Методическая статья

Протокол выделения РНК из тихоходок различных видов

15 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72120

⸱

1 сентября 2026 г.

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе подробно описаны процедуры выделения РНК из различных видов тихоходок с использованием набора для выделения РНК на основе колонок, предназначенного для извлечения РНК из небольших количеств ткани и получения достаточного объема высококачественной РНК для последующего применения, такого как секвенирование РНК и синтез комплементарной ДНК.

Аннотация

Тихоходки — это микроскопические животные, известные своей исключительной устойчивостью к стрессовым воздействиям окружающей среды. Эти животные способны пережить высыхание, экстремальное давление, низкие температуры и высокие уровни ионизирующего излучения. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе этих экстремотолерантных способностей, остаются изученными не полностью. Молекулярные подходы, используемые для исследования этих механизмов, включая секвенирование РНК, РНК-интерференцию (РНКi) и гетерологичную экспрессию генов тихоходок в таких системах, как бактерии, требуют выделения высококачественной матричной РНК (мРНК) из ограниченного количества биологического материала. В данном исследовании мы описываем воспроизводимый протокол выделения общей РНК из тихоходок, который (1) эффективен для нескольких видов, включая вид из группы гетеротихоходок, (2) требует всего 25–200 особей, в зависимости от размера тела, и (3) позволяет получить РНК в количестве и качестве, достаточных для последующих приложений. Данный протокол обеспечивает эффективное восстановление РНК из приемлемого количества тихоходок и позволяет проводить молекулярные исследования стрессоустойчивости у различных видов тихоходок.

Введение

Тихоходки известны своей способностью переносить экстремальный стресс, который был бы фатален для других животных, включая высыхание, экстремальное давление, экстремальные температуры и воздействие агентов, повреждающих ДНК, таких как химиотерапевтические препараты и ионизирующее излучение1,2,3,4,5,6,7,8. В последние годы ученые исследуют механизмы, лежащие в основе экстремальной устойчивости тихоходок, используя такие молекулярные подходы, как секвенирование РНК, РНК-интерференция (РНКи) и гетерологичная экспрессия генов тихоходок в других системах, включая клетки человека и бактерии8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Применение этих подходов стало мощным инструментом, позволяющим понять, каким именно образом тихоходки способны к такой экстремальной стрессоустойчивости8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Однако все эти молекулярные методы изучения стрессоустойчивости тихоходок зависят от возможности выделить РНК из этих крошечных животных в достаточном количестве и надлежащего качества для использования в последующих анализах.

Предыдущий метод выделения РНК из тихоходок оказался успешным для исследователей, работающих с Hypsibius exemplaris23. Однако при попытке воспроизвести этот протокол на H. exemplaris мы обнаружили, что он ненадежен с точки зрения получаемой концентрации и качества РНК (неопубликованные данные). Альтернативный метод выделения РНК на основе фенола продемонстрировал эффективность для H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus и одного вида гетеротихоходок13,21,22,24,25,26. Было показано, что данный протокол позволяет получить РНК достаточного качества и количества для последующих этапов анализа как из одиночных особей, так и из пулов животных (~50). Однако этот протокол требует работы с реагентами, содержащими фенол. Фенол является опасным химическим веществом, требующим осторожного обращения, и неправильное выполнение протокола может привести к переносу фенола, что повлияет на чистоту РНК и последующие приложения. Другой ранее опубликованный протокол выделения РНК из тихоходок ориентирован на возможность выделения РНК из одиночных особей27. Хотя этот протокол ценен для таких приложений, как количественная ПЦР (qPCR)27, он менее подходит для таких задач, как секвенирование РНК, где целью является получение более целостного представления о том, как животные реагируют на определенный стрессор или условие.

Ограничения существующих протоколов выделения РНК привели к исследованию альтернативных методов выделения РНК из тихоходок. Набор для выделения РНК на основе колонок, используемый в данном протоколе, предназначен для выделения РНК из небольших объемов ткани. Этот набор ранее применялся для выделения РНК из тканей насекомых с целью последующего секвенирования РНК, что позволяет предположить его применимость для выделения из других мелких животных, имеющих кутикулу, таких как тихоходки.28В данном исследовании представлен пошаговый протокол использования данного набора для выделения РНК на основе колонок применительно к тихоходкам, включая пояснения относительно специфических мер предосторожности, которые необходимо соблюдать при выполнении данного протокола с тихоходками. В статье сообщается об успешном применении данного протокола для шести видов тихоходок (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadaboutiи гетеротардиграды Viridiscus celatus). В ходе исследования было подтверждено, что РНК достаточного качества и количества может быть выделена даже из 25 животных. Также приведены примеры данных о концентрации и качестве полученной РНК, которая подходит для последующего применения, такого как секвенирование РНК (с минимальным смещением, экспоненциальным усилением библиотек) и синтез комплементарной ДНК (кДНК). Данный протокол выделения РНК уже доказал свою эффективность при изучении механизмов радиорезистентности у H. exemplaris8Успешное применение данного протокола для различных видов тихоходок свидетельствует о возможности его более широкого использования для изучения механизмов стрессоустойчивости, механизмов развития и эволюционных процессов.

Протокол

Следующий протокол не требует одобрения институционального комитета по этике работы с животными, так как беспозвоночные животные освобождены от этого требования. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка оборудования и рабочего места для выделения РНК

  1. Включите нагревательный блок или водяную баню, установив температуру 42 °C, для подготовки к экстракции РНК.
  2. Подготовьте штатив для микроцентрифужных пробирок, дозаторы (2 µL, 20 µL, 200 µL и 1000 µL) и наконечники с фильтром соответствующего размера.
  3. Очистите рабочую поверхность, штатив для пробирок, дозаторы и коробки с наконечниками с помощью средства RNase Away, разбавленного раствора отбеливателя (10%) или 70% этанола для денатурации остаточной РНКазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избыточное содержание РНКазы на оборудовании или в зоне выделения РНК может привести к недостаточному качеству РНК после выделения из-за ее деградации. Снизьте этот риск, предоставив достаточное время для воздействия химических веществ, денатурирующих РНКазу, и дав поверхности и оборудованию полностью высохнуть перед началом работы.
  4. На всех этапах данного протокола используйте перчатки и часто обрабатывайте их раствором для денатурации РНКазы, чтобы предотвратить деградацию РНК под действием РНКазы.

2. Сбор животных для изоляции РНК

  1. Используя грушу для пипеток, присоединенную к камере аспирационной трубки, оснащенной стеклянным капилляром (Рисунок 1A), петлей Ирвина или микропипеткой перенесите 25–200 особей (в зависимости от размера вида) из чашек с культурой в чашку с чистой родниковой водой, чтобы уменьшить количество материала, не относящегося к тихоходкам (водорослей или других источников пищи, таких как нематоды или коловратки, в зависимости от вида).
  2. Возьмите пестик и пробирку объемом 1,5 мл, не содержащую РНказы.
  3. С помощью резиновой груши, прикрепленной к камере аспирационной трубки, оснащенной стеклянным капилляром или петлей Ирвина, переместите животных на дно пробирки объемом 1,5 мл, не содержащей РНказ, стараясь перенести вместе с животными как можно меньше воды.
  4. Центрифугируйте при 4500 об/мин г в течение 3 мин для осаждения тихоходок на дно микроцентрифужной пробирки.
  5. Наблюдая за пробиркой с осажденными тихоходками под диссекционным микроскопом, используйте 20 µL пипетка или резиновая груша, присоединенная к аспирационной трубке с камерой, оснащенной стеклянным капилляром с отверстием, размер которого меньше размера тихоходок, из которых выделяют РНК, чтобы осторожно удалить максимально возможный объем воды, не потревожив осадок тихоходок. См. Рисунок 1B для представления допустимого количества остаточной влаги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и оставьте небольшой слой воды, чтобы животные не пересохли за короткое время между удалением воды и добавлением буфера для экстракции (XB). Пересыхание животных может привести к низкому качеству выделенной РНК.
  6. Добавьте 100 µL буфера для экстракции (XB) в пробирку с тихоходками.

3. Механическое разрушение тихоходок и экстракция РНК

  1. Используя пестик, не содержащий РНказ, разрушьте тихоходки, осторожно, но плотно прижимая пестик к дну пробирки в течение ~30 s. Для полного разрушения тихоходок должно быть достаточно 20–30 циклов растирания.
  2. Извлеките пестик из пробирки, стараясь максимально сохранить жидкость на дне пробирки.
  3. Осмотрите содержимое микроцентрифужной пробирки под диссекционным микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии целых особей.
  4. Инкубируйте смесь при 42 °C в течение 30 min на встряхивающем термоблоке при слабом перемешивании (300 rpm).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для экстракции (XB) стабилизирует РНК, предотвращая ее деградацию при данной температуре.

4. Кондиционирование колонки для выделения РНК

  1. За 10 мин до завершения инкубации при экстракции подготовьте колонку для сбора и очистки РНК. Поместите колонку для очистки в пробирку для сбора и соответствующим образом промаркируйте колонку.
  2. Добавьте 250 µL кондиционирующего буфера (CB) непосредственно в колонку.
  3. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
  4. Центрифугируйте при 16,000 × g в течение 1 мин и удалите фильтрат. Теперь колонку можно использовать для нанесения супернатанта с РНК на следующем этапе.
  5. Достаньте 10x буфер для реакции DNase I и воду, свободную от нуклеаз, из морозильной камеры, чтобы они полностью разморозились к этапу 6.

5. Связывание РНК с колонкой

  1. После инкубации при экстракции центрифугируйте пробирку с механически разрушенными тихоходками и экстракционным буфером (XB) при 3,000 × g в течение 2 мин.
  2. Возьмите новую пробирку, не содержащую РНКаз, и соответствующим образом промаркируйте ее.
  3. С помощью дозатора на 200 µL с фильтрующим наконечником осторожно удалите супернатант из осадка кутикул тихоходок. Будьте осторожны, чтобы не задеть осадок кутикул и удалить только супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Попадание кутикулы на последующие этапы приведет к снижению эффективности выхода РНК с колонки из-за физического засорения колонки. Чтобы избежать этой возможной ошибки, можно осмотреть наконечник дозатора с супернатантом под микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии кутикулы. При наличии кутикулы верните супернатант в пробирку и повторите этап центрифугирования.
  4. Перенесите супернатант в новую промаркированную пробирку, не содержащую РНКаз.
  5. Перенесите 100 µL 70% этанола в пробирку с РНК и тщательно перемешайте, несколько раз набирая и вытесняя жидкость дозатором. На этом этапе при добавлении этанола должны появиться прозрачные вязкие нити. Это хороший признак того, что в вашем супернатанте присутствует РНК.
  6. Перенесите всю смесь (200 µL) на подготовленную на этапе 4 колонку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При внесении любых растворов на колонку на данном и последующих этапах следите за тем, чтобы распределять жидкость в центр колонки и избегать физического касания колонки наконечником дозатора. Механическое повреждение колонки приведет к проблемам с качеством и количеством РНК на последующих этапах.
  7. Для связывания РНК с колонкой центрифугируйте в течение 2 мин при 100 × g, затем центрифугируйте при 16,000 × g в течение 30 с для удаления фильтрата.

6. Приготовление раствора DNase I

  1. Перед приготовлением раствора дайте 10x DNase I Reaction Buffer и Nuclease-Free Water полностью оттаять.
  2. Для каждого выделения РНК приготовьте в отдельной микроцентрифужной пробирке объемом 1.5 mL раствор объемом 40 µL, состоящий из 32 µL Nuclease-Free Water, 4 µL 10x DNase I Reaction Buffer и 4 µL DNase I Enzyme. Храните раствор на льду до момента нанесения на колонку в шаге 7.3.

7. Промывка РНК и обработка ДНКазой I

  1. Перенесите пипеткой 100 µL промывочного буфера 1 (W1) непосредственно в колонку для очистки, содержащую связавшуюся РНК (из этапа 5.7).
  2. Центрифугируйте в течение 1 мин при 8,000 × g и удалите фильтрат.
  3. Перенесите пипеткой 40 µL раствора DNase I из этапа 6 непосредственно в колонку для очистки и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин для удаления контаминации ДНК.
  4. Перенесите пипеткой 40 µL промывочного буфера 1 (W1) в колонку для очистки и центрифугируйте при 8,000 × g в течение 30 с.
  5. Перенесите пипеткой 100 µL промывочного буфера 2 (W2) в колонку для очистки и центрифугируйте при 8,000 × g в течение 1 мин.
  6. Перенесите еще 100 µL промывочного буфера 2 (W2) в колонку для очистки и центрифугируйте при 16,000 × g в течение 2 мин. Удалите фильтрат.
  7. Центрифугируйте колонку при 16,000 × g в течение 1 мин для подсушивания колонки.

8. Элюция РНК

  1. Возьмите пробирку объемом 0,5 mL (входит в состав набора) для каждого выделения РНК и надлежащим образом промаркируйте ее. В этой пробирке будет находиться РНК после выделения.
  2. Перенесите колонку с связанной и промытой РНК в промаркированную пробирку объемом 0,5 mL. Колонка должна плотно защелкнуться в этой пробирке.
  3. Глядя на пробирку сбоку, расположите наконечник пипетки непосредственно над мембраной колонки, внесите 11 µL буфера для элюции (EB) на колонку и инкубируйте в течение 1 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильное распределение буфера для элюции (EB) по колонке приведет к снижению выхода РНК. Если вокруг периметра колонки наблюдаются капли жидкости, это свидетельствует о неправильном распределении буфера для элюции (EB). В таком случае рекомендуется повторить этот шаг, используя фильтрат из этапа 8.5, обеспечив внесение буфера для элюции (EB) точно в центр колонки.
  4. Поместите пробирку объемом 0,5 mL с колонкой в collecting tube, прилагаемую к набору, для обеспечения правильной фиксации во время центрифугирования (Рисунок 2).
  5. Центрифугируйте колонку при 1,000 × g в течение 1 мин для распределения буфера для элюции (EB), а затем центрифугируйте при 16,000 × g в течение 1 мин для элюции РНК.
  6. Немедленно поместите пробирку объемом 0,5 mL с РНК на лед.

9. Валидация количества и качества РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки количества и качества РНК могут быть использованы другие методы. В данном случае используется метод с применением микрообъемного спектрофотометра. Также могут быть использованы флуориметр или прибор для микрофлюидного гель-электрофореза29.

  1. Протрите пьедестал микрообъемного спектрофотометра безворсовой салфеткой, чтобы убедиться в отсутствии остатков других жидкостей.
  2. Выберите на спектрофотометре настройку RNA для проведения анализа.
  3. Обнулите спектрофотометр, используя 1 µL буфера для элюции (EB), примененного на этапе 8.3.
  4. После обнуления удалите буфер для элюции (EB) с пьедестала с помощью безворсовой салфетки.
  5. Держите пробирку объемом 0.5 mL с РНК на льду; перенесите 1 µL РНК на пьедестал спектрофотометра. Опустите рычаг спектрофотометра, чтобы измерить оптическую плотность образца для количественного определения и оценки качества выделенной РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию о допустимом качестве и количестве РНК для последующего использования см. в разделе «Результаты» ниже.

Результаты

Критически важным этапом данного протокола, как упоминалось выше, является удаление подходящего количества воды из собранных тихоходок перед добавлением буфера для экстракции (XB) для выделения РНК. Оставление слишком большого количества воды приведет к разбавлению буфера для экстракции (XB) и к неоптимальному (т. е. RIN < 7, соотношение 260/280 < 1,8, соотношение 260/230 < 1,8 и/или концентрация < 5 ng/µL) выделению РНК из животных, что приведет к снижению концентрации и качества РНК после элюции. Удаление слишком большого количества воды вызовет быстрое высыхание животных, что может привести к их гибели и снижению качества РНК из-за повышения активности РНКаз после смерти. Для успешного выполнения данного протокола приводится наглядное изображение подходящего количества воды, которую следует оставить в пробирке с тихоходками перед добавлением буфера для экстракции (XB) (Рисунок 1B).

На сегодняшний день данный протокол был апробирован на шести различных видах тихоходок, включая гетеротихоходку (V. celatus). В результате выделения были получены концентрации РНК от 11 ng/µL до 106,6 ng/µL (подтверждено с помощью микрообъемного спектрофотометра, Таблица 1) и от 9 ng/µL до 113 ng/µL (подтверждено методом микрофлюидного гель-электрофореза, Таблица 2). Количество животных, необходимых для выделения РНК, варьируется в зависимости от размера вида, используемого в работе. Более крупные тихоходки, такие как виды Paramacrobiotus и Milnesium sp., позволяют получить достаточные концентрации РНК даже из 25 особей (Таблица 1). Для более мелких видов, таких как H. exemplaris и V. celatus, более успешные результаты выделения достигаются при использовании 100 или более особей (Таблица 1). В большинстве случаев выделенная РНК имеет соотношение 260/280 около 2, что указывает на чистоту образца30. Выделение РНК из некоторых видов (V. celatus, H. exemplaris и видов Paramacrobiotus) иногда приводит к низкому значению соотношения 260/230, что свидетельствует о загрязнении реагентами30. Это часто случалось при использовании меньшего количества животных (100 для V. celatus и H. exemplaris, и 25 для видов Paramacrobiotus), что позволяет предположить, что недостаточное количество биоматериала может повысить риск загрязнения конечной элюированной РНК реагентами. Посредством оценки качества РНК с помощью микрофлюидного гель-электрофореза может быть рассчитан индекс целостности РНК (RIN). Значение RIN в диапазоне 9–10 указывает на высококачественную РНК с минимальной деградацией31; обычно не рекомендуется переходить к последующим этапам, таким как секвенирование РНК, если RIN ниже 7. Приведены примеры результатов микрофлюидного гель-электрофореза (Рисунок 3) для образцов с высокими и низкими/неопределяемыми значениями RIN. Некоторые из этих образцов были исключены из дальнейшего анализа (Таблица 2, Рисунок 3A,D). Однако некоторые образцы с низким/неопределяемым RIN были отобраны для подготовки библиотек для секвенирования РНК и все же дали качественные результаты секвенирования (Таблица 2, Рисунок 3B,F, неопубликованные данные, см. раздел «Обсуждение» для получения дополнительной информации).

figure-results-1
Рисунок 1: Схема выделения РНК. На изображениях показаны груша для пипетки, прикрепленная к камере аспирационной трубки, оснащенной стеклянным капилляром для перемещения животных и удаления воды (A), и пример допустимого количества воды, остающейся перед добавлением буфера для экстракции (XB) к тихоходкам Paramacrobiotus (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Схема расположения пробирок для финального элюирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Типичные результаты микрофлюидного гель-электрофореза для H. exemplaris и P. gadabouti. (A) Гель РНК H. exemplaris после воздействия ионизирующего излучения. (B) Гель РНК P. gadabouti и H. exemplaris в контрольных условиях. (C–F) Типичные профили пиков высококачественного образца РНК H. exemplaris (C), образца H. exemplaris сомнительного качества (D), качественного образца P. gadabouti (E) и образца H. exemplaris с явной деградацией (пик на 147 bp) (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Репрезентативные значения концентрации и качества РНК различных видов тихоходок, определенные с помощью микрообъемного спектрофотометра. *Концентрации ниже 20 ng/µL, определенные с помощью микрообъемного спектрофотометра, могут привести к неточным значениям соотношения абсорбции. **Низкое соотношение 260/230 вызвано неверной скоростью центрифугирования на этапе 5.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Репрезентативные данные о концентрации и качестве РНК двух видов тихоходок, полученные с помощью системы микрофлюидной гель-электрофорезы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Целью данного протокола является выделение РНК из тихоходок в количестве и качестве, достаточных для последующих приложений, позволяющих исследовать стрессоустойчивость тихоходок. В представленном протоколе описаны этапы, на которых могут возникнуть сложности, включая удаление достаточного количества воды перед добавлением буфера для экстракции (XB) (шаг 2.5), разрушение тел тихоходок (шаги 3.1–3.3), перенос супернатанта в колонку для очистки (шаг 5.3) и элюцию РНК (шаг 8.3). Ошибки на любом из этих этапов могут привести к снижению концентрации или качества полученной РНК. Если концентрация полученной РНК составляет менее 5 ng/µL (что подтверждается с помощью микрообъемного спектрофотометра), пользователю рекомендуется рассмотреть возможность повторного выделения РНК с использованием (1) большего количества исходных животных (>100 для мелких видов или >50 для крупных видов) или (2) повторения протокола с особым вниманием к этапам удаления воды, разрушения тихоходок и элюции.

В данной статье представлены примеры оценки качества РНК (показатель RIN, соотношение 260/280, соотношение 260/230), которые были признаны подходящими или неподходящими для секвенирования РНК (Таблица 1, Таблица 2, Рисунок 3). Время от времени низкие (<1.0) При использовании данного протокола в некоторых случаях выделения РНК наблюдаются значения соотношения 260/230 (Таблица 1), что указывает на наличие остаточных органических соединений. Обычно это было связано с малым количеством исходного биоматериала животных. Если увеличение количества исходного материала невозможно или если пользователи постоянно сталкиваются с низким соотношением 260/230, рекомендуется добавить дополнительный этап промывки буфером для промывки 2 (W2) (повторить шаг 7.6) и/или увеличить время центрифугирования на режиме «сухого осадка» в шаге 7.7, чтобы обеспечить удаление этих загрязняющих веществ. Кроме того, следует отметить, что один репрезентативный H. exemplaris выделение с низким соотношением 260/230 (Таблица 1) была выполнена студентом бакалавриата, который впервые использовал данный протокол и впоследствии осознал, что шаг 5.7 (центрифугирование для удаления этанола после связывания РНК с колонкой) был проведен при неправильной скорости центрифугирования (слишком низкой). Вероятно, это привело к тому, что этанол остался на колонке и переносился на следующие этапы протокола, что стало причиной низкого соотношения 260/230. Последующие выделения, проведенные этим пользователем, дали значения 260/230 в пределах допустимого диапазона (не ниже 1,5). Таким образом, всем пользователям, особенно тем, кто выполняет процедуру впервые, следует строго соблюдать скорость центрифугирования при работе по протоколу, чтобы избежать возникновения подобных проблем. Несмотря на периодически низкие значения соотношения 260/230 или низкий показатель RIN в H. exemplarisРНК с аналогичными показателями качества все еще могут быть использованы для последующего секвенирования РНК с целью изучения дифференциальной экспрессии генов после воздействия ионизирующего излучения или других стрессоров8 (Таблица 1, Таблица 2, и неопубликованным данным). Аналогичным образом, РНК, выделенная из P. gadabouti использование данного протокола позволило получить РНК с высокой концентрацией и качеством (что подтверждено показателем RIN, Таблица 2, Рисунок 3) и позволило получить значимые данные секвенирования РНК (неопубликованные данные). По имеющимся сведениям, в данном исследовании была успешно использована РНК из H. exemplaris с низкими концентрациями (5–9 нг/µL) для синтеза кДНК с целью последующего успешного клонирования H. exemplaris гены8Когда РНК из H. exemplaris привели к низкой или неопределяемой концентрации и значению RIN (измеренному с помощью микрофлюидного гель-электрофореза), в связи с чем перед переходом к подготовке библиотек для секвенирования РНК для данного варианта обработки была проведена повторная изоляция РНК (Таблица 2, Рисунок 3A,D). Решение о повторном выделении РНК для данного образца (Рисунок 3A,D), вместо того чтобы приступать к секвенированию, как это было сделано с другими образцами из H. exemplaris с неопределяемым показателем RIN (Рисунок 3B,F), было принято на основании отсутствия четких полос на микрофлюидном геле, что может указывать на ошибку при нанесении образца, деградацию РНК или недостаточную концентрацию РНК. Напротив, при использовании РНК, выделенной из H. exemplaris имела относительно низкую концентрацию, неопределяемый показатель RIN и признаки частичной деградации РНК, о чем свидетельствовал повышенный уровень коротких молекул РНК, тем не менее после подготовки библиотек она позволила получить пригодные данные секвенирования РНК (неопубликованные данные, Таблица 2, Рисунок 3B,F). Следовательно, несмотря на то, что здесь приведены некоторые рекомендации по определению пригодности образцов РНК для последующих приложений, пользователю следует руководствоваться собственным усмотрением и учитывать специфику конкретного применения при оценке того, достаточно ли качества и количества РНК для продолжения работы.

Ученым, желающим выделить РНК из тихоходок, необходимо учитывать множество аспектов при определении того, какой протокол лучше всего подходит для их целей. Все ранее описанные методы выделения РНК (включая метод, представленный здесь) позволили получить РНК в количестве и качестве, достаточном для проведения последующих приложений, таких как секвенирование РНК, синтез кДНК и qPCR8,12,13,17,21,22,25,27. Стоимость часто является важным фактором, особенно для исследовательских лабораторий с ограниченным бюджетом или учебных лабораторий. Описанный здесь протокол дороже ранее опубликованных протоколов в расчете на одну реакцию выделения. Однако мы полагаем, что увеличение стоимости сопровождается определенными преимуществами по сравнению с предыдущими протоколами. По сравнению с другими протоколами выделения РНК на основе колонок23, данный протокол позволяет получить достаточное количество РНК надлежащего качества из меньшего объема исходного материала (меньшего количества животных). Кроме того, как упоминалось во введении, ранее описанный протокол выделения РНК на основе колонок работал в наших руках нестабильно, что часто приводило к крайне низкому выходу РНК, недостаточному для последующих процессов (неопубликованные данные). Описанный здесь протокол также значительно безопаснее по сравнению с подходом к выделению РНК на основе фенола, так как он не требует работы с опасными химическими веществами в вытяжном шкафу. Кроме того, распространенной проблемой при использовании протоколов экстракции РНК с фенолом является перенос остатков фенола, что влияет на чистоту РНК и может помешать проведению последующих приложений. Эти проблемы делают экстракцию РНК на основе фенола менее доступной для студентов бакалавриата (как в исследовательских лабораториях, так и в учебных аудиториях). Тем не менее, метод на основе фенола является наиболее экономически эффективным. Данный протокол не подходит для выделения РНК из одной особи с целью оценки транскриптомного ответа отдельного животного (как опубликовано в Kirk et al), но он представляет ценность для изучения общих изменений у разных особей в ответ на стрессор, обеспечивая более целостный взгляд на стрессовые реакции. Таким образом, пользователям следует сопоставить значимость стоимости, доступности животных и удобства использования существующих протоколов, чтобы определить, какой метод лучше всего соответствует их потребностям.

В данном отчёте подтверждено, что данный протокол позволяет выделить РНК достаточного количества и качества из шести различных видов тихоходок, включая репрезентативный вид из группы Heterotardigrada. Кроме того, этот метод изоляции РНК позволяет получить достаточное количество РНК из приемлемого числа особей (25–200, в зависимости от размера вида). Валидация данного протокола изоляции РНК для нескольких видов открывает возможности для изучения захватывающих аспектов биологии тихоходок. Это касается не только исследования стрессоустойчивости, но и понимания эволюции этих животных, включая развитие и эволюцию механизмов резистентности. Данный протокол особенно полезен для немодельных и собранных в полевых условиях видов тихоходок, характеризующихся ограниченной биомассой и отсутствием стандартизированных методов изоляции РНК. Наконец, этот протокол доступен исследователям и может быть воспроизводимо выполнен студентами, что делает его ценным ресурсом для учебных или исследовательских лабораторий в высших учебных заведениях с преимущественно бакалаврским уровнем подготовки.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

Данная работа была поддержана стартовым финансированием UNC Asheville (для CCH) и грантом NSF 2225683, предоставленным Джейсону Пинаару (постдокторантскому наставнику PK). Мы благодарим Центр высокопроизводительного секвенирования UNC за техническую помощь.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифужные пробирки 1.5 mLUSA Scientific1615-5500Градированные микроцентрифужные пробирки Seal-Rite 1.5 mL, натуральные, полипропилен, 500/уп.
70% этанолVWR71001-654Для очистки рабочих поверхностей и оборудования
Набор для выделения РНК Arcturis PicoPure RNA Isolation KitFisherKIT0204Набор, содержащий компоненты для протокола выделения, описанного в данной статье
ЦентрифугаEppendorf5405000441Центрифуга 5425, с поворотными ручками, без охлаждения, с ротором FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (US)
Природная вода Deer ParkAny Grocery StoreN/AСреда для культивирования тихоходок и для промывки тихоходок перед выделением РНК
Диссекционный микроскопZeissN/AZeiss Stemi 305, коэффициент зумирования 5:1 и общее увеличение 8x-40x, с блоком трансмиссионной подсветки M LED
ДНКаза IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, без РНКаз (1 U/uL)
Фильтрованные наконечники для дозаторов 10 uLVWR76322-528Подходят любые фильтрованные наконечники
Фильтрованные наконечники для дозаторов 1000 uLVWR76322-154Подходят любые фильтрованные наконечники
Фильтрованные наконечники для дозаторов 20 uLVWR76322-134Подходят любые фильтрованные наконечники
Фильтрованные наконечники для дозаторов 200 uLVWR76322-150Подходят любые фильтрованные наконечники
Стеклянные капиллярыFisher50-821-811Стандартные стеклянные капилляры World Precision Instrument - 1B120-6 (6 дюймов, внешний диаметр 1.2 mm, без нити). Капилляры вытягивают над пламенем для создания двух стеклянных капилляров с суженными концами, затем обрезают до подходящего диаметра для перемещения выбранных видов тихоходок с помощью ротовой пипетки.
ТермоблокEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, базовое устройство без термоблока, 100-130 V/50-60 Hz (US/JP/South America/TW)
Маркер High Sensitivity RNA Screen Tape LadderAgilent5067-5581Маркер для высокочувствительного анализа общей РНК в системах TapeStation
Кассета High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Для высокочувствительного анализа общей РНК в системах TapeStation
Буфер для образцов High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580Буфер для высокочувствительного анализа общей РНК в системах TapeStation
Микрофлюидный гель-электрофорезAgilentG2991BAСистема Agilent 4200 TapeStation
Микрообъемный спектрофотометрFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, тип детектора: 2048-элементный линейный КМОП-датчик изображения, дисплей: 10-дюймовый цветной дисплей высокого разрешения, языки: китайский, английский, французский, японский, немецкий, источник света: ксеноновая вспышка, спектральная ширина полосы: меньше или равна 1.8 nm (FWHM при Hg 254 nm), напряжение: 12 VDC
Ротовая пипеткаMillipore SigmaA5177Комплекты аспирационных трубок для калиброванных микрокапиллярных пипеток
Вода без нуклеазFisherFERR0581Thermo Scientific Water, без нуклеаз
Дозаторы (2.5 uL, 20 uL, 200 uL и 1000 uL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, набор из 4 шт.
RNase AwayFisher21-402-178Средство для деконтаминации поверхностей Thermo Scientific RNase AWAY
Пробирки и пестики без РНКазFisher12-141-368Пробирки и пестики без РНКаз для выделения РНК

Ссылки

  1. Møbjerg N, Neves RC. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2021;254:110890.
  2. Møbjerg N, Halberg KA, Jørgensen A, Persson D, Bjørn M, Ramløv H, et al. Survival in extreme environments—on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiol (Oxf). 2011;202(3):409-420.
  3. Hibshman JD, Clegg JS, Goldstein B. Mechanisms of desiccation tolerance: themes and variations in brine shrimp, roundworms, and tardigrades. Front Physiol. 2020;11:592016.
  4. Hengherr S, Schill RO. Environmental adaptations: cryobiosis. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 295-310.
  5. Schill RO, Hengherr S. Environmental adaptations: desiccation tolerance. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 273-293.
  6. Guidetti R, Rizzo AM, Altiero T, Rebecchi L. What can we learn from the toughest animals of the Earth? Water bears (tardigrades) as multicellular model organisms in order to perform scientific preparations for lunar exploration. Planet Space Sci. 2012;74(1):97-102.
  7. Jönsson KI. Radiation tolerance in tardigrades: current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 2019;11(9):1333.
  8. Clark-Hachtel CM, Hibshman JD, De Buysscher T, Stair ER, Hicks LM, Goldstein B. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 2024;34(9):1819-1830.e6.
  9. Hashimoto T, Kunieda T. DNA protection protein, a novel mechanism of radiation tolerance: lessons from tardigrades. Life (Basel). 2017;7(2):26.
  10. Chavez C, Cruz-Becerra G, Fei J, Kassavetis GA, Kadonaga JT. The tardigrade damage suppressor protein binds to nucleosomes and protects DNA from hydroxyl radicals. Elife. 2019;8:e47682.
  11. Kamilari M, Jørgensen A, Schiøtt M, Møbjerg N. Comparative transcriptomics suggest unique molecular adaptations within tardigrade lineages. BMC Genomics. 2019;20(1):607.
  12. Boothby TC, Tapia H, Brozena AH, Piszkiewicz S, Smith AE, Giovannini I, et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 2017;65(6):975-984.e5.
  13. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 2022;23(1):405.
  14. Anoud M, et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade-specific DNA-binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 2024;13:RP92621.
  15. Förster F, Liang C, Shkumatov AV, et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 2012;6:69-96.
  16. Horikawa DD, Sakashita T, Katagiri C, et al. Analysis of DNA repair and protection in the tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 2013;8(6):e64793.
  17. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  18. Li L, et al. Multi-omics landscape and molecular basis of radiation tolerance in a tardigrade. Science. 2024;386(6720):eadl0799.
  19. Hibshman JD, Clark-Hachtel CM, Bloom KS, Goldstein B. A bacterial expression cloning screen reveals single-stranded DNA-binding proteins as potent desicco-protectants. Cell Rep. 2024;43(11):114956.
  20. Hashimoto T, Horikawa DD, Saito Y, et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nat Commun. 2016;7:12808.
  21. Yoshida Y, Hirayama A, Arakawa K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2024;100(7):414-28.
  22. Murai Y, et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests the possibility of convergent evolution of abundant heat-soluble proteins in Tardigrada. BMC Genomics. 2021;22(1):813.
  23. Boothby TC. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(11):prot102376.
  24. Arakawa K, Yoshida Y, Tomita M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 2016;3:160063.
  25. Yoshida Y, Sugiura K, Tomita M, Matsumoto M, Arakawa K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 2019;19(1):20.
  26. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  27. Kirk MJ, Xu C, Paules J, Rothman JH. Single-animal, single-tube RNA extraction for comparison of relative transcript levels via qRT-PCR in the tardigrade Hypsibius exemplaris. J Vis Exp. 2025;(215):e66935. doi:10.3791/66935.  
  28. Linz DM, Hara Y, Deem KD, Kuraku S, Hayashi S, Tomoyasu Y. Transcriptomic exploration of the coleopteran wings reveals insight into the evolution of novel structures associated with the beetle elytron. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2023;340(2):197-213.
  29. Agilent Technologies Inc. RNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems. Part No. G2991-90121 Rev. D. Santa Clara (CA): Agilent Technologies; 2018.
  30. Manchester KL. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996;20(6):968-70.
  31. Imbeaud S, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005;33(6):e56.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.