Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Циркадные ритмы в чашке Петри: синхронизация клеток гипоталамуса мыши линии mHypoE-42 для анализа экспрессии генов циркадных часов

237 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72039

⸱

3 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNC-UC-Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CiBB-Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 4Gene Therapy Center of Excellence (GeneT), University of Coimbra, 5Institute for Interdisciplinary Research (IIIUC), University of Coimbra

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе представлен практический и воспроизводимый рабочий процесс для синхронизации культивируемых клеток, проведения последовательного отбора проб в разные моменты времени в течение 24–72 ч без необходимости сбора образцов в ночное время, а также анализа экспрессии генов циркадных часов.

Аннотация

Циркадные ритмы представляют собой эндогенные осцилляции с периодом примерно 24 h, которые регулируют широкий спектр клеточных и физиологических процессов, включая экспрессию генов, метаболизм и поведение. Эти ритмы возникают в результате взаимосвязанных транскрипционно-трансляционных петель обратной связи, которые реагируют на временные и средовые сигналы. Поскольку циркадная регуляция крайне динамична, даже незначительные экспериментальные вариации могут повлиять на фазу, амплитуду и ритмичность, что делает стандартизированные экспериментальные рабочие процессы необходимыми для получения надежных и воспроизводимых результатов. Целью настоящего протокола является предоставление практического и воспроизводимого алгоритма синхронизации культивируемых клеток, проведения отбора проб по временным точкам и анализа экспрессии генов циркадных часов в стандартных лабораторных условиях. В протоколе описаны синхронизация методом се ചെയ്യрум-шока, шахматный сбор образцов в течение 24–72 h для исключения необходимости ночного дежурства, экстракция рибонуклеиновой кислоты, синтез комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты, количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени и анализ циркадного ритма с использованием соответствующих статистических подходов. В рабочем процессе также освещаются критические экспериментальные аспекты, включая условия синхронизации, оценку качества образцов, выбор референсного гена и анализ данных для повышения воспроизводимости между экспериментами. Данный метод предоставляет доступный подход к исследованию молекулярных циркадных механизмов и оценке ритмической экспрессии генов в культивируемых клетках, что облегчает изучение циркадной регуляции в физиологических и патологических экспериментальных моделях.

Введение

Циркадные ритмы представляют собой эндогенные циклы с периодом примерно 24 ч, которые регулируют широкий спектр физиологических, метаболических и клеточных процессов1. В системах млекопитающих эти ритмы координируются центральными часами, расположенными в супрахиазматическом ядре (СХЯ) гипоталамуса, а также автономными молекулярными часами на клеточном уровне. Эти часы состоят из взаимосвязанных транскрипционно-трансляционных петель обратной связи с участием основных генов циркадных ритмов, включая белок циклов циркадной локомоторной активности kaput (Clock), базовый белок с спиралью-петлей-спиралью, подобный ядерному транслокатору рецептора ароматических углеводородов 1 (Bmal1), period (Per) и криптохром (Cry)2. Учитывая центральную роль циркадных часов в различных биологических процессах, клеточные модели in vitro стали важными инструментами для изучения молекулярных механизмов временной регуляции в контролируемых экспериментальных условиях.

Целью данного протокола является предоставление надежного, практичного и воспроизводимого рабочего процесса для синхронизации культивируемых клеток с использованием метода сывороточного шока, проведения ступенчатого отбора проб во времени и анализа экспрессии генов циркадных часов, позволяющего избежать круглосуточного сбора образцов. Повышая доступность циркадного пробоотбора без ущерба для качества данных, данный рабочий процесс призван облегчить изучение ритмических биологических процессов с использованием стандартных лабораторных методов.

Исследования циркадных ритмов проводились на широком спектре моделей in vitro, включая линии раковых клеток человека3, фибробласты Rat-14, эксплантаты SCN 5 и органоиды6. Хотя большинство клеток млекопитающих обладают функциональными циркадными часами, отсутствие синхронизирующих сигналов, таких как свет, быстро приводит к десинхронизации в культуре, что ограничивает изучение циркадных ритмов in vitro7. Следовательно, методы синхронизации необходимы для исследования механизмов молекулярных часов и их влияния на здоровье и развитие заболеваний.

Для культур клеток млекопитающих было разработано несколько стратегий синхронизации. Синхронизация на основе глюкокортикоидов с использованием дексаметазона является одним из наиболее широко применяемых подходов, поскольку она эффективно сбрасывает циркадные ритмы во многих типах клеток, одновременно снижая вариабельность, связанную с стимуляцией сывороткой8. Аналогичным образом, активация сигналинга циклического аденозинмонофосфата с помощью форсколина успешно использовалась для синхронизации периферических часов в отдельных клеточных моделях9. Другие подходы включают воздействие сигналами, переносимыми кровью4, различными химическими соединениями8,10, замену среды3, температурный шок11, циклы подачи кислорода12 и механическую стимуляцию13. В совокупности эти методы значительно продвинули исследования циркадных ритмов; однако они могут требовать специального оборудования, специфических экспериментальных условий или дополнительной оптимизации, что делает важным подтверждение эффективности выбранной стратегии синхронизации для каждой биологической модели и конкретной экспериментальной задачи14.

Сывороточный шок является одним из наиболее общепринятых методов синхронизации и заключается в воздействии на культивируемые клетки кратковременным стимулом с высокой концентрацией сыворотки4. Поскольку стимул является переходным, длительное нарушение путей клеточной сигнализации сводится к минимуму4, что снижает вероятность влияния побочных факторов на последующий анализ. Следовательно, сывороточный шок особенно подходит для изучения экспрессии циркадных генов и функций молекулярных часов. Кроме того, данная процедура проста в реализации и не требует специализированного оборудования, что делает ее доступной и легко воспроизводимой в различных лабораториях. Однако практическим ограничением экспериментов с сывороточным шоком является интенсивный график отбора проб, необходимый для точной характеристики циркадной ритмичности. Для надежного анализа ритмов обычно требуется сбор образцов через регулярные интервалы, как правило, каждые 2–6 h в течение одного или нескольких циркадных циклов (24–72 h)14, что часто требует сбора проб в ночное время.

Описанный здесь рабочий процесс решает эту логистическую проблему путем поэтапного начала синхронизации в нескольких культуральных планшетах, что позволяет проводить полный циркадный отбор проб в стандартные рабочие часы, избегая необходимости сбора образцов в ночное время. Вместо внедрения новой стратегии синхронизации, данный протокол представляет собой детальную и воспроизводимую реализацию установленного метода сывороточного шока в сочетании с практическим графиком отбора проб и последующим анализом экспрессии генов. Этот рабочий процесс особенно подходит для изучения циркадной экспрессии генов в культивируемых клетках с использованием общедоступных лабораторных методов. При адаптации протокола к другим клеточным моделям экспериментальные параметры, включая плотность клеток, условия синхронизации, интервалы отбора проб и выбор референсных генов, должны быть оптимизированы и валидированы для конкретного типа клеток перед внедрением.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В следующем протоколе описан валидированный метод синхронизации для эмбриональной линии клеток гипоталамуса мыши mHypoE-42. Перед применением данного протокола к другим типам культивируемых клеток необходимо провести независимую валидацию и оптимизацию метода синхронизации. Обзор рабочего процесса представлен на рисунке 1, а график еженедельного отбора проб — на дополнительном рисунке 1. Список всех реагентов, оборудования и приборов, используемых в данном протоколе, приведен в таблице материалов. Все процедуры по культивированию клеток следует проводить в сертифицированном шкафу биологической безопасности, используя стерильные реагенты и оборудование.

Схема процесса синхронизации клеток, метод сывороточного шока, временная шкала, экспериментальная установка, интервалы CT.
Рисунок 1. Схематический обзор протокола ступенчатой синхронизации методом сывороточного шока. Схема, иллюстрирующая рабочий процесс синхронизации клеток mHypoE-42 с помощью сывороточного шока в двух ступенчатых экспериментальных группах. Ступенчатый дизайн позволяет осуществлять сбор циркадных образцов в стандартные рабочие часы, избегая ночного отбора проб. Впоследствии образцы подвергаются экстракции РНК, количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и анализу циркадных ритмов. Создано с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Культивирование клеток

  1. Культивируйте адгезивные клетки mHypoE-42 в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 mg/L), дополненной 10% (v/v) термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (FBS), 3.7 g/L бикарбоната натрия и 1% раствором антибиотиков.
  2. Содержите клетки при 37°C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 95% воздуха и 5% диоксида углерода (CO2) в культуральных флаконах T75 с конечным объемом среды 10 mL.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тестируйте каждую новую партию FBS перед началом экспериментов, так как свойства сыворотки могут варьироваться от партии к партии.
  3. Проводите субкультивирование клеток при достижении ими примерно 80%–90% конфлюэнтности. Промойте клетки стерильным 1× фосфатно-солевым буфером (PBS; pH 7.4), добавьте 3 mL 0.5% раствора трипсина и инкубируйте в течение 3–5 min для отсоединения клеток.
  4. Для нейтрализации трипсина добавьте полную питательную среду, содержащую 10% (v/v) FBS, в объеме, как минимум в два раза превышающем объем добавленного трипсина.
  5. Разведите клетки свежей ростовой средой в соотношении до 1:2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования клеток с избыточным числом пассажей (например, более 40 пассажей для клеток mHypoE-42). Предварительно нагревайте все растворы перед использованием. Регулярно проверяйте культуры на наличие контаминации микоплазмой.
  6. Приступайте к анализам по синхронизации через 24 h после посева клеток в плотности 2.0 × 105 клеток на лунку, как описано в Шаге 2. Поддерживайте рутинные клеточные культуры при примерно 80%–90% конфлюэнтности перед пассированием.

2. Синхронизация клеточной линии mHypoE-42

  1. Подготовка клеток
    1. После трипсинизации центрифугируйте клетки при 700 × g в течение 5 мин.
    2. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в 10 mL свежей культуральной среды.
    3. Смешайте клеточную суспензию с красителем трипановым синим в соотношении 1:1 (общий объем 20 μL) и определите концентрацию клеток с помощью гемоцитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизируйте растворы, содержащие трипановый синий, в соответствии с правилами учреждения по утилизации химических отходов. Не сливайте неиспользованный краситель в раковину.
  2. Посев клеток и ступенчатый дизайн эксперимента
    1. Высейте 2,0 × 105 клеток на лунку в 6-луночные планшеты или чашки для культивирования диаметром 35 мм. Инкубируйте культуры при 37°C в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начните синхронизацию сывороткой через 24 ч после посева клеток. Таким образом, перед синхронизацией не требуется достижение определенной конфлюэнтности клеток. Вместо этого исследуйте культуры под микроскопом, чтобы подтвердить, что клетки полностью прикрепились и имеют соответствующую морфологию перед началом процедуры синхронизации.
    2. Случайным образом разделите культуральные планшеты на два экспериментальных набора. Используйте первый набор для получения точек циркадного времени (CT) CT0, CT4, CT8, CT24, CT28 и CT32. Используйте второй набор для получения CT12, CT16, CT20, CT36, CT40, CT44 и CT48 (Рисунок 1; Дополнительный рисунок 1).
    3. При необходимости увеличьте количество лунок или планшетов для включения технических повторностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизируйте вариабельность, подготавливая все планшеты из одной и той же клеточной суспензии, поддерживая идентичную плотность посева и условия культивирования, а также проводя синхронизацию с использованием одних и тех же реагентов и экспериментальных настроек. При необходимости скорректируйте формат сосудов для культивирования и плотность посева для других типов клеток. При использовании 6-луночных планшетов объединяйте CT, собираемые одновременно, чтобы оптимизировать использование планшета.
  3. Синхронизация
    1. Через 24 ч аспирируйте среду из первого набора планшетов и добавьте 1 mL безсывороточного DMEM. Инкубируйте в течение 12 ч для индукции сывороточного голодания.
    2. Непосредственно перед использованием приготовьте 50% (v/v) раствор сыворотки лошади в DMEM с высоким содержанием глюкозы.
    3. Аспирируйте среду для голодания из первого набора и подвергните клетки воздействию 1 mL свежеприготовленного 50% раствора сыворотки лошади в течение 2 ч.
    4. Одновременно с этим аспирируйте среду из второго набора планшетов и замените ее 1 mL безсывороточного DMEM. Инкубируйте в течение 12 ч.
    5. После 2-часового сывороточного шока аспирируйте среду и добавьте 1 mL DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненного 10% (v/v) термоинактивированной FBS. Обозначьте эту временную точку как CT0.
  4. Сбор образцов
    1. Поместите культуральные планшеты на лед. Аспирируйте среду, дважды промойте клетки 1 mL холодного стерильного 1× PBS, удалите промывочный раствор и лизируйте клетки механически, используя до 1 mL реагента для лизиса.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Реагент для лизиса содержит опасные химические вещества. Выполняйте все этапы работы в сертифицированном вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты. Утилизируйте отходы в соответствии с правилами химической безопасности учреждения.
    2. Перенесите каждый лизат в стерильную пробирку и храните образцы при −80°C до экстракции РНК.
    3. Повторите этапы 2.4.1 и 2.4.2 для сбора образцов в точках CT4 и CT8.
    4. В точке CT8 повторите этап 2.3.2 для второго экспериментального набора, чтобы синхронизировать остальные клетки.
    5. После 2 ч сывороточного шока завершите синхронизацию второго экспериментального набора, заменив среду на 1 mL DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненного 10% (v/v) термоинактивированной FBS.
    6. Сбирайте образцы поочередно из двух экспериментальных наборов для получения CT12, CT24, CT16, CT28, CT20 и CT32. На следующий день повторите процедуру сбора для получения CT36, CT40, CT44 и CT48.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сывороточное голодание и синхронизация начинались в соответствии с временным графиком эксперимента после посева клеток, а не при достижении определенной конфлюэнтности. Перед началом синхронизации убедитесь, что клетки полностью прикрепились и имеют соответствующую морфологию. Хотя последовательные CT различаются на 4 ч, сбор образцов производится не с 4-часовым интервалом. Полный еженедельный график сбора образцов приведен на Дополнительном рисунке 1.

3. Обработка образцов: экстракция РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы могут варьироваться в зависимости от контекста эксперимента и области применения. Следующий рабочий процесс описывает пример эффективной процедуры экстракции РНК, синтеза комплементарной ДНК (кДНК) и количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР). Экстракцию тотальной РНК следует проводить с использованием комбинированного метода лизиса на основе фенола и разделения фаз с последующей очисткой с помощью силикатных спин-колонок.

  1. Подготовка образцов и разделение фаз
    1. Разморозьте образцы, повторно гомогенизируйте лизаты и инкубируйте их при комнатной температуре в течение 5 min.
    2. Добавьте 200 μL хлороформа на каждый 1 mL лизирующего реагента.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Хлороформ летуч и токсичен. Все процедуры с использованием хлороформа следует проводить в сертифицированном химическом вытяжном шкафу с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.
    3. Интенсивно встряхивайте пробирки в течение 15 s и инкубируйте их при комнатной температуре в течение 3 min.
    4. Центрифугируйте образцы при 12,000 × g в течение 15 min при 4°C. Дождитесь разделения образцов на три фазы: нижнюю фенол-хлороформную фазу, содержащую белки, белую интерфазу, содержащую ДНК, и верхнюю водную фазу, обогащенную РНК.
    5. Осторожно перенесите водную фазу в новую стерильную пробирку, не затрагивая интерфазу. Храните органическую фазу при 4°C, если планируется последующее выделение белков или ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если данные биомолекулы будут выделяться из органической фазы, выполняйте выделение белков или ДНК в соответствии с соответствующим протоколом.
  2. Очистка РНК
    1. Добавьте к водной фазе равный объем 70% этанола (приготовленного на воде, свободной от РНказ) и дважды перемешайте на вортексе в течение 15 s для улучшения связывания РНК.
    2. Нанесите образец на силикажную спин-колонку и очистите РНК в соответствии с алгоритмом очистки на колонке.
    3. Проведите расщепление contaminating genomic DNA с помощью ДНКазы в течение 15 min при комнатной температуре.
    4. Промойте колонку, используя прилагаемые промывочные буферы.
    5. Выполните дополнительную промывку 100 μL промывочного буфера и центрифугируйте при 11,000 × g в течение 2 min для высушивания силикатной мембраны.
    6. Перенесите спин-колонку в чистую микроцентрифужную пробирку. Элюируйте РНК 40–60 μL воды, свободной от РНказ, нанося воду непосредственно в центр силикатной мембраны и центрифугируя при 11,000 × g в течение 1 min.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите объем элюции в зависимости от желаемого выхода и концентрации РНК. Объем элюции 60 μL обычно обеспечивает более полное извлечение РНК из силикатной мембраны, но приводит к получению более разбавленного раствора РНК. Напротив, объем элюции 40 μL позволяет получить более концентрированный препарат РНК, но может снизить общий выход РНК. Оптимизируйте объем элюции в соответствии с рекомендациями производителя и требованиями последующего анализа.
  3. Оценка качества РНК
    1. Поместите образцы РНК на лед и перенесите по 5 μL каждого образца в новую стерильную микроцентрифужную пробирку для оценки качества.
    2. Оцените целостность РНК с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле или капиллярного электрофореза. Подтвердите наличие четких полос 28S и 18S рибосомной РНК.
    3. Определите концентрацию и чистоту РНК путем измерения оптической плотности на спектрофотометре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизируйте отходы, содержащие фенол, в соответствии с внутренними правилами учреждения по утилизации химических отходов. Не сливайте опасные химические отходы в раковину. Для образцов культивируемых клеток концентрация РНК обычно составляет от 200 до 1000 ng/μL, что подходит для синтеза кДНК и qRT-PCR. Принимайте образцы РНК с соотношением A260/230 от 2.0 до 2.2 и соотношением A260/280 примерно 2.0 (см. Дополнительную таблицу 1).
  4. Хранение РНК
    1. Храните очищенные образцы РНК при −80°C до момента синтеза кДНК.

4. Обработка образцов: синтез кДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Синтезируйте кДНК из 1 μg общей РНК, используя набор для синтеза первой цепи кДНК. Отрегулируйте объемы реакций и условия инкубации в соответствии с инструкциями производителя.

  1. Обратная транскрипция
    1. Разморозьте образцы РНК на льду. Приготовьте реакционную смесь для обратной транскрипции объемом 20 μL, содержащую 1 μg суммарной РНК, 10 μL 2× Master Mix (содержащего ингибитор рибонуклеазы, случайные гексамеры, олиго(дезокситимидиновые) праймеры, ионы магния [Mg2+] и дезоксинуклеотидтрифосфаты), 2 μL смеси ферментов (содержащей обратную транскриптазу) и воду, обработанную диэтилпирокарбонатом, до конечного объема 20 μL.
    2. Инкубируйте реакционную смесь в амплификаторе в течение 10 мин при 25°C для отжига праймеров, затем в течение 30 мин при 50°C для синтеза кДНК. Инактивируйте обратную транскриптазу, инкубируя смесь при 85°C в течение 5 мин.
    3. Добавьте 1 μL РНказы H и инкубируйте смесь в течение 20 мин при 37°C для деградации цепи РНК в гибриде РНК–ДНК.
    4. Разведите полученную кДНК стерильной водой в соотношении до 1:20 в соответствии с требованиями по оптимизации анализа и храните разведенную кДНК при −20°C до проведения количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР).

5. Обработка образцов: количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qRT-PCR)

ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте экспрессию генов циркадных часов с помощью количественной ОТ-ПЦР. Обратитесь к Дополнительная таблица 2 для проверенных последовательностей праймеров, температур отжига и концентраций праймеров.

  1. Оптимизация анализа
    1. Перед анализом экспериментальных образцов проведите валидацию и оптимизацию концентрации праймеров, температуры отжига и количества вводимой кДНК, используя объединенные образцы кДНК и стандартную кривую. Оптимизацию и валидацию анализа проводите согласно ранее описанному методу15,16.
  2. Постановка реакции
    1. Подготовьте каждую реакцию qRT-PCR объемом 10 μL, смешав в 96-луночном ПЦР-планшете 5 μL 2× мастер-микса, по 0,4 μL прямого и обратного праймеров, 0,2 μL воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, и 4 μL матрицы кДНК.
    2. Герметизируйте планшет оптически прозрачной пленкой или ковриком. Центрифугируйте планшет при 700 × g в течение 5 мин при 4°C для удаления пузырьков и сбора реакционной смеси на дне каждой лунки.
    3. Проанализируйте все образцы кДНК для определения экспрессии целевых генов Bmal1 и Per2.
    4. Проанализируйте выбранный референсный ген (B2m), используя то же разведение кДНК, для нормализации экспрессии генов в образцах.
  3. Термоциклирование
    1. Проведите qRT-PCR, используя следующие условия циклирования: начальная денатурация и активация ДНК-полимеразы с «горячим стартом» при 95°C в течение 2 мин, затем 39 циклов: 95°C в течение 5 s и 60°C в течение 30 s.
    2. Проведите анализ кривых плавления, нагревая реакционные смеси до 95°C в течение 5 s, с последующим ступенчатым повышением температуры на 0,5°C до 95°C с выдержкой в течение 5 s на каждом шаге.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте время выдержки и настройки кривой плавления в соответствии с рекомендациями к мастер-миксу.
  4. Валидация референсного гена
    ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах по синхронизации сывороткой оценивайте потенциальные референсные гены, так как обработка сывороткой может изменить экспрессию генов «домохозяйств»17. Оценивайте стабильность экспрессии с помощью таких методов, как BestKeeper18, geNorm19, NormFinder20 или сравнительного метода ΔCt21. Выберите наиболее стабильный ген (гены) для нормализации. В данном исследовании гены β-actin (Actb) и β-2-microglobulin (B2m) оценивались с помощью программного обеспечения RefFinder22, которое объединяет несколько алгоритмов валидации референсных генов. B2m продемонстрировал наибольшую стабильность экспрессии на протяжении циркадного временного интервала и поэтому был выбран для нормализации.
  5. Верификация продукта
    1. Подтвердите специфичность амплификации, проанализировав ПЦР-продукты с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите оптимальную температуру отжига, протестировав несколько значений (например, 58 °C, 60°C и 62°C). Выберите температуру, при которой достигается минимальное значение цикла квантификации (Cq) при сохранении одного пика на кривой плавления и отсутствии признаков образования димеров праймеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Принимайте результаты анализов с эффективностью амплификации от 90% до 110% и коэффициентом детерминации (R2) 0,99 или выше. Подтвердите, что температуры плавления технических реплик различаются не более чем на 0,5°C. Для анализа используйте только технические реплики с разницей Cq ≤0,5; эти значения используйте для расчета средних уровней экспрессии. Проводите все реакции в технических репликах (например, в трехкратной повторности), включая контроль без матрицы и контроль без обратной транскрипции.

6. Анализ данных

  1. Анализ экспрессии генов
    1. Вычислите среднее значение технических повторностей для каждого образца перед проведением последующего анализа.
    2. Рассчитайте значение ΔCq для каждого образца и временной точки, используя следующее уравнение:
      ΔCq   = Cqцелевого гена  -  Cqгена домашнего хозяйства
    3. Рассчитайте значение ΔΔCq для каждого образца и временной точки, используя следующее уравнение:
      ΔΔCq   = ΔCqобразца  -  ΔCqконтроля  
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета ΔΔCq значение ΔCqконтроля определяли как среднее значение ΔCq, полученное путем усреднения всех контрольных образцов по всем CT.
    4. Оцените циркадные параметры, включая среднесуточный уровень (MESOR), амплитуду, пик и фазу, с помощью CircaCompare23. Выполните анализ с использованием онлайн-приложения или пакета для R.
  2. Онлайн-анализ с помощью CircaCompare
    ПРИМЕЧАНИЕ: Онлайн-версия предоставляет полные оценки циркадных параметров только в том случае, если набор данных удовлетворяет статистическим критериям ритмичности. Если ритмичность слабая или статистически незначимая, используйте версию для R, чтобы получить оценки параметров для всех наборов данных.
    1. Подготовьте файл со значениями, разделенными запятыми (.csv).
      1. Введите переменную времени (числовая; часы) в Столбец 1.
      2. Введите переменную группировки (только две экспериментальные группы) в Столбец 2.
      3. Введите переменную результата (числовая; ΔΔCq) в Столбец 3.
    2. Загрузите .csv файл в онлайн-приложение CircaCompare.
    3. Назначьте переменные времени, группы и результата соответствующим столбцам.
    4. Нажмите Run (Запуск) для выполнения анализа.
  3. Анализ CircaCompare в R
    1. Выполните анализ, используя R версии 4.5.1 и пакет CircaCompare версии 0.2.024.
    2. Установите необходимые пакеты R.
      1. Установите пакет devtools (версия 2.5.2).
      2. Установите пакет circacompare (версия 0.2.0).
      3. Установите пакет ggplot2 (версия 4.0.3).
      4. Установите пакет svglite (версия 2.2.2).
    3. Загрузите входной .csv файл.
    4. Запустите анализ CircaCompare, установив alpha_threshold = 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установка alpha_threshold = 1 позволяет получить оценки циркадных параметров для всех подогнанных осцилляций независимо от их статистической значимости. Однако ритмичными и статистически значимыми следует считать только те осцилляции, для которых p-value < 0.05.
    5. Отредактируйте Дополнительный файл 1 перед запуском скрипта.
      1. Замените «XXX.csv» именем входного файла данных.
      2. Замените «YYY.csv» желаемым именем файла с результатами.
      3. Замените «ZZZ.svg» желаемым именем файла графика.
      4. Отрегулируйте пределы оси Y (ylim) и любые дополнительные параметры построения графика в соответствии с набором данных.
    6. Пример входного файла приведен в Дополнительной таблице 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Об успешной синхронизации свидетельствует статистически значимая циркадная ритмичность анализируемых часовных генов в контрольном условии (p < 0.05). В данном исследовании было проведено три независимых биологических эксперимента, в которых в качестве отрицательного контроля использовали 0.1% диметилсульфоксида. В качестве репрезентативных циркадных маркеров были выбраны Bmal1 и Per2, поскольку они являются основными компонентами молекулярных циркадных часов и демонстрируют хорошо изученный ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Циркадные ритмы представляют собой эндогенные циклы продолжительностью примерно 24 h, которые регулируют широкий спектр физиологических, метаболических и клеточных процессов посредством консервативных механизмов молекулярных часов1,2. Модели синхронизации in vitro обеспечивают контролируемую экспериментальную среду для исследования этих механизмов и стали ценными инструментами для изучения циркадной регуляции в нормальных и патологических условиях, включ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данная работа была совместно профинансирована Европейским союзом (ЕС) в рамках Механизма восстановления и устойчивости и национальными фондами Португалии через FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia по проектам LA/P/0058/2020 (DOI: 10.54499/LA/P/0058/2020), UID/04539/2025, UID/PRR/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR/04539/2025) и UID/PRR2/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR2/04539/2025); Европейским региональным фондом развития (ERDF) через Региональную оперативную программу Centro 2030 по проекту CENTRO2030-FEDER-02360200; а также национальными фондами Португалии через FCT по грантам 2023.17896.ICDT (DOI: 10.54499/2023.17896.ICDT), 2023.12355.PEX (DOI: 10.54499/2023.12355.PEX), 2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008 (DOI: 10.54499/2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008), 2020.04850.BD (DOI: 10.54499/2020.04850.BD) и 2021.05334.BD (DOI: 10.54499/2021.05334.BD).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
планшет для культивирования клеток на 6 лунокNest Biotechnology15140122Планшет для культивирования клеток
АгарозаNZYtechMB02702Оценка качества РНК
Смесь антибиотиков (пенициллин/стрептомицин)Gibco, Thermo Fisher ScientificD5648Добавка для культур клеток
набор для синтеза кднк (первой цепи)NZYtechMB12502Обратная транскрипция
ХлороформSigma-AldrichA5256701Реагент для разделения фаз
DMEM, с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л глюкозы, L-глутамин)Sigma-Aldrich26050088Среда для культивирования клеток
Микроцентрифужные пробирки EppendorfEppendorf30120086Хранение образцов
Этанол (96%)Fisher Bioreagents15552393Очистка РНК
Фетальная бычья сыворотка, термоинактивированнаяGibco, Thermo Fisher ScientificJ62692.K7Добавка для культуральных сред
Жесткая 96-луночная ПЦР-пластинаBio-Rad LaboratoriesHSP9601планшет для qRT-PCR
Сыворотка лошадиная, инактивированная нагреваниемGibco, Thermo Fisher Scientific15400054Сывороточный шок-синхронизация
линия клеток mHypoE-42 (CVCL_D443)CELLutions Biosystems Inc.MB13402Линия клеток гипоталамуса эмбриональной мыши
Олигонуклеотидные праймерыNZYtechMB12501праймеры для ОТ-ПЦР в реальном времени
Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)Thermo Fisher ScientificMB18502Промывка клеток
Мастер-микс qPCR Green (2×)NZYtechMB22403реагент для ОТ-ПЦР в реальном времени
Система детекции методом ПЦР в реальном времениBio-Rad LaboratoriesEP0030108116прибор для ОТ-ПЦР в реальном времени
Набор для выделения РНКNZYtech288306Очистка с использованием спиновых колонок с силикагелем
Реагент для лизиса РНКNZYtechMB18502Реагент для экстракции РНК на основе фенола
Бикарбонат натрияSigma-AldrichMB22401Добавка к питательной среде для культур клеток
Стерильная культуральная чашка диаметром 35 ммThermo Fisher Scientific121ВЧашка для культивирования клеток
термоциклер T100Bio-Rad Laboratories1861096Синтез кДНК
флакон для культивирования тканей T75Corning430641UСосуд для культивирования клеток
Раствор трипанового синего (0,4%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061Подсчет клеток
Трипсин-ЭДТА (0,5%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054Диссоциация клеток

Ссылки

  1. Fuhr L, Abreu M, Pett P, Relógio A. Circadian systems biology: When time matters. Comput Struct Biotechnol J. 2015;13:417-426.
  2. Albrecht U. Timing to perfection: The biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 2012;74(2):246-260.
  3. Relógio A, et al. Ras-mediated deregulation of the circadian clock in cancer. PLoS Genet. 2014;10(5):e1004338.
  4. Balsalobre A, Damiola F, Schibler U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 1998;93(6):929-937.
  5. Hughes ATL, et al. Constant light enhances synchrony among circadian clock cells and promotes behavioral rhythms in VPAC2-signaling deficient mice. Sci Rep. 2015;5:12092.
  6. Fuhr L, et al. The circadian clock regulates metabolic phenotype rewiring via HKDC1 and modulates tumor progression and drug response in colorectal cancer. EBioMedicine. 2018;33:105-121.
  7. Nagoshi E, et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: Cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 2004;119(5):693-705.
  8. Balsalobre A, et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 2000;289(5488):2344-2347.
  9. Kaneko H, Kaitsuka T, Tomizawa K. Response to stimulations inducing circadian rhythm in human induced pluripotent stem cells. Cells. 2020;9(3):732.
  10. Chalmers JA, et al. Vascular circadian rhythms in a mouse vascular smooth muscle cell line (Movas-1). Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008;295:R1529-R1538.
  11. Brown SA, et al. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Curr Biol. 2002;12(18):1574-1583.
  12. Adamovich Y, et al. Rhythmic oxygen levels reset circadian clocks through HIF1α. Cell Metab. 2017;25(1):93-101.
  13. Rogers EH, et al. Comparing circadian dynamics in primary derived stem cells from different sources of human adult tissue. Stem Cells Int. 2017;2017:2057168.
  14. Gaspar LS, et al. The importance of determining circadian parameters in pharmacological studies. Br J Pharmacol. 2019;176(16):2827-2847.
  15. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 2006;1(3):1559-1582.
  16. Derveaux S, Vandesompele J, Hellemans J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 2010;50(4):227-230.
  17. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-408.
  18. Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper—Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol Lett. 2004;26(6):509-515.
  19. Vandesompele J, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002;3(7):research0034.1-research0034.11.
  20. Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization. Cancer Res. 2004;64(15):5245–5250.
  21. Silver N, Best S, Jiang J, Thein SL. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC Mol Biol. 2006;7:33.
  22. Xie F, Wang J, Zhang B. RefFinder: a web-based tool for comprehensively analyzing and identifying reference genes. Funct Integr Genomics. 2023;23:125.
  23. Parsons R, Garner N, Oster H, Rawashdeh O. CircaCompare: A method to estimate and statistically support differences in mesor, amplitude and phase between circadian rhythms. Bioinformatics. 2020;36(4):1208-1212.
  24. Parsons R. circacompare: Analyses of circadian data. R package version 0.2.0. 2021. Available at: https://CRAN.R-project.org/package=circacompare
  25. Di Nisio A, et al. Impairment of human dopaminergic neurons at different developmental stages by perfluoro-octanoic acid (PFOA) and differential human brain areas accumulation of perfluoroalkyl chemicals. Environ Int. 2022;158:106982.
  26. Xiang S, et al. Oscillation of clock and clock-controlled genes induced by serum shock in human breast epithelial and breast cancer cells: Regulation by melatonin. Breast Cancer (Auckl). 2012;6:155-168.
  27. Chang HC, Guarente L. SIRT1 mediates central circadian control in the SCN by a mechanism that decays with aging. Cell. 2013;153(7):1448-1460.
  28. Yoo SH, et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(15):5339-5346.
  29. Ueda HR, et al. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat Genet. 2005;37(2):187-192.
  30. Beaulé C, Granados-Fuentes D, Marpegan L, Herzog ED. In vitro circadian rhythms: Imaging and electrophysiology. Essays Biochem. 2011;49(1):103-117.
  31. Ribeiro RFN, et al. Circadian rhythms are disrupted in patients and preclinical models of Machado-Joseph disease. Brain. 2025;148(11):4127-4142.
  32. Masri S, Sassone-Corsi P. The emerging link between cancer, metabolism, and circadian rhythms. Nat Med. 2018;24(12):1795-1803.
  33. Ribeiro RFN, Cavadas C, Silva MMC. Small-molecule modulators of the circadian clock: Pharmacological potentials in circadian-related diseases. Drug Discov Today. 2021;26(7):1620-1641.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Синхронизация сывороточным шокомклетки гипоталамуса мышиотбор проб в режиме временного рядаколичественная ПЦРэкстракция РНКвыбор референсного генаанализ циркадных ритмовритмичность экспрессии генов

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.