Демонстрация флуоресцентного пептидил-ингибитора, направленного на митохондриальную ClpXP с помощью флуоресцентной микроскопии в млекопитающих

Краткое содержание

Этот протокол устанавливает количественный процесс визуализации, включающий применение конфокальной микроскопии для мониторинга селективной локализации ингибитора флуоресцентного пептидилClpP FAM-FAPAL-CMK (Карбоксифлуоресцеин-FAPAL-хлорметилкетон) в митохондриях с целью воздействия на ClpP, а также последующих морфологических изменений митохондрий в целостных клетках, вызванных ингибицией ClpP.

Аннотация

Митохондриальные АТФ-зависимые протеазы необходимы для поддержания гомеостаза белков за счёт разрушения повреждённых или неправильно свернутых белков. Среди них протеазный комплекс ClpXP находится в митохондриальной матрице и способствует контролю качества митохондрий в физиологических и стрессовых условиях. Данная работа демонстрирует количественный процесс флуоресцентной микроскопии для оценки митохондриального таргетирования ингибитора флуоресцентного пептидилла FAM-FAPAL-CMK и оценки морфологических изменений митохондрии, связанных с ингибитором ClpXP в клетках млекопитающих. Клетки HeLa были обработаны FAM-FAPAL-CMK и проанализированы с помощью конфокальной микроскопии в сочетании с иммунофлуоресцентным окрашиванием митохондриальных маркеров и количественным анализом изображений. Колокализационный анализ с использованием порога Костеса и коэффициентов перекрытия Мандерса показал митохондриальное обогащение ингибитора. В результате ингибирование ClpP изменило морфологию митохондрий. Анализ иммуноблот не показал значимых изменений в содержании белка ClpP при лечении ингибиторами. В совокупности данная работа описывает воспроизводимый рабочий процесс на основе визуализации, который позволит исследовать функции митохондриального ClpXP в целостных клетках в ответ на нарушения гомеостаза, такие как окислительный стресс.

Введение

Митохондриальные АТФ-зависимые протеазы являются центральными для гомеостаза белков, разрушая неправильно свернутые или повреждённые^белки 1,2,3,4,5,6. Среди них ClpXP — гетероолигомерный протеазный комплекс AAA+, расположенный в митохондриальной матрице. АТФаза ClpX распознаёт и раскрывает белки, затем транслокацирует их в протеолитическую камеру^{ClpP 7,8,9}. Вместе с другими митохондриальными протеазами ClpXP поддерживает контроль качества белка как в нормальных, так и при стрессовых условиях, включая окисляющий стресс и метаболические нарушения ^1,2,4. Нарушение гомеостаза белков митохондрий связано с такими заболеваниями, как нейродегенерация и рак, что подчёркивает важность понимания этих активностей протеазы в целостных^{клеточных системах 3,6,10}.

Одной из основных проблем в этой области является отсутствие методов прямого мониторинга активности митохондриальных протеазы с пространственным разрешением в целостных клетках. Существующие подходы в основном основаны на биохимических анализах с использованием очищенных белков или клеточных лизата, которые предоставляют подробную кинетическую информацию, но не сохраняют субклеточный^{контекст} 11,12,13,14. Стратегии химической биологии частично устранили это ограничение путём разработки фторогенных пептидных субстратов и ингибиторов, направленных на активные участки. Флуоресцентные пептидиловые субстраты позволяют количественно измерять активность пептидаз, зависящей от АТФ, в то время как ингибиторы пептидил формируют обратимые ковалентные взаимодействия с протеолитическим сайтом для достижения селективного^{ингибирования} 13,15,16,17,18,19. Ранее было показано, что лабораторно синтезированный ингибитор ClpXP FAPAL-CMK образует ковалентную связь с^{ClpP 20}. В этом исследовании был разработан FAM-FAPAL-CMK, флуоресцеин-меченый производный FAPAL-CMK, как механизмно-основанный ингибитор ClpP, позволяющий визуализировать его внутриклеточную локализацию.

По сравнению с биохимическими анализами, конфокальная флуоресцентная микроскопия позволяет пространственно разрешённо оценивать распределение зонда и морфологию митохондрий в целостных клетках, предоставляя информацию, которую невозможно получить только из лизатов. Однако, в отличие от ферментативных тестов, локализация флуоресценции не измеряет напрямую каталитическую активность или молекулярные связывающие события и может зависеть от эффективности захвата зонда, динамики митохондрий и условий визуализации. Кроме того, успешная реализация зависит от достаточного накопления зонда и достаточного разрешения митохондриальных сетей, что делает этот рабочий процесс наиболее подходящим для приклеенных культивируемых клеток с чётко различимой морфологией митохондрий.

Цель данного исследования — создать количественный рабочий процесс, который интегрирует механизмно-ориентированные флуоресцентные зонды с конфокальной микроскопией для мониторинга локализации и функционирования митохондриальных протеаз в целостных клетках. Сочетая селективные химические зонды с высокоразрешающей конфокальной визуализацией, этот рабочий процесс позволяет оценить локализацию митохондрий, распределение зондов и морфологические реакции на нарушения гомеостаза митохондрий в целостных клетках. Он может дополнять существующие биохимические анализы, которые напрямую измеряют активность протеаз, но не имеют пространственного разрешения.

Протокол

Эксперименты проводились с использованием коммерчески доступных клеток HeLa. Не использовались человеческие участники, позвоночные животные или первичные биологические материалы, полученные от человека или позвоночных. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Культивирование и обработка клеток

1. Культивировать клетки HeLa в модифицированной среде Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco, дополненных 10% сывороткой плода (FBS) при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2.
2. Клетки на стерильных стеклянных накладках и инкубировать 24 часа для прикрепления клеток.
3. Растворить ингибитор FAM-FAPAL-CMK в DMSO, чтобы подготовить приклад с толщиной 50 мкм и заморозить при -20 °C для хранения.
4. Добавьте 50 нм fam-fapal-cmk в среду роста клеток в обработанных образцах.
5. Добавьте равный объём DMSO для контрольных образцов, чтобы соответствовать итоговой концентрации растворителя образцов, обработанных ингибиторами, чтобы какие-либо эффекты не были вызваны DMSO.
6. Инкубировать клетки ещё 18 часов в тех же условиях культуры перед последующей обработкой.
   Примечание: ингибитор FAM-FAPAL-CMK разработан в лаборатории и синтезирован, а метод синтеза ранее сообщался^{о 20} раз.

2. Фиксация и проницаемость

1. Промыйте клетки с предварительно подогретым D-PBS в течение 5 минут и повторите один раз.
2. Зафиксируйте клетки на 15 минут при комнатной температуре с помощью буфера PHEM (68 мМ PIPES, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mM MgCl₂, pH 6,9), содержащего 2,4% (v/v) формальдегида, 0,05% (v/v) глутаральдегида и 0,5% (w/v) сапонина.
3. Приготовьте свежий раствор борогидрида натрия (5 мг/мл в D-PBS).
4. Инкубировать клетки в растворе борогидрида натрия в течение 15 минут при комнатной температуре для нейтрализации остаточного глутаральдегида.
5. Промывайте клетки трижды D-PBS по 5 минут перед окрашиванием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид и глутаральдегид — токсичные фиксативные средства. Выполняйте фиксационные действия в капюшоне и носите соответствующие средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторный халат и защиту глаз). Боргидрид натрия — это реактивное восстановитое вещество, и с ним следует обращаться осторожно. Фиксационный буфер на основе PHEM, содержащий формальдегид, глутаральдегид и сапонин, был выбран для сохранения морфологии митохондрий при сохранении доступности антигена во время иммунокрашивки. Формальдегид и глутаральдегид обеспечивают перекрёстное сшивание белков для сохранения структуры, а буферный состав и pH PHEM помогают стабилизировать митохондриальную^{ультраструктуру 21}. Сапонин способствует проницаемости мембран, повышая скорость фиксирующего проникновения. Эта стратегия фиксации минимизирует искажение митохондриальных сетей и особенно подходит для количественного анализа морфологии митохондрии.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Блок-клетки на 1 час при комнатной температуре в блокирующем буфере, содержащие 3% (w/v) бычьей сыворотки альбумина (BSA) в PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na_{2HPO 4}, 1,8 мМ KH₂PO₄, pH 7,4) с 0,1% (v/v) Triton X-100.
2. Инкубировать клетки с первичными антителами, разбавлёнными в блокирующем буфере, в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте mouse anti-TOMM20 (1:500) и rabbit anti-ClpP (1:500).
3. Промывайте клетки три раза PBS по 5 минут каждая, чтобы удалить несвязанные первичные антитела.
4. Инкубировать клетки с разбавлёнными вторичными антителами в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте вторичные антитела мыши, конъюгированные с CF405S (1:500) и вторичные антитела к кролику, конъюгированные с Alexa Fluor 647 (1:500).
5. Защитить образцы от света во время и после инкубации вторичных антител.
6. Повторите шаг 3.3.
7. Крепите крышки на стеклянные затворы с помощью монтажного материала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ClpP и TOMM20 визуализировались на расстоянии 405 нм и 647 нм, чтобы избежать спектрального перекрытия с сигналами FAM.

4. Получение изображений

1. Получайте изображения с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с высокочисленной апертурой с масляным погружением в масло.
2. Возбуждайте флуорофоры с помощью лазерных линий диаметром 405 нм и 633 нм. Используйте соответствующие дихроические делители луча для отражения возбуждающего света и передачи излучаемой флуоресценции на детекторы.
3. Установите размер пикселя на 35,3 нм (X, Y) и Z-шаг на 0,1 мкм, чтобы обеспечить достаточное осевое отбор митохондриальных структур.
4. Получите изображения с кадром размером 1900 x 1900 пикселей (X, Y) и соберите по 5 оптических сечений на Z-стек, начиная с верхнего митохондриального сигнала и заканчиваясь ниже митохондриального сигнала, чтобы обеспечить сбор преобладающего митохондриального сигнала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные настройки для получения микроскопа приведены на дополнительном рисунке 1. Для клеток HeLa митохондрии обычно представляют собой тонкие трубчатые структуры, диаметром около 0,5–1 мкм⁽²²). Таким образом, Z-объем 0,5 мкм достаточно, чтобы захватить значительную часть отдельной митохондриальной матрицы, но не обязательно всю ячейку. Был выбран 5-секционный Z-стек для сбалансирования достаточного отбора образцов митохондриальных структур с быстрым получением изображений, чтобы минимизировать артефакты, связанные с движением, во время клеточной визуализации.

5. Лечение живыми клетками и визуализация

1. Культивировать клетки HeLa на стеклянных чашах диаметром 35 мм в DMEM с 10% FBS при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2.
2. Добавьте ингибитор (конечная концентрация: 50 нм) или эквивалентный объём DMSO в клетки через 24 часа после посева. Инкубировать клетки ещё 18 часов в стандартных условиях культуры.
3. Удалите посевную среду с ингибитором или DMSO и промывайте клетки один раз предварительно подогревшей D-PBS на 5 минут.
4. Добавьте раствор для живых клеток с 20 нМ MitoTracker DeepRed.
5. Проведите живую камеру при комнатной температуре, используя те же настройки микроскопа, что и выше. Получайте изображения в режиме сканирования за кадр с примерно 4,72 с на оптический разрез (около 24 с в общей сложности на 5-секционный Z-стек).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пять оптических секций на Z-стек установлены для баланса достаточного отбора образцов митохондриальных структур с управляемым временем их получения. Кроме того, для снижения подвижности митохондрий используется раствор для изображения живых клеток комнатной температуры по сравнению с изображением при 37 °C. Хотя движение митохондрий во время живых клеток может способствовать вариативности измерений колокализации, согласованные настройки сбора во всех образцах помогают снизить систематическое искажение. Репрезентативные настройки программного обеспечения показаны на дополнительном рисунке 2.

6. Анализ морфологии митохондрий

1. Откройте файлы изображений на Fiji²³ и генерируйте проекции максимальной интенсивности из Z-стеков, выбрав Image → Stacks → проект Z и Max Intensity.
2. Примените метод погоя Otsu, перейдя в Image → Adjust → Threshold и выбрав Otsu из этих параметров. Примените порог к сегментируемым митохондриям.
3. Запустите плагин Mitochondria^{Analyzer 24} и выберите режим 2D-анализа на каждом мито.
4. Измерьте размер (площадь) и периметр митохондрий с помощью выхода анализатора митохондрий.
5. Получите значения форм-фактора митохондрий непосредственно с выхода Митохондриального анализатора, где форм-фактор рассчитывается как P²/(4πA), где P обозначает периметр, а A — площадь.
6. Измеряйте общую длину ветви на митохондрию с помощью функции сетевого анализа внутри плагина для оценки митохондриальной связности.
7. Представлены данные как распределения отдельных митохондриальных измерений вместе со средними значениями, полученными из 30 клеток на состояние в трёх независимых биологических репликах.
8. Оцените статистическую значимость с помощью T-теста Уэлча в программном обеспечении для статистического анализа.

7. Анализ колокализации

1. Открывайте файлы с изображениями на Фиджи и генерируйте 2D-проекции максимальной интенсивности из 3D-стеков изображений. Для согласованности анализируйте все образцы с помощью одинаковой стратегии проекции и сбора.
2. Разделяйте флуоресцентные каналы, выбрав Изображение → Цвет → Разделённые каналы.
3. Запустите плагин Coloc 2, выбрав раздел Plugins → Colocalization → Coloc 2.
4. Назначьте соответствующие каналы для анализа и включите регрессию порога затрат в настройках плагинов. Проводите анализ по ячейкам.
5. Запишите коэффициенты перекрытия Мандерса (M1 и M2), чтобы оценить долю сигнала в каждом канале, которая пространственно совпадает с другой.
6. Включите рандомизацию Costes в настройках Coloc 2 и установите количество рандомизаций на 50 для оценки статистической значимости.

8. Генерация лизата клетки

1. Семена HeLa клеток в DMEM с 10% FBS и инкубировать при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2.
2. Добавьте 50 нМ ингибитора или эквивалентного объёма DMSO в клетки через 24 часа после посева и инкубировать ещё 18 часов при стандартных условиях культуры.
3. Снимите культурную среду и прополосните клетки предварительно подогретым D-PBS на 5 минут, затем попробуйте отсоединить клетки.
4. Закалить трипсинизацию свежей клеточной формой для роста и центрифугой при 300 г в течение 3 минут при комнатной температуре. Отбросьте супернатант.
5. Снова суспензировать клеточную гранулу в D-PBS и центрифугировать при 300 г на 3 минуты для промывки клеток. Отбросьте супернатант.
6. Суспензировать клеточную гранулу в предварительно охлаждённом лизисном буфере (50 мМ Tris-HCl, pH 7,6, 150 мМ хлорида натрия, 0,1% SDS, 0,5% натрия дезоксихолата, 2% CHAPS, 10 мМ TCEP, 1 мМ PMSF, 1x коктейль с ингибиторами протеаз).
7. Инкубировать лизаты на льду в течение 20 минут и сониковать лизат в ледяной водяной бане в течение 2 минут, чтобы обеспечить полный лизис.
8. Центрифуга лизирует при 13 000 x г, 4 °C в течение 20 минут.
9. Перенесите очищенный супернатант в свежую предварительно охлаждённую трубку для дальнейшего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ПМСФ токсичен и должен содержаться в вытяжной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты. SDS — это раздражитель, а соникация генерирует тепло и аэрозоли. Выполняйте этапы лизисирования и соникации на льду и соблюдайте институциональные рекомендации по безопасности.

9. Брэдфордский анализ

1. Подготовьте набор стандартных растворов с использованием BSA с хлоридом натрия 0,15 М. Концентрации: 0, 0,02 мг/мл, 0,04 мг/мл, 0,06 мг/мл, 0,08 мг/мл, 0,10 мг/мл.
2. Разбавить неизвестный клеточный лизат в 50 и 100 раз в 0,15 М хлорида натрия.
3. Пипетт воспроизводит каждое стандартное решение кривой и неизвестные образцы в 96-ядровую пластину.
4. Добавьте реагент Брэдфорда в каждую скважину. Для каждой скважины используйте раствор белка 160 мкл с реактивом 40 мкл 5x Брэдфорда (коммерчески доступно). Аккуратно перемешивайте, пипетируйте.
5. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 10 минут и измерить поглощение при 595 нм с помощью считывателя пластин.
6. Сгенерируйте стандартную кривую, отображив концентрации BSA по оси x и усреднённую поглощённость на 595 нм по воспроизведению измерений по оси y.
7. Определите концентрацию белков в образцах с помощью стандартной кривой. Умножьте значения на коэффициент разбавления, чтобы получить исходную концентрацию.

10. Иммуноблотинг

1. Загрузите равное количество лизата клетки на 12% полиакриламидный гель и разделите белки с помощью SDS-PAGE.
2. Активируйте мембрану PVDF, кратковременно погрузив её в этанол. Уравновесьте мембранную и промокающую бумагу в буфере переноса.
3. Переносите белки из геля на мембрану PVDF с помощью полусухой системы переноса.
4. Заблокируйте мембрану 5% (w/v) обезжиренным сухим молоком в TBS (20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,6) при комнатной температуре в течение 1 часа с мягким перемешиванием.
5. Инкубировать мембрану с первичным антителом, разбавлённым в блокирующем буфере при комнатной температуре в течение 1 часа с мягким перемешиванием. Используйте анти-ClpP (1:2000) и мыши антибета-актин (ACTB, 1:10 000).
6. Промыйте мембрану трижды с помощью TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) до 20, pH 7,6) в течение 5 минут за промывку, чтобы удалить несвязанные антитела.
7. Инкубировать мембрану вторичным антителом, сопряжённым с HRP, разбавленной в блокирующем буфере (1:3000) при комнатной температуре в течение 1 часа с мягким перемешиванием.
8. Повторите этап стирки.
9. Обнаружить белковые диапазоны с помощью реагентов для обнаружения хемилюминесцентного обнаружения.

11. Денситометрический анализ

1. Откройте образ западного пятна на Фиджи.
2. Измените тип изображения на 8-битный по Image → тип → 8-битный.
3. Вычтите фон изображения по Процессу → вычтите фон. Проверьте фон света и установите радиус вращающегося шара на 50,0 пикселей.
4. Обведите полосу на первой полосе с помощью инструмента прямоугольника, затем выберите анализ → геля → первую полосу.
5. Переместите инструмент прямоугольника на вторую полосу и выберите анализ → гель → выбрать следующую. Повторяйте этот шаг, пока не будут выбраны все полосы.
6. Постройте плотность полос, анализируя → гели → линии графика.
7. Используйте инструмент прямой линии, чтобы нарисовать линию внизу пика плотности полосы, а палочкой — для считывания плотности полосы.
8. Повторите ту же процедуру из шагов 11.1–11.8 на образе блота управления загрузкой.
9. Сообщите относительную плотность зоны, деля плотность (ClpP) на плотность (ACTB).

Результаты

Ингибирование ClpP изменяет морфологию митохондрий и организацию сети
Была изучена морфология митохондрий для определения, изменяет ли ингибиция ClpP организацию митохондрий в клетках HeLa. Репрезентативные флуоресцентные изображения показали явные различия в организации митохондрий между контрольными и FAM-FAPAL-CMK клетками (рисунок 1A). Количественный анализ показал, что площадь митохондрий уменьшилась с 1,15 ± 4,8^{мкм 2} (n =...

Обсуждение

Ранее было показано, что пептидилхлорметилкетон FAPAL-CMK¹⁵ может быть потенциально необратимым ингибитором субъединицы протеазы (ClpP) митохондриальной АТФ-зависимой протеазы ClpXP. Хотя кинетические эксперименты продемонстрировали силу ингибитора и механизм действия, подход in vitro не смог оценить эффективность FAPAL-CMK как селективного митохондриального ингибитора ClpP в целостных клетках. Флуоресцентная конфокальная микроскопия подтвердила, что FAM-...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Alexa Fluor 647-conjugated rabbit secondary antibody	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin mouse antibody	Proteintech	66009
bovine serum albumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP rabbit PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-conjugated mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fetal bovine serum	R&D Systems	S11550
glutaraldehyde, 70% solution	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-conjugated nouse antibody	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-conjugated rabbit antibody	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging solution	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin for Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
mouse anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Potassium Chloride	Alfa Aesar	11595
potassium phosphate monobasic	VWR	BDH9268
ProLong mounting medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponin	Thermo Scientific	A18820.14
sodium borohydride	Thermo Scientific	200050250
Sodium Chorlde	VWR	BDH9286
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	VWR	0227
sodium phosphate dibasic	AMERSCO	0348
Software name	Version information
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3