Взаимодействие препарата между эвгенолом и репаглинидом при сахарном диабете 2 типа и его потенциальный механизм

Краткое содержание

Целью данного исследования было изучение возможных взаимодействий лекарств между эвгенолом (EUG) и репаглинидом (RPG) у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД2).

Аннотация

В этом исследовании изучалось потенциальное взаимодействие лекарственного препарата (DDI) между эвгенолом (EUG) и репаглинидом (RPG) при сахарном диабете 2 типа (СД2). Была создана модель крыс с СД2 с использованием диеты с высоким содержанием жиров и стрептозотоцина (STZ). Группа, принимающая одну дозу, получала 0,4 мг/кг RPG, а группы с совместным введением проходили предварительное лечение EUG (50, 100, 150 мг/кг) в течение семи дней перед получением одной дозы RPG (0,4 мг/кг). В плазменных образцах крыс оценивались уровень глюкозы в крови и фармакокинетические параметры RPG. Влияние EUG на метаболическую стабильность RPG и активность цитохрома P3A (CYP3A) оценивалось в микросомах печени крыс (RLM). У крыс с ЦД2 лечение РПГ показало гипогликемический эффект, который дополнительно усиливался при совместном введении EUG в зависимости от дозы (p < 0,001). Совместное введение EUG повлияло на фармакокинетику RPG, увеличив площадь под кривой (AUC увеличился на 88,64%, 164,59% и 244,72% по сравнению с одиночным RPG, p < 0,001), максимальную концентрацию в плазме (_{C max} — 18,61%, 53,58% и 77,63% по сравнению с одним RPG, p < 0,01), максимальную концентрацию (_{T max}, 1,0 ч при совместном вводе EUG против 0,5 часа для одного RPG), период полувыведения (t_1/2, продленное 33,86%, 49,61% и 88,19% против одного RPG, p < 0,01), среднее время удержания (MRT, продлённое 17,62%, 26,42%, 44,04% против одного RPG, p < 0,001) и снижение скорости очистки (Clz/F, снижение на 48,92%, 63,31% и 74,10% против одного RPG, p < 0,001) в зависимости от дозы. In vitro В исследовании RLM, EUG улучшила метаболическую стабильность RPG, продлевая период полураспада (44,09 ± 3,25 мин) и снижая внутренний клиренс (30,55 ± 3,69 мкл/мин/мг белка). EUG также ингибировала активность CYP3A с IC₅₀ в 7,90 ± 1,79 мкм. Совместное введение EUG способствовало гипогликемическому эффекту RPG за счёт усиления системного воздействия RPG у крыс с СД2, потенциально за счёт улучшения метаболической стабильности RPG и ингибирования активности CYP3A.

Введение

Сахарный диабет 2 типа (СД2) — это хроническое метаболическое расстройство, характеризующееся инсулинорезистентностью или снижением эффективности инсулина, которое затрагивает миллионы людей по^{всему миру 1}. Сложные взаимодействия с генетической чувствительностью и факторами образа жизни участвуют в ЦД2, что приводит к нарушенному усвоению глюкозы, чрезмерному печёночному глюконеогенезу и хроническому низкостепенному^{воспалению.} СД 2 может привести к серьёзным осложнениям при неправильном лечении, включая сердечно-сосудистые заболевания, болезни почек, ретинопатию и невропатию, что существенно влияет на качество жизни пациентов и увеличивает^{смертность 2}. Современные методы лечения СД 2 включают метформин, препараты сульфонилмочевины, агонисты рецепторов GLP-1, ингибиторы DPP-4 и др^{. 3}. Репаглинид (РПГ) — это один из видов короткодействующего меглитинида, который действует за счёт стимуляции секреции инсулина и обладает характеристикой гибкости^{дозы 4}. По сравнению с сульфонилмочевиной, глиниды обеспечивают лучший контроль постпандиальной гипергликемии, снижают риск некоторых побочных эффектов, таких как гипогликемия, и обеспечивают более благоприятный профиль безопасности, особенно у пациентов с почечной^{недостаточностью 5,6}. RPG быстро всасывается после перорального приёма, достигая максимальной концентрации в плазме обычно в течение 30–60 минут, а короткий период полураспада приводит к кратковременной стимуляции высвобождения инсулина. Клинически РПГ используется либо как монотерапия, либо в сочетании с другими пероральными антигипергликемическими препаратами для оптимизации контроля^{гликемии 7}. Однако клиническое применение ограничено низкой пероральной биодоступностью (около 56%), быстрым метаболизмом печени и потенциальным риском гипогликемии 8,9,10,11,12,13,14. Эти недостатки подчёркивают необходимость комплексной стратегии лечения.

Эвгенол (EUG), химически известный как 4-аллил-2-метоксифенол, — это органическое соединение с химической формулой C_{10H 12}O₂¹⁵. EUG — это бесцветная или бледно-жёлтая жидкость, активное фенольное соединение, которое в основном встречается в гвоздике (Eugenia caryophyllata Thunb.) и других ароматических^{растениях 16}. EUG привлекла большое внимание благодаря её различным фармакологическим свойствам, включая антиоксидантную, противовоспалительную, антибактериальную, обезболивающую и противоопухолевую^{активность} 17,18,19. Недавние исследования показали, что EUG демонстрирует потенциальную ценность как дополнительная терапия при ЦД2, поскольку как in vitro, так и in vivo экспериментальные данные свидетельствуют о повышении чувствительности к инсулину, стимулированию поглощения глюкозы в периферических тканях, подавлении печёночного глюконеогенеза и защите функции β-клеток поджелудочной^{железы 20,21}. Эти многогранные показатели, в сочетании с относительно низкой^{токсичностью 22}, позиционируют EUG как перспективный кандидат в натуральный препарат, способный компенсировать недостатки традиционных клинических препаратов и смягчать осложнения, связанные с СД2, с помощью синергетического механизма.

Ферменты цитохрома P450 (P450s) играют ключевую роль в процессе метаболизма лекарств и опосредуют взаимодействия лекарственного препарата (DDI), индуцируя или ингибируя определённые подтипы, что имеет жизненно важное значение для безопасного и эффективного лечения^{препаратами 23}. Примечательно, что РПГ в основном метаболизируется в печени CYP2C8 и CYP3A4^24,25. При совместном введении с кверцетином (QCT) QCT повышает биодоступность RPG in vivo, ингибируя печёночный первый проход и системный метаболизм с помощью CYP450s²⁶. Также сообщалось, что EUG подавляет активность CYP450, включая 1A2, 2C9, 2D6 и 3A4, зависящее от концентрации, что указывает на возможные взаимодействия при совместном введении EUG с препаратами, метаболизируемыми^{этими ферментами 27}. Несмотря на многообещающий потенциал EUG как дополнительной терапии при ДД2 и известную восприимчивость RPG к CYP-опосредованным DDI, остаётся неясным, изменяет ли EUG системное воздействие, метаболическую стабильность или метаболизм, опосредованный CYP3A. Учитывая, что и EUG, и RPG, скорее всего, будут применяться совместно в клинической практике или при приёме пищевых добавок, отсутствие данных о DDI между ними создаёт потенциальный риск непреднамеренных изменений концентраций RPG в плазме. Такие изменения могут привести либо к снижению терапевтической эффективности, либо к повышению риска гипогликемии. Таким образом, этот разрыв в доказательствах представляет собой значительное препятствие для рационального и безопасного сочетания натуральных продуктов с традиционными противодиабетическими препаратами. Поэтому крайне важно систематически оценивать влияние EUG на фармакокинетику и фармакодинамику RPG, а также прояснить лежащий в основе метаболический механизм, с особым вниманием к активности CYP3A. Учитывая вышеуказанные данные, можно предположить, что EUG может влиять на метаболизм RPG, изменяя активность CYP450. Это первое исследование, изучающее взаимодействие EUG и RPG в условиях СД 2. Ожидается, что результаты восполнят критический пробел в знаниях и обеспечат механистическую основу для оптимизации безопасного совместного управления EUG и RPG в управлении T2DM. Если рассматривается совместное введение, следует учитывать возможность увеличения воздействия RPG и отслеживать признаки гипогликемии, особенно при приёме ЭУГ в высоких дозах или в виде концентрированной добавки. Кроме того, хотя у крыс экспрессируются изоформы CYP3A, функционально аналогичные человеческим CYP3A4, прямая экстраполяция количественных данных на человека требует осторожности из-за различий видов в экспрессии ферментов и каталитической активности.

Протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по этике Академии китайских медицинских наук Цзилинь (Дата: 2024.11.21/No2024112) в соответствии с руководящими принципами^{ARRIVE 28}. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Условия содержания животных

Самцы крыс Спраг-Доули (200–250 г) содержались в лабораторной комнате животных при следующих условиях: температура: 22 °C ± 2 °C, относительная влажность: 40–60%, и 12-часовой цикл света/тьма, с свободным доступом к корму и воде для одной недели^{акклиматизации 29,30}.

2. Моделирование животных, обработка и обработка образцов

Размер выборки определялся на основе анализа мощности с использованием F-теста (G*Power 3.1.9.7). Был проведен априорный анализ мощности с размером эффекта 0,6, уровнем α 0,05 и желаемой мощностью 0,8, что дало общий размер выборки 55. Этот расчёт показал, что на группу требуется не менее 9 крыс. Поэтому использовалось по десять крыс на группу, что дало фактическую мощность 0,86.

До внедрения модели T2DM все крысы голодали 12 часов. Затем их случайным образом делили на две группы: контрольную группу (n = 10) и группу T2DM (n = 50). Создание модели крыс с T2DM было проведено по методу, ранее^{сообщенному 31}. Кратко говоря, крысы группы с ЦД2 получали пищу с высоким содержанием жиров (с содержанием жира 60%) в течение 4 недель подряд, а затем получали одну внутрибрюшинную инъекцию 30 мг/кг STZ, растворённой в стерильном цитратном буфере (pH 4,4). Через три дня после инъекции STZ уровень глюкозы в крови в хвостовой вене крыс с помощью глюкометра, и крысы с концентрацией глюкозы свыше 16,7 ммоль/л были признаны успешно установленными СД2. В контрольной группе крысы получали нормальный рацион и внутрибрюшинные инъекции с 0,9% нормального физиологического раствора в тот же период, что и группа с ЦД2.

Крысы с T2DM были дополнительно разделены на четыре группы по 10 крыс в каждой группе: группа T2DM + RPG (один RPG), группа T2DM + RPG + EUG (50 мг/кг) (co-RPG+EUG 50 мг/кг), группа T2DM + RPG + EUG (100 мг/кг) (co-RPG+EUG 100 мг/кг) и группа T2DM + RPG + EUG (150 мг/кг) (co-RPG+EUG 150 мг/кг). После голодания в течение 12 часов крысам из группы с одним RPG перорально вводили 0,4 мг/кг RPG (взвешенное в физиологическом растворе) через иглу²⁶. Крысы в группах co-RPG+EUG перорально получали 50, 100 и 150 мг/кг EUG соответственно один раз в день в течение семи последовательных дней, а на восьмой день, после дополнительного 12-часового периода натощак, группе совместного введения дополнительно давали 0,4 мг/кг RPG через внутрижелудочный гаваж. Впоследствии параметры глюкозы в крови оценивались с помощью образцов крови, взятых из хвостовой вены.

Для фармакокинетического анализа образец крови (0,2 мл) был собран из задней орбитальной венозной сплетения крыс в гепаринизированные микроцентрифугальные трубки в разные временные моменты (0,25 ч, 0,5 ч, 1 ч, 2 час, 4 час, 6 часов и 8 часов после дозировки). После сбора образцы центрифугировали (1500 × г, 10 мин, 4 °C) для разделения плазмы (бледно-жёлтой, прозрачной), которая хранилась при -80 °C до анализа. Образцы плазмы были впоследствии проанализированы на концентрацию RPG с использованием метода ВЭЖХ, описанного на шаге 4.

3. Исследование метаболизма в объединённых микросомах печени крыс

Для изучения механизма, лежащего в основе in vivo фармакокинетических изменений, в RLM был оценён эффект EUG на метаболическую стабильность RPG и активность CYP3A. RPG (3 мкМ) инкубировался с EUG или без неё в буфере PBS при 37 °C при общим объёме 200 мкл, включая RLM (0,5 мг/мл микросомный белок) и систему регенерации NADPH (1,3 мМ NADP, 3,54 мМ глюкозы 6-фосфат, 0,4 U/mL глюкоза 6-фосфатдегидрогеназу и 3,3 мМ MgCl₂). После 5-минутной прединкубации при 37 °C без NADPH реакция была инициирована добавлением системы регенерации NADPH. Затем смесь инкубировала при 37 °C в встряхивающей водяной бане. В разных моментах инкубации (0 мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин) были собраны образцы по 30 мкл и перемещены в микроцентрифугную трубку с ледяным ацетонитрилом для завершения реакции. Образцы были центрифугированы (12000 × г в течение 10 минут при 4 °C) для получения супернатанта (прозрачного). Полученные супернатанты затем анализировались на концентрацию RPG с использованием того же метода ВЭЖХ, описанного на шаге 4.

4. Анализ ВЭЖХ

Концентрация РПГ в плазме (с шага 2) и микросомальные инкубации (с шага 3) анализировалась с использованием метода ВЭЖХ, описанного Кимом и ^др.26. Конкретные этапы работы следующие: образцы (120 мкл) смешивались с 300 мкл ацетонитрила, содержащего кетоконазол (внутренний стандарт, 100 нг/мл) для получения белкового осадка. Затем смесь была вихрь и центрифугирована при 15000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Супернатант был перемещён в микроколонную центрифугную трубку и испарился при 25 °C под азотной атмосферой. После высыхания остатки повторно растворялись в 50 мкл подвижной фазы, затем вихрь и центрифугированы. Впоследствии 40 мкл супернатанта было введено в колонку ВЭЖХ (250 мм × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм). Колонна была элюирована при 25 °C в изократическом режиме элюции с буфером фосфатов 10 мМ (pH 6,0) и ацетонитрилом (объёмное отношение 46,4: 53,6), с расходом 1 мл/мин. Элюент отслеживался с помощью флуоресцентного детектора с длиной волны возбуждения 240 нм.

5. Статистический анализ

Для расчёта фармакокинетических параметров, включая AUC, C_max, T_max, t_1/2, MRT и клиренс использовалось программное обеспечение для фармакокинетического анализа. Для создания изображений и анализа данных использовалось программное обеспечение для статистического анализа и графиков. Все данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение. Различия между группами анализировались с помощью одностороннего ANOVA (для сравнения уровня глюкозы) или двустороннего ANOVA (для сравнения фармакокинетических параметров), в зависимости от необходимости, а затем последовал пост-хок тест Tukey для множественных сравнений. Влияние EUG на активность CYP3A оценивалось с помощью нелинейного регрессионного анализа. p-значение < 0,05 считалось статистически значимым.

Период полураспада EUG на метаболической стабильности RPG в RLM рассчитывался следующим образом:
t_1/2 (мин) = 0,693/лн (C_t/C₀ × 100).

Внутренняя скорость клиренса (мкЛ/мин/мг белка) = v × 0,693/_{т 1/2};
v (мкЛ/мг) = инкубационный объём/концентрация белка.

Результаты

EUG способствовал гипогликемическому эффекту РПГ у крыс с ЦД2
Уровень глюкозы в крови крыс в группе с ЦД2 был повышен (p < 0,001, 95% ДИ: -13,90~-11,32) по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует об успешном проведении модели СД 2 (рисунок 1A). Введение одного RPG подавляло уровень глюкозы в крови у крыс с ЦД2 (p < 0,001, 95% CI: 5,26~7,84). Совместное введение РПГ и ЭУГ дополнительно снижало уровень глюкозы...

Обсуждение

ТД2 — это хроническое метаболическое заболевание, требующее длительного лечения, и пациентам часто приходится принимать несколько лекарств из-за сопутствующих заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания и заболевания^{почек 32}. Риск DDI значительно увеличивается при совместном приёме препарата, так как это может влиять на всасывание, обмен веществ или эффективность гипогликемических препаратов, что может привести к острым рискам, таким как гипогликемическ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ацетонитрил	Merck, Germany	34851	≥99,9%
хроматографическая колонка	Phenomenex, USA	00G-4041-E0	250 мм × 4,6 мм, размер частиц 5 &му;м
DAS	Beijing Bozhiyin, China	-	3,0
ЕУГ	MUST Bio-technology, China	A0074	чистота ≥99%
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	-	9.0.0
Высокоэффективная жидкостная хроматография	Shimadzu Corporation, Japan	228-45147-42	RF-20A
Кетоконазол	Merck, Germany	K1003	Чистота 99,0-101,0%
Мужские крыс Sprague-Dawley	Shanghai Animal Center, China	-	200–250 г
НАДФН	Merck, Germany	10107824001	97% (сухой вес)
Глюкометр OneTouch Ultra2	Life Scan Inc., USA	https://shop.onetouch.com/onetouch-sup-reg-sup-ultra-sup-reg-sup-2-meter/product/OTSUS05_0019	-
PBS	Merck, Germany	P4474	рН 7,4
RLM	Merck, Germany	M9066	-
RPG	Merck, Germany	R9028	чистота ≥98%
STZ	Merck, Germany	S0130	≥98% (HPLC)
ЕУГ, эвгенол; RPG, репаглинид; RLM, микросомы крысиной печени; NADPH, β-Никотинамид аденин динуkleotidfosfat; STZ, стрептозотоцин; PBS, фосфатно-буферный раствор.