Методическая статья

Акупотомия при шейном спондилезе у крыс: визуализированный протокол создания модели и проведения терапевтического вмешательства

53 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72132

⸱

3 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Dermatology, Beijing Tsinghua Changgung Hospital, School of Clinical Medicine, Tsinghua Medicine, Tsinghua University, 3Acupuncture and Moxibustion Clinic, Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании подробно описан метод моделирования шейного спондилеза у крыс и стратегия терапевтического вмешательства с помощью акупотомии, что представляет собой визуализированный операционный протокол для соответствующих исследований.

Аннотация

Цервикальный спондилез (ЦС) представляет собой хроническое дегенеративное заболевание. Дегенеративные изменения в межпозвоночных дисках шейного отдела позвоночника, а также последующие патологические трансформации затрагивают окружающие ткани и структуры, что приводит к таким клиническим проявлениям, как боль в шее, скованность, ограничение подвижности и, в некоторых случаях, онемение и иррадирующие симптомы в верхних конечностях. Среди них наиболее распространенной является компрессия нервного корешка. В связи с этим в данной работе была создана модель ЦС у крыс, индуцированная компрессией корешков шейных нервов. Терапия акупотомией продемонстрировала потенциал при клиническом лечении ЦС за счет устранения местных сращений мягких тканей и облегчения компрессии нерва. Однако на данный момент отсутствуют визуализированные протоколы данной процедуры для экспериментов на животных. В настоящем исследовании представлено детальное описание надежного метода создания модели ЦС у крыс и соответствующего протокола вмешательства методом акупотомии. В данной процедуре мы подробно описываем процесс индукции модели, этапы манипуляций при акупотомии, локализацию терапевтического воздействия, методы фиксации крыс и критические меры предосторожности. Кроме того, в исследовании использовалась электромиография (ЭМГ) для подтверждения успешного создания модели ЦС, а эффективность вмешательства оценивалась по порогам механического отдергивания, анализу походки и гистопатологии нервных корешков. Данная работа не только служит ориентиром для создания модели ЦС у крыс и проведения акупотомии, но и предлагает систематическую и осуществимую экспериментальную базу для будущих исследований механизмов действия.

Введение

Цервикальный спондилез (ЦС) представляет собой распространенное дегенеративное заболевание позвоночника. Его основной патологический процесс начинается с дегенерации межпозвоночных дисков, что в дальнейшем запускает ряд вторичных патологических изменений, включая стеноз межпозвоночного пространства, формирование остеофитов и гипертрофию связок1,2. Эти патологические изменения приводят к возникновению различных клинических симптомов, таких как ломота и боль в шее и плечах, а также иррадиирующее онемение верхних конечностей. В тяжелых случаях могут возникнуть неврологические нарушения, включая двигательную дисфункцию и даже тетраплегию2,3. Примечательно, что в последние годы заболеваемость цервикальным спондилезом постепенно растет, при этом возраст начала заболевания становится все более молодым, что накладывает значительное социально-экономическое бремя4. Дегенерация шейных межпозвоночных дисков и остеофитная пролиферация могут затрагивать прилегающие костные структуры и мягкие ткани, что приводит к стенозу шейного спинального канала или межпозвоночных отверстий и последующему сдавлению близлежащих структур, включая корешки шейных нервов, спинной мозг и позвоночные артерии1,2,3,4. Среди них наиболее частым является сдавление корешков шейных нервов, которое наблюдается примерно в 60%–70% всех случаев ЦС5,6,7. Хотя в клинической практике доступно множество терапевтических подходов, включая физиотерапию, фармакологическое вмешательство и хирургическое лечение, нехирургические методы стали предпочтительным вариантом для большинства пациентов из-за высокой стоимости, значительной травматичности и неопределенности послеоперационных результатов хирургических процедур4. В современной медицинской практике обычно применяются нестероидные противовоспалительные препараты и нейротропные средства. Хотя эти лекарства могут облегчить боль и в определенной степени замедлить прогрессирование заболевания, они сопровождаются такими побочными реакциями, как повреждение пищеварительной системы и поражение почек8,9.

Акупотомия представляет собой характерный терапевтический метод, разработанный на основе теорий традиционного китайского иглоукалывания в сочетании с современными малоинвазивными хирургическими техниками. Ее воздействие основано на рассечении и высвобождении спаек мягких тканей, регуляции местных воспалительных факторов и улучшении региональной микроциркуляции10,11,12. В последние годы была широко признана клиническая эффективность акупотомии при лечении цервикального спондилеза, продемонстрировавшая многообещающий потенциал в снижении компрессии нервов, облегчении боли и улучшении двигательной функции шейного отдела13,14. Тем не менее, при применении в экспериментах на животных вмешательства методом акупотомии сталкиваются с такими проблемами, как неточная локализация и трудности в контроле глубины манипуляций. В то же время для преобразования этих клинических наблюдений в надежные доказательные выводы необходимым условием является создание стабильных и воспроизводимых моделей на животных. Метод введения внутрипозвоночного нейлонового шва вызывает прямое механическое сдавление путем введения нейлоновых нитей в межпозвоночное отверстие, тем самым точно имитируя патофизиологический процесс клинической компрессии корешка нерва15. Данный подход к моделированию также обладает такими преимуществами, как короткий цикл создания модели и контролируемые сегменты компрессии15. Однако хирургическая процедура в значительной степени опирается на личный опыт специалиста, и в настоящее время отсутствуют детальные визуализированные описания этапов операции.

В данном исследовании представлен полный, детальный и визуализированный экспериментальный протокол, охватывающий создание крысиной модели шейного спондилоза и всю процедуру проведения акупотомии. Поскольку анестетики могут влиять на измерение порога механического отдергивания и, следовательно, искажать результаты эксперимента16,17,18,19, в этой работе было использовано специальное устройство для фиксации крыс. В статье приводится подробное описание процесса индукции модели, пошагового выполнения акупотомии, точной локализации мест воздействия, методов фиксации и закрепления крыс, а также другие важные экспериментальные предосторожности. Были применены несколько параметров оценки, включая измерение порога механического отдергивания, электрофизиологическую регистрацию, анализ походки и гистопатологическое исследование нервных корешков. Целью данной работы является предоставление визуализированного протокола индукции модели и проведения акупотомии на крысиной модели шейного спондилоза, что обеспечит методологическую поддержку для изучения механизмов заболевания и оценки эффективности терапии акупотомией при лечении шейного спондилоза.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были рассмотрены, одобрены и строго контролировались Комитетом по этике работы с лабораторными животными компании Beijing MDKN Biotech (номер одобрения: MDKN-2025-096). Все протоколы выполнялись в строгом соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, изданным Национальными институтами здравоохранения (NIH). Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Экспериментальные животные и группы

  1. Выберите взрослых самцов крыс линии Sprague–Dawley (SD) весом 230,0 г ± 20 г для включения в эксперимент.
  2. Содержать животных в специализированном виварии.
  3. Поддерживайте температуру окружающей среды на уровне 24 °C ± 2 °C и относительной влажностью 50%–60% при 12-часовом цикле свет/темнота. Обеспечьте ad libitum свободный доступ к стандартному корму и воде на протяжении всего исследования.
  4. После 7-дневного периода акклиматизации случайным образом распределите 24 крысы по четырем группам (n = 6 в каждой группе): группе нормального контроля (Control), группе ложнооперированных животных (Sham), группе с моделью CS (Model) и группе акупотомии. График плана эксперимента показан на Рисунок 1.

2. Создание модели CS

ПРИМЕЧАНИЕ: За 12 ч до моделирования прекратите подачу корма и воды всем крысам. Взвесьте животных и запишите массу тела. Стерилизуйте все хирургические инструменты в автоклаве под высоким давлением (Рисунок 2A).

  1. За 1 день до операции подготовьте нейлоновую нить, разрезав ее на сегменты диаметром 0,5 mm и длиной примерно 1 cm. Погрузите нити в 75% этанол на 4 h, высушите их в стерильных условиях, а затем выдержите в 0,1% растворе поли-L-лизина в течение 8 h для повышения адгезии к тканям.
  2. Поместите крысу в индукционную камеру. Проведите индукцию анестезии 4% изофлураном, затем поддерживайте анестезию на уровне 1,5%–2,0% изофлурана через лицевую маску. Закрепите животное в положении на животе (согласно утвержденным протоколам учреждения).
  3. Выбрейте шерсть в дорсальной области шеи, чтобы полностью обнажить операционное поле. Трижды продезинфицируйте операционную область повидон-йодом движениями изнутри наружу, после чего повторите процедуру дезинфекции 75% этанолом.
  4. Пальпируйте и отметьте самый высокий остистый отросток (T2) на спине крысы. Сделайте срединный дорсальный разрез кожи длиной примерно 3 cm, extending краниально от вершины остистого отростка T2. Тупо расслоите подкожную клетчатку и мышцы задней части шеи (Рисунок 2B).
  5. Полностью обнажите левую дугу позвонка от C5 до T1 и тщательно выскребите вышележащие мышечные и соединительные ткани (Рисунок 2C).
  6. Осторожно расслоите желтую связку и соединительные ткани в межпозвоночных промежутках C6–C7 и C7–T1 с помощью микропинцета. Вскройте левую дугу позвонка C7 москитными зажимами, чтобы обнажить спинной мозг.
  7. Осторожно отодвиньте спинной мозг в правую сторону, используя офтальмологический диссектор нервов. С помощью микрохирургического пинцета поместите стерильную нейлоновую нить под нервные корешки C6–C7 и C7–T1 вдоль продольной оси спинного мозга; избегайте избыточного сдавления, чтобы предотвратить повреждение венозных сплетений позвоночника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В группе имитации (sham) обнажите спинной мозг в том же анатомическом месте, но без введения нейлоновой нити.
  8. По завершении процедуры закройте и ушейте разрез послойно.
  9. Переместите крыс на термостатическую грелку с поддержанием температуры 37 °C и контролируйте показатели жизненно важных функций до полного восстановления сознания.
  10. Для послеоперационной антиинфекционной профилактики введите внутримышечно 50 000 единиц раствора натрия пенициллина в заднюю конечность. Верните животных в домашние клетки для послеоперационного восстановления.

3. Процедура фиксации

  1. Зафиксируйте крысу в черном сетчатом рукаве-фиксаторе.
  2. Закрепите две нейлоновые кабельные стяжки на пластиковой раме. Верхнюю стяжку зафиксируйте в области подмышечных впадин, а нижнюю — вокруг тазовой области (Рисунок 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластиковую пластину размером 200 mm × 300 mm × 5 mm с перфорацией в виде прорезей 20 mm × 4 mm, расположенных с интервалом 10 mm вдоль длинных краев и 3 mm вдоль коротких краев, оснащенную пятью опорными ножками, расположенными в центре и по четырем углам (Рисунок 3A).
  3. После индукции модели повторите вышеописанную процедуру фиксации для каждой крысы во всех группах в течение трех дней подряд для обеспечения достаточной габитуации. Продолжительность каждого сеанса фиксации должна составлять не менее 5 min в день.

4. Процедура акупотомии

  1. Начните проведение акупотомии в точке 4th день после создания модели.
  2. Подготовьте одноразовые стерильные иглы для акупотомии (диаметр: 0,40 мм; длина: 40 мм).
  3. Удалите шерсть в области шеи, чтобы полностью открыть операционное поле.
  4. Проведите пальпацию мягких тканей по обе стороны остистых отростков шейного отдела позвоночника для выявления уплотненных узелков или шнуровидных структур. Определите точку одного остистого отростка на уровне C6 или C7, затем найдите две дополнительные точки примерно на 0,5 см латеральнее этого остистого отростка с каждой стороны.
  5. Определите эти три точки как места введения при акупотомии и отметьте их (Рисунок 3C).
  6. Продезинфицируйте отмеченные места введения сначала медицинским повидон-йодом, затем 75%-м медицинским этанолом.
  7. Расположите режущую кромку иглы для акупотомии параллельно задней срединной линии; при введении удерживайте стержень иглы перпендикулярно корональной плоскости заднего отдела шеи.
  8. Оказывайте легкое давление на место введения левым большим пальцем, удерживая иглу для акупотомии неподвижно между большим и указательным пальцами правой руки. Быстро пройдите через подкожную клетку в перпендикулярном направлении, затем медленно продвигайте иглу до достижения поверхности кости.
  9. Выполните локальные продольные разрезы трижды и поперечное высвобождение мягких тканей дважды в области поражения, ограничивая операционную зону пределом 1 мм. По завершении манипуляции извлеките иглу (Рисунок 3D).
  10. Оказывайте сильное давление на место введения в течение 3 мин для достижения гемостаза. Проводите процедуру акупотомии один раз в 5 дней, всего три сеанса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением группы акупотомии, остальные три группы не подвергались терапевтическому воздействию. Тем не менее, животные в этих группах подвергались иммобилизации таким же образом и в течение того же времени, что и животные в группе акупотомии.

5. Тест на порог механического отдергивания (MWT)

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите измерения за день до операции по созданию модели, а также на 3и и 14й дни после операции, используя прибор для стимуляции подошвенной механической боли у крыс и мышей.

  1. Поместите каждую крысу в прозрачную тестовую камеру, установленную на металлическую сетчатую поверхность в тихом помещении при температуре 24 °C ± 2 °C.
  2. Дайте крысе акклиматизироваться в камере в течение как минимум 5 min или до тех пор, пока исследовательское поведение и груминг в значительной степени не прекратятся.
  3. Расположите кончик нити фон Фрея перпендикулярно подошвенной поверхности левой передней лапы, между третьей и четвертой пястными костями. Прикладывайте стимул снизу через металлическую сетку до тех пор, пока не возникнет быстрая реакция отдергивания лапы, вылизывания или встряхивания.
  4. Зафиксируйте отображаемое значение в момент отдергивания лапы в качестве порога механической боли.
  5. После тестирования каждой крысы тщательно протрите металлическую сетку и внутренние стенки камеры 75% медицинским спиртом, затем высушите чистой марлей, чтобы удалить остаточные запахи, которые могут повлиять на последующие поведенческие тесты. Помещайте следующую крысу только после полного высыхания аппарата.
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: Тестируйте всех крыс последовательно в ротирующем порядке в течение трех раундов. Соблюдайте интервал не менее 10 min между двумя последовательными измерениями MWT у одной и той же крысы. В качестве окончательного значения MWT для каждой крысы используйте среднее значение трех измерений.

6. Регистрация электромиографии (ЭМГ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите ЭМГ в состоянии покоя на 3-й день после создания модели, используя систему сбора и анализа биосигналов.

  1. Проведите анестезию крысы путем ингаляции изофлурана (индукционная концентрация 3%–4%, поддерживающая концентрация 1,5%–2,0%). Зафиксируйте животное в положении лежа на животе на экспериментальной платформе и полностью обнажите левую переднюю конечность.
  2. Подключите провода записывающих электродов к соответствующим каналам сбора данных. Запустите программное обеспечение для сбора данных, выберите режим сигнала ЭМГ и установите частоту дискретизации 20 kHz с полосой пропускания полосового фильтра от 15 Hz до 5 kHz.
  3. Продезинфицируйте мышцы левой передней конечности (лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, двуглавая мышца плеча и трехглавая мышца плеча), используя обезжиренные ватные тампоны, смоченные в 75% медицинском этаноле.
  4. Перпендикулярно введите игольчатый записывающий электрод в брюшко мышцы так, чтобы он был ориентирован ортогонально направлению мышечных волокон. Введите второй игольчатый электрод на расстоянии 3–5 mm в качестве референтного электрода, а заземляющий электрод введите в основание хвоста.
  5. Зафиксируйте активность, вызванную введением иглы, сразу после ее установки. После исчезновения потенциалов введения и полного расслабления мышцы запишите сигнал ЭМГ в состоянии покоя в течение 1 min для каждой крысы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всей записи поддерживайте тишину и минимизируйте внешние электромагнитные помехи. Распространенные помехи включают сетевые помехи от переменного тока и высокочастотный шум от другого лабораторного оборудования, который проявляется в виде регулярных синусоид, накладывающихся на электромиограммы. Эти помехи можно уменьшить с помощью заземления, настройки фильтров и контроля окружающей среды.
  6. Осторожно извлеките все игольчатые электроды и верните крысу в домашнюю клетку, позволяя ей спонтанно выйти из наркоза.
  7. После завершения записи ЭМГ для каждой крысы очистите игольчатые электроды 75% медицинским этанолом с помощью обезжиренных ватных тампонов и тщательно просушите их стерильной марлей для предотвращения перекрестного загрязнения.

7. Анализ походки у крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите анализ походки на первый день после завершения процедуры акупотомии (15-й послеоперационный день после создания модели). Система анализа походки состоит из беговой дорожки с прозрачным полотном, высокоскоростной цифровой камеры, расположенной под полотном, и компьютерной рабочей станции.

  1. Поместите крысу на беговую дорожку и дайте ей свободно адаптироваться в течение 3 min.
  2. Запустите ленту беговой дорожки и постепенно увеличивайте скорость от 5.0 cm/s до тех пор, пока у крысы не установится стабильная походка без исследовательского поведения.​
  3. С помощью высокоскоростной камеры запишите 10 s видео процесса ходьбы крысы с вентрального ракурса (вид снизу).
  4. После завершения тестирования каждой крысы тщательно протрите ленту беговой дорожки и испытательную камеру 75% этанолом, чтобы удалить остаточные запахи, которые могут повлиять на последующие поведенческие оценки. Дайте ленте полностью высохнуть перед помещением следующей крысы.
  5. Импортируйте записанные видео в программное обеспечение для анализа. Используйте программу для определения мест постановки каждой конечности и извлечения ряда параметров походки.
  6. По завершении автоматизированного анализа экспортируйте данные параметров походки для последующего статистического анализа.
  7. В данном исследовании учитывайте следующие параметры походки: среднюю площадь отпечатка левой передней лапы (средний размер отпечатка стопы за весь период опоры), максимальную площадь опоры левой передней лапы (максимальный размер отпечатка стопы за весь период опоры) и давление при опоре левой передней лапы (отражающее относительную интенсивность давления лапы во время фазы опоры, зафиксированное системой анализа походки).
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: Получите три валидных последовательности походки для каждой крысы и используйте среднее значение трех измерений для анализа.

8. Окрашивание тканей корешков нервов гематоксилином и эозином

ПРИМЕЧАНИЕ: После проведения поведенческих тестов на 15-й день после моделирующей операции соберите образцы ткани корешков спинного мозга для окрашивания гематоксилином и эозином (HE).

  1. Анестезируйте крыс путем внутрибрюшинного введения 2% раствора пентобарбитала натрия (0,3 mL/100 g) и проведите транскардиальную перфузию параформальдегидом.
  2. Выделите корешки спинномозговых нервов сегментов C6–T1 и поместите ткань в 4% раствор параформальдегида при 4 °C для дофиксации на 48 h.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Работайте с параформальдегидом как с раздражающим веществом в хорошо проветриваемом помещении или в вытяжном шкафу.
  3. Промойте фиксированную ткань корешков нервов под проточной водопроводной водой в течение 1 h для удаления остатков фиксатора.
  4. Проведите ступенчатую дегидратацию ткани в этаноле, последовательно промойте в ксилоле (I) и ксилоле (II), залейте в парафин и сделайте срезы толщиной 3–5 µm. Подсушите срезы при 65 °C.
  5. Удалите парафин из срезов последовательным погружением в ксилол (I) и ксилол (II) по 8 min в каждом. Регидратируйте срезы через серию разведений этанола (100% в течение 15 min, 95% в течение 5 min, 80% в течение 5 min, 70% в течение 3 min), затем погрузите в дистиллированную воду на 2 min.
  6. Окрасьте срезы раствором гематоксилина в течение 5 s, затем промойте под проточной водой в течение 2 min для удаления излишков красителя.
  7. Проведите дифференцировку срезов в дистиллированной воде в течение 30 s. Погрузите срезы в 70% этанол на 10 s, затем в 80% этанол на 10 s.
  8. Окрасьте срезы раствором эозина в течение 4 min, затем промойте под проточной водой для удаления поверхностного красителя. Дегидратируйте срезы в ступенчатых концентрациях этанола (70% в течение 10 s, 80% в течение 10 s, 95% в течение 10 s, 100% в течение 160 s) и промойте в ксилоле в течение 4 min.
  9. Заклейте стекла нейтральной смолой.
  10. Изучите патологические и морфологические изменения ткани корешков спинномозговых нервов под световым микроскопом при увеличении 400× и сделайте микрофотографии репрезентативных полей обзора.

9. Статистический анализ

  1. Выполните статистический анализ с помощью программного обеспечения SPSS. Непрерывные переменные с нормальным распределением представьте в виде среднего значения ± стандартное отклонение.
  2. При соблюдении условий нормальности распределения и гомогенности дисперсии проанализируйте пороги механического отдергивания с помощью дисперсионного анализа с повторными измерениями, а параметры походки — с помощью однофакторного ANOVA. Проведите апостериорные попарные сравнения между группами с использованием теста наименьшей значимой разности (LSD).
  3. При несоблюдении условий нормального распределения или гомогенности дисперсии применяйте непараметрические критерии.
  4. Различия считайте статистически значимыми при p < 0.05.

Результаты

Оценка порога механического отдергивания (MWT) показала сопоставимые исходные значения во всех группах до индукции модели. На 3-й день после моделирования и ложнооперации значимых различий между группой ложнооперации и контрольной группой не наблюдалось (p > 0.05). Напротив, в группах модели и акупотомии наблюдалось заметное снижение MWT по сравнению с группой ложнооперации (p < 0.01, Рисунок 4). После завершения лечения в группе акупотомии было отмечено значимое повышение MWT по сравнению с группой модели (p < 0.05, Рисунок 4).

Записи электромиографии (ЭМГ) показали, что на 3и день после моделирования и имитации операции при игольчатой ЭМГ в состоянии покоя как в модельной группе, так и в группе акупотомии обнаруживалась патологическая спонтанная активность, такая как потенциалы фибрилляции и положительные острые волны. Напротив, на трейсах игольчатой ЭМГ в состоянии покоя в контрольной группе или группе имитации операции патологических спонтанных разрядов не наблюдалось (Рисунок 5). Отсутствие патологических спонтанных потенциалов на пораженной стороне может указывать на то, что в данной модели целевой нервный корешок не был поврежден должным образом, и необходимо повторно проверить ход хирургической процедуры.

Анализ походки показал, что после завершения лечения средняя площадь отпечатка, максимальная площадь опоры и давление при опоре в группе плацебо существенно не отличались от показателей в контрольной группе (p > 0.05). Напротив, все параметры походки были заметно снижены в модельной группе по сравнению с группой плацебо (p < 0.001). По сравнению с модельной группой, в группе акупотомии наблюдалось значительное повышение каждого из этих показателей походки (p < 0.05, Рисунок 6). Средняя площадь отпечатка представляет собой средний размер отпечатка стопы за весь период опоры. Максимальная площадь опоры — это максимальный размер отпечатка стопы за весь период опоры. Давление при опоре отражает относительную интенсивность давления лапы во время фазы опоры, зафиксированную системой анализа походки.

Окрашивание HE тканей корешка шейного нерва показало, что в контрольной группе и группе ложного воздействия морфология ткани корешка нерва выглядела практически нормальной. Нервные волокна и тела нейронов были расположены относительно упорядоченно и компактно, с четко выраженными структурными границами и без явного интерстициального отека. В отличие от группы ложного воздействия, в модельной группе наблюдались выраженные патологические изменения, указывающие на повреждение корешка нерва, которые характеризовались дезорганизованным, рыхлым расположением нервных волокон и тел клеток, разрывом и деформацией части нейронов, частичной фрагментацией волокон и заметным интерстициальным отеком. По сравнению с модельной группой, лечение методом акупотомии значительно уменьшило эти патологические поражения, о чем свидетельствовало более правильное расположение нервных волокон и тел клеток, уменьшение интерстициального отека и частичное восстановление структурной целостности нервной ткани (Рисунок 7).

Схема временной последовательности процесса лечения методом акупотомии с проведением тестов MWT, регистрацией ЭМГ и анализом походки.
Рисунок 1Схема временной оси дизайна эксперимента. После 7-дневного периода адаптивного кормления у крыс как в модельной группе, так и в группе акупотомии были созданы модели CS. Животным группы ложнооперирования (sham-группы) проводили воздействие на ту же область спинного мозга, что и в модельной группе, но без введения рыболовной лески. Вмешательство методом акупотомии начали на 4-йth на следующий день после успешного моделирования в группе акупотомии. Пороги механической болевой чувствительности крыс измеряли за день до моделирования, на 3-и сутки после операции и в конце вмешательства на 14-и сутки после операции. Оценка с помощью электромиографии проводилась на 3-и сутки после операции для оценки компрессии корешка нерва. Анализ походки проводили на 15-и сутки после операции по завершении вмешательства для оценки функции моторной координации крыс. Образцы для анализа собирали после проведения поведенческих тестов на 15-и сутки после операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Набор хирургических инструментов, процесс диссекции грызуна, схема обнажения позвонков для изучения анатомии.
Рисунок 2: Создание модели центрального сенсибилизационного (CS) состояния у крыс. (A) Хирургические инструменты, используемые для индукции модели. (B) Дорсальный разрез шейного отдела и диссекция тканей. (C) Пластинки левых шейных позвонков C5–T1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Подготовка к исследованию на животных, включая схему иммобилизации крысы для проведения медицинской процедуры.
Рисунок 3: Процедура проведения акупотомии. (A) Пластиковая доска, используемая для фиксации крысы. (B) Схематическая иллюстрация фиксации крысы. (C) Анатомические поверхностные ориентиры, соответствующие остистым отросткам C6 и C7 у крыс. (D) Схематическое изображение процедуры акупотомии у крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатая диаграмма, показывающая порог механического отдергивания в группах: контрольной, ложнооперированной, модельной и группе с акупотомией.
Рисунок 4: Сравнение порога механического отдергивания в четырех экспериментальных группах крыс (n = 6 в каждой группе). **p < 0.01 по сравнению с группой ложнооперированных животных; #p < 0.05 по сравнению с модельной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сравнение амплитуды формы волны; A, B демонстрируют высокий уровень шума; C, D демонстрируют низкий уровень шума; график анализа аудиосигнала.
Рисунок 5: Электромиограммы передней конечности в состоянии покоя в четырех экспериментальных группах после индукции модели. (A) Электромиограмма передней конечности в группе модели. (B) Электромиограмма передней конечности в группе акупотомии. (C) Электромиограмма передней конечности в контрольной группе. (D) Электромиограмма передней конечности в группе имитации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатая диаграмма, сравнивающая среднюю площадь отпечатка, максимальную площадь опоры и давление при опоре в четырех группах.
Рисунок 6: Сравнение параметров походки в четырех экспериментальных группах крыс (n = 6 в группе). (A) Сравнение средней площади отпечатка. (B) Сравнение максимальной площади опоры. (C) Сравнение давления при опоре. ***p < 0.001 по сравнению с группой ложной операции; #p < 0.05 по сравнению с группой модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сравнение гистологических срезов ткани, четыре препарата, микроскопическое изображение, масштаб 100 мкм для клеточного анализа.
Рисунок 7: Окрашивание гематоксилином и эозином (HE) тканей нервного корешка четырех экспериментальных групп крыс при 400-кратном увеличении. (A) Окрашивание HE контрольной группы. (B) Окрашивание HE группы ложного вмешательства (sham). (C) Окрашивание HE группы модели. (D) Окрашивание HE группы акупотомии. Масштабная линейка = 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Выбор подходящей животной модели является необходимым условием для выяснения патогенеза шейного спондилеза (CS) и тщательной оценки терапевтических вмешательств. В настоящее время широко применяется метод введения нейлоновой нити в позвоночный канал благодаря таким преимуществам, как относительная простота, короткий цикл моделирования, высокая воспроизводимость и надежность15,20. При данном подходе в спинномозговой канал крысы имплантируется компрессионный материал для создания постоянного давления на корешки шейных спинномозговых нервов, что позволяет воспроизвести патологическое состояние сдавления нервных корешков, вызванное грыжей межпозвоночного диска или остеофитной гиперплазией в клинических условиях. Среди вторичных повреждений, связанных с шейным спондилезом, компрессия нервных корешков является наиболее распространенной и представляет собой основную причину выраженных клинических проявлений, которые обычно проявляются в виде боли в шее, ригидности и иррадиирующих симптомов в верхних конечностях5,7,21. Соответственно, в данном исследовании был использован метод введения нейлоновой нити в позвоночный канал для создания модели CS у крыс, а также представлен визуализированный операционный протокол создания модели и проведения акупотомии у крыс с CS.

После сдавления нервного корешка локальная ишемия, воспалительные реакции и механическое раздражение могут вызвать как периферическую, так и центральную сенсибилизацию, что в конечном итоге приводит к гипералгезии22,23,24,25,26. Полученные данные продемонстрировали выраженное снижение порога механической боли в ипсилатеральной передней лапе крыс после индукции модели, что указывает на успешное развитие механической гипералгезии в результате данной процедуры. У крыс, подвергшихся воздействию методом акупотомии, порог отдергивания лапы при механическом воздействии был значительно восстановлен, что говорит об эффективности метода акупотомии в ослаблении состояния сенсибилизации к боли. Боль влияет не только на сенсорные пороги, но и изменяет паттерны спонтанного движения животных. Системы анализа походки, фиксируя пространственно-временные параметры отпечатков лап при движении, обеспечивают объективную количественную оценку компенсаторных изменений походки, вызванных болью, что позволяет преодолеть выраженную субъективность, присущую традиционным методам поведенческой оценки27. В данном исследовании у крыс модельной группы наблюдалось снижение средней площади отпечатка, максимальной площади опоры и давления при опоре ипсилатеральной передней лапы, что отражает поведение по избеганию нагрузки и защитные изменения походки, вторичные по отношению к боли. Напротив, у крыс, подвергшихся акупотомии, наблюдалась тенденция к нормализации этих параметров походки, что свидетельствует о том, что лечение методом акупотомии, облегчая боль, также улучшает локомоторную координацию. Гистоморфологические исследования дополнительно выявили межгрупповые различия в расположении и морфологии нервных волокон и тел нейронов в нервном корешке, а также в степени интерстициального отека. Эти результаты позволяют предположить, что терапия акупотомией может смягчать патологические изменения нервного корешка.

Компрессия нервного корешка не только вызывает нарушения сенсорной проводимости, но также может привести к денервации или аберрантной гипервозбудимости иннервируемой мускулатуры. Электромиография (ЭМГ) в покое, путем регистрации спонтанной электрической активности (такой как потенциалы фибрилляции и положительные острые волны) в полностью расслабленной мышце, служит чувствительным индикатором аномального возбуждения сарколеммы, вторичного по отношению к нейрогенному повреждению, и представляет собой ключевой электрофизиологический метод оценки радикулопатий как в клинических, так и в экспериментальных условиях28,29,30. В физиологических условиях полностью расслабленная мышца характеризуется электрическим молчанием при отсутствии спонтанных разрядов. В данном исследовании после индукции модели в покоящихся мышцах ипсилатеральной передней конечности крыс были обнаружены выраженные спонтанные разряды. Такая аномальная активность ЭМГ в покое является характерным проявлением нейрогенного повреждения и указывает на то, что шейные нервные корешки у этих крыс могут подвергаться длительной компрессии31. Аномальные данные ЭМГ в модельной группе и группе акупотомии после моделирования дополнительно подтвердили успешное создание модели CS у крыс с электрофизиологической точки зрения.

Чтобы избежать смешивания результатов поведенческих оценок с кумулятивными эффектами повторного применения анестезии, в данном исследовании процедура акупотомии проводилась на бодрствующих животных с использованием фиксирующего устройства32. В предыдущих отчетах было показано, что надлежащее приучение и повторное воздействие могут значительно ослабить стрессовые реакции, вызванные фиксацией33,34,35,36. Это говорит о том, что предварительное приучение перед вмешательством в данном протоколе может эффективно минимизировать влияние острого стресса от фиксации на экспериментальные показатели.

Данное исследование не лишено ограничений. Во-первых, метод введения нейлоновой нити в позвоночник в основном воспроизводит острую или подострую механическую компрессию, тогда как у людей сирингомиелия обычно протекает как хронический дегенеративный процесс. Во-вторых, хотя текущий протокол фиксации был разработан для минимизации стресса, в будущих исследованиях следует оценить биомаркеры стресса, такие как уровень кортизола в сыворотке крови, чтобы более полно оценить воздействие фиксирующего устройства.

В заключение, в данном исследовании представлена детальная рабочая процедура создания крысиной модели цервикального спондилеза (CS) и последующего лечения с помощью акупотомии. Результаты показывают, что акупотомия значительно повышает пороги механической болевой чувствительности, улучшает паттерны походки, связанные с избеганием боли, и ослабляет патологические изменения нервного корешка. Таким образом, эта работа предоставляет систематическую и практическую экспериментальную базу для выяснения механизмов, лежащих в основе терапии акупотомией при лечении CS.

Раскрытие информации

Все авторы заявили об отсутствии потенциального конфликта интересов.

Благодарности

Данное исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (грант № 2023YFC3502703) и ключевым проектом совместного фонда инноваций и развития Фонда естественных наук провинции Хубэй (грант № 2024AFD271).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
шприц объемом 0,5 млHebei Yunsheng Biotechnology Co., LtdSN-04442
шприц объемом 1 млShanghai Zhiyu Medical Equipment Co., LTDZSQ-1
Однониточный шовный материал 4-0 с иглой, одноплечий (4×12)СТЕКЛОJZZSX193
75% спиртShandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTD75–500 мл
Игла для акупотомииBeijing Huaxia Blue Chip Biotechnology Co., Ltd.HY0440
Адгезивный предметный стеклышкоCITOTEST188105
Система регистрации и анализа биологических сигналовTechmanBL-420N
Система сбора и анализа биологических сигналов (программное обеспечение)TechmanBL-420N Версия 3.0.0.237
Предметное стеклоCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd10212432C
ДегидраторDIAPATHДонателло
Электронные весыMettler-ToledoME203E/02
Электротермический сушильный шкаф с принудительной конвекциейЛабораторияGEL-70
Прибор для заливки образцовWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Экологически безопасная прозрачная жидкость для удаления воскаServicebioG1128-1L
Антистатические пинцеты из черной нержавеющей стали (с изогнутыми кончиками)соломенESD-15
ЭтанолSCRC100092683
Безжировой ватный тампонCaoxian Hualu Sanitary Material Co. LTDTZMQ-500
Набор реагентов для постоянного окрашивания гематоксилином и эозином (HE) HD ServicebioG1076
Гемостатические зажимысоломенB0557
IBM SPSS StatisticsIBM CorporationВерсия 22.0
Система визуализацииNikonNIKON DS-U3
ЙодофорShandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTDDF-500
ИзофлуранRWD Life ScienceR510-22-10
Латексные перчаткиBeijing Ruijing Latex Products Co. LTDRJJC-S
Устройство для проведения теста с механическим воздействием на лапу (тест на прикосновение)Основание КьюКВ-КТ-1
Медицинские щипцыАЙЗАНЧЭНЬAZN00008
Гемостатический зажим MosquitoServicebioQX1310D
Нейтральная камедьSCRC10004160
ФизрастворSHIMENSLYS-500мл
Офтальмологические ножницысоломенB0754
Жидкий парафинМакклин8012-95-1
Фиксатор на основе параформальдегида (нейтральный)ServicebioG1101
Патологоанатомический микротомShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
Пенициллин G натрия для инъекцийJilin Huamu Animal Health Product Co., Ltd.Номер регистрации ветеринарного препарата 070011248
Раствор поли-L-лизинаShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R23126-50мл
Машинка для стрижки грызуновсоломенB1564
Система визуализации и анализа походки грызуновУмныйTreadScan; BCamCapture
Система визуализации и анализа походки грызунов (программное обеспечение)ОстроумныйTreadScan версия 4.00; BCamCapture версия 3.00
крысы линии SDBeijing Sibefei Biotechnology Co., LtdA102
Аппарат для анестезии мелких животных ЮЯН Агентно-ориентированное моделирование
Паровой стерилизатор (автоклав)YamatoSQ810C
Хирургический скальпельсоломенB1177
Хирургическая маскапобедительWJKZ-1
Хирургический иглодержательсоломен (solomen)B0772
Хирургические ножницыСТЕКЛОJZZSX-ZC544R
Расширитель тканейZhejiang Kehua Instrument Co., Ltd КД-П
Система очистки воды до сверхчистого состоянияЭлектрод Эйкена для определения водыAK-RO-C2
Универсальный фиксатор тканей (нейтральный)ServicebioG1101-15ML
Вертикальный оптический микроскопNikonNIKON ECLIPSE E100
КсилолSCRC10023418

Ссылки

  1. Theodore N. Degenerative cervical spondylosis. N Engl J Med. 2020;383(2):159-68.
  2. Yeshna, Singh M, Monika, Kumar A, Garg V, Jhawat V. Pathophysiology and emerging therapeutic strategies for cervical spondylosis: the role of pro-inflammatory mediators, kinase inhibitors, and organogel-based drug delivery systems. Int Immunopharmacol. 2025;151:114350.
  3. Nouri A, Tetreault L, Singh A, Karadimas SK, Fehlings MG. Degenerative cervical myelopathy: epidemiology, genetics, and pathogenesis. Spine (Phila Pa 1976). 2015;40(12):E675-93.
  4. Lakhapate SS, Devade OA, Redasani VK. A brief review on cervical spondylosis. J Drug Deliv Ther. 2025;15(7):144-149.
  5. Chen B, et al. Acupotomy versus acupuncture for cervical spondylotic radiculopathy: protocol of a systematic review and meta-analysis. BMJ Open. 2019;9(8):e029052.
  6. Yang F, Li WX, Liu Z, Liu L. Balance chiropractic therapy for cervical spondylotic radiculopathy: study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 2016;17(1):513.
  7. Woods BI, Hilibrand AS. Cervical radiculopathy: epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment. J Spinal Disord Tech. 2015;28(5):E251-259.
  8. Kartha S, Weisshaar CL, Philips BH, Winkelstein BA. Pre-treatment with meloxicam prevents the spinal inflammation and oxidative stress in DRG neurons that accompany painful cervical radiculopathy. Neuroscience. 2018;388:393-404.
  9. Harirforoosh S, Asghar W, Jamali F. Adverse effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs: an update of gastrointestinal, cardiovascular and renal complications. J Pharm Pharm Sci. 2013;16(5):821-847.
  10. Jiang G, Wan B, Huang W, Chen L, Duan B, Wang Y. Influence of acupotomy loosing on IL-6, IL-10 and TNF-α in synovial fluid of rheumatoid arthritis patients with elbow joint stiffness. World J Acupunct Moxibustion. 2018;28(2):91-96.
  11. Sun J, et al. Acupotomy therapy for knee osteoarthritis pain: systematic review and meta-analysis. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020:2168283.
  12. Hu J, Tong H, Zhang J, Jiang L. Acupotomy for musculoskeletal pain: exploring therapeutic potential and future directions. J Pain Res. 2025;18:3027-3036.
  13. Kwon CY, Yoon SH, Lee B. Clinical effectiveness and safety of acupotomy: an overview of systematic reviews. Complement Ther Clin Pract. 2019;36:142-152.
  14. Lijian Z, Zhen Z, Yuan Y, Nachuan Z. Ultrasound-guided acupotomy for cervical spondylosis: a systematic review and meta-analysis based on GRADE quality assessment. Front Pain Res (Lausanne). 2025;6:1654265.
  15. Shi T, et al. Acupuncture relieves cervical spondylosis radiculopathy by regulating spinal microglia activation through MAPK signaling pathway in rats. J Pain Res. 2023;16:3945-3960.
  16. Mogil JS. Animal models of pain: progress and challenges. Nat Rev Neurosci. 2009;10(4):283-294.
  17. Yamauchi M, Sekiyama H, Shimada SG, Collins JG. Halothane suppression of spinal sensory neuronal responses to noxious peripheral stimuli is mediated, in part, by both GABA(A) and glycine receptor systems. Anesthesiology. 2002;97(2):412-417.
  18. Li Q, Mathena RP, Eregha ON, Mintz CD. Effects of early exposure of isoflurane on chronic pain via the mammalian target of rapamycin signal pathway. Int J Mol Sci. 2019;20(20):5102.
  19. Boegel K, Gyulai FE, Moore KK, Gold MS. Deleterious impact of a γ-aminobutyric acid type A receptor-preferring general anesthetic when used in the presence of persistent inflammation. Anesthesiology. 2011;115(4):782-790.
  20. Liguo Z, Bin T, Xu W, He Y. Research progression and evaluation of an animal model of cervical radiculopathy. Chin J Tissue Eng Res. 2018;22(35):5700-5705.
  21. Caridi JM, Pumberger M, Hughes AP. Cervical radiculopathy: a review. HSS J. 2011;7(3):265-272.
  22. Liu DL, et al. Chronic cervical radiculopathic pain is associated with increased excitability and hyperpolarization-activated current (Ih) in large-diameter dorsal root ganglion neurons. Mol Pain. 2017;13:1744806917707127.
  23. Rothman SM, Winkelstein BA. Chemical and mechanical nerve root insults induce differential behavioral sensitivity and glial activation that are enhanced in combination. Brain Res. 2007;1181:31-43.
  24. Rothman SM, Huang Z, Lee KE, Weisshaar CL, Winkelstein BA. Cytokine mRNA expression in painful radiculopathy. J Pain. 2009;10(1):90-99.
  25. Hubbard RD, Winkelstein BA. Transient cervical nerve root compression in the rat induces bilateral forepaw allodynia and spinal glial activation: mechanical factors in painful neck injuries. Spine (Phila Pa 1976). 2005;30(17):1924-1932.
  26. Costigan M, Scholz J, Woolf CJ. Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage. Annu Rev Neurosci. 2009;32:1-32.
  27. Vrinten DH, Hamers FFT. "CatWalk" automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat: a comparison with von Frey testing. Pain. 2003;102(1-2):203-209.
  28. Gonçalves LI, Oliveira Junior PH, Baima JPS. Cervical radiculopathy for neurologists: the role of electrodiagnosis. Arq Neuropsiquiatr. 2025;83(10):s00451812893.
  29. Tong HC. Incremental ability of needle electromyography to detect radiculopathy in patients with radiating low back pain using different diagnostic criteria. Arch Phys Med Rehabil. 2012;93(6):990-992.
  30. Lee SJ, Han TR, Hyun JK, Jeon JY, Myong NH. Electromyographic findings in nucleus pulposus-induced radiculopathy in the rat. Spine (Phila Pa 1976). 2006;31(18):2053-2058.
  31. Fisher MA. Electrophysiology of radiculopathies. Clin Neurophysiol. 2002;113(3):317-35.
  32. Miller AL, Golledge HDR, Leach MC. The influence of isoflurane anaesthesia on the rat grimace scale. PLoS One. 2016;11(11):e0166652.
  33. Medeiros MA, Canteras NS, Suchecki D, Mello LEAM. c-fos expression induced by electroacupuncture at the Zusanli point in rats submitted to repeated immobilization. Braz J Med Biol Res. 2003;36(12):1673-1684.
  34. Grissom N, Kerr W, Bhatnagar S. Struggling behavior during restraint is regulated by stress experience. Behav Brain Res. 2008;191(2):219-226.
  35. Grissom N, Bhatnagar S. Habituation to repeated stress: get used to it. Neurobiol Learn Mem. 2009;92(2):215-224.
  36. Gray M, Bingham B, Viau V. A comparison of two repeated restraint stress paradigms on hypothalamic-pituitary-adrenal axis habituation, gonadal status and central neuropeptide expression in adult male rats. J Neuroendocrinol. 2010;22:92-101.

Перепечатки и разрешения

Теги

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.