Протоколы эффективного разведения и функционального анализа эндопаразитоидной осы Asobara japonica и её хозяина Drosophila melanogaster

Summary

Цель этого протокола — облегчить функциональный анализ взаимодействий паразитоидов и хозяина у Asobara japonica и Drosophila melanogaster. с помощью оптимизированных методов выращивания, анализа на инфекцию с одиночным откладением яиц и устранения генов с помощью РНКi.

Abstract

Паразитизм — это биологическое взаимодействие, при котором один организм эксплуатирует тело или ресурсы другого (хозяина), что приводит к значительному ущербу или смерти хозяина. Среди паразитических животных паразитоидные осы являются одними из самых богатых видами линий, составляющих почти 20% всех видов насекомых. В частности, эндопаразитоидные осы откладывают яйца непосредственно в тела хозяина и используют разнообразные ядовитые факторы для управления развитием хозяина, иммунитетом и физиологией. В ответ на атаку ос хозяева пытаются уничтожить паразитоидные яйца с помощью врождённых иммунных механизмов. Однако молекулярные и клеточные механизмы, с помощью которых отдельные компоненты яда модулируют биологию хозяина и способствуют успешному паразитизму, остаются плохо изученными. Здесь мы описываем стандартизированный лабораторный протокол по разведению эндопаразитоидной осы Asobara japonica и её хозяина Drosophila melanogaster. Доступны как партеногенетические, так и половые штаммы A. japonica, а партеногенетический штамм демонстрирует высокий уровень успеха паразитизма, что позволяет стабильно поддерживать лабораторные запасы для анализа генома и тестов паразитизма. Для функционального анализа генов яда были оптимизированы анализ на инфекции с помощью яидесятых яиц и двухцепочечный метод устранения генов на основе РНК. Вместе эти протоколы предоставляют практическую экспериментальную основу для анализа молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействий паразитоидов и хозяина, и будут способствовать будущим исследованиям в области биологии развития, иммунологии и физиологии.

Introduction

Паразитизм — это образ жизни, при котором один организм использует питательные ресурсы другого, и он широко распространён среди таксонов. Считается, что до половины всех известных организмов проявляют паразитизм в течение^{жизненного цикла 1}. Среди паразитов паразитоидные осы — особенно разнообразная группа, составляющая примерно 20% всех^{насекомых.} Они эксплуатируют широкий спектр членистоногих хозяев, таких как насекомые, пауки и клещи, и демонстрируют удивительное разнообразие в своей жизненной истории и паразитических^{стратегиях 3}. Эти особенности делают паразитоидных ос одной из самых эволюционно и экологически успешных групп насекомых.

Взаимодействия между паразитоидами и их хозяевами были широко изучены как модельные системы эволюционных «гонок вооружений». В частности, эндопаразитоидные осы используют широкий спектр факторов, включая яды, симбиотические вирусы и^{тератоциты 4,5}. Эти факторы влияют на физиологию и развитие хозяина, обеспечивая успешное развитие внутри хозяина. Несмотря на эти достижения, молекулярные механизмы, лежащие в основе паразитизма, остаются плохо изученными у большинства паразитоидных видов. Одним из серьёзных ограничений является их небольшой размер тела, что затрудняет биохимическую идентификацию компонентов яда. Кроме того, технически сложно поддерживать паразитоидов и их хозяев с синхронизированными стадиями развития в лабораторных условиях.

Недавние достижения в секвенировании следующего поколения и других омикс-технологиях теперь позволяют проводить анализ на уровне всего генома даже у очень мелких паразитоидных видов. Эти подходы открыли новые возможности для изучения ранее недоступных молекулярных механизмов, позволив изучать взаимодействия паразитоидов и хозяина с беспрецедентным разрешением. В этом контексте наша лаборатория сосредоточена на Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera: Braconidae), виде, впервые выявленном в^{Японии 6,7,8}. A. japonica включает телитокозный партеногенетический штамм, при котором самки производят потомство без спаривания. Эта особенность позволяет нам собирать значительные объёмы генетически однородной геномной ДНК для секвенирования целого^{генома 9}. Кроме того, этот вид паразитирует на широком спектре видов рода Drosophila, включая модельный организм D. melanogaster,  который предлагает значительные экспериментальные преимущества благодаря хорошо устоявшимся условиям выращивания и точно определённым стадиям развития, позволяя проводить воспроизводимые анализы инфекций и точно контролировать развитие паразитоидов¹⁰.

Во время паразитизма A. japonica самка осы вводит яд вместе с одним яйцом личинке мухи, внутри которой вместе с хозяином растёт личинка осы. Примечательно, что у A. japonica высокий уровень успешного паразитизма на хозяине D. melanogaster, что делает эту пару паразитоид-хозяин мощной экспериментальной моделью. Здесь мы описываем протоколы стабильного выращивания, анализ на инфекцию с одной яйцекладкой и метод устранения генов на основе двухцепочечной РНК (dsRNA) у A. japonica. Эти протоколы предоставляют надёжную основу для анализа молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействий паразитоидов и хозяина.

Protocol

Схематический обзор синхронизированного метода выращивания D. melanogaster и A. japonica представлен на рисунке 1.

1. Выращивание плодовой мушки-хозяина Drosophila melanogaster в лаборатории

1. Поддерживайте всех экспериментальных животных при 25 °C и относительной влажности 50-60% в цикле 12:12 часа. Используйте дикий штамм Oregon-R (OR) в качестве хозяина для A. japonica (рисунок 2A).
2. Переместить взрослых мух в новый кормовой флакон со стандартной кукурузной мукой-дрожжевой агаровой средой (0,55% агар, таблица 1). Маркируйте флакон датой передачи и названием сорта «OR».
3. Очистите этих взрослых мух на следующий день после переноса, чтобы предотвратить чрезмерное количество яиц в корме. Убедитесь, что личинки потомства питаются на поверхности корма.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве рекомендации поддерживайте примерно 200-250 яиц в каждом флаконе (φ30×100 мм). Более высокая плотность яиц может снижать успех паразитизма и увеличивать разнообразие в развитии хозяина и ос.
4. Через четыре дня после шага 1.2 переложите ложку личинок мух (через 4 дня после откладки яиц, dAEL) в новый флакон для корма. Держать этих личинок вне контакта с паразитоидами для следующего поколения. Эта процедура также помогает контролировать плотность личинок хозяина в флаконе.

2. Разведение эндопаразитоидной осы Asobara japonica в лаборатории

1. Используйте партеногенетический штамм Tokyo (TK) и половой штамм Iriomote-jima (IR) (рисунок 2B). Первая состоит из самок, а вторая — из самок и самцов. Самцы закрываются на два-четыре дня раньше самок. Поэтому подтверждайте наличие самок у их яйцекладов до переноса.
2. Пересадите 10-20 взрослых ос непосредственно из флакона в флакон с личинками мух при 4 dAEL. Маркируйте флакон датой передачи и названием сорта «TK» или «IR». Поддерживайте ос в тех же условиях, что и шаг 1.1.
3. Позвольте взрослым осам откладывать яйца в личинках мух. Очищайте этих ос через один-два дня, чтобы предотвратить суперпаразитизм, который может привести к гибели хозяина. Удалять закрытых взрослых мух, сбежавших от паразитизма, через 10 и более дней после Шага 2.2.
4. Через две недели после шага 2.2 взрослые осы начинают замыкаться из куколки мухи-хозяина. Перенесите этих недавно закрытых взрослых ос в новый кормовой флакон с фильтрующей бумагой, содержащей 25% глюкозы и 50 мМ раствора витамина C. Кусочки фильтрующей бумаги следует стерилизовать при 130 °C в течение 2 часа. Размещение раствора на фильтровой бумаге способствует откладению яиц и продлевает продолжительность жизни взрослых ос. Наш подход к использованию витамина C для улучшения откладки яиц был вдохновлён наблюдениями в исследованиях ^{Drosophila 11}.

3. Однояйцевый анализ инфекций

1. Синхронизировать стадию развития личинок мух, используемых для эксперимента с инфекцией.
   1. Поместите взрослых мух в трубку объёмом 50 мл с тарелкой для агар-пластины с виноградным соком (3% агар), намазанной свежей дрожжевой пастой, и дайте им откладывать яйца в течение 24 часов.
   2. Соберите только что вылупившиеся личинки первого возраста на тарелке с виноградным соком агаром и переместите их в небольшой флакон (12 мл), содержащий 2-3 г паста для мух (корм для мух, смешанный с соответствующим количеством воды). В флакон помещают 20–30 личинок. Личинкам мух разрешают расти при температуре 25 °C.
2. В подходящее время приготовьте чашку Петри диаметром 4 см, содержащую тонкий, равномерно распределённый слой пасты для корма для мух, покрывающий площадь диаметром примерно 1,5–2,0 см (далее — арена для анализа инфекции). Помимо теста инфекций, подготовьте новый небольшой флакон (12 мл) с соответствующим количеством пасты для корма для мух. Этот флакон используется для выращивания личинок хозяина после анализа инфекции.
3. Соберите поэтапные личинки и переместите их в тарелку с деионизированной водой (сопротивление = 15 МОм·см, 25 °C). Промывайте личинок в блюде с помощью аккуратного перемешивания, чтобы удалить остатки пищи из их организма.
4. После промывания аккуратно удаляйте лишнюю влагу с личинок с помощью бумажных салфеток без ворса, так как избыточная вода мешает откладке яиц ос на арене анализа инфекции. Затем перенесите личинок на арену. Этот этап увеличивает активность личинок во время эксперимента с инфекцией.
5. Анестезия взрослых ос газом_CO2 при расходе 5 л·^мин-1 и давлении 0,2 МПа. Затем аккуратно поместите примерно три самки ос в зону для анализа инфекции. Закройте крышку блюда и дайте им восстановиться на пасте для корма для мух.
6. Наблюдайте поведение откладки яиц этих ос под стереомикроскопом (режим увеличения: 10× 15×).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда оса касается тела движущейся личинки мухи, она быстро вводит яйцеклад в тело мухи и вводит компоненты яда. Хотя личинка мухи извивается и дергается телом, она сразу же парализована. Впоследствии оса вибрирует брюшко и откладывает яйцо в тело личинки хозяина, после чего яйцеклад удаляется. Это поведение при откладении яиц называется инфекцией.
7. После заражения откройте крышку и перенесите личинку инфицированной мухи в новый небольшой флакон с пастой для корма мух, приготовленной в шаге 3.2. Для стандартизации времени заражения проводите эксперимент с инфекцией в течение 15 минут.
8. Маркируйте небольшой флакон экспериментальной информацией, такой как дата, название образца, время заражения и количество особей. Эти флаконы заглушают и помещают в влажный контейнер, где хранят при температуре 25 °C.

4. Генерация ос с интерференцией РНК (РНКи) путём инъекции dsRNA

1. Синтезируйте dsRNA диаметром 400 bp или более для устранения генов (интерференция РНК, RNAi) с помощью системы синтеза dsRNA на основе транскрипции in vitro . Образцы дсРНК следует поддерживать при -20–-80 °C до применения. Подробные протоколы, как описано^{ранее, 9}.
2. Приготовьте чашку Петри диаметром 5,5 см с 2% агар для размещения тел ос. Наполните две трети каждой порции агаром, чтобы получить толстый слой тарелки для инъекции.
3. Положите на крышку пластиковой тарелки бумажную салфетку без ворса, смоченной водой.
4. Соберите куколки мух-хозяина через 7 дней после заражения (dpi) из флакона и положите их на бумажные салфетки без ворса, подготовленные в шаге 4.3. Добавление капли воды в стенку флакона помогает отделить куколки мух хозяина от флакона.
5. Под стереомикроскопом (режим увеличения: 20×) удалите куколку мухи хозяина и обнажите тело осы щипцем. При 7 dpi большинство ос находятся на стадии куколки, где различимы голова, грудная клетка и брюшко. Тело осы неподвижно.
6. Поместите найденные тела ос на агарную пластину, подготовленную в шаге 4.2, выровняя их оси тела в той же ориентации. Расположите 20-30 тел ос с их спинной стороной вверх в одну-две линии. Удалите лишнюю влагу с агарной пластины с помощью безворсовой бумажной салфетки, чтобы осы не скользили.
7. Следуя инструкциям производителя, установите инжекторный аппарат и стереомикроскоп (рисунок 3A). Используйте систему микроинъекции с стеклянной капиллярной иглой, которая позволяет точно контролировать объём и скорость инъекции. Поместите агарную пластину, в которой головки ос ориентированы к кончику иглы для инъекции. Объём впрыска составляет 50 нл·^wasp-1 , а скорость впрыска — 50 нл·^сек-1 на форсунке.
8. Подготовьте стеклянные капиллярные иглы с помощью игла. Форма стеклянного капилляра регулируется в зависимости от температуры нагревателя.
9. Положите иглу стеклянного капилляра на шлифовальную машину под углом 30-35°. Шлифуйте иглой, пока длина кончика не достигнет 0,04 мм (четыре раздела на сетке окуляра, рисунок 3B).
10. Непосредственно перед инъекцией разморозьте дсРНК. Концентрация дсРНК составляет 0,25-1 мкг·^μл-1. Для визуализации раствор дсРНК окрашивают синим красителем (соль эриоглауцина динатрия, 2% веса·^объём-1). С помощью наконечника пипетки микрозагрузчика заполните стеклянный капилляр раствором dsRNA синим красителем. 4 мкл достаточно для инъекции 30 тел ос. Убедитесь, что внутри раствора нет пузырьков воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После загрузки раствора dsRNA аккуратно постучите ногтем по боковой стороне иглы, чтобы удалить застрявшие пузырьки воздуха. Остаточные пузырьки воздуха могут препятствовать потоку раствора и мешать успешному введению.
11. Используя шприц объёмом 1 мл и иглу, заполните свободную часть стеклянного капилляра минеральным маслом, чтобы внутри капилляра не осталось пузырьков воздуха.
12. Прикрепите стеклянную капиллярную иглу с раствором dsRNA и минеральным маслом к держателю иглы и закрепите её на инъекционном устройстве.
13. Отрегулировать положение агарной пластины и стеклянной капиллярной иглы на инжекторе так, чтобы стеклянная игла располагалась под углом 30-45° относительно тела ос (рисунок 3A).
14. Введите стеклянную капиллярную иглу в спинную сторону тела осы, с немного латеральной стороны к спинной средней линии. Микроинъекция раствора дсРНК внутрь организма. Введённый раствор дсРНК виден с помощью синего красителя  (рисунок 3C).
15. После инъекции поместите агарные пластины в влажный контейнер (относительная влажность 70-80%) и храните их в инкубаторе при температуре 25 °C в течение недели, пока взрослые осы не закроются. Тела повреждённых ос следует извлекать из агарной пластины, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение.
    ТОЧКА ПАУЗЫ: В шаге 4.6 куколки осы можно держать на агарной пластине несколько часов перед инъекцией. Иглы можно подготовить заранее (шаги 4.8 и 4.9); однако со временем они склонны к засорванию. Свежеприготовленные иглы обычно обеспечивают более надёжную эффективность инъекций.

Results

Асексуальные и половые штамы Asobara japonica
A. japonica широко распространён по всей Японии. На основных островах преобладают телитокозные партеногенетические штаммы, тогда как арренотокные половые штаммы встречаются на субтропических островах, включая острова Амами-Осима и Ириомоте-дзима ^8,12. В половых штаммах самцы появляются на несколько дней раньше самок, поэтому время переноса взрослых особей отличается между этими штаммами. Телитокозный партеногенез у A. japonica индуцируется инфекцией Wolbachia — эндосимбиотической бактерией 13, передающейся^{материнским} путём. Ликвидация волбахии с помощью антибиотиков приводит к образованию^{самцов 9,14}, а трансплантация волбахии в половые штаммы вызывает^{партеногенез 15}. Как бесполые, так и полые штаммы A. japonica демонстрируют высокий уровень паразитизма среди нескольких видов Drosophila. Например, они могут паразитировать на D. suzukii, экономически важном вредителе фруктов, и считаются потенциальными биологическими средствами борьбы в сельском^{хозяйстве 16}. Среди доступных штаммов мы в основном использовали штамм TK, инфицированный Wolbachia, для наших экспериментов. Штамм TK демонстрирует более высокую паразитическую активность по отношению к личинкам хозяев по сравнению с^{IR-штамом 14}, что делает его подходящим для анализа.

Успех паразитизма зависит от условий выращивания
Процент успеха паразитизма у A. japonica обычно высок, но сильно зависит от условий воспитания мух-хозяев. В условиях бедных питательных веществ период роста личинок мух продлевается, а время куколкообразования^{откладывается 17}. В таких условиях осы могут не использовать ресурсы хозяина должным образом и не синхронизировать их развитие с развитием хозяев. Чтобы изучить эту возможность, мы выращивали мух и ос в условиях нормальных дрожжей (1×) и дрожжей (0,1×). Затем мы оценили успех паразитизма и время развития (рисунки 2C, 2D). Успех паразитизма рассчитывался как соотношение появившихся взрослых ос к личинкам хозяев.

При нормальных дрожжевых условиях уровень успешности паразитизма составлял 81,7% в однояйцевым тесте на инфекцию (рисунок 2C, слева; Таблица 2). Когда содержание дрожжей снижалось до 10% (плохое состояние дрожжей), уровень успеха паразитизма снижался до 35,0% (рисунок 2C, справа; Таблица 2). Это снижение можно объяснить тем, что примерно 50% личинок хозяина умерли после заражения. Эти результаты свидетельствуют о том, что распределение ресурсов между хозяином и паразитоидом нарушается при условиях бедных питательных веществ.

Примечательно, что время эклозии ос не задерживалось в такой степени при условиях с дрожжами, бедных на дрожжи, как при нормальных дрожжевых условиях. Хотя время эклозии у мух задерживалось до 9 дней, время эклозии ос — всего на 4-5 дней. Этот результат говорит о том, что доступность питательных веществ в первую очередь влияет на развитие хозяина. Время эклозии неизменно как у мух, так и у ос при нормальных дрожжевых условиях, но не при условиях с дрожжами, что говорит о необходимости синхронизированного развития паразитоидов и хозяев от доступности питательных веществ.

Подход на основе РНК для функционального анализа генов яда
Хотя транскриптомические и протеомные анализы ядовитой железы выявляют множество кандидатов на молекулы, остаётся неясным, какие из них необходимы для успешного паразитизма. Для определения физиологической роли этих кандидатов необходимы функциональные анализы in vivo с использованием методов генного knockdown.

Недавно мы сообщили, что паразитизм A. japonica вызывает апоптоз, аутофагию и митотическую остановку в воображаемых дисках личинок D. melanogaster, что приводит к тяжёлой деградации тканей — явлению, называемому воображаемым разрушением дисков (IDD⁾¹⁰. Для выявления молекул, ответственных за IDD, мы провели РНК-скрининг кандидатов-генов, выявленных в транскриптом, протеомных и сравнительных геномных анализах. В результате были идентифицированы два гена: фактор деградации воображаемых дисков (IDDF)-1 и IDDF-2. И IDDF-1, и IDDF-2 содержат область неизвестной функции 4803 (DUF4803). Примечательно, что после нашего первоначального отчёта независимое исследование выявило несколько белков яда A. japonica (называемых ядово-индуцированной деградацией, VID), ассоциируемых с IDD, все из которых также обладают доменом DUF4803¹⁸.

На основе этих результатов мы дополнительно оптимизировали протокол РНКи для повышения воспроизводимости и эффективности. В частности, использование Nanoject III позволило точно контролировать объём и скорость инъекции, что привело к более стабильным результатам сбивания.

Для оценки эффективности оптимизированного протокола РНКи мы провели устранение IDDF-1. У взрослых ос с замкнутыми глазами уровень экспрессии IDDF-1 был значительно снижен по сравнению с контрольной группой (см. рисунок 3D). Для функциональной валидации мы провели тесты инфекций с одноразовым яйцекладением с использованием этих РНК-ос ос и личинок мух-хозяина, экспрессирующих апоптозный репортёр GC3Ai в области^19-го крыла. Сигнал GC3Ai был обнаружен в подсумке крыла после заражения осами контроля (GFP RNAi). В отличие от этого, сигнал GC3Ai был значительно снижен после заражения осами IDDF-1 РНК (рисунок 3E, 3F). Эти результаты согласуются с предыдущими данными, подтверждая, что функция IDDF-1 эффективно подавляется РНКи.

Рисунок 1. Схематический обзор процедур выращивания D. melanogaster и A. japonica. 
Поэтапные процедуры представлены в зависимости от стадий развития D. melanogaster. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Паразитизм от Asobara japonica. (A) Схема развития отношений между D. melanogaster и его паразитоидом A. japonica. Самка осы откладывает яды и одно яйцо в личинку мухи. После вылупления личинка осы развивается параллельно с личинкой-хозяином, которая впоследствии превращается в пупарии. После пупариации оса поглощает всё тело мухи и в итоге замыкается из куколки мухи. (B) Взрослые осы бесполого штамма (слева) и полового штамма (справа) A. japonica. Чешуйка, 1 мм. (C) Частота выхода мух или ос при нормальных (1×) и дрожжевых (0,1×) условиях. Анализы инфекций с одиночной откладкой яиц проводились с личинками мух-хозяина через 4 дня после откладывания яиц (dAEL). n = 267 (1×, мухи), 120 (0,1×, мухи), 85 (1×, осы) и 80 (0,1×, осы) соответственно. (D) Время эклозии мух и ос при двух питательных условиях, указанных в (C). Соотношение взрослых особей к куколкам указано. n = 250, 107, 61 и 41 соответственно. Чёрная стрелка указывает время заражения осами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Оптимизированная процедура РНКи с использованием Nanoject III. (A) Установка микроинъекционного аппарата под стереомикроскопом. Игла стеклянного капилляра располагалась под углом 30-45° относительно агаровой пластины. (B) Кончик стеклянной капиллярной иглы заточивался с помощью шлифовальной машины. (C) В тело осы с помощью стеклянной капиллярной иглы микровводили в тело осы. Передняя сторона осы на изображении обозначена буквой A. P, задняя часть. Масштабная полоса, 1 мм. (D) Уровни экспрессии IDDF-1 в осах GFP RNAi и IDDF-1 RNAi были количественно измерены методом дельта-дельта C_t . Уровни экспрессии были нормализованы до RpL32-Aj. Данные представляют среднее ± SD с отдельными точками данных (n = 5). P < 0,005 (тест t-ученика). (E и F) GC3Ai поступает сигналы в дисках крыльев неинфицированных личинок и личинок хозяина через 6 часов после заражения (HPI) после заражения осами контрольной (GFP RNAi ) или IDDF-1 РНКи. Диски крыльев очерчены белыми пунктирными линиями, основанными на окрашивании ядер DAPI (1:10000, 62247; Thermo Fisher Scientific). Было количественно измерено отношение площади GC3Ai-положительной к площади подсумка крыла. P < 0,005 (односторонний ANOVA, затем тест множественных сравнений Тьюки). n = 11 биологических репликаций на группу. Шкала 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Компоненты	Сумма
Вода	1 L
Агар	5,5 г
Дрожжи	40 г
Кукурузная мука	90 г
Глюкоза	100 г
Пропионовая кислота	3 мл
10% бутил p-гидроксибензоат в 70% EtOH	3,5 мл

Таблица 1: Компоненты стандартной среды кукурузной муки, дрожжей-агар (корм для мух).

Тип пищи	Состояние	# Общее количество индивидуумов	# замкнутых или умерших лиц				Частота появления мух или ос (%)
			Fly	Wasp	Куколка летальна	Личинка смертельна
1×	Неинфицированные	267	248	0	2	17	92.88389513
	Инфицированная A. japonica	120	0	98	9	13	81.66666667
0,1×	Неинфицированные	85	38	0	23	24	44.70588235
	Инфицированная A. japonica	80	0	28	13	39	35

Таблица 2: Количество особей и частота появления при нормальных (1x) и дрожжевых (0,1x) условиях.

Название буквы	Последовательность (5'>3')	Назначение
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTCTCTCTACT	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGCGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	Клонирование CDS
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	CDS-клонирование, шаблон dsRNA
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	GAGGAGAGTGGAAGCCAGTTGGTAG	Шаблон dsRNA
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT CAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	Шаблон dsRNA
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAG GAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	Шаблон dsRNA
※ Эти праймеры и шаблоны dsRNA описаны в Kamiyama и др. 2022.
※ gene007424 означает IDDF-1.

Таблица 3: Последовательности праймеров и шаблонов dsRNA, использованных в этом исследовании.

Discussion

В этом исследовании мы создали универсальную экспериментальную платформу для изучения взаимодействий паразитоидов и хозяина на молекулярном уровне. Оптимизируя условия выращивания, анализ инфекции с одной яйцекладкой и протокол РНКи, мы обеспечиваем надёжную систему для функциональных исследований факторов, производящихся от паразитоидов. Эта платформа будет способствовать будущим исследованиям, направленным на выявление механизмов, с помощью которых паразитоидные осы манипулируют развитием хозяина, а также может способствовать разработке биологических стратегий борьбы с вредителями.

Инфицированный Wolbachia TK-штамм A. japonica представляет собой высоковоспроизводимую экспериментальную систему для анализа паразитизма. Во многих исследованиях с паразитоидными хозяевами результаты экспериментов часто варьируют: выживаемость хозяина и успех паразитоидов сильно зависят от условий окружающей среды и физиологии. В отличие от этого, штамм TK демонстрирует стабильно высокий уровень паразитизма, что фактически создаёт состояние «паразитоидно-доминирующее», при котором исход заражения в основном одинак. Кроме того, как партеногенетический штамм, он снижает экспериментальную вариативность среди особей благодаря своему однородному генетическому фону. Такая воспроизводимость позволяет надёжно отслеживать процесс паразитизма и способствует количественному анализу реакций хозяина и факторов, возникших от паразитоидов.

Кроме того, размножение телитокозу значительно облегчает геномный анализ, обеспечивая получение высокогоменной геномной ДНК, что критически важно для высококачественной сборки^{генома 9}. Хотя такие партеногенетические штаммы доступны не во всех паразитоидных видах, наши результаты подчёркивают потенциал телитоки, индуцированного Wolbachia, как стратегии улучшения геномных ресурсов. Установление линий, инфицированных Wolbachia, у других паразитоидных видов может быть мощным подходом для расширения геномных ресурсов и ускорения сравнительных молекулярных исследований среди паразитоидов.

Результаты паразитизма сильно зависят от питательных условий хозяина, что указывает на то, что условия выращивания являются критически решающими фактором успеха паразитоидов. Поскольку успешный паразитизм зависит от точной временной координации с развитием хозяина и ос, неконтролируемые условия питания могут нарушить этот процесс и снизить воспроизводимость. Поэтому тщательная стандартизация условий воспитания хозяина необходима для создания надёжной экспериментальной системы изучения взаимодействий паразитоидов и хозяина. Кроме того, флаконы с мухами следует содержать отдельно от флаконов от ос, так как наличие ос снижает поведение откладки яиц^{мух на 20,21}.

Для количественной оценки взаимодействий паразитоидных и хозяиновых органов мы разработали анализ инфекции с одиночным откладыванием яичек, при котором в каждом хозяине откладывается по одной яйцеклетке. Этот анализ отличается от обычных массовых анализов инфекций, которые часто включают множественные процессы откладки яиц, приводящие к чрезмерному повреждению и смертности хозяина. Для обеспечения эффективного откладки яиц в ограниченное временное окно (~15 мин) недавно закрытых взрослых ос предварительно обусловили раствором глюкозы и витамина C, что улучшило эффективность откладки яиц и общую воспроизводимость.

Кроме того, мы оптимизировали протокол РНК-и для анализа функции генов у паразитоидных ос. Используя систему микроинъекции, мы добились точного контроля объёма впрыска и улучшили стабильность эффективности сбивания. Функциональная валидация с использованием IDDF-1 подтвердила, что этот метод эффективно подавляет экспрессию генов и приводит к воспроизводимым фенотипическим результатам. Учитывая, что транскриптомические и протеомные исследования продолжают выявлять большое количество кандидатных факторов яда, наличие функциональной скрининговой платформы будет крайне важно для определения их биологической роли.

Ограничением этого протокола РНКи является его непригодность для анализа генов, функционирующих на ранних стадиях развития ос, поскольку технически сложно вводить дсРНК в яйца ос, находящихся внутри тел хозяина. Чтобы преодолеть это, создание системы ex vivo выращивания может предложить полезный^{подход 22}. Альтернативно, подходы к нокаутированию генов с использованием прямого родительского (DIPA)-CRISPR могут предоставлять дополнительную стратегию, при которой реагенты вводятся взрослым самкам для получения отредактированного геномом^{потомства 23}. Действительно, этот подход успешно привёл к созданию эктопаразитоида куколки Nasonia vitripennis с помощью инъекции реагентов взрослым самкам или особям на поздней^{стадии 24} куколки. Вместе с нашим методом устранения генов на основе РНКi, эти подходы позволят более комплексному анализу функций генов, участвующих в процессе паразитизма.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 мл пробирка	Greiner Bio-One	210261	Исследование инфекции
Шприц 1 мл	TERUMO	SS-01T	Введение дсРНК
Агар	Daisin, Ltd.	P-700	Воспитание
Петри Asnol чаша φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Исследование инфекции
Петри Asnol чаша φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	Введение дсРНК
Синий краситель (Эриоглауцин, динатриевая соль)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	Введение дсРНК
Бутил-р-гидроксибензоат	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Воспитание
Регулятор давления СО2	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Исследование инфекции
Конфокальный лазерно-сканирующий микроскоп	Zeiss	LSM700	Анализ изображений
Кукурузная мука	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Воспитание
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Окрашивание ядер, 1:10000
Деионизированная вода	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Исследование инфекции
Тянульщик стеклянных микропипеток с двумя стадиями	Narishige	PC-10	Введение дсРНК
Fiji	НД	https://fiji.sc	Анализ изображений
Фильтровальная бумага	Advantec	ITEM 526	Воспитание
Склянка для корма мух	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Воспитание
Пробка для склянки с кормом для мух	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Воспитание
Пинцет	Dumont Biologie	11252-20	Диссекция
Морозильник, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Хранение образцов
Морозильник, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Хранение образцов
Стеклянные предметные стёкла	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Исследование инфекции
Глюкоза	Showa Sangyo Co., Ltd.	Недоступно	Воспитание
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	Синтез дсРНК
Инкубатор	Panasonic	MIR-254-PJ	Воспитание
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	Синтез дсРНК
Микропипеточный измельчитель	Narishige	EG-401	Введение дсРНК
Минеральное масло	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	Введение дсРНК
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	Введение дсРНК
Стеклянные капилляры Nanoject	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Введение дсРНК
pBluescript KS (+) плазмида	Недоступно	Недоступно	Синтез дсРНК
pBluescript SK (-) плазмида	Недоступно	Недоступно	Синтез дсРНК
PrimeScript обратная транскриптаза	Takara	2680A	Синтез дсРНК
Пропионовая кислота	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Воспитание
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Исследование инфекции, введение дсРНК.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix с удалением гДНК	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
Реагент RNAiso Plus	Takara	9108	qRT-PCR
Маленькая склянка (пробирка 12 мл)	Sarstedt	REF 58.487	Исследование инфекции
Пробка для маленькой склянки	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Исследование инфекции
Ложка	As One Corporation	6-522-02	Воспитание
Квадратная чаша Петри	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	Введение дсРНК
Стереомикроскоп	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Исследование инфекции
Стереомикроскоп	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	Введение дсРНК
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	Синтез дсРНК
Термоциклер Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Термоциклер GeneAtlas	Astel	G02	Синтез дсРНК, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Недоступно	qRT-PCR
Витамин С, L-аскорбиновая кислота	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Воспитание
Сок виноградный Welch's grape 100	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Исследование инфекции
Дрожжи	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Воспитание