Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Неонатальная внутримозговая трансплантация для замены микроглии и анализа линии in vivo

146 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72119

⸱

28 июля 2026 г.

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает эффективную неонатальную внутримозговую трансплантацию определённых популяций микроглии, поддерживая надёжную долгосрочную приживку и анализ линии микроглии, а также интеграцию in vivo между несколькими донорскими источниками и моделями реципиентов.

Аннотация

Замена микроглии с помощью трансплантации миелоидных клеток стала перспективным экспериментальным подходом для изучения неврологических процессов и заболеваний. Однако существующие стратегии трансплантации часто ограничены неэффективной трансплантацией, зависимостью от облучения или ограниченной гибкостью между донором и реципиентом. Здесь мы описываем неонатальный протокол внутримозговой трансплантации для введения очищенных микроглий (Hoxb8 и не-Hoxb8 микроглии) в развивающийся мозг мыши. Этот метод позволяет эффективно приживать донорские клетки и интегрировать их в паренхиму мозга при физиологически позволяющих условиях. Важно, что протокол совместим с несколькими донорскими источниками, включая эмбриональных гемопоэтических прогениторов и постнатальную микроглию, полученную из мозга, и может применяться к различным моделям реципиентов с уменьшенной или отсутствующей эндогенной микроглией, включая условных мышей с дефицитом Csf1r и мышей Csf1r ΔFIRE. Донорские клетки очищаются методом сортировки клеток, активируемой флуоресценцией, и вводятся двусторонним образом в мозг новорождённых мышей с помощью стеклянных микропипеток для эффективной и минимально инвазивной доставки. Реципиентные мыши старят, чтобы донорские клетки могли расширяться и заселять нишу микроглии, а результаты оцениваются с помощью гистологического анализа распределения донорских клеток и экспрессии маркеров. Этот подход предоставляет надёжную и масштабируемую платформу для изучения онтогенезы микроглий и интеграции in vivo в различных экспериментальных контекстах.

Введение

Замена микроглии через трансплантацию миелоидных клеток стала мощной стратегией для изучения биологии микроглии и потенциальной терапевтической парадигмой неврологических заболеваний. За последние несколько лет эта область достигла стратегий, способных к широкомасштабной замене микроглии в центральной нервнойсистеме 1. Недавние исследования показали, что макрофаги и предшественники, полученные от донора, способны внедрять в мозг, внедрять транскрипционные программы, похожие на микроглию, и в некоторых случаях улучшать фенотипы, связанные сзаболеваниями, 2,3,4,5,6,7,8. Эти результаты подтверждают идею, что замена макрофагов мозга может использоваться для изучения и потенциальной модификации неврологических заболеваний.

Ключевая задача при трансплантации микроглии — достижение надёжной пришивки при минимизации экспериментальных запутанных факторов. Многие устоявшиеся методы замещения опираются на облучение, химиотерапию или парадигмы истощения микроглии для формирования пригодной для адаптацииниши 6,9,10,11,12,13. Несмотря на свою эффективность, эти методы могут вызывать старение микроглии, нарушать гематоэнцефалический барьер и изменять воспалительные сигналы, что усложняет интерпретацию поведения донорскихклеток 9,14. В более поздние годы начались исследования методов замены микроглии, независимых от обусловлений или сниженной токсичности, 5,8,15.

Время развития является важным фактором, определяющим успех трансплантации. Неонатальный мозг создаёт благоприятную среду, поддерживающую расширение донорских клеток и долгосрочную интеграцию, вероятно, благодаря снижению структурных барьеров и постоянному формированию эндогенной ниши микроглии. Недавние исследования трансплантации с использованием ранних постнатальных родов (P0–P5) демонстрируют устойчивое прищепление паренхимы и приобретение идентичности, похожей на микроглию, что подчёркивает важность контекста развития для эффективнойзамены 7,8,16,17.

Микроглия Hoxb8 представляет собой особенно информативную систему для изучения вклада, специфических по линии, в биологию микроглий. Эти клетки происходят из эмбриональных гемопоэтических предшественников и представляют собой определённую подгруппу паренхимальной микроглии с поведенческими последствиями придисфункциональности 17,18,19,20,21. Недавние исследования с использованием первичных прогениторов Hoxb8 и систем микроглии и эстрогеновых рецепторов (ER)-Hoxb8 демонстрируют, что эти клетки могут быть расширены, генетически манипулированы и успешно внедрены в мозг, где они принимают транскрипционные профили, похожие на микроглию, и функциональныехарактеристики 7,8,17. Эти достижения дополнительно подчёркивают полезность методов трансплантации для вскрытия линии микроглии и гетерогенности.

Здесь мы описываем платформу неонатальной внутримозговой трансплантации, оптимизированную для универсальности между системами донора и реципиента. В отличие от методов, основанных на облучении или системном обусловлении, этот метод использует прямую двустороннюю внутримозговую доставку неонатальных мышей, что позволяет размещать донорские клетки в разрешённую для развития среду мозга и минимизировать системные возмущения. Техника совместима с несколькими донорскими источниками, включая эмбриональные гемопоэтические предшественники и постнатальную микроглию, полученную в мозге, и может применяться к различным моделям реципиентов с уменьшенной или отсутствующей эндогенной микроглией. Основное практическое преимущество заключается в том, что тонкий неонатальный череп позволяет быстро вручную вводить стеклянные микропипетки, исключая необходимость сверления или стереотаксичной фиксации, при этом обеспечивая широкое прищепление паренхимы.

В совокупности этот подход обеспечивает надёжную, гибкую и масштабируемую систему для изучения онтогенеза микроглии, гетерогенности и интеграции in vivo в различных экспериментальных контекстах. Это позиционирует неонатальную внутримозговую трансплантацию как дополнительную и экспериментально контролируемую альтернативу системным стратегиям замещения микроглии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы и эксперименты в этом исследовании были проведены на мышах. Экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Юты, Служба общественного здравоохранения #D16-00018 (A3031-01).

1. Подготовка пар для размножения для помётов донора и реципиента

  1. Размещайте пары заводчиков в одной клетке вечером, чтобы начать спаривания с ограничением времени.
  2. Каждое утро проверяйте самок на наличие вагинальной пробки для подтверждения успешного спаривания.
  3. Удалять забитых самок у самцов и содержать их индивидуально до родов, которое занимает примерно 18–20 дней.
  4. Бережно обращайтесь с беременной матерью по 5 минут ежедневно в течение 7–10 дней до рождения, чтобы снизить стресс, связанный с неонатальной медицинской помощью.
  5. Подвергайте мамы воздействию ватного тампона с запахом бетадина во время ежедневных сеансов обращения, чтобы снизить стресс у матери при возвращении щенков после операции.
  6. Подготовьте чистые клетки с материалом для гнезда для беременных самок до предполагаемых родов.

2. Сбор и обработка неонатального мозга

  1. Эвтаназия донорских мышей новорождённых (P0–P4) путём передозировки изофлурана с помощью колокольчика или аналогичной закрытой камеры с ложным полом для предотвращения прямого контакта с анестетиком.
  2. Как только дыхание прекращается и отсутствие рефлексов подтверждается, немедленно обезглавливайте.
  3. Собрать весь мозг, включая мозжечок и обонятельные луковицы. Поместите мозги в 3 мл холодного раствора 1× Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) в пластиковой чашке Петри на льду.
  4. Используя стерильные скальпели и щипцы, измельчите мозг примерно на кусочки размером 1–2мм 3 .
  5. Переместить измельчённую мозговую ткань (1 мозг на каждую трубку диссоциации) в трубки для диссоциации тканей с ферментными реагентами для пищеварения, поставляемыми системой диссоциации нейронных тканей согласно рекомендованному производителем протоколу.
  6. Поместите трубки в устройство механической диссоциации с возможностью нагрева и инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, используя рекомендованную производителем программу диссоциации нервных тканей.
  7. Предварительное замачивание 70 мкм фильтров с 400 мкл 1× HBSS.
  8. Пропустите диссоциированную ткань через заранее пропитанные сита, которые размещаются над конической трубкой объёмом 50 мл на льду.
  9. Промыйте трубки 10 мл 1× HBSS и проведите фильтры для максимального восстановления клеток.
  10. Сбросьте фильтры и спин-элементы при 300 × г на 10 минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант.
  11. Ресуспензировать клетки в буфере лизиса эритроцитов в стерильной ультрачистой воде на образец и инкубировать 10 минут при 4 °C.
  12. Заглушите лизисную реакцию с помощью 10 мл 1× HBSS/1% BSA/5% FBS.
  13. Сбросьте фильтры и спин-элементы при 300 × г на 10 минут при 4 °C. Аспирировать супернатант.
  14. Определите количество клеток с помощью гемоцитометра. Типичный диапазон выхода клеток составляет 3,2–4,0 × 106 до сортировки.
  15. Ресуспензировать клетки в 5% FBS в 1× HBSS в нужной концентрации для дальнейшего окрашивания антител.

3. Окрашивание клеточных антител для сортировки микроглий с FACS

  1. Ресуспендировать клетки в 1 мл буфера для окрашивания (5% FBS в 1× HBSS), содержащем антитело, блокирующее Fc-рецепторы (очищенное CD16/32, 1:2000), и инкубировать клетки в течение 10 минут при 4 °C.
  2. Опускайте клетки при 240 × г в течение 3 минут при 4 °C. Аспирировать супернатант.
  3. Инкубировать клетки флуоресцентно сопряжёнными антителами (CD45 APC, 1:160; CD11b Alex Fluor 700, 1:160) в 1 мл буфера для окрашивания 30 минут на льду в темноте.
  4. Опускайте клетки при 240 × г в течение 3 минут при 4 °C. Аспирировать супернатант.
  5. Добавьте краситель жизнеспособности (например, 3 мкм DAPI в 1× HBSS), чтобы исключить мёртвые клетки.
  6. Выполните сортировку FACS с помощью высокоскоростного сортировщика ячеек, оснащённого соответствующими лазерами для обнаружения DAPI, GFP, tdTomato, CD45-APC и CD11b-Alexa Fluor 700.
  7. Используйте сопло диаметром 100 мкм с низким давлением оболочки, чтобы максимизировать жизнеспособность элементов. Держите пробирки для сбора образцов и отсортированные клетки во льду на протяжении всего процесса.
  8. При необходимости используйте неокрашенные элементы, регуляторы одноцветной компенсации и регуляторы флуоресценции минус один при необходимости для настройки напряжений, компенсации и вентилей.
  9. Первые элементы затвора по площади прямого рассеяния против боковой площади рассеяния, чтобы исключить мусор.
  10. Синглеты затвора, использующие высоту бокового рассеяния против ширины бокового рассеяния.
  11. Исключайте мёртвые клетки путём гейтинга на DAPI⁻-ячейках.
  12. Из живых синглов — гейт на CD45низкий CD11b⁺ микроглия.
  13. В пределахCD45 с низким уровнем CD11b⁺ микроглии используйте флуоресценцию GFP и tdTomato для разделения донорских микроглий (микроглия Hoxb8 : DAPI⁻ CD45низкий CD11b⁺ tdTomato⁺ GFP⁺, не-Hoxb8 микроглия: DAPI⁻ CD45низкий CD11b⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. Сортируйте каждую популяцию по стерильным трубкам с холодным 1x HBSS.
  15. После сортировки повторно проанализируйте небольшой аликвот отсортированных клеток, чтобы подтвердить чистоту и жизнеспособность перед трансплантацией.
  16. Собирайте отсортированные клетки в стерильные 1× HBSS и храните их на льду в темноте до трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные показатели для микроглии Hoxb8 варьируются от 3,70 до 4,60 x 104 клеток и не-Hoxb8 микроглии 1,10–1,14 x 105 клеток на мозг новорождённого (P0–P4), хотя выходы могут варьироваться в зависимости от возраста, генотипа и эффективности обработки тканей. Трансплантация очищенных живых клеток как можно скорее, желательно в течение 60 минут после сортировки клеток.

4. Сбор и обработка гемопоэтических предшественников печени плода

  1. Эвтаназия беременных дамб с использованием 5% изофлурана, доставленного в кислороде через прецизионный вапорайзер, пока дыхание не прекратится и не будет подтверждено отсутствие рефлексов.
  2. После передозировки изофлураном проводите вторичный физический метод с вывихом шейки матки для обеспечения смерти, в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу и использованию животных.
  3. Удалите рога матки у беременных мышей и поместите их в холодные 3 мл 1× HBSS в пластиковые чашки Петри (60 мм × 15 мм).
  4. Вскрыть эмбрионы E12.5 из матки и поместить в свежий холод 3 мл 1× HBSS в пластиковые чашки Петри.
  5. Вскрытие печени плода с помощью мелких щипцов и поместить их в свежие 3 мл холодного 1× HBSS с 5% FBS в чашках Петри.
  6. Механически диссоциируйте сгруппированную ткань печени плода с помощью иглы 26 г и шприца на 3 мл.
  7. Опускайте клетки при 240 × г в течение 5 минут при 4 °C. Аспирировать супернатант.
  8. Промывайте ячейки с 1× HBSS.
  9. Пропустите суспензию ячейки через 80 мкм ситечко ячейки.
  10. Инкубировать клетки в 20 мкл буфера лизиса эритроцитов (0,15 м хлорида аммония, 1 мМ KHCO3) в течение 5 минут, затем добавить 13 мл 1× HBSS для закалки.
  11. Продолжайте инкубацию в течение 5 минут, чтобы вывести эритроциты.
  12. Опускайте клетки при 200 × г в течение 5 минут при 4 °C.

5. Окрашивание клеточных антител для сортировки гемопоэтических прогениторных клеток FACS

  1. Инкубировать клетки печени плода флуоресцентно конъюгированными антителами (Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50; Kit PE-CY7, 1:100) в 5% FBS/1% BSA за 1× HBSS на 30 минут на льду в темноте.
  2. Промывайте ячейки с 1× HBSS и отвергайте при 240 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  3. Добавьте краситель жизнеспособности (например, 3 мкм DAPI в 1× HBSS), чтобы исключить мёртвые клетки.
  4. Выполнять сортировку FACS с помощью высокоскоростного сортировщика ячеек с соответствующими лазерами и фильтрами для обнаружения DAPI, Ter119 PerCP-Cy5.5, Kit PE-Cy7, tdTomato, и GFP.
  5. Используйте сопло диаметром 100 мкм с низким давлением оболочки, чтобы максимизировать жизнеспособность элементов. Держите пробирки для сбора образцов и отсортированные клетки во льду на протяжении всего процесса.
  6. При необходимости используйте неокрашенные элементы, регуляторы одноцветной компенсации и регуляторы флуоресценции минус один при необходимости для настройки напряжений, компенсации и вентилей.
  7. Первые элементы затвора, использующие площадь рассеяния напротив боковой площади рассеяния для исключения мусора.
  8. Синглеты затвора, использующие высоту прямого рассеяния против ширины прямого рассеяния, затем высоту бокового рассеяния против ширины бокового рассеяния.
  9. Исключайте мёртвые клетки путём гейтинга на DAPI⁻-ячейках.
  10. Из живых синглетов исключайте клетки эритроидной линии путём гейтинга на клетках Ter119⁻.
  11. Внутри популяции Ter119⁻ гейт на высоко гемопоэтических прогениторных клетках Kit.
  12. Ввысоком популяции DAPI⁻ Ter119⁻ Kit изолировать предков Hoxb8 с положительной линией, путём гейтинга на клетках tdTomato⁺.
  13. Если донорская линия также несёт репортёр Cx3cr1-GFP, используйте флуоресценцию GFP, чтобы подтвердить, что отсортированная популяция предков плода в печени на данномэтапе низкая GFP⁻ или GFP, что отличает предшественники от дифференцированных миелоидных клеток, экспрессирующих Cx3cr1.
  14. Сортируйте последнюю популяцию DAPI⁻ Ter119⁻Kit high tdTomato⁺ GFP в стерильные трубки с холодным 1× HBSS.
  15. После сортировки повторно проанализируйте небольшой аликвот отсортированных клеток, чтобы подтвердить чистоту и жизнеспособность перед трансплантацией.
  16. Собирайте отсортированные клетки в стерильные 1× HBSS и храните их на льду в темноте до трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные выходы варьируются примерно от 5,0 до 7,0 × 104 гемопоэтических предшественников Hoxb8 на препарат печени плода E12,5, в зависимости от размера эмбриона и эффективности сортировки. Пересадить очищенные живые клетки как можно скорее, желательно в течение 60 минут после сортировки.

6. Подготовка инъекционных игл

  1. Загрузить боросиликатные стеклянные капилляры (внешний диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,58 мм, с филаментом) в микропипеточный вытягиватель.
  2. Вытягивание капилляров с помощью двухлинейной программы вытягивания, оптимизированной для создания длинных конических игл, подходящих для неонатальной внутримозговой трансплантации.
    1. Типичные настройки включают: Heat = 645, Pull = 30, Velocity = 120, Delay = OFF и Pressure = 200. Оптимизируйте окончательные настройки под конкретный тип стекла, условия окружающей среды и калибровку вытягивателя. Затем обрезайте полученные иглы и скройте их, чтобы получить окончательный диаметр наружного кончика примерно 30 мкм.
  3. Поместите вытянутые иглы на две полоски шпаклевки внутри большой пластиковой чашки Петри, чтобы защитить кончики от повреждений, прежде чем обрезать и наносить фаски.
  4. Поместите вытянутую иглу под стереомикроскопом для рассекания при примерно 10×–20× увеличении и поддержите её мягкой опорой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При осмотре наконечника может использоваться более высокое увеличение (20×–40× для проверки правильного формирования конуса и выявления дефектов до обрезки и фаскивания.
  5. Используйте стерильное лезвие, чтобы обрезать кончик иглы и получить внешний диаметр примерно 30 мкм.
  6. Закрепите обрезанную иглу в держателе для микрокофемолки.
  7. Отрегулируйте угол скоса на 30°–35°.
  8. Включите кофемолку и подсветку.
  9. Дайте дистиллированной воде капать на шмельный камень с равномерной скоростью примерно одной капли каждые 4–5 секунд.
  10. Аккуратно приближайте кончик иглы к вращающемуся шлифовальному камню, пока не появится скошенный край.
  11. Измерьте внешний диаметр скошенного наконечника с помощью измерительного прибора для наконечника, когда он доступен.
  12. Выберите иглы с внешним диаметром около 30 мкм для пересадки.
  13. Наполните иглу стерильным буфером и аккуратно выведите жидкость, чтобы убедиться, что кончик открыт и не заблокирован ли.

7. Подготовка инъекционного аппарата

  1. Соберите ручную ротовую пипетку, состоящую из гибкой трубки, мундштука, встроенного фильтра и капиллярного держателя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Встроенный фильтр встроен в аппарат пипетирования с управлением ротом для предотвращения загрязнения.
  2. Отмечайте иглу каждые 2 мм (до 2 отметок на иглу). Каждые 2 мм соответствуют ~2 мкл.
  3. Вставьте подготовленную стеклянную иглу на ~1,5 см в держатель капилляра и убедитесь, что сборка надёжна и герметична.
  4. Примените мягкое всасывание через мундштук, чтобы убедиться в чистом потоке воздуха и правильном сопротивлении.
  5. Убедитесь, что система обеспечивает плавное управление аспирацией и инъекцией перед загрузкой донорских клеток.
  6. Заполните стеклянную инъекционную иглу подготовленной донорской ячейкой (всего 4,5 мкл) с помощью тонкого наконечника пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в игле не осталось пузырьков воздуха перед началом трансплантации. Используйте одну иглу на мышь.

8. Анестезия неонатальных реципиентов и подготовка хирургического поля

  1. Разместите неонатальную мышь в положении на спине на хирургическом столе и введите анестезию с помощью 2,0–5,0% изофлурана, подаваемого в кислороде через прецизионный вапорайзер.
  2. Поместите нос мыши в носовой конус, чтобы поддерживать непрерывную подачу изофлурана и кислорода на протяжении всей процедуры.
  3. Выделите примерно 1 минуту на индукцию анестезии, контролируя дыхание.
  4. Аккуратно коснитесь конечностей и убедитесь, что у него нет отменного рефлекса, чтобы убедиться в адекватной анестезии.
  5. После достижения соответствующей анестезии концентрацию изофлурана уменьшите до 0,5–2,0% для поддержания и продолжайте анестезию до 10 минут во время процедуры трансплантации.
  6. Поддерживайте неонатальную мышь при температуре примерно 38 °C, используя грелку, размещённую под хирургическим столом.
  7. Очистите место инъекции на голове, чередуя применение бетадина и 70% этанола стерильными ватными палочками.
  8. Нанесите последний слой бетадина и дайте коже высохнуть перед инъекцией.
    ВНИМАНИЕ: Изофлуран — опасный анестетик. Используйте соответствующие анестетические системы удаления и обеспечьте адекватную вентиляцию помещения в соответствии с институциональными нормами безопасности.

9. Проведение неонатальной внутримозговой трансплантации

  1. Аккуратно стабилизируйте головку с помощью перчаток или мягкой опоры, чтобы минимизировать движение во время инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши-реципиенты пересаживаются между P1 и P4.
  2. Определить двусторонние участки инъекции в переднем дорсальном теленцефалоне (будущая область лобной коры), примерно в 1–2 мм латерально от сагиттальной средней линии и непосредственно хвостовик обонятельных луковиц. Расположить места инъекции симметрично в каждом полушарии, избегая видимых поверхностных кровеносных сосудов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за тонкого черепа и небольшого размера новорождённых мышей инъекции проводятся с использованием визуальных анатомических ориентиров, а не стереотаксических координат.
  3. Визуально осмотрите череп и избегайте введения иглы рядом с видимыми кровеносными сосудами.
  4. Аккуратно проведите скошенную стеклянную микропипетку по коже и развивающемуся черепу.
  5. Направляйте иглу примерно на 1–2 мм ниже поверхности черепа в лобное полушарие.
  6. Доставлять донорские клетки с контролируемым ручным давлением через пипетку, управляемую ротом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При трансплантации очищенных гемопоэтических прогениторов или неонатальной микроглии вводите 2–3 мкл на полушарие, что соответствует примерно 2,5 ×10 4 клеткам на инъекцию. Это обеспечивает примерно 5 × 104 клеток на мозг мыши.
  7. Постепенно выводите микропипетку из мозга, чтобы минимизировать рефлюкс инъекционных клеток и уменьшить повреждение тканей.
  8. Выполните контралатеральную инъекцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одну иглу на мышь, чтобы избежать перекрёстного загрязнения между мышами.

10. Восстановление пересаженных новорождённых

  1. После процедуры положите каждого щенка на подогревательную подушечку.
  2. Следите за щенками, пока не вернутся нормальный цвет тела, спонтанные движения и общая активность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время восстановления составляет от 5 до 10 минут.
  3. Верните щенков на плотину.
  4. Тщательно натрите каждого щенка подстилкой и материалом для гнездования в клетке.
  5. Поместите щенков обратно в клетку вместе с мамой.
  6. Убедитесь, что плотина забирает и принимает возвращённых щенков.

11. Мониторинг послеоперационного здоровья

  1. Наблюдайте за щенками ежедневно по 10 минут в первые 3 дня после пересадки.
  2. Оценивайте щенков на нормальную активность, поведение при вскармливании и взаимодействие с матерью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокойте клетки для мышей в это время. Это может увеличить нагрузку на плотину.
  3. Продолжайте наблюдать за щенками через день до отлучения от груди после первых трёх дней.
  4. Оценивайте нормальное развитие щенков, кормовое поведение, уровень активности и материнского ухода.
  5. Измеряйте и фиксируйте массу тела ежедневно в ранний послеоперационный период.
  6. Осмотрите щенков на признаки дискомфорта, аномальной осанки, вялости или нарушения в кормлении.
  7. Проводите гуманную эвтаназию при необходимости в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными.
    1. Для новорождённых мышей усыпляйте с помощью передозировки изофлураном, используя колокольчик или аналогичную закрытую камеру с ложным полом для предотвращения прямого контакта с анестетиком. Как только дыхание прекращается и отсутствие рефлексов подтверждается, немедленно обезглавливайте.
    2. Для взрослых мышей эвтаназия с использованием 5% изофлурана, подаваемого в кислороде через прецизионный вапорайзер, до прекращения дыхания и подтверждения отсутствия рефлексов, затем вывих шейки матки как вторичный физический способ обеспечения смерти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животные с послеоперационной смертностью или отсутствием обнаруживаемого донорского имплантирования клеток в экспериментальной конечной точке были исключены из анализа. Послеоперационная анальгезия не проводилась, поскольку неонатальная внутримозговая трансплантация считалась минимально инвазивной.

12. Сбор тканей мозга для криосекции и иммунофлуоресцентного окрашивания

  1. Аккуратно удалите мозг и подготовьте его к анализу замороженного сечения.
  2. Обрабатывайте постнатальную ткань мозга для криосекции и разрезайте корональные срезы с помощью криостата согласно ранее описанным процедурам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши анализируется 9–12 корональных срезов, охватывающих соматосенсорную кору.
  3. Закрепите секции на стекли микроскопа и храните их при -20 °C до окрашивания.
  4. Инкубировать срезы кратковременно в буфере проницаемости, содержащие 0,2% тритона X-100 и 1% дезоксихолата натрия.
  5. Подготовьте первичные антитела (куриные анти-GFP, 1:500; Антитела к подопытной свинке против tdTomato — 1:250; кролик против Iba1; 1:500) разбавленной в соответствующем буфере разбавления антител.
  6. Инкубировать срезы ткани с первичными антителами за ночь при 4 °C.
  7. Промывайте секции с фосфатно-буферным физиологическим раствором для удаления несвязанных первичных антител.
  8. Инкубировать секции с фторофор-конъюгированными вторичными антителами (козячий анти-кролик Alexa Fluor 647, 1:500; козья анти-морская свинка Alexa Fluor 555, 1:500; козья анти-курица Alexa Fluor 488, 1:500) в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте.
  9. Контрокрашивание срезов с помощью DAPI для визуализации ядер клеток.
  10. Крепите секции с помощью монтажного средства против фейда и нанесите стеклянную защиту.

13. Получение изображений конфокальной микроскопии

  1. Получайте флуоресцентные изображения с помощью конфокального микроскопа с объективами 10× или 20×.
  2. Снимайте изображения с разрешением 512 × 512 или 1024 × разрешением 1024 пикселя с использованием скоростей сканирования от 200 до 400 Гц.
  3. Собирайте оптические срезы с интервалами 2–5 мкм z-step через ткань.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Неонатальная внутримозговая трансплантация очищенных популяций микроглии приводит к долгосрочной выживаемости и широкому внедрению донорских клеток в паренхиму мозга реципиента. Очищенные популяции донорской микроглии были выделены методом флуоресцентно-активированной сортировки клеток с помощью репортеров флуоресцентной линии (Hoxb8 microglia: tdTomato⁺ GFP⁺; не-Hoxb8 микроглия: tdTomato⁻ GFP⁺) перед трансплантацией (рисунок 1A). После нео...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Неонатальная внутримозговая трансплантация очищенных микроглиальных предшественников или определённых микроглиальных субпопуляций предоставляет надёжный подход к реконструкции микроглиального компартмента in vivo и изучения генеоспецифических свойств макрофагов мозга. Этот метод обеспечивает селективное восстановление с использованием генетически определённых донорских клеток, что позволяет напрямую оценить прищепление и созревание донорских клеток в мозговой среде.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здоровья (R01 MH093595) (M.R.C.), Фондом семьи Дотен и Центром потоковой цитометрии Университета Юты. Мыши Csf1rΔFIRE были созданы доктором Беном Сюй из Университета Юты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bell jarVariousN/AИспользуется для эвтаназии
Капилляры из борosilikатного стекла с
нитью		Sutter InstrumentBF100-78-15Используется для инъекционных игл
Беловой альбумин (BSA)Sigma AldrichA8806Используется для приготовления буфера PB. Доступны различные бренды. Упомянутый здесь - лишь пример
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222Миелоидные клетки
CD45 APCBioLegend103112Гемопоэтические клетки
Фильтры для клеток (70 &микро;м)Falcon352350Используется для получения одиночных
клеточных суспензий. Доступны различные бренды. Упомянутый здесь - лишь пример
Куриное анти-GFP антителоAves LabsGFP-1020Иммунофлуоресцентное
окрашивание
c-Kit PE-Cy7 антителоBioLegend105814Гемопоэтические прогенитры
Конфокальный микроскопLeicaTCS SP5Используется для флуоресцентной
визуализации
Коническая пробирка (15 мл/ 50 мл)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301Обработка ткани/клеток. Доступны различные бренды. Упомянутый здесь - лишь пример
Криостатный аппаратLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/Получение замороженных секций
ткани. Доступны различные бренды. Упомянутый здесь - лишь пример
Ядерное окрашивание DAPIThermo Fisher ScientificD1306Используется для оценки жизнеспособности и
окрашивания ядер
Диссекционный микроскопLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/Используется для обработки и подготовки инъекционных
игл. Доступны различные бренды. Упомянутый здесь - лишь пример
Сортировщик потокового цитометра FACSAriaBD BioscienceFACSAria Очистка клеток
Fc блок (очищенный CD16/32)Biolegend101302Блокирует нежелательное связывание антител с мышцами, экспрессирующими Fc рецепторы
Фетальный бычий сыворотка (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlИспользуется в буферах для клеточной подготовки
. Доступны различные бренды. Упомянутый здесь - лишь пример
Гибкий шланг для ручного пипеткиVariousN/AКомпонент ручного
аппарата для инъекций
Программное обеспечение для анализа потокового цитометраFlowJov10.8.1Используется для анализа данных FACS
Сортировщик клеток потокового цитометраBD BiosciencesFACSAriaИспользуется для очистки клеток
Аппарат gentleMACS Octo Dissociator с
нагревателями		Miltenyi Biotec130-096-427Используется для диссоциации ткани головного мозга
Горчичный анти-куриный вторичный антиген Alexa Fluor 488
Thermo Fisher ScientificA-11039Вторичное антитело
Горчичный анти-морской свинки вторичный антиген Alexa Fluor
555		Thermo Fisher ScientificA-21428Вторичное антитело
Горчичный анти-кроличиный вторичный антиген Alexa Fluor 647
Thermo Fisher ScientificA-21245Вторичное антитело
Горчичный анти-крысиный вторичный антиген Alexa Fluor 647
Thermo Fisher ScientificA-48265Вторичное антитело
Анти-tdTomato антитело морской свинкиFrontier InstituteAB_2631185Иммунофлуоресцентное
окрашивание
Разбалансированный солевой раствор Ханкса
(HBSS)		Gibco14175-079Используется при подготовке клеток
ГемоцитометрVariousN/AПодсчет клеток
Встроенный фильтр для ручного пипеткиVariousN/AПредотвращает загрязнение
МикромолотNarishigeEG-400Используется для затачивания стеклянных
инъекционных игл
Приспособление для изготовления микропипетокSutter InstrumentP-1000Используется для изготовления тонких
инъекционных игл
Насадка для ручного пипеткиVariousN/AИспользуется для ручного управления
инъекцией
Набор для диссоциации нервной ткани (P)Miltenyi Biotec130-092-628Используется для ферментативной диссоциации ткани головного мозга
Чаши ПетриThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022Используется для хранения оттянутых игл или сбора тканей. Доступны

Ссылки

  1. Rao Y, Bai Y, Li X, Du B, Peng B. The evolution of microglia replacement: A new paradigm for CNS disease therapy. Cell Stem Cell. 2025;32(12):1807-1832.
  2. Wu J, et al. Microglia replacement halts the progression of microgliopathy in mice and humans. Science. 2025;389(6756):eadr1015.
  3. Capotondo A, et al. Intracerebroventricular delivery of hematopoietic progenitors results in rapid and robust engraftment of microglia-like cells. Sci Adv. 2017;3(12):e1701211.
  4. Shibuya Y, et al. Treatment of a genetic brain disease by CNS-wide microglia replacement. Sci Transl Med. 2022;14(636):eabl9945.
  5. Mishra P, et al. Rescue of Alzheimer’s disease phenotype in a mouse model by transplantation of wild-type hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Rep. 2023;42(8):112956.
  6. Colella P, et al. CNS-wide repopulation by hematopoietic-derived microglia-like cells corrects progranulin deficiency in mice. Nat Commun. 2024;15(1):5654.
  7. Nemec KM, et al. Microglia replacement by ER-Hoxb8 conditionally immortalized macrophages provides insight into Aicardi-Goutières syndrome neuropathology. eLife. 2026;14:RP102900.
  8. Van Deren DA, et al. Defective Hoxb8 microglia are causative for both chronic anxiety and pathological overgrooming in mice. Mol Psychiatry. 2026;31(2):915-928.
  9. Sailor KA, et al. Hematopoietic stem cell transplantation chemotherapy causes microglia senescence and peripheral macrophage engraftment in the brain. Nat Med. 2022;28(3):517-527.
  10. Priller J, et al. Targeting gene-modified hematopoietic cells to the central nervous system: Use of green fluorescent protein uncovers microglial engraftment. Nat Med. 2001;7(12):1356-1361.
  11. Elmore MRP, et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 2014;82(2):380-397.
  12. Wilkinson FL, et al. Busulfan conditioning enhances engraftment of hematopoietic donor-derived cells in the brain compared with irradiation. Mol Ther. 2013;21(4):868-876.
  13. Mildner A, et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat Neurosci. 2007;10(12):1544-1553.
  14. Monje ML, Mizumatsu S, Fike JR, Palmer TD. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat Med. 2002;8(9):955-962.
  15. Lombroso SI, et al. Microglia replacement by peripheral delivery of CSF1R inhibitor-resistant hematopoietic cells. Mol Ther. 2026;34(2):850-866.
  16. Bennett FC, et al. A combination of ontogeny and CNS environment establishes microglial identity. Neuron. 2018;98(6):1170-1183.e8.
  17. De S, et al. Two distinct ontogenies confer heterogeneity to mouse brain microglia. Development. 2018;145(13):dev152306.
  18. Van Deren DA, et al. Defining the Hoxb8 cell lineage during murine definitive hematopoiesis. Development. 2022;149(8):dev200200.
  19. Nagarajan N, Capecchi MR. Optogenetic stimulation of mouse Hoxb8 microglia in specific regions of the brain induces anxiety, grooming, or both. Mol Psychiatry. 2024;29(6):1726-1740.
  20. Tränkner D, et al. A microglia sublineage protects from sex-linked anxiety symptoms and obsessive compulsion. Cell Rep. 2019;29(4):791-799.e3.
  21. Chen SK, et al. Hematopoietic origin of pathological grooming in Hoxb8 mutant mice. Cell. 2010;141(5):775-785.
  22. Foran DR, Peterson AC. Myelin acquisition in the central nervous system of the mouse revealed by an MBP-Lac Z transgene. J Neurosci. 1992;12(12):4890-4897.
  23. Dangata YY, Kaufman MH. Myelinogenesis in the optic nerve of (C57BL CBA) F1 hybrid mice: A morphometric analysis. Eur J Morphol. 1997;35(1):3-18.
  24. Rojo R, et al. Deletion of a Csf1r enhancer selectively impacts CSF1R expression and development of tissue macrophage populations. Nat Commun. 2019;10(1):3215.
  25. Askew K, et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 2017;18(2):391-405.
  26. Lund H, et al. Competitive repopulation of an empty microglial niche yields functionally distinct subsets of microglia-like cells. Nat Commun. 2018;9(1):4845.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

233233Hoxb8non Hoxb8
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.