гены β-ситостерола подвергались анализу функционального обогащения ГО и обогащения путей KEGG. Результаты обогащения, включая значительно обогащённые биологические процессы, клеточные компоненты, молекулярные функции и сигнальные пути, были отсортированы и сохранены в дополнительном файле 1 для последующего биоинформатического анализа.

Моделирование и группирование животных

Размер выборки был установлен в шесть животных на группу на основе предыдущего исследования, проведённого априорным энергетическим анализом с использованием программного обеспечения G*Power (α = 0,05, мощность = 0,80) и показало, что n = 6 достаточно для обнаружения биологически значимых различий в сопоставимых^{экспериментальных условиях 26}. Самцы мышей C57BL/6 в возрасте 6–8 недель (20 ± 2 г) были случайным образом распределены в пять групп: контрольная группа, модельная группа ХОБЛ, группа ХОБЛ + дексаметазон (DEX), группа ХОБЛ + β-ситостерол и группа ХОБЛ + DEX + β-ситостерол. Мыши содержались в стандартных лабораторных условиях (25 °C, 12 часов цикл свет/темнота) с свободным доступом к стандартной еде и воде, и им разрешалось акклиматизироваться в течение 1 недели перед экспериментами.

Для установления модели ХОБЛ мышей помещали в камеру для отвержения сигаретного дыма по всему телу (63 см × 55 см × 45 см) и подвергали воздействию обычного сигаретного дыма в течение 12 недель. Каждая сигарета содержала 10 мг смолы, 0,9 мг никотина и 10 мг угарного газа. Экспозиция дыма проводилась дважды в день (5 дней в неделю) в 9:30 утра и 15:00, при этом дым выделялся от 18 сигарет, подаваемых в камеру на 90 минут за^{сеанс 27}.

Для оценки терапевтического эффекта вмешательств было начато введение лекарств после 8 недель воздействия сигаретного дыма и продолжалось в течение оставшихся 4 недель. Начиная с 9-й недели, мыши в соответствующих группах лечения получали ежедневное внутрижелудочное введение DEX (1 мг/кг)²⁸ или β-ситостерола (50 мг/кг)^29,30 за 1 час до воздействия сигаретного дыма. Предыдущие фармакокинетические исследования сообщали о пероральной биодоступности примерно 4% β-ситостерола у^{грызунов 31}. Кроме того, в нескольких исследованиях на мышях использовались дозы от 20 до 50 мг/^{кг 32}. Поэтому была выбрана доза 50 мг/кг для обеспечения достаточного системного воздействия, оставаясь в пределах широко используемого в доклинических исследованиях диапазона.

Мыши в контрольной группе подвергались воздействию фильтрованного воздуха в комнате, тогда как мыши в модельной и обработанной группах получили эквивалентный объём нормального физиологического раствора в качестве транспортного средства. В конце экспериментального периода мышей глубоко анестезировали изофлураном до потери педального рефлекса и эвтаназии с помощью экскрови с помощью забора крови из брюшной аорты. Грудная полость была немедленно открыта, а целые двусторонние ткани лёгких аккуратно удалены, промыты ледяным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и положены на лёд. Для сбора бронхоальвеолярной жидкости для промывания (BALF) трахея была законсервирована и промывалась холодным стерильным PBS, который аккуратно вводился и многократно выводился для сбора жидкости для промывания. Ткани лёгких и образцы BALF хранились на льду и затем обработаны для дальнейших анализов.

Культура клеток BEAS-2B

Эпителиальные клетки BEAS-2B в бронхе человека содержались в Modified Eagle Medium/F12 от Dulbecco (DMEM/F12), содержащие 10% сыворотки плода бычьего скота (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина под 5% CO₂ при 37 °C.

Подготовка CSE и воздействие клеток BEAS-2B

Клетки BEAS-2B промывались солевым раствором, буферируемым фосфатами, и засеяны в пластины с 24 колодцами в тройном экземпляре с плотностью 5 ×^{10 4} клеток на колодцу. После 12 часов культуры клетки достигали примерно 60% совпадения и подвергались воздействию CSE. CSE был подготовлен свеже, как было описано ранее, с незначительными изменениями³³. Кратко, одна нефильтрованая коммерческая сигарета постоянно горела, и массовый дым был вдзелен в 10 мл безсывороточной среды с помощью вакуумного насоса при постоянном расходе 1,05 л/мин (примерно −11 кПа отрицательное давление) примерно 5 минут, пока сигарета полностью не сгорала. Полученный раствор сначала подвергался предварительной фильтрации для удаления крупных примесей, затем стерилизовался с помощью стерильного микропористого фильтра диаметром 0,22 мкм для удаления остаточных частиц; полученный стандартный раствор был определен как 100% CSE. Вся свежеприготовленная CSE использовалась для обработки клеток сразу после фильтрации без хранения. Клетки стимулировались средой с 2,5% CSE. После 24 часов обработки CSE супернатанты были собраны и хранятся при -40 °C для последующего анализа³⁴.

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-qPCR)

Полная РНК была извлечена из клеток BEAS-2B с помощью комплекта для экстракции полной РНК и обратно транскрибирована в кДНК с помощью комплекта обратной транскрипции согласно инструкциям производителя. RT-qPCR впоследствии выполнялся с использованием системы обнаружения ПЦР в реальном времени и мастер-микса qPCR на базе SYBR Green. Все эксперименты RT-qPCR проводились с использованием трёх биологических и трёх технических репликий на образец для обеспечения надёжности данных.

Каждая qPCR-реакция проводилась в общим объёме 20 мкл, содержащем 10 мкл мастер-смеси SYBR Green qPCR, 0,4 мкл прямого праймера, 0,4 мкл обратного праймера, 2 мкл разбавленной кДНК-шаблона и 7,2 мкл воды без РНаз. Условия усиления были следующими: начальная денатурация при 95 °C в течение 3 минут, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 секунд и отжиг/удлинение при 60 °C в течение 30 секунд. Относительные уровни экспрессии генов рассчитывались с использованием метода 2^−ΔΔCt, при этом GAPDH выступал в качестве внутреннего эталонного гена. Последовательности праймеров, используемые в этом исследовании, приведены в Дополнительной таблице 1.

Внутриклеточный анализ реактивных видов кислорода (ROS)

Внутриклеточная продукция ROS в клетках BEAS-2B оценивалась с помощью фторогенного зонда 2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеинового диацетата (DCFH-DA) и анализировалась с помощью проточной цитометрии. Во время цитометрического сбора потока применялась стандартная стратегия прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для исключения клеточного мусора и выбора целых отдельных клеток. Всего для каждого образца было получено 10 000 действительных клеточных событий. Длины волн возбуждения и излучения были установлены на уровне 488 нм и 525 нм соответственно. Впоследствии были проанализированы цитометрические данные потока для количественной оценки интенсивности флуоресценции внутриклеточной ROS.

Определение уровня малондиалдегида (MDA)

Внутриклеточное содержание MDA измерялось с помощью набора для перекисления липидов согласно инструкциям производителя. Кратко времени обработанные клетки BEAS-2B были собраны и лизированы, затем центрифугированы при низкой температуре для сбора супернатанта. Затем была проведена колориметрическая реакция тиобарбитуровой кислоты (TBA), а поглощение измерено на 532 нм с помощью считывателя микропластин. Относительные уровни MDA рассчитывались по стандартной кривой.

Оценка старения клеток

Клеточное старение оценивалось с помощью теста на диагностику старения на основе активности β-галактозидазы, ассоциированной с старением, (SA-β-gal). Клетки SA-β-гал-положительных были количественно измерены с помощью потоковой цитометрии. Параллельно уровни экспрессии мРНК маркеров, связанных со старением p53 и p21, были определены методом RT-qPCR.

Анализ клеточной пролиферации

Пролиферация клеток оценивалась с помощью колориметрического теста жизнеспособности клеток. Поглощение измерялось при 450 нм с помощью считывателя микропластин.

GR пробный анализ

Трансфекция клеток проводилась с использованием липидного трансфекционного реагента. Были трансфектированы следующие олигонуклеотиды: глюкокортикоидные рецепторы, нацеленные на малую интерферирующую РНК (si-GR), и отрицательную контрольную малую интерферирующую РНК (si-NC). Кандидатные последовательности siRNA, направленные на GR, были разработаны с использованием онлайн-платформы биоинформатики siDirect 2.0. После трансфекции клетки культивировались в течение 48 часов, и все siRNA использовались при конечной концентрации 50 нм. Эффективность нокдауна была проверена путём измерения экспрессии мРНК GR с помощью RT-qPCR.

Группы контроля транспортных средств были включены как в эксперименты с лечением β ситостеролом, так и в трансфекции. Для вмешательства β ситостерола клетки, обработанные только растворителем средств, выступали в качестве контрольной группы транспортных средств (обозначается как CSE+0). Статистический анализ подтвердил, что существенных различий между контрольной группой транспортного средства и пустыми контрольными группами не наблюдалось.

Статистический анализ

Все количественные результаты были выражены как среднее ± стандартное отклонение от трёх биологически независимых экспериментов in vitro. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для статистического анализа. Тест Шапиро–Уилка использовался для изучения нормальности распределения набора данных до проведения статистического тестирования; Была принята пост-хок коррекция Бонферрони для корректировки значений P при множественных сравнениях после анализа дисперсии (ANOVA). Сравнения между двумя группами оценивались с помощью t-теста студента без пары, а односторонний или двусторонний ANOVA применялся для многогрупповых сравнений. p-значение ≤ 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

β-ситостерол был потенциально натуральным продуктом для лечения ХОБЛ

Из-за сообщаемых целебных эффектов Fritillaria cirrhosa D. Don, засохшего цветка Lonicera japonica Thunb., высохшего корня Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. и Adenophora stricta Miq. в лечении заболеваний лёгочных 35,36,37,38 в данном исследовании использовалась база данных TCMSP для систематического выявления активных компонентов этих трав традиционной китайской медицины (TCM), β-ситостерол был выявлен как важный активный компонент, общий для этих трав TCM (рисунок 1A). Для систематического изучения молекулярного механизма β-ситостерола структурная информация SMILES была извлечена из базы данных PubChem и импортирована в базу данных SwissTargetPrediction для прогнозирования целей; Все предсказаемые цели с предсказательной вероятностью выше 0 сохранялись для последующих анализов. Полученная сеть взаимодействия ингредиент-мишень между β-ситостеролом и его кандидатами была визуализирована и представлена на рисунке 1B. Всего с помощью базы данных SwissTargetPrediction было предсказано 43 предполагаемых целевых гена β-ситостерола. Впоследствии были проведены анализы функционального обогащения по GO и пути KEGG на целевых генах β-ситостерола, а все полные наборы данных по обогащению были заархивированы в Дополнительном файле 1. В частности, стероидные метаболические процессы были определены как одни из наиболее значительно обогащённых путей. Накопленная литература показала тесную связь между метаболизмом аномальных стероидов и устойчивостью к глюкокортикоидам при^{ХОБЛ 39}. Кроме того, ГР был явно обогащён в функциональных кластерах, связанных с метаболизмом стероидов. Это открытие обеспечивает ключевую биоинформатическую поддержку для наших последующих клеточных экспериментов, изучающих механизм, с помощью которого β-ситостерол повышает чувствительность к DEX и изменяет уровень экспрессии GR.

Гены, связанные с ХОБЛ, были извлечены из баз данных TTD и CTD. Последующий анализ пересечения Венна (рисунок 1C) выявил два перекрывающихся гена между β-ситостерол-мишенями и генами, связанными с ХОБЛ, полученными из ТТД, ещё два перекрывающихся гена между β-ситостероловыми мишенями и генами, связанными с ХОБЛ, полученными от КТД, и пять общих генов ХОБЛ между наборами данных ТТД и КТД. В конечном итоге GR был единственным геном, общим для всех трёх наборов данных, и был определен как основная мишень β-ситостерола против ХОБЛ. Подробные числовые данные анализа Венна приведены в дополнительном файле 2. Для дальнейшей проверки аффинности связывания была проведена молекулярная стыковка β-ситостерола с GR (рисунок 1D). Карманы связывания с показателями Vina ниже −7,0 ккал/моль были признаны обладающими благоприятной связывающей аффинностью. Показатели Vina для карманов C1 и C5 составляли −8,8 и −7,2 ккал/моль соответственно, что указывает на сильное предсказанное взаимодействие между β-ситостеролом и GR.

β-ситостерол защищал клетки BEAS-2B от повреждения CSE, что может быть связано с повышенной экспрессией GR

β-ситостерол проявил значительный защитный эффект в модели повреждения клеток BEAS-2B, вызванной CSE. Группа CSE + 0 была разработана как транспортное средство, принимающее CSE с равным объёмом растворителя без β-ситостерола. Как и ожидалось, значимой разницы между группами CSE и CSE + 0 не обнаружено. Соединение ингибировало выработку TNF-α и IL-6, вызванную CSE, в зависимости от концентрации (рисунок 2A). Он также снизил уровень внутриклеточного ROS (рисунок 2B). β-ситостерол также значительно снижал содержание MDA (рисунок 2C), подавлял клеточное старение, вызванное CSE (рисунок 2D), и снижал уровень маркеров, связанных с старением, p53 и p21 (рисунок 2E). Эти эффекты сопровождались повышенной экспрессией мРНК GR (рисунок 2F), что указывает на то, что её защитная функция может быть тесно связана с транскрипционной арегуляцией GR. В исследованном диапазоне концентраций β-ситостерол не оказывал явной цитотоксичности на жизнеспособность клеток BEAS-2B (см. рисунок 2G), что свидетельствует о благоприятной клеточной толерантности к этому соединению. Поскольку 20 мкг/мл (примерно 48,2 мкм) демонстрировали наиболее мощные ингибирующие эффекты, эта доза была выбрана для последующих экспериментов. Хотя статистически значимой разницы между группами 10 мкг/мл и 20 мкг/мл в отношении подавления провоспалительных цитокинов не наблюдалось, 20 мкг/мл β-ситостерол показал лёгкую тенденцию к снижению уровня воспалительных факторов. Кроме того, по сравнению с 10 мкг/мл, 20 мкг/мл обеспечивали лучшую эффективность в ингибировании накопления РОС и МДА, индуцируемой CSE, снижении клеточной старения и повышении экспрессии мРНК GR. Это позволило выбрать оптимальную рабочую концентрацию 20 мкг/мл для контрольных спасательных анализов.

Результаты RT-qPCR (рисунок 2H) подтвердили успешное снятие GR. Уровни мРНК GR в группе si-GR снизились примерно на 78% по сравнению с контролем si-NC, что подтверждает эффективность подавления GR для последующих спасательных анализов. После снижения GR ингибирующие эффекты β-ситостерола на воспалительные факторы и ROS были значительно обратны (рисунок 2I, J). Аналогично, ослабление клеточного старения β-ситостеролом также было отменено (рисунок 2K). В совокупности эти результаты показали, что β-ситостерол играет защитную роль против повреждения бронхиальных эпителиальных клеток, вызванных CSE, через GR-опосредованные противовоспалительные и антивозрастные механизмы.

β-ситостерол усилил терапевтическое влияние DEX на функцию лёгких и воспаление в мышиной модели ХОБЛ

В мышиной модели ХОБЛ, установленной при воздействии сигаретного дыма, лечение β-ситостеролом, DEX или их комбинацией оказывало явные защитные эффекты. Статистические сравнения между несколькими группами анализировались с помощью одностороннего ANOVA, за которым последовал пост-хок тест Тьюки. Для различия экспериментальных когорт применялись пять различных стилей символов: круги для контрольной группы, треугольники для группы Модель, звёздочки для группы Модель + DEX, квадраты для группы Модель + β-ситостерол и ромбы для группы Модель + DEX + β-ситостерол. Каждая горизонтальная скобка представляет собой статистическое сравнение двух связанных экспериментальных групп.

По сравнению с контрольной группой, мыши из модели ХОБЛ демонстрировали заметное снижение принудительного выдохового объёма на 0,1 с (FEV₀.₁), принудительной жизненной ёмкости (FVC), пикового выдохового потока (PEF) и соотношения FEV₀.₁/FVC. Как показано на рисунке 3A–D, соотношение FEV₀.₁/FVC ниже 70% подтверждало успешное установление модели ХОБЛ. Введение только DEX или β-ситостерола значительно обратило эти нарушения функции лёгочных по сравнению с модельными мышами, а комбинированное лечение привело к дальнейшим улучшениям по сравнению с однокомпонентным введением. Кроме того, изменённое соотношение MMP-9/TIMP-1 является характерным молекулярным маркером ремоделирования дыхательных путей, а повышенная экспрессия MUC5AC свидетельствует о чрезмерной гиперсекреции^{слизи 40,41}. Мы дополнительно обнаружили уровни мРНК MMP-9, TIMP-1 и маркера слизи MUC5AC, а также рассчитали соотношение MMP-9/TIMP-1 (рисунок 3E, F). Модель показала заметное повышение соотношения MMP-9/TIMP-1 и повышенную экспрессию MUC5AC. DEX или β-ситостерол сами по себе эффективно снижали оба параметра, а комбинированное лечение обеспечивало лучшую тормозную эффективность по сравнению с монотерапией.

Модельные мыши с ХОБЛ демонстрировали выраженное повышение уровня BALF TNF-α и IL-6, а также увеличение содержания ROS в лёгких по сравнению с контрольными мышами. DEX или β-ситостерол сами по себе значительно снижали уровень воспалительных цитокинов и окислительный стресс, а комбинированное лечение приводило к более сильному тормозу (рисунок 3G, H). Кроме того, экспрессия мРНК GR в лёгочных была заметно снижена у мышей модели ХОБЛ. DEX или β-ситостерол сами по себе значительно повышали экспрессию GR, а совместное лечение — ещё больше повышали уровень GR (рисунок 3I).

В совокупности эти результаты показали, что β-ситостерол защищает от патологических изменений, связанных с ХОБЛ, у мышей, поддерживая функцию лёгких, подавляя воспаление, снижая окислительный стресс и повышая экспрессию ГВ. Кроме того, совместное введение β-ситостерола усилило защитную эффективность DEX в этой модели.

β-ситостерол повысил терапевтическую эффективность DEX, возможно, за счёт регуляции пути GR в модели BEAS-2B, индуцированной CSE

В модели BEAS-2B, индуцированной CSE, монотерапия DEX значительно понизила экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов, снизила уровень внутриклеточного ROS и MDA, а также снизила долю стареющих клеток, а также экспрессию маркеров старения p53 и p21. Эти результаты подтверждают противовоспалительную, антиоксидантную и антистаресцентную активность DEX. Примечательно, что совместное введение β-ситостерола дополнительно усиливало защитные эффекты DEX, что приводило к более сильному подавлению воспаления, окислительного стресса и клеточного старения по сравнению с монотерапией DEX. После снижения GR (si-GR) в группе совместного лечения DEX + β-ситостерола клеточный ответ на комбинированную терапию был заметно ослаблен. Как показано на рисунке 4A–E, совместное подавление воспаления, окислительного стресса и старения DEX и β-ситостеролом, было значительно обратито вспять, что указывает на то, что дефицит GR ослабляет благоприятное влияние β-ситостерола на эффективность DEX.

В совокупности эти результаты показали, что β-ситостерол повышает эффективность DEX, возможно, за счёт регулирования процессов, связанных с GR, тем самым усиливая защитные эффекты DEX против повреждения клеток бронхиального эпителия, вызванного CSE.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Все исходные данные, подтверждающие результаты данного исследования, приведены в дополнительных материалах (Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2).

Рисунок 1: Ключевая роль β-ситостерола в терапии ХОБЛ. (A) Активные компоненты у Fritillaria cirrhosa D. Don, засушенного цветка Lonicera japonica Thunb. и высушенного корня Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. и Adenophora stricta Miq. были проверены через базу данных TCMSP. (B) Возможные цели β-ситостерола. (C) Анализ пересечений β-ситостерола в нижней части и генов, связанных с ХОБЛ. (D) Анализ молекулярного соединения между β-ситостеролом и белком GR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Участие GR в защите, связанной с β-ситостеролом, от повреждения клеток, вызванных CSE. (A) Концентрационно-зависимая модуляция воспалительных медиаторов, индуцированных CSE (TNF-α, IL-6), β-ситостеролом. (B)Влияние дозы β-ситостерола на уровень ROS в клетках, подвергшихся CSE. (C) Влияние β-ситостерола на повышенное содержание МДК, повышающееся CSE. (D) Влияние β-ситостерола на клеточное старение, поддерживаемое CSE. (E) Модуляция связанных с старением p53 и p21 β-ситостеролом при стимуляции CSE. (F) β-ситостерол-зависимая регуляция экспрессии GR при стимуляции CSE. (G) Жизнеспособность клеток β-ситостерола в тестируемых концентрациях в клетках BEAS-2B. (H) RT-qPCR обнаружение экспрессии мРНК GR для подтверждения эффективности knockdown после трансфекции сиРНК, нацеленной на GR. (I) Регуляторная ассоциация между GR и β-ситостеролом с воспалительными факторами, вызванными CSE. (J) Регуляторная ассоциация между GR и β-ситостеролом с накоплением ROS, вызванной CSE. (K) Регуляторная ассоциация между GR и β-ситостеролом против клеточного старения, вызванного CSE. *p < 0,05; **p < 0.01; p < 0,001; NS, не значительно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Влияние β-ситостерола в сочетании с DEX на функцию лёгких, воспаление, окислительный стресс и экспрессию GR у мышей модели ХОБЛ. (A) Изменения в объёме принудительного выдоха в 0,1 с (FEV₀.₁) у мышей с ХОБЛ. (B) Изменения в принудительной жизненной ёмкости (FVC) у мышей с ХОБЛ. (C) Влияние на пиковый выдохательный поток (PEF) у мышей с ХОБЛ. (D) Соотношение FEV₀.₁/FVC у мышей модели ХОБЛ. (E) Относительное отношение мРНК MMP-9/TIMP-1, отражающее ремоделирование дыхательных путей. (F) Относительная экспрессия мРНК MUC5AC указывает на гиперсекрецию слизи в тканях лёгких мышей. (G) Уровни TNF-α и IL-6 в бронхоальвеолярной жидкости для промывания (BALF). (H) Выработка ROS в ткани лёгких у мышей с ХОБЛ. (I) Относительная экспрессия мРНК ГР в ткани лёгких мышей. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Влияние β-ситостерола на устойчивость к DEX, опосредованную GR, в клетках BEAS-2B, индуцируемых CSE. (A) Относительная экспрессия мРНК воспалительных факторов (TNF-α, IL-6) в каждой группе. (B) Уровень ROS в каждой группе. (C) Содержание MDA в каждой экспериментальной группе. (D) Процент стареющих клеток BEAS-2B в каждой группе. (E) Относительные уровни мРНК маркеров, связанных с старением, p53 и p21. **p < 0,01; p < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительная таблица 1: Праймерные последовательности, используемые для RT-qPCR анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Полные наборы данных анализа обогащения GO и KEGG для генов-мишень β-ситостеролов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Подробные численные результаты анализа Венна, определяющие перекрывающиеся мишени между β-ситостеролом и ХОБЛ.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

ХОБЛ накладывает значительную глобальную нагрузку на болезни и остаётся серьёзной проблемой для глобального^{здравоохранения 1}. Текущее лечение ХОБЛ охватывает как фармакологические, так и нефармакологические^{вмешательства 42}. Среди фармакологических методов лечения глюкокортикостероиды (ГК) широко применяются при хронических воспалительных заболеваниях. Они действуют, связываясь с GR и рекрутируя гистондеацетилазу 2 в транскрипционные комплексы для обратного ацетилирования^{гистонов 43}. Однако несколько исследований показали снижение чувствительности к ГК у пациентов с^{ХОБЛ 44,45}, а исследования подтвердили наличие устойчивости к ГК при этом^{заболевании 46}. Эти результаты свидетельствуют о том, что преодоление резистентности к ГК является значительной клинической задачей, подчёркивая необходимость новых терапевтических препаратов. Поэтому выявление более эффективных терапевтических вариантов ХОБЛ имеет большое значение.

Предыдущие исследования показали, что γ-ситостерол оказывает антипролиферативное действие на эпителиальные клетки бронха при^{ХОБЛ 47}. Поскольку γ-ситостерол и β-ситостерол являются распространёнными биоактивными компонентами фитостеролов, настоящее исследование расширяет современное понимание действия фитостеролов при ХОБЛ и подчёркивает потенциальную защитную ценность β-ситостерола в патогенезе заболеваний. Наши результаты показали, что β-ситостерол значительно подавляет выделение воспалительных факторов, снижает окислительный стресс и подавляет клеточное старение. Это соответствует более ранним сообщениям, показывающим, что β-ситостерол эффективно подавляет апрегуляцию воспалительных медиаторов, вызванных липополисахаридами, таких как IL-6, индуцируемая оксид азота синтаза и TNF-α⁴⁸. Эти данные подтверждают его противовоспалительную активность и подтверждают согласованность в различных воспалительных моделях.

Ингаляционные ГК являются эффективными противовоспалительными средствами для контроля воспаления дыхательных путей. Они действуют в основном за счёт привязки и активации GR⁴⁹. Однако ключевой патологической особенностью ХОБЛ является сниженная чувствительность клеток к противовоспалительным эффектам^GC44. Снижение или функциональное нарушение ГР считается основным механизмом, лежащим в основе развития резистентности к ГК у пациентов с^{ХОБЛ 50}. Предыдущие исследования показали, что определённые препараты могут повышать чувствительность к ГК. Например, комбинация азитромицина и будесонида оказывает значительно более сильное ингибирующее действие на выработку IL-4 и CXCL8, чем один из этих^{препаратов 51}.

Примечательно, что настоящее исследование показало, что как в моделях мышей с ХОБЛ, воздействовавшими дымом сигарет, так и в моделях клеток BEAS-2B, индуцированных CSE, комбинация β-ситостерола с DEX вызывала значительно более сильное тормозирующее воздействие на воспалительные факторы, окисляющий стресс и клеточное старение, чем только DEX. Эта комбинация также значительно повысила защитную эффективность DEX против патологических изменений, связанных с ХОБЛ, и повреждения бронхиальных эпителиальных клеток у мышей. Этот результат указывает на то, что β-ситостерол может повысить чувствительность бронхиальных эпителиальных клеток к DEX, предоставляя новый подход к борьбе с нечувствительностью или резистентностью к ГК у некоторых пациентов с ХОБЛ. В соответствии с количественными результатами ПЦР in vitro , β-ситостерол повышает уровень мРНК GR в зависимости от концентрации, а не напрямую выступает в роли агониста или антагониста GR. Подтверждённые эффективность устранения si-GR и последующие функциональные анализы дополнительно подтверждают, что β-ситостерол улучшает чувствительность клеток ГК за счёт увеличения общего уровня внутриклеточного GR, а не за счёт прямой активации GR, тем самым создавая усиленный терапевтический эффект в сочетании с DEX, каноническим агонистом GR. Соответственно, изменения экспрессии ГР могут быть связаны с действием β-ситостерола, что соответствует предыдущим наблюдениям значительно сниженного ГР и его активной изоформы GRα в клетках гладких мышц дыхательных путей у пациентов^{с ХОБЛ 52}. Важно отметить, что эксперименты с подавлением GR дополнительно выявили центральную роль этого рецептора в β-ситостерол-опосредованной цитопротекции, что указывает на то, что некоторые биологические функции β-ситостерола зависят от целостности пути GR.

В совокупности данное исследование не только показывает, что GR может служить ключевым медиатором β-ситостерола при вмешательстве при ХОБЛ, но и предлагает потенциальный новый подход к преодолению клинической проблемы устойчивости к DEX, закладывая экспериментальную основу для разработки естественных дополнительных терапий, направленных на путь GR.

Однако настоящее исследование имело несколько ограничений. Во-первых, функция лёгких оценивалась только для подтверждения успешного установления модели мышей с ХОБЛ, а окрашивание гематоксилин-эозина (HE) и Массона не проводилось для дальнейшей проверки типичных патологических признаков, включая эмфизему, ремоделирование дыхательных путей и гиперсекрецию слизи. Поскольку все фиксированные образцы лёгких были использованы в предыдущих экспериментах, реконструкция 12-недельной модели мышей с ХОБЛ, вызванной дымом сигарет, была невозможна в течение доступного периода исследования. Для частичного устранения этого ограничения соотношение MMP-9/TIMP-1 и уровней экспрессии мРНК MUC5AC было количественно измерено с помощью сохранившихся образцов РНК легких. Во-вторых, в живом организме была оценена только одна комбинация дозы β-ситостерола и DEX, а систематически не исследовались доза-реакция или синергетические эффекты. Дальнейшие исследования с использованием нескольких комбинаций доз необходимы для характеристики потенциальных синергетических взаимодействий. В-третьих, из-за экспериментальных ограничений и затрат на исследования, в каждую группу было включено всего шесть мышей. Относительно небольшой размер выборки мог повысить восприимчивость к изменчивости между животными и ограничить статистическую устойчивость результатов. Для дальнейшей проверки текущих результатов необходимы будущие исследования с большим размером выборки. В-четвёртых, стабильные линии, устойчивые к DEX, не были установлены; поэтому способность β-ситостерола обращать устоявшуюся устойчивость к глюкокортикоидам не может быть напрямую оценена. Для дальнейшего изучения этого механизма требуются дополнительные исследования с использованием валидированных моделей, устойчивых к глюкокортикоидам.

В заключение, эти данные свидетельствуют о том, что сигнализация GR может участвовать в защитном эффекте β-ситостерола против повреждений, вызванных CSE, в клетках BEAS-2B, включая ингибирование выделения воспалительных факторов, окислительный стресс и клеточное старение, а также улучшение функции лёгких и биомаркеров повреждений лёгких. Кроме того, β-ситостерол повышал терапевтическую чувствительность этих клеток к DEX. В совокупности эти результаты выявляют β-ситостерол как потенциальную естественную кандидатскую молекулу, которая может способствовать разработке новых терапевтических стратегий при ХОБЛ.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BEAS-2B human bronchial epithelial cells	SunnCell, China	SC-0218	Human bronchial epithelial cell line for in vitro study
C57BL/6 mice	Vital River Laboratories, China	213	Animal model for COPD in vivo experiment
CB-DOCK2	China	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	for molecular docking simulation between ligand and receptor protein
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, China	C0038	Detection of cell viability and proliferation
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, USA	C10851	Detection of cellular senescence
Cigarettes	Hongta, China	Not provided	Cigarette used for smoke exposure and CSE preparation
CTD	USA	https://ctdbase.org/	for retrieving COPD-related genes
DCFH-DA fluorescent probe	Sigma-Aldrich, USA	D6883-50MG	Detection of intracellular ROS level
Dexamethasone (DEX)	Yeasen, China	40323ES03	Glucocorticoid for combined intervention
DMEM/F12 medium	Gibco, USA	11330032	Basal medium for BEAS-2B cell culture
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10270106	Supplement for cell culture medium
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	9.3.1	Data statistical analysis and graph drawing
Isoflurane	RWD Life Science, China	R510-22-10	Inhaled anesthetic for animal euthanasia
Lipid Peroxidation MDA Assay Kit	Beyotime Biotechnology, China	S0131S	Detection of intracellular malondialdehyde (MDA) content
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, USA	11668030	Transfection reagent for siRNA delivery
Multimode microplate reader	Thermo Fisher, USA	VL0000D0	Detection of absorbance and fluorescence value
Navios EX Flow Cytometer	Beckman Coulter, USA	B80912	Analysis of ROS and senescent cells
Penicillin/streptomycin	HyClone, USA	SV30010	Antibiotics to prevent bacterial contamination
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, USA	4367659	Fluorescent quantitative PCR amplification
PrimeScript™ RT reagent Kit	Takara, Japan	RR037Q	Reverse transcription for cDNA synthesis
PubChem database	USA	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	for acquiring canonical SMILES sequence and downloading 3D SDF structural information of beta-sitosterol
QuantStudio Dx PCR Instrument	Thermo Fisher, USA	4479889	Real-time RT-qPCR detection
RCSB PDB	USA	https://www.rcsb.org/	to obtain GR crystal 3D structure file
RNA/Protein Isolation Kit	Beyotime Biotechnology, China	R0018S	Total RNA extraction from cell and lung tissue
si-GR	Designed in silico via siDirect 2.1	Custom synthesis	Guide: 5’-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3’; Passenger: 5’-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3’, knockdown for GR
si-NC	Thermo Fisher, USA	4390843	used as negative transfection control for cellular and in vivo assays
SwissTargetPrediction database	Switzerland	http://swisstargetprediction.ch/	for in silico prediction of potential drug-related protein targets
TCMSP database	China	https://www.tcmsp-e.com/	for herbal ingredient screening and target prediction
TTD	Singapore	https://db.idrblab.net/ttd/	for collection of validated COPD-associated disease genes
Whole-body smoke exposure chamber	Teague Enterprise, USA	TE-2	Establishment of cigarette smoke-induced COPD model
β-sitosterol	ChemicalBook, China	83-46-5	Active phytosterol for drug treatment