В данном исследовании изучаются терапевтические эффекты формулы Bushen-Jianpi-Qingchang и ее субформул при колии у крыс, а также раскрываются механизмы их регуляторного воздействия на ось «микробиота кишечника — метаболизм желчных кислот» с помощью мультиомного анализа.
Исследовательская статья
Формула Bushen Jianpi Qingchang облегчает течение колита у крыс путем регуляции метаболизма желчных кислот и микробиоты кишечника
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Традиционная китайская медицина (ТКМ) широко применяется для лечения язвенного колита (ЯК) благодаря подтвержденной эффективности и благоприятному профилю безопасности. Основной патогенез хронического рефрактерного ЯК характеризуется дефицитом селезенки и почек, сопровождающимся накоплением сырости-жара в кишечнике, а формула Bushen-Jianpi-Qingchang (BJQF) представляет собой клинически проверенный многокомпонентный препарат для лечения данного состояния. Целью настоящего исследования было изучение терапевтического действия BJQF и трех ее составляющих субформул (формула Bushen, BSF; формула Jianpi, JPF; формула Qingchang, QCF) при индуцированном декстрансульфатом натрия (DSS) колите у крыс, а также характеристика их регулирующего воздействия на профили желчных кислот (ЖК) в фекалиях и сообщества кишечных микроорганизмов. Состав бактерий в фекалиях и концентрации ЖК у крыс с DSS-индуцированным ЯК были количественно определены с помощью секвенирования гена 16S рРНК и жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS), после чего была проанализирована потенциальная связь между микробиотой кишечника и метаболизмом ЖК. BJQF значительно уменьшила воспаление и изъязвление слизистой оболочки толстой кишки в модели ЯК. Между крысами с колитом и здоровым контролем были выявлены отчетливые изменения в разнообразии и составе бактерий. Связь между дифференциальными бактериями и ЖК была сосредоточена вокруг 23-дезоксихолевой кислоты (23-DCA) как ключевого метаболического узла. Примечательно, что тауролитохолевая кислота-3-сульфат (TLCA-3S) и литохолевая кислота-3-сульфат (LCA-3S) могут служить потенциальными биомаркерами эффективности. Субформула JPF продемонстрировала эффективность, наиболее близкую к полной формуле BJQF. Применение BJQF и ее составляющих формул эффективно уменьшает гистопатологические повреждения, воспаление, дисбиоз кишечной микробиоты и нарушения метаболизма ЖК у крыс с ЯК, что обеспечивает механистическую основу для комбинированной терапии методами ТКМ.
Введение
Язвенный колит (ЯК), основной вид воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), характеризуется хроническим непрерывным неспецифическим воспалением, ограниченным слизистой оболочкой толстой кишки. У пациентов с ЯК наблюдаются такие клинические симптомы, как диарея, боли в животе, непреднамеренная потеря веса, а также кровянистый или гнойный стул, что значительно снижает качество жизни. В патогенезе ЯК задействованы средовые, генетические, микробные и иммунные факторы. ЯК обычно развивается вследствие дисбаланса микробиоты кишечника, и этот дисбиоз может заметно ускорить прогрессирование заболевания1. Накопленные данные позволяют рассматривать метаболическую ось «микробиота кишечника — желчные кислоты (ЖК)» как ключевой регуляторный модуль в патогенезе ЯК. Нарушение метаболизма желчных кислот является общепризнанным признаком повреждения слизистой оболочки кишечника при ВЗК. Вторичные ЖК синтезируются исключительно из первичных ЖК хозяина микробиотой кишечника, которая экспрессирует ключевые ферменты, такие как 7α-дегидроксилаза, необходимые для этой биотрансформации. Таким образом, пул желчных кислот в кале служит идеальным функциональным показателем, отражающим перестройку микробиома, вызванную лечением методами традиционной китайской медицины (TCM).
Эти вторичные желчные кислоты (ЖК) действуют как важнейшие сигнальные молекулы для поддержания иммунного гомеостаза кишечника, целостности слизистого барьера и выживаемости эпителиальных клеток2. Нарушения в этой оси, включая дефицит вторичных ЖК, вызванный микробным дисбиозом, и сбои в передаче сигналов ЖК, непосредственно запускают провоспалительные реакции в кишечнике и дисфункцию барьера, что делает эту систему перспективной терапевтической мишенью для лечения язвенного колита (ЯК). Микробиота кишечника играет критическую роль в развитии ЯК и воздействует на организм хозяина через метаболические продукты, такие как желчные кислоты, образующиеся в результате ферментативных реакций. Патологические изменения микробиоты кишечника и метаболизма ЖК тесно связаны с ЯК3. Поскольку микробиота кишечника опосредует выработку вторичных ЖК, изменения в составе и численности микроорганизмов могут нарушить метаболизм ЖК и способствовать развитию воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК)4.
ТКМ широко применяется при лечении НЯК благодаря эффективности и безопасности при длительной терапии в качестве альтернативы или дополнения к противовоспалительным или иммуносупрессивным препаратам5. Согревание и укрепление селезенки и почек, очищение кишечника и выведение сырости являются основными терапевтическими принципами при НЯК6. Согласно теории ТКМ, основным патогенезом затяжного течения НЯК является дефицит селезенки и почек (Fu-Zheng, укрепление жизненной энергии ци) в сочетании с накоплением сырости и жара в кишечнике (Qu-Xie, устранение патогенных факторов), и синергетическое применение этих двух стратегий необходимо для эффективного лечения НЯК.
Предыдущие экспериментальные исследования подтвердили, что JPF и QCF, две основные субформулы BJQF, оказывают терапевтический эффект при язвенном колите (UC). JPF уменьшает воспаление слизистой оболочки и дисфункцию кишечного эпителиального барьера через сигнальный путь NF-κB/HIF-1α7, в то время как QCF восстанавливает гомеостаз метаболизма микробиоты кишечника, защищает кишечный эпителиальный барьер и регулирует путь NLRP3/IL-1β8. Чтобы определить конкретный биологический вклад функциональных модулей Fu-Zheng и Qu-Xie в ось «микробиота кишечника — ЖК», данное исследование было разработано с использованием полной формулы BJQF и трех разложенных субформул: BSF (формула Bushen, тонизирующая селезенку и почки, чистый Fu-Zheng), JPF (формула Jianpi, укрепляющая селезенку, основной Fu-Zheng) и QCF (формула Qingchang, очищающая кишечник от сырости и жара, чистый Qu-Xie). Такой экспериментальный дизайн позволяет проанализировать синергетические и независимые эффекты каждого функционального модуля при лечении UC, что имеет решающее значение для перевода сложных рецептов традиционной китайской медицины (TCM) в доказательную терапию.
Рабочая гипотеза заключается в том, что BJQF облегчает течение индуцированного DSS колита путем ремоделирования состава кишечной микробиоты и нормализации метаболизма желчных кислот, и что модуль Jianpi служит основным функциональным компонентом, определяющим регуляторное воздействие на ось «микробиота кишечника — ЖК». Данное исследование было разработано для систематического анализа механизма «состав-модуль» BJQF. Путем оценки полного состава и соответствующих целевых физиологических субмодулей исследование стремится расшифровать биологический синергизм этого соединения традиционной китайской медицины (ТКМ) и предоставить современную фармакологическую основу для лечения ВЗК посредством регуляции метаболической оси «микробиота кишечника — желчные кислоты». В данной работе проводится систематическое сравнение терапевтической эффективности полного состава BJQF и трех разделенных функциональных формул при индуцированном DSS язвенном колите (ЯК). Учитывая ключевую роль метаболической оси «микробиота кишечника — желчные кислоты» в патогенезе ЯК, в этой работе анализируется синергетический механизм «состав-модуль» BJQF, уточняется конкретный регуляторный вклад модулей Bushen, Jianpi и Qingchang, а также характеризуются эффекты ремоделирования состава микробиоты кишечника и профилей желчных кислот в фекалиях каждым модулем. Основными целями являются выявление современных биологических основ применения BJQF при облегчении ЯК, определение ключевых микробно-метаболических мишеней для вмешательства методами ТКМ и создание механистического базиса для рационального применения и трансляционных исследований комплексных рецептов ТКМ при ВЗК.
Протокол
Для исследования было взято сорок четыре здоровых самца крыс линии Sprague-Dawley весом 200 ± 20 g. Все животные содержались в условиях отсутствия специфических патогенов со свободным доступом к стандартному гранулированному корму и воде; перед началом эксперимента животные проходили акклиматизацию в течение 1 недели. Все процедуры по обеспечению благополучия животных и экспериментальные манипуляции проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, изданным Министерством науки и технологий Китая. Исследование было одобрено Комитетом по этике работы с животными Нанкинского университета китайской медицины (номер одобрения 2023DW-029-01). Полные сведения об источнике получения животных и материалах для их содержания приведены в Таблице материалов.
Приготовление рецептуры ТКМ
Полный состав рецептуры Bushen-Jianpi-Qingchang (BJQF) был сформирован из девяти растительных ингредиентов в заранее определенных дозировках: 15 g Astragali Radix, 10 g обжаренного Atractylodis Macrocephalae Rhizoma, 10 g Scutellariae Radix, 4 g Coptidis Rhizoma, 10 g Sanguisorbae Radix, 6 g Aucklandiae Radix, 5 g Glycyrrhizae Radix, 15 g Psoraleae Fructus и 15 g Alpiniae Oxyphyllae Fructus. Все исходные растительные материалы вымачивали в нормальном физиологическом растворе в течение 1 h, после чего подвергали отвариванию в течение 1 h до получения конечного объема 1500 mL. Три модифицированные суб-рецептуры были приготовлены с использованием идентичного протокола отваривания. Рецептура Bushen (BSF) содержала 15 g Psoraleae Fructus и 15 g Alpiniae Oxyphyllae Fructus, отваренных до конечного объема 500 mL. Рецептура Jianpi (JPF) состояла из 15 g Astragali Radix, 10 g обжаренного Atractylodis Macrocephalae Rhizoma и 5 g Glycyrrhizae Radix с конечным объемом отвара 500 mL. Рецептура Qingchang (QCF) состояла из 10 g Scutellariae Radix, 4 g Coptidis Rhizoma, 10 g Sanguisorbae Radix и 6 g Aucklandiae Radix, также доведенных до конечного объема 500 mL. Полные спецификации производителей и номера партий для всех растительных материалов приведены в Таблице материалов. В основном тексте последовательно используется общая номенклатура растительных компонентов, а сведения о конкретных производителях ограничены исключительно Таблицей материалов.
Индукция колита и формирование экспериментальных групп
Крыс случайным образом разделили на шесть экспериментальных групп: контрольная группа (n = 6): обычная питьевая вода + внутрижелудочное введение физиологического раствора. Группа модели НЯК (n = 6): питьевая вода с 3,5% (мас./об.) DSS + внутрижелудочное введение физиологического раствора. Группа лечения BJQF (n = 8): питьевая вода с 3,5% DSS + внутрижелудочное введение BJQF (0,6 г/кг массы тела). Группа лечения BSF (n = 8): питьевая вода с 3,5% DSS + внутрижелудочное введение BSF (0,6 г/кг массы тела). Группа лечения JPF (n = 8): питьевая вода с 3,5% DSS + внутрижелудочное введение JPF (0,6 г/кг массы тела). Группа лечения QCF (n = 8): питьевая вода с 3,5% DSS + внутрижелудочное введение QCF (0,6 г/кг массы тела).
Экспериментальный колит индуцировали путем введения 3,5% DSS с питьевой водой в течение 10 последовательных дней; контрольная группа получала дистиллированную воду без DSS. Дозировка каждого состава TCM (0,6 г/кг) была пересчитана из клинически эффективной дозы для взрослых в эквивалентную дозу для крыс с использованием метода нормализации площади поверхности тела (формула Миха-Рубнера). Поскольку исследование находилось на этапе поиска и было сосредоточено на сравнении составов, была принята единая клинически эквивалентная доза. Начиная с 1-го дня, каждый состав TCM вводили интрагастрально один раз в день. Контрольная группа и группа модели получали такой же объем физиологического раствора (10 мл/кг). На 11-й день крыс забивали путем перелома шейных позвонков. Для анализа собирали сыворотку крови, образцы фекалий и ткани толстой кишки. Массу тела измеряли ежедневно. Первоначально для всех групп было запланировано n = 8. В период индукции DSS 2 крысы в контрольной и модельной группах погибли из-за тяжелого колита, в результате чего окончательное n = 6 для этих двух групп. Последующий анализ мощности подтвердил, что итоговый размер выборки обеспечивает статистическую мощность ≥ 0,8 для всех первичных исходов (гистологический балл, ключевые цитокины, масса тела), что соответствует стандартным статистическим требованиям.
Измерение концентраций воспалительных цитокинов
Уровни IL-1β, IL-10 и TNF-α в сыворотке определяли с помощью коммерческих наборов ELISA, строго следуя протоколам производителя. Значения оптической плотности считывали на автоматическом микропланшетном ридере. Статистический анализ: однофакторный ANOVA для выявления общих различий между группами с последующей коррекцией FDR по методу Бенджамини-Хохберга для апостериорных попарных сравнений, что соответствует стандартам анализа омиксных данных.
Гистопатологическая оценка
Образцы тканей толстой кишки фиксировали в 10% формалине, дегидратировали, заливали парафином, нарезали и окрашивали гематоксилином и эозином (HE). Гистологическую оценку проводили с использованием модифицированной системы оценки колита Купера — валидированной полуколичественной шкалы для экспериментального колита9. Оценка охватывает четыре параметра: воспалительная инфильтрация, структурные повреждения крипт, отек слизистой оболочки и степень изъязвления (общий балл 0–12). Заявление об ослеплении: перед оценкой все стекла были деидентифицированы с помощью числовых кодов. Два независимых патологоанатома, не знавших о распределении по группам, оценивали каждое стекло независимо. Итоговый балл определяли как среднее значение двух оценок; расхождения ≥ 2 баллов разрешались третьим, старшим патологоанатомом. Для анализа использовали однофакторный ANOVA с поправкой Бенджамини-Хохберга (FDR) для попарных сравнений, что соответствует обработке других фенотипических данных.
Сбор образцов и экстракция ДНК
Свежие образцы фекалий крыс собирали в стерильные центрифужные пробирки объемом 1 mL, немедленно замораживали при −80 °C и транспортировали на сухом льду. Геномную ДНК бактерий фекалий экстрагировали из 250 mg фекалий с помощью набора для выделения ДНК согласно инструкциям производителя. Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра, а целостность проверяли методом электрофореза в 0.8% агарозном геле. При экстракции и количественном определении использовали отрицательный контроль с буфером. Экстракты хранили при -20 °C до использования.
Секвенирование гена 16S рРНК и биоинформатический анализ
ПЦР-амплификация была направлена на гипервариабельные области V3–V4 (338F–806R) гена 16S рРНК. Продукты ПЦР очищали и секвенировали на платформе Illumina MiSeq с использованием парноконцевого секвенирования (2 × 300-bp). После фильтрации по качеству в среднем на образец было получено 68 450 ± 28 297 высококачественных очищенных прочтений (макс. 158 361, мин. 28 294). Последовательности объединяли в OTU при уровне сходства 97%. Рассчитывали кривые разрежения, индексы богатства и индексы разнообразия. Таксономическая аннотация выполнялась с помощью RDP Classifier. Для оценки сходства сообществ в среде R проводили PCoA на основе расстояний UniFrac и иерархическую кластеризацию. Анализ LEfSe выполнялся на платформе Galaxy для выявления дифференциально представленных таксонов (пороги: LDA > 3, критерий Краскела-Уоллиса p < 0.05, апостериорный критерий Вилкоксона p < 0.05). Для множественных сравнений обилия микроорганизмов применялась поправка Бенджамини-Хохберга на FDR; значимым считалось значение p(FDR) < 0.05.
Анализ желчных кислот в фекалиях методом ЖХ-МС/МС
Образец фекалий массой 20 mg гомогенизировали с 200 µL метанола. После центрифугирования супернатант концентрировали, восстановили в 100 µL 50% водного раствора метанола и проанализировали с помощью ЖХ-МС/МС. Система детектирования включала систему Shimadzu UPLC и систему Applied Biosystems 6500 QTRAP MS/MS. Качественный и количественный анализы проводили с использованием калибровочных кривых по стандартам желчных кислот. Для оценки разделения метаболического профиля использовали метод главных компонент (PCA). Дифференциальными желчными кислотами считались те, для которых VIP ≥ 1 и кратность изменения (fold change) ≥ 2 или ≤ 0.5. Для визуализации распределения дифференциальных ЖК использовали скрипичные диаграммы (violin plots). Для множественных сравнений применяли поправку Бенджамини-Хохберга на FDR, аналогично анализу микробиологических данных.
Статистический анализ
Корреляция Спирмена рассчитывалась с помощью функции cor в R. Значимость корреляции проверялась с использованием функции corPvalueStudent из пакета WGCNA для R. Фенотипические данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (Mean ± SD). Для всех многогрупповых сравнений (фенотипических, микробных, метаболических) применялся однофакторный ANOVA с поправкой Бенджамини-Хохберга (FDR) для апостериорных тестов. Скорректированное p < 0.05 считалось статистически значимым. Все анализы выполнялись в GraphPad Prism 7.00 и R 4.2.0. Апостериорный расчет мощности выборки проводился с помощью G*Power 3.1.
Результаты
Формулы ТКМ уменьшают воспаление и повреждение толстой кишки при DSS-индуцированном колите
Защитная эффективность формул ТКМ была первоначально оценена по изменению массы тела. По сравнению с контрольной группой, в группе с моделью ЯК наблюдалась устойчивая потеря веса. BJQF, BSF, JPF и QCF значительно уменьшили потерю веса, вызванную DSS (Рисунок 1A). Окрашивание гематоксилином и эозином (HE) выявило сохранную слизистую оболочку толстой кишки и отсутствие воспаления в контрольной группе. Напротив, в тканях толстой кишки группы с моделью наблюдались выраженная деформация эпителия, разрушение крипт и обширная инфильтрация воспалительными клетками слизистой и подслизистой оболочек. Все виды лечения ТКМ способствовали восстановлению тканей и уменьшению воспаления, при этом BJQF продемонстрировал наиболее выраженное улучшение (Рисунок 1B–C). Количественная гистологическая оценка подтвердила, что ТКМ значительно уменьшили гистопатологические повреждения (p < 0.05).
BJQF, BSF, JPF и QCF в разной степени снижали уровни IL-1β (Рисунок 1D) и TNF-α (Рисунок 1F) в сыворотке крови. Уровни IL-10 в группах лечения не достигли показателей контрольной группы, однако были значительно выше, чем в модельной группе (Рисунок 1E). Эти результаты указывают на то, что формулы традиционной китайской медицины (TCM) подавляют вызванное DSS воспаление кишечника.
Рисунок 1: Терапевтические эффекты BJQF и его разложенных субформул при DSS-индуцированном колите у крыс. (A) Динамика изменения отношения массы тела к исходному значению в каждой группе в течение 10-дневного экспериментального периода; (B) Количественные гистологические баллы тканей толстой кишки во всех экспериментальных группах; (C) Репрезентативные срезы тканей толстой кишки, окрашенные гематоксилином и эозином (HE), для каждой группы (масштабная линейка = 200 µm); (D–F) Концентрации воспалительных цитокинов в сыворотке крови в каждой группе: (D) IL-1β, (E) IL-10, (F) TNF-α. Данные представлены как среднее значение ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Лечение традиционной китайской медициной (ТКМ) перестраивает структуру микробного сообщества кишечника у крыс с ЯК
После фильтрации по качеству в каждом образце было получено в среднем 68 450 ± 28 297 высококачественных очищенных чтений. Лечение ТКМ изменило бактериальное α-разнообразие (индекс Chao1, Рисунок 2A). BJQF значительно снизила повышенное α-разнообразие у крыс с ЯК (p(FDR) < 0,05). Среди вспомогательных формул JPF значительно снизила разнообразие (p(FDR) < 0,05), в то время как BSF и QCF не оказали значимого эффекта. Что касается β-разнообразия, невзвешенный PCoA расстояний UniFrac показал четкое разделение групп, что указывает на то, что ТКМ изменила общий состав микробиоты (Рисунок 2B). Иерархическая кластеризация дополнительно продемонстрировала отчетливое разделение между контрольной группой модели и группами лечения (Рисунок 2C).
Всего было выявлено 13 типов, 22 класса, 36 отрядов, 65 семейств и 158 родов. На уровне типов преобладали Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Verrucomicrobia и Proteobacteria (>99% общей численности, Рисунок 2D). Firmicutes доминировали в контрольной группе (86,98%), их численность значительно снизилась при UC (p(FDR) < 0,05) и восстановилась под воздействием TCM (p(FDR) < 0,05), при этом BJQF оказал наиболее сильный эффект. Численность Bacteroidetes и Proteobacteria значительно увеличилась при UC и снизилась под влиянием всех формул TCM. На уровне родов (численность >1%, Рисунок 2E) Lactobacillus доминировали в контрольной группе (59,77%), были заметно сокращены при UC (3,57%, p(FDR) < 0,05) и восстановлены с помощью TCM (p(FDR) < 0,05). BJQF и JPF оказали более выраженное влияние на восстановление Lactobacillus. При UC также наблюдалось увеличение Bacteroides, Ruminococcus_2, Bifidobacterium и Blautia, а также снижение Enterorhabdus и Corynebacterium_1 — большинство из этих изменений были обращены под действием TCM. В целом, все формулы смягчили связанный с UC микробный дисбиоз, при этом BJQF и JPF продемонстрировали наиболее выраженные эффекты.
Рисунок 2: Состав микробиоты кишечника в группах. (A) Индекс α-разнообразия бактерий, оцененный с помощью индекса Chao 1 (p(FDR) < 0.05 по сравнению с группой Model); (B) PCoA расстояний UniFrac на основе состава и численности OTU в различных группах; (C) Иерархический кластерный анализ на основе матрицы расстояний; (D) Относительная численность на уровне типа (p(FDR) < 0.05 по сравнению с группой Model); и (E) Относительная численность на уровне рода (p(FDR) < 0.05 по сравнению с группой Model). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
LEfSe выявляет дифференциальные таксоны, связанные с ЯК и воздействием ТКМ
Анализ LEfSe был проведен для выявления таксонов, имеющих дифференциальное обогащение в группах (LDA > 3, p < 0.05, Рисунок 3). Таксоны, обогащенные при ЯК, включали Bacteroidaceae, Bacteroides, Clostridiales, Clostridia, Bacteroidia, Bacteroidales, Bacteroidetes, Faecalibaculum и Ruminococcaceae, главным образом из типов Bacteroidetes и Firmicutes. После лечения ТКМ большинство таксонов, обогащенных при применении BJQF, принадлежали к Firmicutes, и только Bifidobacteriaceae, Bifidobacteriales и Bifidobacterium относились к Actinobacteria. Таксоны, обогащенные при BSF, также в основном принадлежали к Firmicutes. Таксоны, обогащенные при JPF, такие как Turicibacter и Dorea, относились к Firmicutes. При QCF наблюдалось наиболее сильное обогащение Verrucomicrobia (включая Akkermansia), что указывает на высокую чувствительность этого типа к воздействию QCF. В целом, Firmicutes оказался типом, наиболее активно реагирующим на BJQF, BSF и JPF.
Рисунок 3: Метод LEfSe определил наиболее существенно различающиеся по численности ОТУ в разных группах. Значимые различия в показателях LDA (p < 0,05) были выявлены между классами (критерий Краскела — Уоллиса) и между подклассами (критерий Уилкоксона). Дифференциальные таксоны определялись на основании порогового значения LDA > 3 и уровня статистической значимости 0,05. (p: тип, c: класс, o: порядок, f: семейство, g: род). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Воздействие ТКМ нормализует профили желчных кислот в фекалиях крыс с ЯК
Учитывая нарушение всасывания ЖК при ВЗК, авторы использовали метод LC-MS/MS для количественного определения ЖК в фекалиях. PCA показал четкое разделение между контрольной и модельной группами, в то время как все группы лечения сгруппировались ближе к контрольным, что указывает на частичную нормализацию метаболизма ЖК (Рисунок 4A). Наиболее измененными ЖК в модельной группе были повышенный уровень LCA-3S и сниженный уровень GDCA (Рисунок 4B). После лечения наиболее активированными ЖК были ILCA (BJQF), GCDCA (BSF), DLCA (JPF) и GCDCA (QCF); наиболее подавленными ЖК были TLCA-3S (BJQF), LCA-3S (BSF), LCA-3S (JPF) и TLCA-3S (QCF) (Рисунок 4C–F). На скрипичных диаграммах были визуализированы общие дифференциальные ЖК в разных группах (Рисунок 5). Примечательно, что все формулы ТКМ увеличивали уровни 23-DCA, 3-oxo-DCA и DLCA, и снижали уровни HCA, LCA-3S, TCA и TLCA-3S.
Рисунок 4: Формулы ТКМ регулировали нарушения обмена желчных кислот, индуцированные DSS, в модели ЯК. (A) График PCA желчных кислот в группах Control, Model, BJQF, BSF, JPF и QCF. (B) Столбчатая диаграмма кратности изменения в группе Model по сравнению с Control. (C) Столбчатая диаграмма кратности изменения в группе BJQF по сравнению с Model. (D) Столбчатая диаграмма кратности изменения в группе BSF по сравнению с Model. (E) Столбчатая диаграмма кратности изменения в группе JPF по сравнению с Model, и (F) Столбчатая диаграмма кратности изменения в группе QCF по сравнению с Model. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Скрипичный график дифференциальных BA в каждой группе сравнения. (A) Дифференциальные BA в группе BJQF по сравнению с группой Model. (B) Дифференциальные BA в группе BSF по сравнению с группой Model. (C) Дифференциальные BA в группе JPF по сравнению с группой Model и (D) дифференциальные BA в группе QCF по сравнению с группой Model. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Корреляция между желчными кислотами в фекалиях и численностью кишечной микробиоты
Был проведен корреляционный анализ Спирмена между дифференциально представленными типами бактерий и дифференциальными ЖК (Рисунок 6A–F, Рисунок 7A–D). На хордовых диаграммах показаны корреляции с |r| ≥ 0,8 (Рисунок 6B, 6D, 6F). При сравнении группы модели и контрольной группы 23-DCA положительно коррелировала с Saccharibacteria и Firmicutes и отрицательно — с Proteobacteria и Bacteroidetes (Рисунок 6B). При сравнении группы BJQF с группой модели Proteobacteria ассоциировались с TLCA-3S, LCA-3S, TCA, α-MCA, 6,7-DKLCA, HCA, CDCA и THCA (Рисунок 6D). При сравнении группы BSF с группой модели Proteobacteria положительно коррелировали с TDCA, 6,7-DKLCA и LCA-3S, а Saccharibacteria положительно коррелировали с GUDCA и 23-DCA (Рисунок 6F).
Рисунок 6: Корреляции между дифференциальными желчными кислотами (ЖК) в фекалиях и численностью дифференциальных бактерий на уровне типа. (A, C, E) Анализ корреляции Спирмена для групп «Контроль против Модели», «BJQF против Модели» и «BSF против Модели» соответственно. (B, D, F) Соответствующие хорд-диаграммы, иллюстрирующие сильные корреляции (|r| ≥ 0,8) для групп «Контроль против Модели», «BJQF против Модели» и «BSF против Модели» соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Диаграммы хорд отображают корреляции с |r| ≥ 0.8 (Рисунок 7B, 7D). При сравнении JPF с моделью Saccharibacteria были отрицательно связаны с TLCA-3S, LCA-3S и HCA, и положительно коррелировали с 23-DCA (Рисунок 7B). При сравнении QCF с моделью Saccharibacteria отрицательно коррелировали с HCA, CA, LCA-3S, THCA и TLCA-3S, и положительно коррелировали с 23-DCA (Рисунок 7D). Эти результаты указывают на то, что различные формулы TCM модулируют сеть взаимодействий между бактериями и ЖК по разным паттернам.
Рисунок 7Корреляции между дифференциальными желчными кислотами (ЖК) в фекалиях и численностью дифференциальных бактерий. (А, С) Анализ корреляции по Спирмену для групп JPF в сравнении с Model и QCF в сравнении с Model соответственно. (B, D) Соответствующие хордовые диаграммы, иллюстрирующие сильные корреляции (|r| ≥ 0,8) для групп JPF против Model и QCF против Model соответственно. Красный цвет указывает на положительные корреляции, синий — на отрицательные. p < 0.05, p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Все необработанные данные были загружены в базу данных NCBI Sequence Reads Archive (SRA) (номер доступа: PRJNA749732). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA749732
Обсуждение
В данном исследовании изучается терапевтический механизм BJQF и его разложенных субформул в облегчении симптомов DSS-индуцированного язвенного колита (ЯК) через ось «микробиота кишечника — метаболизм желчных кислот». Этот мультиомный анализ показывает, что BJQF оказывает противовоспалительное действие на толстую кишку, восстанавливая связанный с ЯК микробный дисбиоз и нормализуя пул желчных кислот (ЖК) в фекалиях. Его субформулы демонстрируют различные модульные регуляторные эффекты, при этом JPF проявляет эффективность, наиболее близкую к полной формуле, что раскрывает ключевую роль стратегии Jianpi. Авторы также идентифицируют 23-DCA как ключевой узел ЖК, связывающий ремоделирование микробиоты и облегчение ЯК, и TLCA-3S/LCA-3S как потенциальные биомаркеры эффективности.
Восстановление микробного дисбиоза под воздействием BJQF потенциально связано с нормализацией пула желчных кислот (ЖК) и снижением воспаления. Язвенный колит (ЯК) обусловлен нарушением регуляции сети «иммунитет-микробиота-метаболизм», при этом дисбаланс основных типов бактерий является типичным признаком как у пациентов, так и в моделях на животных10. Полученные результаты подтверждают, что у крыс с DSS-индуцированным ЯК наблюдается снижение содержания Firmicutes и Lactobacillus, а также увеличение Bacteroidetes и Proteobacteria, что согласуется с клиническими профилями ЯК11. BJQF и JPF наиболее эффективно устранили эти отклонения, в то время как BSF и QCF оказали умеренный эффект. Поскольку хорошо задокументировано, что таксоны Firmicutes, такие как Lactobacillus и Clostridium, обладают основным ферментативным аппаратом для биосинтеза вторичных ЖК12, это указывает на возможную ассоциативную связь: BJQF, особенно его модуль Jianpi, восстанавливает популяцию Firmicutes с биосинтетической способностью к выработке ЖК, что может усилить биотрансформацию вторичных ЖК и скорректировать метаболические нарушения. На уровне родов BJQF и JPF также нивелировали вызванные ЯК изменения в Bacteroides, Ruminococcus_2, Enterorhabdus и Corynebacterium_1, что способствовало дальнейшему устранению дисбиоза и восстановлению функций, связанных с синтезом ЖК.
Восстановление микробного дисбиоза может способствовать нормализации пула желчных кислот (ЖК), что является ключевым метаболическим механизмом противовоспалительного эффекта при колите. Метаболизм ЖК сильно зависит от активности микробиоты, а вторичные ЖК имеют решающее значение для иммунного гомеостаза и целостности барьера13. Данные ЖХ-МС/МС показывают, что у крыс с язвенным колитом (ЯК) наблюдается снижение уровня защитных вторичных ЖК (23-DCA, 3-oxo-DCA, DLCA) и накопление сульфатированных ЖК (TLCA-3S, LCA-3S), что согласуется с предыдущими сообщениями о дисрегуляции ЖК, связанной с ЯК14. Сульфатированные ЖК обладают низкой абсорбцией в кишечнике и не могут вступать в энтерогепатическую циркуляцию15, поэтому их накопление отражает нарушение метаболизма ЖК и связано с активацией провоспалительных путей16. Все исследуемые формулы устраняли это нарушение, при этом наиболее выраженный эффект был отмечен у BJQF и JPF.
Корреляционный анализ подтверждает, что 23-DCA является ключевым узлом BA, связанным с изменениями основных типов микробиома: он положительно коррелирует с Firmicutes и отрицательно — с Proteobacteria. Поскольку 23-DCA является вторичной BA с противовоспалительным и барьерно-защитным действием17, повышение его уровня под влиянием BJQF/JPF, вероятно, обусловлено обогащением Firmicutes и усилением биосинтеза, что коррелирует со снижением уровня цитокинов и улучшением гистологических показателей. На основании этих корреляционных данных авторы предлагают гипотетическую механистическую модель: BJQF восстанавливает обилие Firmicutes > усиливает микробный биосинтез вторичных BA > повышает уровень защитного 23-DCA > подавляет воспаление в кишечнике. Данная модель требует подтверждения в ходе функциональных экспериментов.
Данное исследование связывает теорию традиционной китайской медицины (ТКМ) с современной молекулярной биологией путем сопоставления функциональных модулей BJQF с конкретными микробными и метаболическими изменениями. Центральным связующим звеном является концепция Цзяньпи (Jianpi). В соответствии с теорией ТКМ о "взаимное усиление селезенки и почек"18... в BSF наблюдалось умеренное обогащение Firmicutes и повышение экспрессии 23-DCA. В QCF в основном было обогащено... Verrucomicrobia (Akkermansia) и регулируемый метаболизм ксенобиотиков, что отражает "очищение от сырости и жара" эффект. Полная формула оказывает синергическое действие, превосходящее эффект любого отдельного модуля, что подтверждает рациональность разработки сложных составов традиционной китайской медицины (ТКМ) на основе дифференциации синдромов.
Корреляционный анализ дополнительно выявляет отчетливые сети взаимодействия бактерий и ЖК, формируемые каждым рецептом. Эти различия отражают регуляторные характеристики конкретных модулей и служат основой для индивидуального клинического применения: JPF при НЯК с преобладанием дефицита селезенки и дисбиозом с центром вокруг Firmicutes, QCF при НЯК с преобладанием влажно-жаркого синдрома и повреждением слизистого барьера, и полный BJQF при классическом комбинированном синдроме. В соответствии с этими выводами, недавние исследования также подтверждают, что ось «микробиота кишечника — желчные кислоты» является основной терапевтической мишенью при НЯК и вмешательстве методами ТКМ19,20,21,22. Дефицит вторичных ЖК, вызванный микробным дисбиозом, является ключевым признаком активного НЯК, и восстановление гомеостаза ЖК может эффективно уменьшить воспаление и повреждение слизистой оболочки23.
Данное исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, все связи между ремоделированием микробиоты и нормализацией BA основаны на корреляционном мультиомном анализе; причинно-следственные связи не были подтверждены функциональными экспериментами, такими как трансплантация фекальной микробиоты. Во-вторых, размер выборки относительно невелик, что может ограничивать статистическую мощность и возможность обобщения результатов. В-третьих, количественно определялись только BA в фекалиях; профили BA в сыворотке крови и слизистой оболочке, отражающие энтерогепатическую циркуляцию, не измерялись. В-четвертых, конкретные активные фитохимические вещества, ответственные за регуляцию микробиоты и BA, не были идентифицированы. В будущих работах будут подтверждены причинно-следственные связи с помощью FMT и экспериментов на животных с гнотобионтной микробиотой (germ-free), определены ключевые активные компоненты BJQF и проведены пилотные клинические исследования для подтверждения трансляционной значимости.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.
ВКЛАД АВТОРОВ:
Hongyu Chen участвовал в концептуализации, разработке методологии, валидации, формальном анализе, исследовании, визуализации и написании первого варианта рукописи. Song Zhao участвовал в разработке методологии, административном управлении проектом, исследовании, визуализации, получении финансирования и написании первого варианта рукописи. Luzhou Xu участвовал в концептуализации, предоставлении ресурсов, рецензировании и редактировании рукописи, административном управлении проектом и общем научном руководстве исследованием.
Благодарности
Данная работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81774243).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл | Axygen | ПЦР-02-C | Для реакций ПЦР-амплификации гена 16S рРНК |
| Стерильные центрифужные пробирки объемом 1,5 мл | Axygen | MCT-150-C | Стерильные контейнеры для сбора, хранения и центрифугирования образцов |
| 10% нейтральный buffered формалин | Solarbio Science & Технология | 1008128 | Для фиксации образцов тканей толстой кишки |
| Система ЖХ-МС/МС 6500 QTRAP | Sciex | 5009065 | Для количественного профилирования желчных кислот в фекалиях методом MRM |
| -80 ºУльтранизкотемпературный морозильник | Thermo Fisher Scientific | 702-UR | Для криоконсервации образцов фекалий и биологических материалов |
| Агароза | Sigma-Aldrich | A9539 | Для определения целостности ДНК методом гель-электрофореза |
| Плоды альпинии остролистной | Nanjing TCM Co., Ltd. | Партия 20230321 | Исходное растительное сырье, по 15 г на дозу, используемое в BJQF и BSF |
| Корень астрагала | Nanjing TCM Co., Ltd. | Партия 20230312 | Исходный растительный материал, по 15 г на одну дозу, используемый в BJQF и JPF |
| Корень Оклендии (Aucklandiae Radix) | Nanjing TCM Co., Ltd. | Партия 20230217 | Сырье лекарственных трав, по 6 г на дозу, используемое в составах BJQF и QCF |
| Стандартная смесь желчных кислот | Sigma-Aldrich | B4893 | Для качественной и количественной калибровки желчных кислот в фекалиях |
| Корневище коптиса (Coptidis Rhizoma) | Nanjing TCM Co., Ltd. | Партия 20230118 | Исходное растительное сырье, 4 г на дозу, используемое в составах BJQF и QCF |
| декстран сульфат натрия (DSS, 36–50 кДа) | MP Biomedicals | 160110 | Для индукции язвенного колита у крыс препарат готовили в виде 3,5% (масс./об.) раствора для питья, который давали в течение 10 дней подряд. |
| Корень солодки (Glycyrrhizae Radix) | Nanjing TCM Co., Ltd. | Партия 20230411 | Сырье из лекарственных трав, по 5 г на дозу, используемое в составах BJQF и JPF |
| GraphPad Prism | Программное обеспечение GraphPad | v7.00 | Для статистического анализа, проверки значимости и построения научных графиков |
| Гематоксилин-эозин (ГЭ)&Е) Набор для окрашивания | Beyotime Biotechnology | C0105S | Для окрашивания срезов тканей толстой кишки, гистопатологического исследования и оценки степени воспаления |
| Высокоскоростная центрифуга с охлаждением | Eppendorf | 5810R | Для центрифугирования образцов при экстракции нуклеиновых кислот и подготовке проб для метаболомики |
| Метанол для ВЭЖХ | Merck KGaA | 1.06007.4008 | Для подготовки проб и подвижной фазы для ЖХ-МС/МС |
| Платформа секвенирования Illumina MiSeq | Illumina Inc. | SY-410-1003 | Для высокопроизводительного секвенирования гена 16S рРНК и профилирования микробиоты кишечника |
| База данных KEGG | Лаборатории Канехисы | Релиз 107.0 | Для аннотации функциональных путей микроорганизмов |
| Самцы крыс линии SD (стандартные), SPF-класс | Shanghai Xipu-Bikai Experimental Animal Co., Ltd. | / | 44 крысы весом 200 ± 20 г, для создания модели ЯКБ и последующих экспериментов |
| Multiskan™ Микропланшетный ридер GO | Thermo Fisher Scientific Oy | 51119080 | Для измерения оптической плотности при ИФА и количественного определения цитокинов |
| Спектрофотометр NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Для количественного определения и оценки чистоты геномной бактериальной ДНК из фекалий |
| Кассеты для заливки парафином | Leica Biosystems | 3801520 | Для дегидратации и заливки в парафин тканей толстой кишки |
| PowerFecal® Набор для выделения ДНК | MoBio (Qiagen) | 12830-50 | Для экстракции и очистки геномной ДНК бактерий из фекалий |
| Плоды псоралеи (Psoraleae Fructus) | Nanjing TCM Co., Ltd. | Партия 20230129 | Сырье растительного происхождения, 15 г на дозу, используемое в составе BJQF и BSF |
| Статистическая среда R | R Foundation for Statistical Computing | v4.2.0 | Для биоинформатического анализа и статистических вычислений |
| Набор для ИФА на ИЛ-10 крысы | Lun Chang Shuo Biotech | YD-30194 | Для количественного определения концентрации ИЛ-10 в сыворотке крови |
| ИЛ-1 крысыβ Набор для ИФА | Lun Chang Shuo Biotech | YD-30206 | Для количественного определения ИЛ-1 в сыворотке кровиβ концентрация |
| ФНО крысы (TNF-крысы)α Набор для ИФА | Lun Chang Shuo Biotech | YD-31063 | Для количественного определения ФНО-α в сыворотке кровиα концентрация |
| Корень sanguisorбы (Sanguisorbae Radix) | Nanjing TCM Co., Ltd. | Партия 20230309 | Сырье из лекарственных трав, 10 г на одну дозу, используемое в составах BJQF и QCF |
| Корень шлемника (Scutellariae Radix) | Nanjing TCM Co., Ltd. | Партия 20230407 | Исходный растительный материал, по 10 г на дозу, используемый в BJQF и QCF |
| Система UFLC UPLC Shim-pack | Shimadzu Corporation | CBM-20A | Для хроматографического разделения образцов желчных кислот из фекалий |
| Обжаренный корневище сырокореника крупноглавого (Atractylodis Macrocephalae Rhizoma) | Nanjing TCM Co., Ltd. | Партия 20230225 | Сырье растительного происхождения, 10 г на дозу, используемое в BJQF и JPF |
Ссылки
- Gilbert JA, et al. Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 2018;24(4):392-400.
- Fiorucci S, et al. Bile acid signaling in inflammatory bowel diseases. Dig Dis Sci. 2021;66(3):674-693.
- Sinha SR, et al. Dysbiosis-induced secondary bile acid deficiency promotes intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 2020;27(4):659-670.e5.
- Zhan K, et al. Gut microbiota-bile acid crosstalk in diarrhea-irritable bowel syndrome. Biomed Res Int. 2020;2020:3828249.
- Zhang C, Jiang M, Lu A. Considerations of traditional Chinese medicine as adjunct therapy in the management of ulcerative colitis. Clin Rev Allergy Immunol. 2013;44(3):274-283.
- Zhang S, et al. Consensus on Chinese medical diagnosis and treatment of ulcerative colitis (2009). Chin J Integr Tradit West Med. 2010;30(5):527-532.
- Chen YL, et al. Systems pharmacology approach reveals protective mechanisms of Jian-Pi Qing-Chang decoction on ulcerative colitis. World J Gastroenterol. 2019;25(21):2603-2622.
- Hu J, et al. Qingchang Huashi Formula attenuates DSS-induced colitis in mice by restoring gut microbiota-metabolism homeostasis and goblet cell function. J Ethnopharmacol. 2021;266:113394.
- Cooper HS, et al. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest. 1993;69(2):238-249.
- Zuo T, Ng SC. The gut microbiota in the pathogenesis and therapeutics of inflammatory bowel disease. Front Microbiol. 2018;9:2247.
- Kobayashi T, et al. Ulcerative colitis. Nat Rev Dis Primers. 2020;6(1):74.
- Wahlström A, Sayin SI, Marschall HU, Bäckhed F. Intestinal crosstalk between bile acids and microbiota and its impact on host metabolism. Cell Metab. 2016;24(1):41-50.
- Joyce SA, Gahan CGM. Bile acid-microbiota crosstalk in inflammatory bowel disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2020;17(11):694-707.
- Duboc H, et al. Connecting dysbiosis, bile-acid dysmetabolism and gut inflammation in inflammatory bowel diseases. Gut. 2013;62(4):531-539.
- Alnouti Y. Bile acid sulfation: A pathway of bile acid elimination and detoxification. Toxicol Sci. 2009;108(2):225-246.
- Ungaro R, et al. Ulcerative colitis. Lancet. 2017;389(10080):1756-1770.
- Tang Y, Li Y, Zhang L, et al. 23-Deoxycholic acid ameliorates colitis by regulating gut microbiota and activating FXR signaling. J Ethnopharmacol. 2022;298:115463.
- Lu YH, Cong LL, Zhang Y. TCM syndrome classification and its correlation with gut microbiota in ulcerative colitis. Chin J Integr Tradit West Med. 2020;40(7):867-871.
- Zhang Y, Li X, Wang H. Traditional Chinese medicine for inflammatory bowel disease: From empirical therapy to mechanism-based treatment. J Ethnopharmacol. 2022;296:115347.
- Li J, Wang Y, Zhang L, et al. Targeting the gut microbiota-bile acid axis: a novel strategy for TCM compound prescriptions in treating chronic inflammatory diseases. Pharmacol Res. 2023;192:106589.
- Abdo W, et al. Gut Microbiota and Bile Acid Metabolism in Inflammatory Bowel Disease: Pathophysiological Links and Therapeutic Implications. Arch Med Res. 2023;54(8):789-801.
- Liu M, et al. Traditional Chinese Medicine Targeting Gut Microbiota-Bile Acid Axis for Ulcerative Colitis: A Systematic Review. Arch Med Res. 2022;53(6):542-553.
- Chen L, et al. Secondary Bile Acids as Key Mediators of Intestinal Mucosal Barrier Protection in Inflammatory Bowel Disease. Arch Med Res. 2023;54(2):189-200.