Профилирование эластичных волокон в тканях легких с помощью количественного анализа визуализации

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, подробно описывающий подготовку тканей для визуализации эластичных волокон и количественного профилирования в ткани лёгких мышей. Этот метод позволяет надёжно оценить архитектуру тканей, пространственную организацию волокон и ремоделирование внеклеточного матрикса в физиологических и патологических условиях.

Аннотация

Ремоделирование легочного внеклеточного матрикса (ЭКМ) является ключевой особенностью повреждений и заболеваний легких. Эластичные волокна являются центральным компонентом ЭКМ легких, обеспечивая устойчивость и отдачу, необходимые для нормальной дыхательной функции, а их нарушение способствует нарушению механики тканей. Этот протокол описывает надёжный, воспроизводимый рабочий процесс по подготовке и анализу мышиной легкой ткани с акцентом на визуализацию и количественное профилирование эластичных волокон. В нём изложены оптимизированные методы обработки тканей и гистологического окрашивания для сохранения и обнаружения структур эластина. Кроме того, протокол описывает конвейер анализа изображений, позволяющий количественно оценивать содержание, организацию и пространственное распределение эластичных волокон в лёгких. Рабочий процесс дополнительно включает оценку векторов окраски в QuPath, цветовую деконволюцию в Fiji/ImageJ и анализ изображений на основе TWOMBLI для количественной оценки количества, ветвления и сложности сетей упругих волокон. Включены стратегии получения изображений, выбора регионов интереса, оптимизации параметров и контроля качества для обеспечения воспроизводимости и минимизации пользовательского искажения. Используя этот рабочий процесс, мы успешно выявили изменения в организации эластичных волокон и архитектуре сети в лёгких мышей с ожирением, что продемонстрировало их применимость для выявления ремоделирования ЭБМ, связанного с заболеваниями. Вместе эти подходы предоставляют комплексную основу для изучения ремоделирования эластичных волокон и его вклада в архитектуру тканей в физиологических и патологических условиях. Этот метод облегчает изучение структурных изменений, вызванных фибробластами, и поддерживает механистическое понимание изменений ЭКМ, лежащих в основе заболеваний легких.

Введение

Эластичные волокна — это важные компоненты легочного внеклеточного матрикса (ЭКМ), состоящие преимущественно из эластина и связанных с ним микрофибриллярных белков, которые собираются в высокоорганизованные, устойчивые сети¹. В лёгких эластичные волокна расположены вдоль альвеолярных перегородок и перибронхиальных структур, обеспечивая эластичность и отдачу, необходимые для нормальной дыхательной^{механики 1,2}. Будучи одним из самых распространённых структурных компонентов ЭКМ в тканях, таких как лёгкое, аорта и матка, его целостность критически важна для поддержания тканевой^{комплаенсированности 1,2}. Нарушение организации эластичных волокон наблюдалось при ряде заболеваний лёгких, включая фиброз, эмфизему и хронические воспалительные состояния, где изменённая структура волокон способствует нарушению функции лёгких и механических^{свойств 2,3}.

Матрисома лёгких была недавно охарактеризована, выявив основные белки ЭКМ, такие как коллагены и ламинины, а также связанные с матрисомами компоненты, включая цитокины, регуляторы ЭКМ и белки, связанные с ЭКМ (например, интегриновые лиганды, галектины)^4,5. Помимо структурной поддержки, эти компоненты активно регулируют функцию тканей и формируют специализированные ниши, поддерживающие резидентные и мигрирующие клетки ^6,7. Примечательно, что недавние исследования подчеркнули, что метаболические состояния, такие как ожирение, связаны с существенными изменениями в организации эластичных волокон, связывая системную метаболическую дисрегуляцию с изменениями в архитектуре ЭКМ лёгких и функции^{фибробластов 3}. Эти результаты подчёркивают важность понимания ремоделирования эластичных волокон как динамического и релевантного для заболевания процесса.

Традиционная оценка эластичных волокон часто опирается на качественную гистологическую оценку, полуколичественные системы оценки или измерения содержания эластина, которые дают ограниченную информацию об организации, связности и сложности сети ^8,9. Хотя эти подходы полезны для выявления грубых изменений содержания эластина, они могут не учитывать тонкие архитектурные изменения, связанные с ремоделированием тканей. Количественный анализ на основе изображений может преодолеть эти ограничения, позволяя объективно и воспроизводимую характеристику эластичных волоконных сетей и способствуя сравнению между экспериментальными условиями и исследованиями. Для решения этой проблемы описанный здесь протокол позволяет интегрированно анализировать организацию лёгочных РЭБ с особым акцентом на архитектуру эластичных волокон. В дополнение к устоявшимся подходам к характеристике^{ECM 4,5}, этот рабочий процесс включает окрашивание Elastica и конвейер анализа¹⁰ изображений на основе TWOMBLI, оптимизированный для архитектуры тканей лёгких. Сочетая окрашивание Elastica с количественным сетевым анализом, этот рабочий процесс выходит за рамки традиционной гистологической оценки и позволяет детально охарактеризовать содержание волокон, фрагментацию, пространственную организацию и структурную сложность. Протокол особенно подходит для исследований фиброза, эмфиземы, ремоделирования лёгких, связанных с ожирением, воспалительных заболеваний лёгких, старения и других состояний, характеризующихся ремоделированием внеклеточного матрикса в лёгких.

Протокол

Все описанные здесь эксперименты на мышях были проведены в соответствии с одобрением Комитета по этике животных земли Северный Рейн-Вестфалия, Германия (AZ: 81-02.04.2021.A221).

ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей процедуры носите соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки, защитные глаза).

1. Отбор проб и подготовка мышиной легкой ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были эвтаназированы изофлураном в соответствии с институциональными и государственными рекомендациями до сбора тканей.

1. Аккуратно откройте грудную полость с разрезом по средней линии, затем разрезайте диафрагму вдоль её крепления и аккуратно обнажите лёгкие.
2. Удалите всё лёгкое, вырезая правую и левую доли вместе, стараясь сохранить все доли целыми.
3. Поместить доли легких отдельно в трубку объёмом 5 мл с 2 мл 10% нейтрального буферного формалина и инкубировать 15–20 часов при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация сохраняет архитектуру тканей для последующих гистологических и эластичных анализов волокон. Поскольку основной целью этого рабочего процесса была визуализация и количественная оценка организации эластичных волокон, а не альвеолярный морфометрический анализ, лёгкие не фиксировались по надуванию до обработки тканей.
   ВНИМАНИЕ: Нейтральный буферный формалин содержит формальдегид, который токсичен, канцерогенен и может вызывать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Обращайтесь с формалином в сертифицированной химической вытяжке, одновременно нося соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторный халат и защитные очки.
4. Внедрить фиксированную ткань лёгких в парафин с использованием стандартного гистологического протокола^{вложения 11}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте полное обезвоживание и инфильтрацию парафина для поддержания морфологии тканей для последующего окрашивания. Чтобы минимизировать вариабельность между образцами и обеспечить совместимость с экспериментальными условиями, всегда используйте одни и те же доли лёгких для каждого анализа. Рекомендуется использовать левую долю для гистологии.
5. Разрежьте ткань лёгких FFPE на секции толщиной 5–7 мкм с помощью микротома и закрепите их на стандартных стеклянных стеклах. Выпекайте затворы при 60 °C в течение 1 часа перед тем, как перейти к следующим применениям. Слайды можно хранить в RT в свободной от пыли в течение нескольких недель или при 4 °C для длительного хранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте воздействия влаги во время хранения, так как влажность может вызвать окисление парафина и ухудшить качество окраски. Храните стекли в герметичной пластиковой коробке с осушивателем, если требуется длительное хранение.
   Точка паузы: храните стекли при RT или 4 °C до появления морилки.

2. Окрашивание эластичных волокон

1. Проведите окрашивание Elastica (резорцин-фуксин) на срезах лёгких с парафином диаметром 5–7 мкм, чтобы визуализировать эластичные волокна внутри альвеолярных и сосудистых структур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивайте только столько слайдов, сколько можно одновременно обрабатывать, чтобы обеспечить равномерную интенсивность и воспроизводимость по образцам.
   1. Депарафинируйте слайды, погружая в ксилол (смешанные изомеры) дважды по 5 минут каждый.
      ВНИМАНИЕ: Ксилол токсичен и легковоспламеняющийся. Держите его в вытяжке с химическим дымом и носите соответствующее защитное снаряжение.
   2. Регидратировать стекла в нисходящей серии этанола до 80% этанола.
      1. Инкубировать затвор в течение 3 минут при RT в камере для окрашивания, заполненной 100% этанолом.
      2. Переведите стекло на свежий 100% этанол и инкубуйте 3 минуты при RT.
      3. Переведите стекло на 95% этанола и инкубуйте 3 минуты при RT.
      4. Переведите стекло на 80% этанола и инкубируйте 3 минуты при RT.
   3. Переместите затвор в новую камеру для окрашивания с раствором резорцина-фуксина и инкубируемые в течение 20–30 минут при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: раствор для окрашивания резорцина-фуксина может использоваться несколько раз и стабилен при RT.
      ВНИМАНИЕ: Раствор для окрашивания резорцина-фуксина содержит потенциально опасные химикаты, включая концентрированные кислоты и красители, которые могут вызывать раздражение кожи и глаз. Обрабатывайте раствор в хорошо проветриваемом помещении или в вытяжной вытяжке и носите соответствующие средства индивидуальной защиты в соответствии с требованиями учреждения по безопасности.
   4. Поставьте затвор в камеру для окрашивания под проточной дистиллированной водой и стирайте 1 минуту.
   5. Дифференцировать 95–96% этанола: 15–60 с, контролировать под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Останавливайтесь, когда эластичные волокна останутся глубокими пурпурно-фиолетовыми и фон будет достаточно очищен. Окрашенные эластичные волокна выглядят тёмно-фиолетовыми. Волокна коллагена остаются без пятен и обычно выглядят бледными. Чрезмерное запятнание может увеличить фон; Корректируйте время инкубации в зависимости от толщины ткани и фиксации.
   6. Прекращайте дифференциацию, немедленно переведя стекло в бидистиллированную воду и промывая в течение 30 секунд. Опционально: при необходимости можно провести контрокрашивание для дополнительной оценки лёгких, но это может снизить эффективность сегментации волокна. Рекомендуем проводить окрашивание по методу H&E, чтобы оценить лёгкие на соседних порезах.
   7. Последовательно обезвоживайте препараты в 95% этаноле в течение 1–2 минут, затем 100% этанола дважды по 1–2 минуты каждая, чтобы удалить остатки воды.
   8. Очистите срезы в ксилоле 2 раза в течение 3 минут, пока ткань не станет оптически прозрачной.
   9. Крепите накладки с использованием постоянной синтетической смолы, совместимой с ксилолом, и позволяют затворам высыхать ровно на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полное обезвоживание и очистка необходимы для предотвращения помутнения и долгосрочного сохранения запятнанных участков.
      Точка паузы: храните стекли с окрашенными окрашками на RT до начала изображения.

3. Визуализация эластичных волокон и анализ сетей

1. Получение изображений
   1. Получайте высококачественные яркие изображения срезов лёгких с помощью слайд-сканера с объективом 40×. Обеспечьте согласованные настройки экспозиции и баланса белого во всех образцах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были получены с использованием одинаковых настроек сканера на протяжении всего исследования, включая увеличение, пространственное разрешение (0,25 мкм/пиксель), освещение и экспозицию.
   2. Нарисуйте область интереса (ROI), охватывающую весь участок лёгких, чтобы обеспечить полное покрытие во время сканирования.
   3. Определите область отсчёта фона без ткани для измерения и вычитания интенсивности фона при анализе изображения.
   4. Используйте автоматическое определение фокуса сканера, чтобы назначить оптимальное количество фокусных точек по ткани, обеспечивая равномерную резкость и качество изображения.
   5. Получите изображение с помощью равномерных настроек освещения и экспозиции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если автоматическая фокусировка не работает в плотных или неровных областях, используйте ручную тонкую корректировку фокуса, чтобы все структуры тканей, включая альвеолярные и сосудистые области, были чётко зафиксированы.
2. Деконволюция изображения: оценка вектора окрашивания в QuPath¹². Векторы окрашивания представляют конкретные значения поглощения RGB каждого гистологического красителя, что позволяет разделять перекрывающиеся окраски во время цветовой деконволюции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе векторы окрашивания были определены в QuPath, поскольку заранее определённые векторы для резорцино-фуксина недоступны на Фиджи.
   1. Откройте изображение в QuPath и выберите тип изображения с ярким полем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы минимизировать смещение, рассчитайте векторы окраски с использованием репрезентативных изображений из набора данных и примените одинаковые значения ко всем изображениям.
   2. Нарисуйте область, представляющую интерес (ROI), содержащую преимущественно эластичные волокна, чтобы определить первый компонент окрашивания.
   3. Во вкладке «Изображение» перейдите к разделам векторов «Окраска».
   4. Нажмите Stain 1, затем установите вектор окрашивания из ROI, чтобы определить цветовой вектор для эластичных волокон (обычно пурпурно-фиолетового).
   5. Выберите ROI, содержащую неэластичную ткань (например, фоновую или коллагенную), нажмите окрашивание 2, затем установите вектор окрашивания из ROI, чтобы определить вторичный цветовой компонент.
   6. QuPath автоматически вычисляет Пятно 3, соответствующее фону.
   7. Пример векторов, рассчитанных и применённых на Фиджи: Резорцин-Фуксин R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553; Неспецифический сигнал R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295; Фон R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения были окрашены для изображений, окрашиваемых только резорцином-фуксином. Если есть контрокрашивание, необходимо рассчитывать новые векторы окрашивания.
   8. Сохраните их как кастомные векторы окраски и нанесите для равномерной деконволюции цвета во всех образцах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определение индивидуальных векторов окрашивания из представительных областей повышает точность деконволюции цвета, особенно при окрашивании резорцин-фуксином, где оттенки эластина и фона могут различаться в разных партиях.
3. Свертка цвета на^{Фиджи 13,14}.
   1. Откройте Fiji (ImageJ) и загрузите яркое изображение окрашенной ткани.
   2. Опционально: Преобразовать изображение в формат RGB (Image → Type → RGB Color) только если изображение не находится в RGB (например, 8-битные изображения). Этот шаг открывает новое окно изображений; Сохраняйте его, чтобы сохранить исходные сырые данные.
   3. Выполните цветовую деконволюцию, выбрав Image > Color > Color Deconvolution > User Values.
   4. Введите пользовательский вектор окрашивания, ранее полученный в QuPath.
   5. Запустите плагин, чтобы сгенерировать три отдельных изображения в оттенках серого, соответствующих эластичным волокнам, тканям, исключающим эластичные волокна, и фону.
   6. Используйте изображения напрямую для TWOMBLI без дополнительной предварительной обработки. TWOMBLI требует чётких изображений с достаточным разрешением; сглаживание (например, гауссовское размытие) следует избегать для сохранения структурных деталей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что области, выбранные в QuPath для оценки векторов, отражают типичное окрашивание, так как эти пользовательские векторы будут наноситься равномерно на все изображения для согласованного сравнения.
   7. Сохраняйте эластичный волоконный канал в виде TIFF-файла для дальнейшей количественной оценки и анализа.
4. Выбор ROI для анализа волокон
   1. Для каждого среза лёгких выберите пять несмещённых квадратных ROI в альвеолярной области и пять ROI в перибронхиолярной области (по 100 мкм x 100 мкм каждая).
   2. Дублировать каждый ROI на исходном изображении (Image > Duplicate), чтобы сохранить исходные данные.
   3. Повторите те же ROI при анализе деконволютированного упругого волокна.
   4. Сохраняйте все дублированные ROI как отдельные TIFF-файлы для дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Области с тканевыми складками, артефактами секционирования, разрывами, крупными кровеносными сосудами или плохо сохранившейся альвеолярной архитектурой были исключены из анализа. Для анализа TWOMBLI использовались только деконволютированные ROI из эластичного волокна, тогда как соответствующие сырые дубликаты изображений сохранялись в качестве эталонных файлов для контроля качества и визуального осмотра. Интересующие области (ROI) следует выбирать с помощью систематического случайного отбора проб для обеспечения объективного представления ткани. Для дальнейшего минимизации смещения операторов автоматический скрипт выбора ROI, совместимый с QuPath, предоставлен в Дополнительном файле 1 и Дополнительном файле 2, а его реализация описана в разделе 3.5.
5. Применение автоматического выбора ROI в QuPath с помощью автоматического скрипта выбора ROI.
   1. Откройте изображение в QuPath и установите тип изображения на Brightfield.
   2. В меню «Инструменты » выберите нужный инструмент аннотаций, чтобы создать начальные аннотации. Рекомендуется использовать квадратные аннотации.
   3. Нарисуйте квадратные аннотации внутри ткани лёгких. Каждая аннотация должна охватывать только одну область интереса (ROI) для анализа — либо альвеолярную, либо перибронхиальную область.
   4. После создания аннотаций перейдите в раздел «Аннотации » и выберите «Замкнутые аннотации », чтобы предотвратить случайное перемещение или изменения.
   5. Добавьте классы «альвеолы» и «перибронхиальная область» в список классов, нажав кнопку «+» рядом со списком классов в панели аннотации.
   6. Присваивать каждую аннотацию соответствующему классу. Выберите аннотацию, выберите соответствующий класс и нажмите Set selected. Цвет аннотаций изменится, и назначенный класс («альвеолы» или «перибронхиальная область») будет отображаться в панели свойств аннотаций.
   7. Откройте соответствующий скрипт и выполните его. После завершения сообщения появится сообщение о успешной генерации ROI. Новые ROI будут отображаться в иерархии аннотаций как дочерние аннотации исходной аннотации, определяющей класс.
   8. Чтобы экспортировать ROI, выберите их и перейдите в раздел «Файл → экспорт изображений → оригинальных пикселей». Сохраняйте экспортированные ROI в виде TIFF-файлов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипты разработаны так, чтобы распознавать только названия классов «альвеолы» и «перибронхиальная область». Эти имена должны быть введены точно в соответствии с указанием. По умолчанию скрипты случайным образом генерируют пять неперекрывающихся квадратных ROI размером 100 мкм × 100 мкм внутри каждой аннотации. Кандидатские ROI принимаются только в том случае, если их углы и центр полностью расположены в пределах аннотации, обеспечивая полное включение в выбранный регион. Количество и размеры ROI могут быть изменены внутри скрипта с учётом специфических экспериментальных требований. Рекомендуется использовать как минимум три биологических репликаты и минимум пять ROI на образец.
6. Анализ TWOMBLI
   1. Сохраняйте все изображения ROI эластичных волокон в отдельной папке для анализа.
   2. Создайте две подпапки внутри рабочего каталога: a. Папка маски — для бинарных масок, сгенерированных TWOMBLI. b. Папка HDM — для изображений высокоплотной матрицы (HDM), сгенерированных TWOMBLI.
   3. Запустите плагин TWOMBLI: откройте Fiji и запустите TWOMBLI (Плагины -> Макросы -> Запуск).
   4. Выберите соответствующий файл параметров анализа. Для анализа упругого волокон были использованы следующие параметры TWOMBLI, переведённые в Таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут варьироваться в зависимости от интенсивности окрашивания. Параметры были эмпирически оптимизированы с использованием множества репрезентативных изображений из срезов лёгких тканей, окрашенных в стандартизированных условиях. Оптимизация проводилась путём сравнения сгенерированных масок с исходным рисунком окрашивания и выбора настроек, обеспечивающих наилучшее перекрытие между сегментированной маской и подлежащей эластичной волоконной сетью. После установления одни и те же параметры применялись ко всем изображениям в наборе данных.
   5. Выберите опцию «тёмные волокна на светлом фоне».
   6. Генерируйте и сохраняйте бинарные маски в папке Mask.
   7. Генерируйте и сохраняйте бинарные изображения в папке HDM.
   8. Извлекать количественные параметры сети, такие как длина волокна, точки ветвления, кривизна, плотность и выравнивание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ TWOMBLI требует резких, высококачественных изображений (>1 пиксель/мкм). Плохая цветовая деконволюция, размытые области или сжатие изображения могут снизить точность количественной оценки оптоволоконной сети.
7. Количественная оценка и статистический анализ
   1. Экспортировать параметры сети TWOMBLI в виде CSV-файла.
   2. Импортируйте сырые CSV-данные в GraphPad Prism для статистического анализа и визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется следующий параметр: Общая длина маски, который отражает общее количество эластичных волокон внутри ROI, позволяя количественно оценивать количество и потери волокна. Fiber Endpoints указывает степень фрагментации волокна; Увеличение числа конечных точек указывает на нарушение или повреждение волокон. Fiber Branchpoints измеряют, насколько волокна взаимосвязаны, отражая структурную сложность и целостность сети ECM. Большее количество точек ответвления указывает на более сложную и переплетённую сеть. Лакунарность количественно определяет однородность распределения волокна по ROI. Низкая лакунарность указывает на равномерную сеть с зазорами схожего размера, тогда как высокая лакунарность отражает гетерогенную сеть с переменными размерами зазоров, описывающую более сложную структуру. Box Counting-Fractal Dimension отражает сложность волоконной архитектуры. Более высокие значения фрактальных размерностей указывают на более сложные и детализированные сети, тогда как более низкие — на более простые или нарушенные структуры.
   3. Генерируйте столбцовные графики, показывающие среднее ± SEM для каждого количественного параметра сети (например, длина волокна, ветвления, кривизна и плотность).
   4. Проверьте нормальность данных с помощью теста Шапиро-Уилка. Для параметрических данных примените двухсторонний непарный t-тест Студента. Для непараметрических данных применяем тест Манна–Уитни U. Для сравнений с участием более двух экспериментальных групп следует применять односторонний анализ дисперсии (ANOVA), за которым следует соответствующий пост-хок тест с множественным сравнением, или тест Крускаля–Уоллиса для непараметрических данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте все сырые CSV-файлы без изменений, чтобы обеспечить воспроизводимость и прослеживаемость данных. Сообщите количество ROI и биологических реплик, проанализированных для каждого состояния, в надписях рисунков.

Результаты

Этот протокол предоставляет количественные параметры эластичной волоконной сети в различных областях лёгких и в экспериментальных условиях. Анализ TWOMBLI, как было описано ранее, даёт такие параметры, как длина волокна, плотность ветвления, лакунарность и фрактальная размерность для оценки внеклеточной^{матрицы 10}. Основываясь на этой концепции, наш подход позволяет всесторонне охарактеризовать организацию эластичных волокон, что позволяет оценить изменения их содержания, связности, равномерности и структурной сложности как в физиологической, так и в патологической ткани лёгких.

В здоровой ткани лёгких эластичные волокна образуют длинные, непрерывные и хорошо расположенные сети вдоль альвеолярных перегородок и перибронхиальных структур. В отличие от этого, патологические или метаболически изменённые лёгкие, такие как у мышей с ожирением, часто демонстрируют усиленное ветвление и большую сложность сети, что отражает изменения в организации эластичных^{волокон 3}. Репрезентативные выходы, включая бинарные маски и количественные параметры, показаны на рисунке 1A, B. Эти результаты могут быть интегрированы с гистологическими и молекулярными анализами для оценки целостности РЭБ и степени^{ремоделирования 3}. Недостатки и заполнение промежутков проявляются в здоровой ткани лёгких для визуализации различий в организации ЭКМ (рисунок 1C). В сочетании с другими количественными показателями эти параметры отражают сложность сети и выявляют изменения в архитектуре тканей, вызванные реорганизацией ЭБМ, предоставляя представление о различных паттернах структурного ремоделирования внутри эластичной волоконной сети.

Точная интерпретация этих количественных результатов критически зависит от высокого качества получения и обработки изображений. Неоптимальные условия изображения или обработки, включая плохую фокусировку, нестабильное освещение или неточную оценку вектора окрашивания, могут привести к фрагментированным или шумным маскам и, следовательно, к ненадёжным количественным данным (см. рисунок 1D). Поэтому тщательный визуальный анализ исходных изображений и результатов сегментации крайне важен для обеспечения качества данных перед интерпретацией. Неоптимальные маски обычно можно распознать по чрезмерной фрагментации непрерывных волокон, разрывной или неполной сегментации, включению фонового шума в структуры волокон или плохом перекрытии исходного рисунка окрашивания и сгенерированной маской, что указывает на необходимость переоценки параметров получения изображения, оценки вектора окрашивания или сегментации. Для иллюстрации этих признаков были намеренно проанализированы срезы с контрокрашиванием, что мешает идентификации эластичных волокон и приводит к неоптимальной сегментации. Пример такой низкокачественной маски показан на рисунке 1E. Для дальнейшей оценки надёжности и воспроизводимости рабочего процесса наборы изображений были независимо проанализированы двумя исследователями с использованием одинаковых оптимизированных параметров анализа (рисунок 2A). Кроме того, были включены образцы независимых животных для оценки биологической изменчивости (рисунок 2B). Сопоставимые количественные результаты были получены между операторами и биологическими репликатами, что подтверждает воспроизводимость и независимость от пользователя предлагаемого конвейера анализа изображений. Вместе эти анализы демонстрируют, что рабочий процесс позволяет надёжно оценивать организацию эластичных волокон и способствует сравнению физиологических и патологических состояний.

Рисунок 1. Рабочий процесс анализа окрашивания с помощью эластичных окрашиваний. (A) Репрезентативное исходное изображение, изолированный сигнал эластичного волокна, полученный с помощью деконволюции изображения, бинарная маска, сгенерированная с помощью TWOMBLI, и наложение исходных эластичных волокон соответствующей маской, демонстрируя точную сегментацию. (B) Репрезентативные количественные параметры, полученные анализом TWOMBLI. (C) Примеры анализов дефицита и заполнения пробелов в здоровой ткани лёгких мышей для иллюстрации различий в организации внеклеточного матрикса. (D) Иллюстрация фрагментированных и шумных масок, возникающих в результате неоптимального захвата или обработки изображений. (E) Тканевой срез окрашен гематоксилином и эозином, демонстрируя нарушенную идентификацию эластичных волокон и неоптимальную генерацию масок. Отмечены участки, показывающие слабое соответствие исходного узора окрашивания и сгенерированной маске. Шкала A, D = 100 мкм, E = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Воспроизводимость и надёжность рабочего процесса анализа эластичных волокон . (A) Наборы данных изображений были независимо проанализированы двумя исследователями с использованием параметров анализа TWOMBLI для оценки воспроизводимости между операторами. Показаны количественные метрики, полученные на основе TWOMBLI. A и B обозначают двух независимых операторов. (B) Анализировались образцы независимых животных для оценки биологической изменчивости. Показаны количественные метрики, основанные на TWOMBLI, демонстрирующие сопоставимые результаты среди биологических реплик и подтверждающие надёжность анализового конвейера. M1, M2 и M3 указывают на отдельных здоровых животных. n = 3. Статистический анализ был проведён с использованием одностороннего ANOVA, за которым последовал тест множественных сравнений Даннетта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Параметры	Ценности
Контрастная насыщенность	0.75
Минимальная ширина линии	5
Максимальная ширина линии	10
Окно минимальной кривизны	20
Окно кривизны Максимуна	80
Минимальная длина ветви	10
HDM-дисплей Maximun HDM	175
Диаметр минимального зазора	0

Таблица 1: Сводка количественных параметров, полученных из TWOMBLI. Обзор параметров, полученных TWOMBLI, и их интерпретации для оценки архитектуры эластичных волокон в ткани лёгких. Метрики включают показатели содержания волокон, ветвления, выравнивания, связности и организации сети.

Дополнительный файл 1: Беспристрастная инвестиция альвеол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Беспристрастная ROI перибронхиальная область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает надёжный, воспроизводимый рабочий процесс для изучения архитектуры мышиного легочного внеклеточного матрикса (ECM), с особым акцентом на ремоделирование эластичных волокон, управляемых фибробластами. Эластичные волокна необходимы для поддержания поддержки лёгких и отдачи, а их нарушение является отличительной чертой множественных заболеваний лёгких, включая фиброз, повреждения лёгких, старение и метаболические^{нарушения 2}. Несмотря на их центральную функциональную роль, количественная оценка организации и сборки эластичных волокон остаётся ограниченной. Рабочий процесс устраняет этот пробел, обеспечивая систематическую и количественную характеристику архитектуры эластичных волоконных сетей.

Основная сила этого метода заключается в интеграции количественного процесса визуализации с структурным гистологическим анализом. Хотя традиционные подходы часто оценивают состав ЭБУ или гистологические особенности отдельно, этот протокол позволяет объективно оценивать организацию эластичного волокна, включая их длину, ветвление и сложность сети. Это позволяет напрямую сравнивать физиологические и патологические состояния и даёт представление о ремоделировании ЭКМ, опосредованной^{фибробластами. 3}.

Однако для обеспечения согласованности экспериментов и качества данных критически важны несколько технических аспектов. Окрашивание резорцина–фуксина чувствительно к таким параметрам, как время фиксации, толщина сечения и консистенция реагента, что делает стандартизацию необходимой для воспроизводимости. Количественные результаты TWOMBLI зависят от качества изображения, разрешения и последовательного выбора интересующих областей, поэтому должны интерпретироваться вместе с гистологической оценкой и проверяться на нескольких выборках. Кроме того, плотность и морфология волокон различаются между альвеолярными и перибронхиальными областями, что требует оптимизации по региону. Этот подход отражает глобальную организацию эластичной волоконной сети в двух измерениях и не разрешает ультраструктурные особенности, требующие более высокоразрешающих методов, таких как электронная микроскопия. Трёхмерные методы визуализации, включая конфокальную или мультифотонную микроскопию, могут дополнительно улучшить анализ геометрии волокон и связности.

Несколько этапов в рабочем процессе особенно важны для обеспечения надёжных и воспроизводимых результатов. Фиксация тканей, качество сечения и постоянное окрашивание резорцино-фуксином существенно влияют на визуализацию эластичных волокон и поэтому должны тщательно стандартизироваться.  Низкая интенсивность окрашивания, неравномерное окрашивание или высокий фон могут быть вызваны переменным качеством реагентов, непоследовательными условиями окрашивания или недостаточной консервацией тканей. Кроме того, рекомендуется включать здоровые и заболевшие ткани лёгких, технические методы контроля окрашивания и эталонных образцов, обработанных в экспериментальных партиях, для контроля консистенции окрашивания и аналитической устойчивости. Ткани, богатые эластичными волокнами, могут также служить положительным контролем для проверки процедур получения и сегментации изображений. Точная оценка вектора окрашивания во время деконволюции изображения — ещё один важный этап, так как неправильный выбор вектора может привести к неполной экстракции волокна и фрагментации масок. В зависимости от экспериментального вопроса рабочий процесс может быть изменен путём изменения размера и числа ROI, адаптации параметров обработки изображений или интеграции трёхмерных подходов к визуализации для дальнейшего изучения организации эластичного волокна.

В целом, этот метод представляет собой универсальную платформу для изучения ремоделирования РЭК как в физиологическом, так и в патологическом контексте. Поскольку целостность эластичного волокна напрямую связана с поступлением лёгких и механической функцией, этот подход особенно важен для понимания того, как структурные изменения в ECM приводят к изменениям в функции лёгких. Он хорошо подходит для изучения структурных изменений, вызванных фибробластами, и предоставляет новые возможности для лучшего понимания ремоделирования ЭКМ и её вклада в прогрессирование заболевания и функцию тканей. Подход также может быть распространён на другие ткани, включая сердечно-сосудистые ткани, кожу, матку, заболевания соединительной ткани, фиброзные органы и человеческие образцы, либо в сочетании с современными пространственными и высококачественными методами визуализации для дальнейшего расширения его применимости.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	версия 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	версия 11
Qupath		https://qupath.github.io	версия 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172