Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ультразвуковое контролируемое открытие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) в микрофлюидном чипе «ГЭБ-глиобластома» для исследований по доставке лекарственных средств

272 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72041

⸱

18 августа 2026 г.

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается создание микрофлюидной чип-модели гематоэнцефалического барьера и глиобластомы (ГЭБ-ГБМ). Модель валидирована по показателям целостности ГЭБ и позволяет исследовать транзиторное и в значительной степени обратимое открытие ГЭБ, индуцированное ультразвуком низкой интенсивности, что обеспечивает количественную оценку транспорта наномицелл через ГЭБ и эффективности их доставки к опухоли под воздействием ультразвука.

Аннотация

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является основным препятствием при лечении глиобластомы (GBM), так как он ограничивает проникновение большинства терапевтических молекул в мозг. Межвидовые различия в структуре и функциях ГЭБ затрудняют клиническую трансляцию моделей на животных, что подчеркивает необходимость создания релевантных для человека платформ ГЭБ in vitro для оценки проницаемости препаратов при терапии GBM. В данной работе описывается протокол создания микрофлюидной чип-модели ГЭБ-GBM. Эта модель представляет собой систему тройной культуры, включающую эндотелиальные клетки микрососудов головного мозга человека (HCMECs), первичные астроциты (ACs) и клетки U87-MG в микрофлюидной платформе с включением Matrigel. Целостность ГЭБ подтверждается путем непрерывного иммуноокрашивания на zonula occludens-1 (ZO-1) и анализа проницаемости для FITC-декстрана. Затем используется низкоинтенсивный ультразвук (US) (1 MHz, 1 W/cm2, 30 s) для индукции транзиторного и в значительной степени обратимого открытия ГЭБ, что позволяет наномицеллам, таргетированным на опухоль (SFN@RB@SPMs), эффективно преодолевать барьер и накапливаться в клетках GBM. Ключевой особенностью данного протокола является интеграция измерений проницаемости ГЭБ и доставки лекарств в режиме реального времени в одном ультразвукозависимом чипе, что обеспечивает мощную платформу для изучения механизмов доставки препаратов, усиленной ультразвуком, при GBM.

Введение

Лечение глиобластомы (GBM) сильно ограничено гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), который существенно препятствует проникновению почти всех терапевтических агентов в мозг1,2. ГЭБ образован нефенестрированными эндотелиальными клетками, соединенными белками плотных контактов (например, окклюдином, ZO-1), при дополнительной поддержке перицитов и концевых ножек астроцитов3. Хотя модели на животных предоставили ценные сведения о функционировании ГЭБ, видоспецифические различия в физиологии и метаболизме ограничивают их способность точно предсказывать ответ человека на лекарственные препараты4,5. Следовательно, физиологически релевантные модели ГЭБ человека незаменимы для оценки проницаемости препаратов при терапии GBM.

Традиционные модели ГЭБ in vitro, такие как система культивирования Transwell, не позволяют воспроизвести всю сложность ГЭБ, включая межклеточные взаимодействия, динамические изменения жидкости и вызванное потоком напряжение сдвига6. Напротив, микрофлюидные модели ГЭБ зарекомендовали себя как более совершенные платформы, которые точно имитируют эти характеристики, присущие условиям in vivo7. Такие системы «ГЭБ-на-чипе» широко используются для изучения метастазирования опухолей мозга8, исследования дисфункции ГЭБ при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера9, и оценки транспорта лекарственных средств через ГЭБ10,11. Однако большинство существующих моделей ГЭБ-чипа используются в основном для тестирования проницаемости препаратов и не обладают возможностью интеграции внешних физических стимулов, модулирующих проницаемость ГЭБ. В настоящее время фокусированный ультразвук (ФУЗ) стал перспективной стратегией для транзиторного открытия ГЭБ с последующим существенным восстановлением, что позволяет улучшить доставку терапевтических агентов в мозг12,13. Предыдущие механистические исследования показали, что вызванная ультразвуком механическая стимуляция может временно модулировать барьерную функцию за счет ремоделирования межклеточных соединений и повышения проницаемости эндотелия. Например, Silvani и соавт. показали, что вызванные ультразвуком механические силы приводили к образованию обратимых межэндотелиальных щелей в модели «сосуд-на-чипе» in vitro14. В соответствии с этими данными Beekers и соавт. продемонстрировали, что опосредованные ультразвуком механические биоэффекты вызывали кратковременное размыкание контактов между эндотелиальными клетками, тем самым повышая проницаемость эндотелия15. Недавно Qiao и соавт. сообщили, что проницаемость эндотелиального барьера критически регулируется параметрами ультразвукового воздействия, в частности длительностью импульса, что подчеркивает важность оптимизации акустических параметров для достижения безопасной и контролируемой модуляции ГЭБ16. Несмотря на этот прогресс, платформы in vitro, позволяющие одновременно проводить количественный анализ опосредованного ультразвуком открытия ГЭБ и его влияния на доставку нанолекарственных препаратов, остаются ограниченными.

Для восполнения вышеуказанного пробела представлен протокол создания микрофлюидного чипа ГЭБ-ГБМ. Микрофлюидное устройство поддерживает трикультуру HCMECs, первичных ACs и клеток ГБМ U87-MG, встроенных в Matrigel. Реконструированный ГЭБ продемонстрировал структурные и функциональные характеристики интактного барьера, что подтверждается непрерывной локализацией ZO-1 вдоль межклеточных соединений и ограниченной диффузией FITC-декстрана 40 kDa через сосудистый интерфейс. Важно отметить, что этот чип может быть сопряжен с контролируемой ультразвуковой стимуляцией для индукции транзиторного открытия ГЭБ, что повышает последующий транспорт и эффективность адресной доставки наномицелл к опухоли. С помощью данной системы можно количественно оценить транспорт и эффективность опухолевого таргетинга наномицелл SFN@RB@SPM. В целом, эта платформа представляет собой полезный инструмент для изучения взаимосвязи между параметрами ультразвука, модуляцией ГЭБ с обратимыми характеристиками и улучшенной доставкой наномицелл при терапии ГБМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с животными проводились в соответствии с Руководством (GB/T35892-2018) по этической экспертизе благополучия экспериментальных животных и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Нинбоского института промышленности жизни и здоровья, UCAS (номер одобрения GK-2023-XM-073). Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Изготовление и подготовка устройства «орган на чипе» ГЭБ-ГБМ

  1. Проектирование чипа и макета фотошаблона
    1. Спроектируйте чип с помощью программного обеспечения Auto CAD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чип состоит из трех параллельных микрофлюидных каналов: канала крови, канала мозга и канала опухоли. Ширина канала крови и канала опухоли составляет 10 µm, а ширина канала мозга — 130 µm. Высота всех трех каналов составляет 150 µm; соседние каналы разделены массивами трапециевидных микростолбиков шириной 20 µm, которые обеспечивают межотсековую молекулярную диффузию и клеточную коммуникацию. Подробный макет дизайна фотошаблона представлен на Дополнительном рисунке 1 и Дополнительном рисунке 2. В данной работе использован фоторезист SU-8 3050.
  2. Изготовление кремниевой мастер-формы методом стандартной фотолитографии с использованием фоторезиста SU-8.
    1. Поместите чистую кремниевую пластину на вакуумный прижим центрифуги для нанесения покрытий и активируйте вакуум для надежной фиксации пластины.
    2. Медленно нанесите 10 mL фоторезиста SU-8 на центр пластины.
    3. Выполните двухэтапный процесс центрифугирования для получения однородного слоя фоторезиста: сначала при 50 rpm в течение 10 s, затем при 250 rpm в течение 90 s.
    4. Перенесите пластину с покрытием на нагревательную плитку и проведите мягкий обжиг при 95 °C в течение 30 min для испарения растворителя.
    5. Дайте пластине остыть до комнатной температуры и измерьте толщину слоя SU-8 с помощью измерителя толщины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального формирования ГЭБ рекомендуется высота канала 10–150 µm. Однократное центрифугирование (этап 1.2.3), как правило, дает толщину пленки 40–50 µm; следовательно, для достижения требуемой общей толщины необходимо провести от двух до трех циклов центрифугирования.
  3. Фотолитографическое создание рисунка
    1. Установите интенсивность ультрафиолетового (УФ) излучения установку для совмещения масок на уровень 14–15 mW/cm2.
    2. Совместите хромированный фотошаблон с кремниевой пластиной, покрытой SU-8, и выполните УФ-экспонирование в течение 10 s.
    3. Немедленно перенесите кремниевую пластину на нагревательную плитку для обжига после экспонирования при следующих условиях: 65 °C в течение 10 s, затем 95 °C в течение 30 s.
    4. После того как кремниевая пластина остынет до комнатной температуры, погрузите ее в раствор проявителя (пропиленгликольмонометиловый эфир ацетат, PGMEA) и оставьте для проявления на 4–6 min.
    5. Промойте пластину изопропанолом для остановки процесса проявления, после чего промойте деионизированной водой.
    6. Высушите пластину потоком азота и осмотрите созданные структуры микроканалов под оптическим микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если остались непроявленные частицы фоторезиста, повторите этап проявления до четкого формирования микроструктур.
    7. Высушите готовую кремниевую мастер-форму в печи при 200 °C в течение 1 h для улучшения адгезии фоторезиста SU-8 к поверхности кремниевой пластины.
  4. Изготовление чипа из PDMS
    1. Приготовьте полидиметилсилоксан (PDMS), тщательно перемешивая базовый преполимер и отвердитель в массовом соотношении 10:1 (w/w) в течение 30 min до получения гомогенного преполимера PDMS.
    2. Залейте смесь PDMS в изготовленную кремниевую мастер-форму, обеспечив полное покрытие микроструктур.
    3. Поместите мастер-форму в вакуумный эксикатор для дегазации с целью удаления пузырьков воздуха.
    4. Перенесите мастер-форму в печь и подвергните отверждению при 65 °C в течение 1,5–2 h.
    5. После отверждения аккуратно вырежьте слой PDMS по границам чипа с помощью канцелярского ножа и осторожно отделите его от кремниевой мастер-формы.
    6. Погрузите чип из PDMS в 70%–75% этанол на 30 min для предварительной стерилизации, затем промойте деионизированной водой и высушите на воздухе.
    7. Проделайте входные и выходные отверстия с помощью биопсийного просекателя диаметром 2 mm.
  5. Плазменное склеивание и сборка устройства
    1. Поместите чип из PDMS и чистое предметное стекло в камеру установки для плазменной очистки так, чтобы сторона с микроканалами PDMS была обращена вверх.
    2. Откачайте воздух из камеры до падения давления ниже 30 Pa, затем введите кислород.
    3. Поддерживайте подачу кислорода в течение 90 s, сохраняя давление в камере ниже 40 Pa.
    4. Установите радиочастотную (РЧ) мощность на 5% и проведите плазменную обработку в течение 90 s для активации поверхностей PDMS и стекла.
    5. Немедленно приложите активированный чип из PDMS к предметному стеклу и слегка прижмите для достижения необратимого склеивания.
    6. Поместите собранное устройство в печь при 65 °C на 24 h для стабилизации соединения и восстановления гидрофобности.
    7. Перед посевом клеток стерилизуйте склеенное устройство ультрафиолетовым облучением в течение 30 min.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильности храните стерилизованные чипы в герметичных чашках Петри внутри бокса биологической безопасности до момента использования.

2. Посев клеток и создание модели ГЭБ-ГБМ

  1. Подготовьте следующие реагенты:
    1. среда для культивирования ACs (для мозгового канала): базальная среда DMEM/F12, содержащая 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S).
    2. среда для культивирования HCMECs (для сосудистого канала): среда для эндотелиальных клеток (ECM), дополненная 1% P/S.
    3. среда для культивирования клеток GBM (для канала глиомы): базальная среда MEM, содержащая 10% FBS и 1% P/S.
    4. реагент для диссоциации клеток: используйте 0,25% раствор трипсина-ЭДТА для отсоединения адгезивных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие трипсина может снизить жизнеспособность клеток. Контролируйте отсоединение клеток под микроскопом и своевременно нейтрализуйте трипсин полной средой.
    5. До посева в микрофлюидное устройство поддерживайте все клетки (ACs, HCMECs и U87-MG) в культуральных чашках диаметром 10 мм.
  2. Изоляция первичных ACs
    1. Изолируйте первичные ACs из коры головного мозга новорожденных крыс (1–3-й постнатальный день). После осторожного удаления мозговых оболочек и кровеносных сосудов на льду измельчите ткань коры стерильными хирургическими ножницами и подвергните ферментативному перевариванию.
    2. Промойте полученную суспензию диссоциированных клеток ледяным PBS, обработайте трипсином для достижения одноклеточной диссоциации и осадите клетки путем центрифугирования (40 x g, 5 мин, комнатная температура).
    3. Ресуспендируйте клетки и перенесите их в культуральные флаконы T25, содержащие среду для культивирования ACs.
    4. Идентифицируйте ACs по маркеру GFAP с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Изображение представлено на Дополнительном рисунке 3.
  3. Посев клеток
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: День 1 — Посев ACs в мозговой канал.
    1. Внесите 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в культуральную чашку с ACs. Осторожно встряхните для равномерного распределения.
    2. Инкубируйте при 37 °C в течение 1–2 мин до отсоединения клеток от поверхности чашки.
    3. Добавьте 3 мл среды для ACs (из этапа 2.1.1) для нейтрализации трипсина. Осторожно пропипетируйте для получения суспензии одиночных клеток.
    4. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 30 × g в течение 3 мин при 4 °C.
    5. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 20 µL среды для AC.
    6. Определите концентрацию клеток с помощью автоматического счетчика клеток и доведите плотность до 2,5 × 106 клеток/мл.
    7. Смешайте суспензию клеток ACs с Matrigel в соотношении 3:5 (v/v) (клетки AC : Matrigel).
    8. С помощью микропипетки внесите 10 µL смеси Matrigel-ACs в мозговой канал.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте процедуру загрузки, удерживая чип на льду, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию Matrigel.
    9. Инкубируйте чип при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 в течение 30 мин для полимеризации Matrigel и стабилизации клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: День 1 — Посев HCMECs в сосудистый канал.
    10. Нанесите 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте при 37 °C примерно 30 с до отсоединения клеток.
    11. Добавьте 3 мл среды для HCMECs (этап 2.1.2), чтобы остановить ферментативное переваривание.
    12. Осторожно пропипетируйте для создания однородной суспензии одиночных клеток.
    13. Соберите суспензию и центрифугируйте при 30 × g в течение 3 мин при 4 °C.
    14. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 20 µL среды для HCMECs.
    15. Подсчитайте количество клеток и доведите концентрацию до 2 × 106 клеток/мл.
    16. Осторожно внесите 10 µL суспензии HCMECs в сосудистый канал чипа.
    17. Разместите чип на боку в клеточном инкубаторе на 30 мин для стимуляции прикрепления эндотелиальных клеток к стенке канала.
    18. Внесите дополнительные 10 µL суспензии HCMECs в сосудистый канал для увеличения плотности эндотелия в сосудистом канале.
    19. Инкубируйте чип еще 30–60 мин для обеспечения адгезии HCMECs.
    20. Добавьте 10 µL смешанной культуральной среды в inlet чипа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанная среда состоит из среды для AC и среды для HCMECs в соотношении 1:1 (v/v).
      День 3 — Посев клеток U87-MG в канал глиомы.
    21. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в культуральную чашку и инкубируйте при 37 °C в течение 1–2 мин.
    22. Добавьте 3 мл среды для U87-MG (из этапа 2.1.3), чтобы прекратить переваривание.
    23. Осторожно пропипетируйте для получения гомогенной суспензии одиночных клеток.
    24. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 30 × g в течение 3 мин.
    25. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 20 µL среды для U87-MG.
    26. Подсчитайте концентрацию клеток и доведите плотность до 2 × 106 клеток/мл.
    27. Внесите 10 µL суспензии клеток U87-MG в канал глиомы чипа.
    28. Инкубируйте чип при 37 °C с 5% CO2 в течение 30–60 мин для прикрепления клеток.
    29. Добавьте 10 µL культуральной среды для U87-MG в inlet чипа.
    30. Поддерживайте микрофлюидное устройство в среде при 37 °C с 5% CO2 еще 48 ч для формирования плотных контактов эндотелия.

3. Оценка целостности ГЭБ

  1. Анализ проницаемости
    1. Приготовьте раствор флуоресцеин-изотиоцианат-декстрана (FITC-декстрана) с молекулярной массой 40 кДа в смешанной культуральной среде (среда для ACs : среда для HCMEC = 1:1, об/об) с конечной концентрацией 10 µg/mL.
    2. Введение 10 µL раствора FITC-декстрана в сосудистый канал.
    3. Поместите микрофлюидный чип на предметный столик инвертированного флуоресцентного микроскопа для получения флуоресцентных изображений как сосудистого канала, так и прилегающего канала мозга с интервалом в 20 минут, чтобы контролировать диффузию декстрана через эндотелиальный барьер.
    4. Количественно определите коэффициент проницаемости (Pприложение, см/с) по следующей формуле:
      Pприложение (см/с)= Уравнение эффективности процесса, включающее Fs, Fc, Δt; математическая формула для научных исследований.
      Где Pприложение является коэффициентом кажущейся проницаемости (см/с), FS является ли интенсивность флуоресценции в начальный момент времени в канале крови, FC является интенсивностью флуоресценции в канале мозга в конце интервала диффузии, где Δt — время диффузии (с), а VT — объем диффузии FITC-декстрана в канале мозга (см³).3), а A — площадь поверхности эндотелия (см2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкий коэффициент проницаемости указывает на более высокую целостность ГЭБ и формирование более плотного эндотелиального барьера.
    5. Выполните анализ данных и определение параметров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из значений интенсивности флуоресценции для каналов крови и мозга вычитали фоновый сигнал, полученный при измерениях в областях чипа, не содержащих клеток. Области интереса (ROI) определяли по обе стороны интерфейса «кровь-мозг» на основе длины диффузии флуоресценции. Площадь поверхности эндотелия (A) рассчитывали исходя из площади интерфейса между сосудистым каналом и каналом мозга (используя зазор между двумя микростолбиками в качестве эталона): 200 µm × 150 µm = 30,000 µm2 = 3 × 10-6 см2Объем диффузии FITC-декстрана (VT) определяли путем умножения расстояния проникновения диффузии в мозговом канале на A. Изображения флуоресценции получали каждые 20 мин (120 с) в течение 60 мин; коэффициент проницаемости рассчитывали на основе данных за 20-минутный интервал. Значения проницаемости рассчитывали по трем независимым чипам для каждой экспериментальной группы. Все пересчеты единиц измерения проводились перед выражением проницаемости в см/с.
  2. Иммунофлуоресцентный анализ ZO-1
    1. Трижды промойте микрофлюидные каналы фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы удалить остатки культурной среды.
    2. Зафиксируйте клетки, введя в каналы 4% раствор параформальдегида (PFA), и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
    3. Пермебилизируйте клетки 0,1% раствором Triton X-10 в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре.
    4. Заблокируйте неспецифическое связывание антител, инкубируя каналы с 2% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS в течение 45 минут при комнатной температуре.
    5. Введите первичные антитела к ZO-1 (разведение 1:20) в каналы и инкубируйте при 4 °C в течение ночи
    6. Тщательно промойте канал буфером PBS, чтобы удалить несвязавшееся первичное антитело.
    7. Инкубируйте чипы с антикроличными вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 55 (разведение 1:10), в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте.
    8. Проведите контрастное окрашивание ядер с помощью 1 µg/mL 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в течение 1 мин при комнатной температуре в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI чувствителен к свету, поэтому во время окрашивания его следует беречь от освещения.
    9. Трижды промойте каналы раствором PBS.
    10. Визуализируйте микрофлюидное устройство с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа и конфокального лазерного сканирующего микроскопа для определения локализации ZO-1 вдоль межклеточных контактов эндотелиальных клеток.

4. Доставка наномицелл через ГЭБ в клетки ГМО с помощью ультразвукового усиления

  1. Ультразвуковая стимуляция
    1. Осторожно извлеките чип из чашки для культивирования и поместите его в бокс биологической безопасности.
    2. Проведите ультразвуковую стимуляцию с использованием терапевтической ультразвуковой системы, оснащенной преобразователем с частотой 1 МГц (эффективная площадь излучения: 5 см²).2).
    3. Поместите между ультразвуковым датчиком и поверхностью микрофлюидного чипа акустическую связующую прокладку медицинского назначения толщиной 3 мм для обеспечения эффективной передачи акустического сигнала.
    4. Расположите ультразвуковой датчик непосредственно над областью сосудистого канала микрофлюидного устройства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха между преобразователем и чипом значительно снижают передачу акустической энергии, поэтому их следует избегать.
    5. Установите следующие параметры ультразвука: рабочий цикл: 60%; частота: 1 МГц; интенсивность: 1 Вт/см²2; продолжительность воздействия: 30 с; частота повторения импульсов (ЧПИ): 10 Гц. Подробные параметры ультразвука приведены в Дополнительная таблица 1.
    6. Для необлеченной контрольной группы поместите ультразвуковой датчик в то же положение, но убедитесь, что он остается неактивным, чтобы он служил имитационным контролем, обеспечивая идентичность процедур обращения без акустического воздействия.
    7. После воздействия ультразвука снимите соединительную прокладку и немедленно поместите чип обратно в стерильную культуральную чашку.
    8. Добавьте свежую культуральную среду в входные порты чипа.
    9. Инкубируйте устройство при 37 °C с 5% CO2 до проведения дальнейшего анализа.
  2. Оценка модуляции ГЭБ под воздействием ультразвука
    1. Выполните иммунофлуоресцентное окрашивание на ZO-1 сразу после ультразвукового воздействия (0 ч) и через 24 ч после воздействия, чтобы оценить изменения целостности плотных контактов.
    2. Следуйте процедуре иммунофлуоресцентного окрашивания, описанной в этапе 3.2.
    3. Сравните распределение окрашивания ZO-1 вдоль оси z для оценки влияния ультразвуковой стимуляции на целостность плотных контактов ГЭБ.
  3. Приготовление и характеристика наномицелл SFN@RB@SPM
    1. Подготовьте наномицеллы SFN@RB@SPM в соответствии с ранее установленным протоколом17Вкратце, основные растворы амфифильного пептида (обозначенного как SPM, 6 мг/мл), RB (0,6 мг/мл) и SFN (6 мМ) смешивали в объемном соотношении 1:1:1.
    2. Поместите смесь в ультразвуковой аппарат и подвергните воздействию ультразвука на частоте 28 кГц, 25 °C в течение 30 мин.
    3. Диализуйте смесь (порог отсечения по молекулярной массе: 10 Да) в течение 48 ч для удаления свободного RB и SFN.
    4. Измерьте размер и дзета-потенциал наномицелл методом динамического рассеяния света (ДРС). Данные характеристики представлены в Дополнительный рисунок 4.
  4. Оценка доставки наномицелл под воздействием ультразвука и их накопления в клетках глиомы
    1. Сразу после ультразвукового воздействия введите культуральную среду, содержащую наномицеллы, в сосудистый канал микрофлюидного устройства.
    2. Для оценки транспорта наномицелл через ГЭБ поместите микрофлюидный чип на предметный столик инвертированного флуоресцентного микроскопа и получите флуоресцентные изображения как сосудистого канала, так и прилегающего канала мозга с интервалом в 20 мин на протяжении 60 мин.
    3. Проведите количественный анализ флуоресцентных изображений в канале мозга для оценки проницаемости наномицелл, усиленной воздействием ультразвука.
    4. Для оценки накопления наномицелл в клетках глиомы инкубируйте устройство в стандартных условиях культивирования (37 °C, 5% CO22) в течение 3 ч после воздействия ультразвука, затем выполните визуализацию канала с глиомой с помощью флуоресцентного микроскопа для оценки внутриклеточного поглощения наномицелл.
  5. Статистический анализ
    1. Представьте все количественные данные в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего (SEM).
    2. Проведите каждый эксперимент с использованием трех независимых биологических повторностей (n = 3 чипа на каждое экспериментальное условие). Для каждой биологической повторности было выполнено не менее трех технических повторов (областей интереса [ROI] на один канал) для обеспечения достоверности данных.
    3. Вычислите коэффициент проницаемости (Pприложение(см/с) с каждого отдельного чипа служила основной единицей анализа для всех статистических сравнений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнение двух групп проводили с использованием двухстороннего t-критерия Стьюдента для независимых выборок t-критерийСравнения между тремя и более группами анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим применением апостериорного критерия Тьюки для множественных сравнений. Для экспериментов с двумя независимыми переменными проводили двухфакторный ANOVA с последующим применением критерия множественных сравнений Тьюки. Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения для статистического анализа и построения графиков. pзначение p <Значение 0,05 считалось статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для воссоздания структуры ГЭБ in vivo была разработана микрофлюидная чип-система с трикультурой, включающая HCMEC, первичные AC и клетки U87-MG (далее — «модель на чипе»). Как показано на Рисунке 1A,B, в устройстве расположены три параллельных канала: сосудистый (слева, синий), мозговой, заполненный Matrigel (центральный, розовый), и опухолевый (справа, зеленый), в которые соответственно засеваются HCMEC, AC и клетки U87-MG. Каналы разделены массивами микростолбиков...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данном протоколе описывается создание микрофлюидного чипа ГЭБ-ГБМ для оценки модуляции ГЭБ под воздействием ультразвука и доставки наномицелл. По сравнению с традиционными моделями ГЭБ in vitro (например, Transwell), эта микрофлюидная платформа позволяет осуществлять пространственно определенное совместное культивирование эндотелиальных клеток, астроцитов (AC) и клеток глиомы, что дает возможность исследовать транспорт лекарственных средств через физиологически релевантный ГЭБ. Несколько критических этапов про...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

При подготовке данной рукописи авторы использовали ChatGPT (OpenAI) исключительно для редактирования и улучшения языка. Авторы проверили и отредактировали весь контент, созданный с помощью ИИ, и несут полную ответственность за точность и целостность рукописи. Инструменты ИИ не использовались для генерации данных, анализа или подготовки рисунков.

Благодарности

Мы с благодарностью подтверждаем получение финансирования от Провинциального фонда естественных наук Чжэцзяна (LQ24H160003), Фонда медицинских научных исследований провинции Чжэцзян (2024KY351), Фонда естественных наук Нинбо (2023J365), Программы привлечения талантов Юнцзян (Проект молодых инновационных талантов, 2021A-012-G) и Программы талантов Бэйань района Цзянбэй, Нинбо (2023RC004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
вторичные антитела против кролика, конъюгированные с Alexa Fluor 555Cell Signaling Technology, Inc.4413
антитела к ZO-1Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
Панч-биопсияZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
Бычий сывороточный альбуминAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
Счетчик клетокThermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
Чашка для культивирования клеток (100 мм)Corning Inc.430167
ЦентрифугаBeckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
Хромированная маскаSuzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.ZX-GBYM
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопCarl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
РазработчикSuzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
внеклеточный матриксScienCell Research Laboratories1001
ЭтанолХимический завод Ningbo Zhenhai Yongfeng6923193900015
Фетальная бычья сывороткаScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)Проект с открытым исходным кодомДанные отсутствуют
ФИТЦ-декстран (40 кДа)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
Предметные стеклаCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
GraphPad Prism 9.5GraphPad Software, Inc.Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, отправьте текст, который необходимо перевести.
Эндотелиальные клетки микрососудов головного мозга человека (HCMECs)Коллекция культур BeNaBNCC337717
ИнкубаторEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
Инвертированный флуоресцентный микроскопNikon Instruments Inc.TS2-FL
ИзопропанолSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
MEM (среда с минимальным количеством эфирных экстрактов)Pricella Life Science & Technology Co., Ltd.PM150410
АзотNingbo Baifang Gas CO., Ltd.Н/П
КислородNingbo Baifang Gas CO., Ltd.Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, отправьте текст, который необходимо перевести.
Параформальдегид (ПФА, 4%)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500мл
ФСБ (фосфатно-солевой буфер)ScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
ПДМСCorning Inc.220777
Пенициллин/стрептомицинPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
ФотолитографияИнститут оптики и электроники Китайской академии наукURE-2000\AL
Хот-плейт для фотолитографииSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
Плазменный асшерTIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
Первичные астроцитыПеревод отсутствует, так как исходный текст не был предоставлен. Пожалуйста, введите текст для перевода.Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, отправьте текст, который необходимо перевести.Выделены из мозга новорожденных крыс (1–3-го дня жизни)
Кремниевая пластинаZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
Центрифуга для нанесения покрытий (спин-коатер)Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
ТрипсинScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
клетки U87-MGPricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
Ультразвуковой аппарат Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4(blue edition)Carl Zeiss AGНет данных

Ссылки

  1. Narsinh KH, Perez E, Haddad AF, Young JS, Savastano L, Villanueva-Meyer JE, et al. Strategies to improve drug delivery across the blood-brain barrier for glioblastoma. Curr Neurol Neurosci Rep. 2024;24(5):123-139.
  2. Xie Y, Yang F, He L, Huang H, Chao M, Cao H, et al. Single-cell dissection of the human blood-brain barrier and glioma blood-tumor barrier. Neuron. 2024;112(18):3089-105 e7.
  3. Scalise AA, Kakogiannos N, Zanardi F, Iannelli F, Giannotta M. The blood-brain and gut-vascular barriers: from the perspective of claudins. Tissue Barriers. 2021;9(3):1926190.
  4. Sivandzade F, Cucullo L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(10):1667-1681.
  5. Shawahna R, Decleves X, Scherrmann JM. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 2013;14(1):120-136.
  6. Oddo A, Peng B, Tong Z, Wei Y, Tong WY, Thissen H, et al. Advances in Microfluidic Blood-Brain Barrier (BBB) Models. Trends Biotechnol. 2019;37(12):1295-1314.
  7. Hajal C, Offeddu GS, Shin Y, Zhang S, Morozova O, Hickman D, et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nat Protoc. 2022;17(1):95-128.
  8. Xu H, Li Z, Yu Y, Sizdahkhani S, Ho WS, Yin F, et al. A dynamic in vivo-like organotypic blood-brain barrier model to probe metastatic brain tumors. Sci Rep. 2016;6:36670.
  9. Park J, Wetzel I, Marriott I, Dreau D, D'Avanzo C, Kim DY, et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 2018;21(7):941-951.
  10. Park TE, Mustafaoglu N, Herland A, Hasselkus R, Mannix R, FitzGerald EA, et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nat Commun. 2019;10(1):2621.
  11. Peng B, Tong Z, Tong WY, Pasic PJ, Oddo A, Dai Y, et al. In situ surface modification of microfluidic blood-brain-barriers for improved screening of small molecules and nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(51):56753-56766.
  12. Mainprize T, Lipsman N, Huang Y, Meng Y, Bethune A, Ironside S, et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: a clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 2019;9(1):321.
  13. Adriani G, Ma D, Pavesi A, Kamm RD, Goh EL. A 3D neurovascular microfluidic model consisting of neurons, astrocytes and cerebral endothelial cells as a blood-brain barrier. Lab Chip. 2017;17(3):448-459.
  14. Silvani G, Scognamiglio C, Caprini D, Marino L, Chinappi M, Sinibaldi G, et al. Reversible cavitation-induced junctional opening in an artificial endothelial layer. Small. 2019;15(51):e1905375.
  15. Beekers I, Vegter M, Lattwein KR, Mastik F, Beurskens R, van der Steen AFW, et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 2020;322:426-438.
  16. Qiao C, Luo S, Liu Z, Bu Y, Cai Y, Liu Z, et al. Tuning endothelial barrier permeability with ultrasound: a pulse-length-dependent interplay between bubble dynamics and cellular bioeffects. Ultrason Sonochem. 2026;129:107851.
  17. Li Y, Yang X, Wei Z, Niu H, Wu L, Chen C, et al. Sulforaphane wrapped in self-assembled nanomicelle enhances the effect of sonodynamic therapy on glioma. Pharmaceutics. 2024;17(1):34.
  18. Yuan W, Lv Y, Zeng M, Fu BM. Non-invasive measurement of solute permeability in cerebral microvessels of the rat. Microvasc Res. 2009;77(2):166-173.
  19. Lee SWL, Campisi M, Osaki T, Possenti L, Mattu C, Adriani G, et al. Modeling nanocarrier transport across a 3D in vitro human blood-brain-barrier microvasculature. Adv Healthc Mater. 2020;9(7):e1901486.
  20. Mehta RI, Carpenter JS, Mehta RI, Haut MW, Ranjan M, Najib U, et al. Blood-brain barrier opening with MRI-guided focused ultrasound elicits meningeal venous permeability in humans with early Alzheimer disease. Radiology. 2021;298(3):654-662.
  21. Cho H, Seo JH, Wong KH, Terasaki Y, Park J, Bong K, et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 2015;5:15222.
  22. Campisi M, Shin Y, Osaki T, Hajal C, Chiono V, Kamm RD. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  23. Wang YI, Abaci HE, Shuler ML. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. 2017;114(1):184-194.
  24. Jiang L, Li S, Zheng J, Li Y, Huang H. Recent progress in microfluidic models of the blood-brain barrier. Micromachines (Basel). 2019;10(6):375.
  25. Bonkowski D, Katyshev V, Balabanov RD, Borisov A, Dore-Duffy P. The CNS microvascular pericyte: pericyte-astrocyte crosstalk in the regulation of tissue survival. Fluids Barriers CNS. 2011;8(1):8.
  26. Hurtado-Alvarado G, Cabanas-Morales AM, Gomez-Gonzalez B. Pericytes: brain-immune interface modulators. Front Integr Neurosci. 2014;7:80.
  27. Santa-Maria AR, Walter FR, Figueiredo R, Kincses A, Vigh JP, Heymans M, et al. Flow induces barrier and glycocalyx-related genes and negative surface charge in a lab-on-a-chip human blood-brain barrier model. J Cereb Blood Flow Metab. 2021;41(9):2201-2215.
  28. van der Helm MW, van der Meer AD, Eijkel JC, van den Berg A, Segerink LI. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 2016;4(1):e1142493.
  29. Alluri H, Peddaboina CS, Tharakan B. Evaluation of tight junction integrity in brain endothelial cells using confocal microscopy. Methods Mol Biol. 2024;2711:257-262.
  30. Nitta T, Hata M, Gotoh S, Seo Y, Sasaki H, Hashimoto N, et al. Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice. J Cell Biol. 2003;161(3):653-660.
  31. Ben-Zvi A, Lacoste B, Kur E, Andreone BJ, Mayshar Y, Yan H, et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 2014;509(7501):507-511.
  32. Andreone BJ, Chow BW, Tata A, Lacoste B, Ben-Zvi A, Bullock K, et al. Blood-brain barrier permeability is regulated by lipid transport-dependent suppression of caveolae-mediated transcytosis. Neuron. 2017;94(3):581-594 e5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель глиобластомыультразвуковое открытие ГЭБпроницаемость ГЭБэндотелиальные клеткикокультивирование с астроцитамианализ с FITC-декстраномтранспорт наномицелл

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.