Сохранение сложности тканей In Vivo в модели обонятельной нервной системы мыши с использованием анализа всего органа для изучения регенерации нейронов

Краткое содержание

В данном протоколе описывается полный рабочий процесс сохранения анатомической сложности обонятельной нервной системы мыши. Здесь подробно представлены все этапы, включая диссекцию, подготовку тканей и визуализацию. Этот протокол может быть использован для изучения обонятельной системы в нормальных или патологических условиях, включая процессы ее естественного восстановления.

Аннотация

В эпоху трехмерной (3D) визуализации стало очевидно, что стандартный иммуногистохимический анализ имеет серьезные ограничения при изучении патологий и сложной анатомии человека. При анализе только узких срезов крупные структуры и важные аспекты архитектуры тканей могут утратить критические контекстуальные детали, что приводит к неполным или ошибочным интерпретациям. Хотя двухмерные (2D) срезы помогли сформировать базовое понимание гистоархитектоники, их недостаточно для отображения истинной трехмерной структуры биологических тканей.

В растущем количестве исследований различных анатомических областей сейчас применяются методы изоляции целых анатомических единиц — препараты flat mount (плоский препарат), whole-mount (цельный препарат) или en face (лицом к наблюдателю) — в сочетании с флуоресцентной микроскопией высокого разрешения. Такие подходы обеспечивают более комплексную визуализацию и интерпретацию структурной организации. Это особенно значимо для обонятельной нервной системы, где определение сложных клеточных механизмов, лежащих в основе ее удивительной регенеративной способности, требует контекста всей толщины ткани. При использовании тонких срезов существует риск упустить ключевые патофизиологические особенности, которые остаются недостаточно изученными.

Учитывая эти ограничения и недостаток знаний о клеточных взаимодействиях, определяющих регенерацию обонятельного эпителия, было необходимо разработать усовершенствованный метод окрашивания целых образцов, способный сохранить сложность полнослойной ткани. Слизистые оболочки обонятельного эпителия выделяли в виде полнослойных образцов с применением оптимизированного протокола проникновения антител. Визуализация с высоким разрешением (EVIDENT SpinSR) и 3D-реконструкция позволили точно отобразить клеточные взаимодействия in vivo.

Введение

Обонятельная нервная система (ОНС) представляет собой уникальную и хорошо изученную модель для исследования механизмов регенерации нейронов, поскольку она сохраняет исключительную способность к обновлению нейронов на протяжении всей жизни¹. Однако потенциал клинического применения этой нейрорепаративной способности остается ограниченным из-за значительных пробелов в понимании поведения клеток обонятельной системы^2,3,4. Клеточные ответы и анатомическая организация ОНС, включая первичные обонятельные нейроны, обонятельные оболочечные клетки (OECs) и периневральные фибробласты, были описаны в ряде исследований на животных с использованием ультратонкого (<2 µm) сечения тканей в сочетании с моделями тяжелых физических повреждений ОНС грызунов^1,2. Животные в этих исследованиях обычно подвергались эвтаназии через 10 дней после травмы, что давало возможность наблюдать лишь один конкретный момент обширного и более сложного ремоделирования такой ткани при нейронном повреждении². В этих работах сообщалось, что после гибели аксонов OECs и фибробласты сохраняются в виде непрерывных каналов после травмы.

Несмотря на информативность, из-за многих вышеописанных ограничений использованный подход обеспечил лишь концептуальный обзор обонятельного нерва (ONS) с низким разрешением и на поверхностном уровне, что в конечном итоге сделало невозможной комплексную оценку реальной клеточной организации внутри интактного ONS³. В результате могли быть упущены критически важные пространственные взаимосвязи.

Сохранение трехмерной структуры ткани крайне важно для точного анатомического и клеточного анализа и было успешно применено для изучения множества органов и патологий^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Методы анализа целых образцов (whole-mount) использовались для картирования нейронной организации слизистой оболочки обонятельного эпителия^13,14, однако визуализация клеточных взаимодействий в структуре обонятельного нейроэпителия (ONS) полной толщины, включая сохранную собственную пластинку (lamina propria), до сих пор не проводилась.

В данном исследовании мы разрабатываем рабочий процесс с использованием мышиной модели, включающий обработку тканей целым препаратом, иммуноокрашивание, визуализацию с высоким разрешением и трехмерную реконструкцию, что позволяет детально анализировать архитектуру ONS. Данный протокол был разработан, чтобы восполнить пробелы в существующих опубликованных методах; он обеспечивает сохранение и консервацию слизистой оболочки обонятельного эпителия во всю толщу, включая собственную пластинку (lamina propria), что позволяет изучать межклеточные взаимодействия. Примечательно, что эта усовершенствованная методология сбора и обработки тканей может быть применена и комбинирована с различными моделями обонятельной системы.

Протокол

Все эксперименты с использованием животных и трансгенно модифицированных клеток проводились с одобрения Комитета по биобезопасности Университета Гриффита (NLRD/003/2020_var3) и Комитета по этике работы с животными Университета Гриффита (MHIQ/04/23/AEC) в соответствии с руководящими принципами регулятора Офиса по генным технологиям Австралийского Содружества (OGTR).

ПРИМЕЧАНИЕ: В исследовании было использовано в общей сложности 15 взрослых лабораторных мышей (8–9 недель) обоих полов. В частности, применялись трансгенные мыши S100β-DsRed, у которых все OECs экспрессируют ярко-красный белок DsRed под контролем промотора S100β. S100β входит в более широкое семейство кальций-связывающих белков и обычно экспрессируется в глиальных клетках центральной нервной системы, таких как OECs. Эта модель была оптимальной для целей данных экспериментов, так как позволяла легко локализовать целевые популяции клеток с помощью сигналов эндогенной флуоресценции. Трансгенные мыши S100β-DsRed были созданы ранее, и было показано, что использование этих трансгенных мышей обеспечивает более эффективное обнаружение OECs по сравнению с иммуногистохимическим анализом фиксированных тканей^15,16,17,18.

1. Сбор голов и фиксация тканей

1. Эвтаназируйте животных путем вдыхания CO₂ с постепенным повышением концентрации в установленные экспериментальные временные точки.
2. Убедитесь, что смерть подтверждена отсутствием корнеального рефлекса и рефлекса отдергивания лапы, после чего выполните цервикальный вывих или следуйте утвержденному стандартному операционному регламенту (SOP).
3. С помощью ножниц удалите всю голову вместе с челюстями.
4. Снимите кожу с черепа и удалите хрящ на кончике носа, чтобы открыть носовую полость и обеспечить эффективное проникновение фиксирующего агента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что данный этап отсечения наиболее передней части носового хряща животного имеет решающее значение для правильной фиксации тканей внутри носовой полости.
5. Быстро промойте головы в 1× PBS для удаления излишков крови.
6. Зафиксируйте ткани путем погружения в 4% параформальдегид на ночь (12–18 ч), но не менее чем на 6 ч (достаточное время для фиксации интересующих тканей) при 4 °C на ротаторе.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Параформальдегид является опасным химическим веществом, которое выделяет пары формальдегида. Он токсичен при вдыхании, контакте с кожей и проглатывании; вызывает раздражение глаз, кожи и дыхательных путей, а также является предполагаемым канцерогеном. Работайте только в вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки, лабораторный халат и средства защиты глаз. Безопасная утилизация опасных химикатов и биологических отходов, образующихся в ходе протокола, должна осуществляться в соответствии с институциональными и местными правилами.
   ​ПРИМЕЧАНИЕ: В ходе оптимизации было установлено, что 6 ч достаточно для фиксации интересующих тканей; однако выдержка более 12 ч может привести к гиперфиксации и деградации структур слизистой оболочки.
7. Извлеките головы из фиксирующего агента и промывайте их в течение 3 ч в 1× PBS при комнатной температуре (20–25 °C) на ротаторе.
8. Храните головы в свежем PBS при 4 °C и проведите сбор цельных образцов тканей слизистой оболочки в течение 48 ч.

2. Сбор тканей для анализа всего образца

1. Выполните изоляцию ткани под микроскопом.
2. Разрежьте головы пополам с помощью скальпеля, следуя по срединной сагиттальной линии.
3. Обнажите внутреннюю часть полости носа (Рисунок 1). Определите анатомические области и соберите ткань слизистой оболочки, выстилающую весь анатомический отдел (Рисунок 1B).
4. С помощью костного резака осторожно разломите и удалите перегородочную кость, перекрывающую часть слизистой полости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 2АЭтот этап имеет решающее значение для обнажения вогнутой полости под костью, где пучки аксонов проходят через дорсальную стенку (Рисунок 1B).
5. После обнажения этой области с помощью изогнутого пинцета осторожно отделите и извлеките ткань из вогнутой дорсальной стенки. Приподнимите ткань над подлежащей костью и аккуратно снимите оставшуюся обонятельную слизистую оболочку, чтобы получить цельный препарат.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе требовалась крайняя осторожность, чтобы избежать разрыва ткани.
6. Соберите интересующую ткань из обеих ноздрей: слизистая оболочка покрывает перегородку, дорсальные левую и правую стенки, а также решетчатую пластинку полости носа (Рисунок 1A, B)Соберите ткани из обеих ноздрей, включая перегородку, дорсальные стенки и решетчатую пластинку, чтобы изолировать анатомическую область, содержащую первичные обонятельные структуры (Рисунок 2C).
7. Промойте собранные ткани в 1× PBS и удалите любые ненужные фрагменты тканей, включая обломки костей. Храните ткани при температуре 4 °C в 1× PBS для последующего иммуногистохимического анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань подлежит длительному хранению, рекомендуется хранить ее в растворе 1× PBS с добавлением 0,001% (масс./об.) азида натрия при температуре 4 °C.

3. Оптимизированный протокол окрашивания

ПРИМЕЧАНИЕ: Общепринятые протоколы окрашивания обычно оптимизированы для срезов малой и средней толщины (например, до 50 µm). Следовательно, данный протокол потребовал адаптации для значительно более толстых тканей.
​Было отмечено, что критически важным этапом является поддержание ткани в плавающем состоянии внутри пробирок Eppendorf на протяжении всего процесса окрашивания с размещением пробирок на ротаторе для обеспечения проникновения реагентов. Таким образом, этапы окрашивания проводились не с тканью на предметном стекле. Ткань сначала окрашивали в плавающем состоянии, а затем монтировали на предметные стекла. Такие меры позволили избежать складывания ткани и обеспечили проникновение реагентов и антител во всю область образца.

1. Извлеките ткани из места хранения и поместите их в пробирку Eppendorf с блокирующим раствором (выбор раствора зависит от конкретного метода окрашивания).
   ​ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий раствор: 3% BSA, 0,3% Triton X-100 в PBS. Другой важным параметром было время воздействия каждого реагента и коктейля антител на ткань.
2. Выдержите ткань в блокирующем растворе в течение 3 ч при комнатной температуре на ротаторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что нет необходимости увеличивать концентрацию выбранных антител и реагентов для окрашивания (Таблица 1), если увеличить время воздействия на них по сравнению со стандартным методом иммуногистохимического окрашивания тонких срезов. Это также позволило минимизировать расход дорогостоящих антител. Инкубацию проводят в пробирке Eppendorf объемом 1,5 mL с обрезанным зажимом крышки, чтобы пробирка могла вращаться на ротаторе. Объем реагента составлял 500 µL.
3. Инкубируйте в течение 72 ч при 4°C с первичными антителами на ротаторе.
4. Промойте ткань дважды (по 1,5 ч каждая промывка), используя PBS 1× при комнатной температуре на ротаторе.
5. Инкубируйте ткань с вторичными антителами (обернув алюминиевой фольгой) и красителем для ядер минимум 4 ч при комнатной температуре на ротаторе, после чего перенесите в холодильник на ночь (12–18 ч) при 4 °C на ротаторе.
6. Промойте ткань дважды (по 1,5 ч каждый раз), используя PBS 1× при комнатной температуре на ротаторе.

4. Подготовка предметных стекол

1. Осторожно извлеките ткань из пробирки Eppendorf
2. Под микроскопом поместите ткань на предметное стекло, убедившись в отсутствии складок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентацию ткани можно определить под микроскопом даже без флуоресценции. Слизистую оболочку следует расположить так, чтобы эпителий прилегал к предметному стеклу, а собственная пластинка (lamina propria) была обращена к покровному стеклу. Собственную пластинку можно идентифицировать по наличию толстых пучков нервов, которые видны без окрашивания. Такое расположение (собственная пластинка со стороны покровного стекла, эпителий — на предметном стекле) облегчит процесс окрашивания и визуализации.
3. Накройте образцы покровными стеклами, используя флуоресцентную среду для заключения препаратов, и загерметизируйте стекла.
4. После overnight-высушивания (12–18 h) в темноте при комнатной температуре стекла можно хранить при 4 °C

5. Сбор изображений и постобработка

1. Получение иммунофлуоресцентных изображений с низким увеличением
   1. Выполните автоматическую сшивку при получении изображений, используя линейное альфа-смешивание.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кадров z-стека следует подобрать в соответствии с толщиной образца, чтобы обеспечить полный охват объема ткани.
   2. Захватывайте соседние поля зрения с перекрытием 15%. Получайте мозаичные изображения, используя шаблон сканирования «меандр».
   3. Отрегулируйте общее количество оптических срезов в зависимости от толщины ткани.
   4. Установите калибровку изображения 215.594 nm/pixel по осям X и Y. Получайте изображения в виде z-стеков с шагом по оси z 0.8 µm.
   5. Поместите смонтированную целую ткань на предметный столик конфокального микроскопа. Получите обзорные изображения, используя объектив 30x (NA 1.04).
2. Получение иммунофлуоресцентных изображений с высоким увеличением.
   1. Получите детальные изображения, используя объектив 60× (NA 1.5). Установите калибровку изображения 107.923 nm/pixel по осям X и Y. Получите изображения z-стека с шагом по оси z 0.41 µm.
   2. Отрегулируйте общее количество оптических срезов в зависимости от толщины ткани. Захватывайте изображения из одного поля зрения.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Сшивка изображений при использовании объектива 60× не требуется, так как каждый набор данных представляет собой одно поле зрения.
3. Получение гистологических референсных изображений
   1. Снимите срезы головы мыши в срединной сагиттальной плоскости, окрашенные гематоксилином и эозином (HE), используя сканирующий микроскоп при светлом поле.
   2. Получите изображения, используя объектив 40× (NA 0.95) и увеличение камеры 0.63x, что дает эффективное увеличение 25.2×.
   3. Подтвердите калибровку пикселей 136.905 nm/pixel по осям X и Y. Получите изображение в виде одной фокальной плоскости.
   4. Выполните автоматическую сшивку мозаичных изображений, используя шаблон сканирования «меандр» и линейное альфа-смешивание.
4. Получение обзорных иммунофлуоресцентных референсных изображений
   1. Получите дополнительные обзорные иммунофлуоресцентные изображения, используя объектив 10x.
   2. Зафиксируйте образец в виде одного z-среза, используя 0% перекрытия плиток при получении изображения.
   3. Установите калибровку изображения 647.249 nm/pixel по осям X и Y. Сформируйте обзорное изображение, охватывающее всю интересующую анатомическую область.
5. Обработка изображений и создание финальных фигур.
   1. Экспортируйте полученные наборы изображений в программное обеспечение для анализа изображений. Создайте проекции максимальной интенсивности (MIP) из наборов данных z-стеков.
   2. Выберите области интереса (ROI) для последующего анализа и подготовки фигур.
   3. Объедините обзорные иммунофлуоресцентные изображения с соответствующими HE-изображениями для создания анатомических референсных фигур. Затем проверьте выравнивание и анатомическое соответствие между флуоресцентными и гистологическими наборами данных перед подготовкой фигур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вся сшивка изображений должна выполняться автоматически во время захвата с использованием заданных настроек микроскопа и не должна требовать дополнительной постобработки. В нашем случае 3D-визуализация была создана с помощью программного обеспечения Imaris: для построения 3D-реконструкции использовался плагин визуализации поверхности на основе пороговой интенсивности для каждого полученного канала. В итоге финальные изображения были скомпонованы в Adobe Illustrator.

Результаты

Представленный здесь метод обработки целых образцов позволил изолировать и сохранить слизистую оболочку обонятельного эпителия в ее целостности. В данном исследовании наше внимание было сосредоточено на изучении клеточных и анатомических изменений как на макроуровне (полный анатомический обзор), так и на микроуровне (клеточный уровень).

Метод анализа целых препаратов позволяет собирать как эпителиальный слой, так и слой собственной пластинки слизистой оболочки, сохраняя пространственные взаимосвязи между пучками аксонов, обволакивающими клетками обонятельного нерва (OECs) и фибробластами — клетками, представляющими для нас интерес. Данный подход позволил получить обширные непрерывные наборы данных, охватывающие всю толщину и большую площадь поверхности слизистой ткани (Рисунок 3), что дало возможность детально изучить сложную клеточную структуру и взаимодействия (Рисунок 3), а также проследить, как они изменяются в интактных условиях (n = 3) (Рисунок 3A, B) и при повреждении (n = 12) (Рисунок 3C, D).

Объединив эту оптимизированную процедуру подготовки и окрашивания тканей с конфокальной микроскопией высокого разрешения, мы смогли получить изображения более обширных участков слизистой оболочки с высокой и точной детализацией на клеточном уровне по всей глубине ткани. Сбор Z-стеков в нескольких соседних областях позволил реконструировать расширенные анатомические домены без потери разрешения или целостности сигнала (Рисунок 4A–F). Благодаря высокой детализации на клеточном уровне мы также смогли использовать полученные Z-стеки всей толщи ткани (Рисунок 4G) для создания рендерированных изображений (Рисунок 4H), что позволило глубже изучить микроархитектонику ткани.

Надежное определение ориентации ткани перед монтированием и визуализацией последовательно достигалось без необходимости в флуоресцентном мечении. Сторона собственной пластинки слизистой оболочки (lamina propria) легко идентифицировалась при светлопольной микроскопии по наличию толстых нервных пучков, которые четко отличались от эпителиального слоя. Стандартизация ориентации образцов путем размещения собственной пластинки слизистой оболочки рядом с покровным стеклом, а эпителиальной поверхности — прилегающей к предметному стеклу, улучшила согласованность изображений между образцами и облегчила последующую трехмерную реконструкцию. Степень проникновения антител можно определить путем анализа соответствующего сигнала, наблюдаемого по всей толщине ткани. Обычно это проявляется либо отсутствием сигнала, либо его постепенным ослаблением по мере продвижения вглубь ткани.

Трехмерный рендеринг, выполненный в программе Imaris, позволил четко визуализировать сложные клеточные сети и организацию аксонов в интактной слизистой оболочке. Рендеринг на основе поверхности, реализованный путем применения пороговых значений интенсивности для каждого канала, позволил создать точные 3D-представления архитектуры ткани с сохранением мелких структурных деталей.

Для окрашивания и визуализации ожидаемыми результатами являются четкая визуализация сигнала целевого окрашивания без какой-либо аномальной потери или ухудшения сигнала по всей толщине тканей. Невозможность визуализировать известный окрашенный объект при микроскопии следует считать неудачным результатом.

Рисунок 1. Изображение анатомической области с наложением препарата слизистой оболочки, полученного методом тотального окрашивания. (A–C). Сагиттальный вид внутренней поверхности левой ноздри мыши (A) (окрашивание гематоксилином и эозином, HE) с наложением изображения тотального окрашивания слизистой оболочки той же области (для анатомической ориентации) (B), на котором показаны ориентация и положение пучков аксонов (зеленый цвет) и ядра клеток (синий цвет). Данный метод позволил сохранить всю анатомическую структуру: можно четко различить пучки аксонов основного обонятельного нерва (ON) и добавочных (вомероназальных нервов, VNN), а также проследить их путь от перегородки к обонятельной луковице (OB) через решетчатую пластинку (B, C). Ткань на представленных изображениях была окрашена Hoechst для ядер (синий цвет) и β-III-Tubulin для пучков аксонов (зеленый цвет). Репрезентативные изображения из n = 15 независимых препаратов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Макро- и схематический виды обонятельной системы. (A) С помощью костного резака, следуя красной пунктирной линии, удаляется перегородка носа (желтая область). (B) После обнажения лежащей под ней вогнутой полости ноздри (коричневый цвет) можно собрать всю слизистую ткань, простирающуюся от этой области до респираторной и обонятельной слизистой. (C) Графическое представление, иллюстрирующее непрерывность этих структур, простирающихся от обонятельного эпителия до обонятельной луковицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Расширенный вид анатомической области, полученный с помощью протокола сбора и окрашивания целого образца. (A–D). Представлены репрезентативные изображения здоровой и поврежденной слизистой оболочки. Сверху вниз: неповрежденная слизистая здоровой ткани (n = 3) и поврежденная слизистая (n = 12). В здоровой ткани (A) OEC с их удлиненной биполярной морфологией (A, слева) окружают пучки аксонов (A, центр), а фибробласты образуют внешний слой этих туннелеподобных структур (A, справа, белая стрелка). Три выбранных ROI отражают эти детали (B). В поврежденной слизистой оболочке OEC демонстрируют как биполярную, так и округлую морфологию (C, D, слева, белые стрелки). Пучки аксонов выглядят менее однородными и плотными (C, D, центр, белые стрелки). Фибробласты распределены повсеместно по всей области (C, D, справа, белые стрелки). Масштабная линейка = 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. Трехмерная флуоресцентная визуализация целых препаратов слизистой оболочки. (A–H). Изображения клеток при малом увеличении (A–F) и изображение при большом увеличении (G) были получены из стеков изображений нескольких последовательных областей с использованием микроскопа SpinSR. Обоняющие клетки (OECs) показаны красным цветом, фибробласты — пурпурным, аксоны — зеленым, а ядра — синим. Стрелки указывают на различные морфологии OEC (A) и внешний слой фибробластов вокруг пучков аксонов (B и C). На рисунках D–F стрелками отмечено сходство здоровых структур фибробластов. Эти изображения позволили выявить пространственную организацию клеточных компонентов, которая затем была визуализирована с помощью программного обеспечения Imaris (H). Масштабная линейка = 50 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Реагент	Мишень	Разведение	Условия инкубации	Обоснование
Первичные антитела
β-III-Tubulin (Rabbit)	Аксоны	1:300	В течение 72 h при 4 °C на ротаторе	для обеспечения проникновения на всю толщину образца
PDGFR-β (Rat)	Фибробласты	1:100
Вторичные антитела
Alexa 488	Первичные антитела кролика	1:250	Завернув в алюминиевую фольгу, минимум 4 h при комнатной температуре на ротаторе, затем в течение ночи при 4 °C на ротаторе.	Алюминиевая фольга предотвращает фотообесцвечивание; продолжительность, температура и перемешивание на ротаторе обеспечивают хорошее проникновение
Alexa 647	Первичные антитела крысы	1:500
Ядра
Hoechst	Ядра клеток	1:2500

Таблица 1: Список антител с разведениями, оптимизированными для данного протокола.В этой таблице перечислены реагенты для окрашивания с указанием их мишеней, разведений и обоснованием условий инкубации.

Обсуждение

За последние несколько десятилетий постепенно началась эра трехмерных исследований, сопровождаемая развитием многих инновационных подходов в научной области. Например, методы трехмерной реконструкции, ставшие возможными благодаря разработке сложных методов визуализации целых препаратов в сочетании с флуоресцентными микроскопами высокого разрешения, способствовали лучшему пониманию гистоархитектоники нескольких полнослойных тканей. Эти подходы к трехмерному рендерингу использовались для определения ряда структур человеческого тела, таких как сосуды, железы и распространенные опухоли^4,5,6,7,8,9. Более того, были собраны данные о различиях между патологическими и нормальными структурами, например, в полноценных образцах мозга мыши^10,11,12. Данный подход был определен как решающий шаг на пути к лучшему пониманию различных биологических систем, способствующий более глубокому осмыслению клеточных сетей, их структурной и функциональной пространственной организации, а также их потенциального вклада в развитие патологий у человека.

Недостатком различных комбинаций трехмерной реконструкции и визуализации тканей является то, что большинство подходов включают этапы просветления тканей. Хотя этот метод полезен для многих тканей, он подходит не для всех типов тканей^8,9,19. Фактически, процедуры просветления включают несколько этапов промывки, которые потенциально могут повредить целевые эпитопы и повлиять на эндогенные сигналы²⁰.

Описанные выше подходы использовались для определения многих важных клеточных структур в различных системах. Однако в обонятельной системе и интересующих ее структурах минимально представлены костные компоненты, с помощью которых их можно было бы легко изолировать; поэтому в последние годы испытывались методы анализа целых образцов без этапов просветления^13,14.

В ходе этих исследований была признана важность более точного определения организации нейронных структур в обонятельной системе. Соответственно, их основной целью было создание четкой топографической карты распределения обонятельных сенсорных нейронов на основе экспрессии различных маркеров¹⁴, а также выявление новых особенностей их специфических ресничек¹³.

Разработанный и представленный здесь метод цельного монтирования позволяет собирать и сохранять слизистую ткань в ее целостности, открывая возможность получить важнейшие сведения об анатомическом и физиологическом строении этой среды, с особым вниманием, в нашем случае, к взаимосвязи между OECs, фибробластами и пучками аксонов. Сочетание этого усовершенствованного метода изоляции и окрашивания с конфокальной визуализацией высокого разрешения позволило получить масштабные изображения, отражающие структуру всей целевой области и находящихся в ней клеток. В частности, наш усовершенствованный метод дает два отчетливых преимущества: извлекается и обрабатывается вся слизистая оболочка, включая архитектуру собственного слоя (lamina propria)¹³, а более щадящий метод подготовки ткани помогает сохранить макроскопическую анатомию, а также межклеточные взаимодействия (например, между обонятельными оболочечными клетками, аксонами и фибробластами) по сравнению с другими протоколами плоского монтирования¹⁴. Именно по этой причине данный протокол не включает валидацию путем окрашивания тонких срезов.

Как упоминалось выше, методы окрашивания целого препарата обычно требуют длительной подготовки тканей и использования специфических дорогостоящих реагентов. Данный метод был разработан с упором на минимальную обработку тканей, чтобы сократить временные затраты и снизить риск повреждения важных клеточных структур. Таким образом, оптимизированный метод представляет собой быстрый процесс, который можно реализовать с помощью реагентов, обычно применяемых для иммуногистохимического анализа тонких срезов, что является эффективной альтернативой подходам, требующим более длительной обработки и не подходящим для структур без костного остова, таких как слизистая ткань.

Сбор данных и последующая обработка изображений могут быть выполнены на любой платформе конфокальной микроскопии, способной получать z-стеки высокого разрешения из толстых образцов тканей, с достаточным проникновением лазера для визуализации интересующих слизистых оболочек (подробную информацию о настройках сбора и обработки изображений см. в разделе «Методы»).

Мы полагаем, что при соответствующих модификациях данный протокол может быть адаптирован и применен к другим распространенным моделям грызунов. При внесении некоторых тканеспецифических изменений этот метод может быть использован в различных контекстах, включая изучение слизистых и подслизистых тканей дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ); исследование организации тканей и мультисистемных взаимодействий в нервной системе; анализ воспалительных процессов и ассоциированных со слизистыми оболочками лимфоидных тканей (MALT), а также изучение различных мультисистемных осей, таких как ось «кишечник-мозг».

Основное преимущество данного протокола заключается в методологических усовершенствованиях, которые позволяют получать высококачественные трехмерные изображения, сохраняя целостность ткани и обеспечивая при этом относительно высокую скорость выполнения по сравнению с другими методами полноцелостного окрашивания, ранее применявшимися в данной области.

Успешная реализация данного подхода в значительной степени зависела от глубокого понимания анатомии исследуемой ткани. В частности, в нашем случае знание ожидаемой локализации пучков аксонов было необходимо для минимизации инвазивности процедуры забора материала после обнажения внутренней части черепа. Эти анатомические знания имели решающее значение для быстрой локализации интересующего региона и ткани, а также для сохранения общей структуры слизистой оболочки, что подчеркивает внутреннюю связь между успешной обработкой ткани и продуманной стратегией её забора, а не только этапами последующей обработки.

Как упоминалось в разделе «Методы» в нескольких примечаниях, для разработки и оптимизации данного метода критически важными были многочисленные технические корректировки. Свободное плавание ткани в пробирках Eppendorf на протяжении всего процесса окрашивания в сочетании с постоянным вращением во время инкубации с реагентами и антителами стало ключевым отличием от более статических протоколов окрашивания целых препаратов и тонких срезов. Данное усовершенствование предотвратило складывание ткани, обеспечив при этом гомогенное проникновение реагентов по всему образцу, что позволило повысить однородность окрашивания без необходимости проведения лишних этапов просветления. Кроме того, важным этапом оказалась тщательная оптимизация продолжительности инкубации для каждого реагента и коктейля антител. Последний этап может потребовать дополнительной корректировки в зависимости от выбранного типа антител.

В совокупности эти специфические факторы позволили повысить воспроизводимость, сократив при этом общее время обработки и интенсивность воздействия на образцы.

Еще одним важным методологическим этапом была возможность надежно определять ориентацию ткани перед закреплением и визуализацией без необходимости использования флуоресцентного маркирования. Сторону собственного слоя (lamina propria) слизистой ткани можно было легко идентифицировать при светлопольной микроскопии по наличию толстых нервных пучков, которые четко отличались от окружающей эпителиальной ткани. Было установлено, что стандартизация ориентации образца путем размещения собственного слоя стороной к покровному стеклу, а эпителиального слоя — на предметном стекле, способствует повышению качества получения изображений. Это простое, но эффективное усовершенствование улучшило согласованность визуализации между образцами и повысило качество полученных трехмерных реконструкций.

Тем не менее, следует учитывать некоторые ограничения. Данный протокол не был протестирован на многих распространенных линиях мышей или других видах грызунов. Аналогично, оптимизация проводилась в конкретных экспериментальных условиях, описанных выше, и только с использованием перечисленных панелей антител. Хотя протокол должен работать с большинством линий мышей и крыс, различными антителами и любыми экспериментальными моделями, позволяющими забирать слизистые оболочки полной толщины, может потребоваться дальнейшая тщательная оптимизация. Еще одним заметным ограничением является то, что один целый препарат (whole-mount) можно окрасить только одной панелью антител, в отличие от тканей, разделенных на тонкие срезы, где каждый срез может быть окрашен отдельной панелью антител и, следовательно, на тонких срезах тканей можно протестировать несколько различных панелей антител.

В целом, данные методологические инновации демонстрируют, как относительно простые корректировки в процессе обработки тканей, условиях окрашивания и ориентации образцов могут существенно улучшить результаты прижизненной визуализации целых препаратов. Избегая длительной подготовки и просветления тканей, данный подход предлагает практичную и адаптивную альтернативу для изучения хрупких тканей, не содержащих костных структур, позволяя при этом получать детальные крупномасштабные трехмерные данные.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	Иммуногистохимия
Adobe Illustrator		версия 28.5
Антитела к бета-III тубулину — нейрональный маркер	Abcam	ab18207
Антитела к PDGFR бета [APB5]	Abcam	ab91066
бис-бензимид H 33342 тригидрохлорид	Sigma Aldrich	14533
ПОКРЫВНОЕ СТЕКЛО 24X50ММ № 1.5 100ШТ	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	Иммуногистохимия
Вторичные антитела: ослиные анти-кроличьи IgG (H+L), высокоперекрестно-адсорбированные, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Кусачки для костей Dumont #15A — с эпоксидным покрытием	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	Диссекция тканей
Пинцет Dumont #7 — Biologie/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	Диссекция тканей
Вторичные антитела: козьи анти-крысиные IgG (H+L), перекрестно-адсорбированные, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Программное обеспечение Imaris	Imaris	версия 9.5.0	Визуализация
Диссекционные ножницы Майо	ProSciTech	420SS	Диссекция тканей
Параформальдегид	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Обработка тканей
Фосфатно-солевой буфер, стерильные таблетки PBS (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	Обработка тканей
Среда для приклеивания ProLong Glass Antifade	Thermo Fisher Scientific	P36980	Иммуногистохимия
Лезвие скальпеля #23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	Диссекция тканей
Ручка скальпеля #4	ProSciTech	T134	Диссекция тканей
Азид натрия	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Обработка тканей
Сахароза	Chem-Supply	57-50-1	Обработка тканей
Адгезивные предметные стекла TOMO Adhesion	ProSciTech	GEMS63705-09	Иммуногистохимия
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	Иммуногистохимия