Данное исследование направлено на выяснение взаимосвязи между полиморфизмом rs2910164 miR-146a и предрасположенностью к аллергическому риниту (АР). Более низкие уровни miR-146a в плазме и генотип GG rs2910164 связаны с повышенным риском развития АР, усилением воспалительных реакций и более тяжелыми клиническими проявлениями у пациентов с АР.
Исследовательская статья
Исследование ассоциации полиморфизма rs2910164 гена mir-146a с предрасположенностью к аллергическому риниту
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Аллергический ринит (АР) не представляет угрозы для жизни пациентов, однако он серьезно ухудшает качество их жизни. МикроРНК-146a (miR-146a) играет важную роль в иммунной регуляции и воспалительных реакциях; тем не менее, взаимосвязь между полиморфизмом rs2910164 miR-146a и предрасположенностью к АР остается недостаточно изученной. Данное исследование «случай-контроль» было разработано для изучения влияния полиморфизма rs2910164 miR-146a на предрасположенность к АР. В исследовании приняли участие 180 здоровых добровольцев без АР и 211 пациентов с АР. Экспрессия miR-146a в плазме измерялась методом RT-qPCR; генотип rs2910164 определяли с помощью метода TaqMan-qPCR. Для определения уровней IgE, IL-4, IL-6 и IL-10 в сыворотке использовали метод ELISA. С помощью корреляционного анализа Пирсона оценивались линейные зависимости между экспрессией miR-146a и показателями TNSS, RQLQ, а также концентрацией факторов в сыворотке. Факторы риска АР определяли с помощью логистической регрессии. Генотип GG и аллель G miR-146a rs2910164 встречались значительно чаще у пациентов с АР, чем у здорового контроля. Уровень miR-146a в плазме был снижен у пациентов с АР. Более низкий уровень miR-146a в плазме наблюдался у пациентов с АР с генотипом GG, которые проявляли более активные аллергические и воспалительные реакции. Экспрессия miR-146a была тесно связана с аллергическими симптомами и тяжестью клинических проявлений. Логистическая регрессия показала, что уровни IgE и IL-4 в сыворотке являются независимыми факторами риска АР, в то время как IL-10 и экспрессия miR-146a являются независимыми протективными факторами. У пациентов с АР наблюдается низкий уровень miR-146a в плазме, и генотип GG miR-146a rs2910164 повышает предрасположенность к АР.
Введение
Аллергический ринит (АР) представляет собой опосредованное аллергенами неинфекционное воспалительное заболевание слизистой оболочки полости носа. Типичные клинические симптомы АР включают зуд в носу, заложенность носа, прозрачные выделения из носа и частое чихание1. В более тяжелых случаях у пациентов также может наблюдаться снижение обоняния, что может влиять даже на качество сна. Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что глобальная распространенность АР увеличивается с каждым годом, достигая 10%–25%2. Хотя АР не представляет непосредственной угрозы для жизни пациентов, он серьезно нарушает сон, процесс обучения и трудовую деятельность, значительно снижает качество жизни и накладывает тяжелое экономическое бремя на людей и общество3. Исследования подтвердили, что АР служит фактором риска развития астмы, и по мере прогрессирования заболевания у пациентов с большей вероятностью развиваются синусит или полипы в носу, что еще больше увеличивает бремя болезни4,5. Таким образом, профилактика и контроль АР становятся ключевой задачей в области респираторных заболеваний. Однако патогенез АР до сих пор не выяснен полностью. Глубокое изучение патофизиологического механизма АР и разработка стратегий таргетной терапии имеют решающее значение. Это одна из актуальных научных проблем, требующих срочного решения.
Развитие аллергического ринита (АР) связано с экологическими и генетическими факторами6. Современные исследования в целом подтверждают, что синергетический эффект индивидуальной генетической предрасположенности и воздействия аллергенов в окружающей среде является основным движущим фактором развития АР. Группа Брозека дополнительно подтвердила, что взаимодействие между генетической восприимчивостью организма и воздействием факторов окружающей среды является фундаментальной причиной АР2. В области исследования генетических механизмов АР внимание ученых постепенно сосредоточилось на генетическом полиморфизме. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), будучи наиболее распространенной формой генетического полиморфизма, являются основной причиной вариаций генетической информации в организмах7. Накапливающиеся данные указывают на то, что генотип TT в локусе rs7044343 гена IL-33 может служить потенциальной мишенью для профилактики и лечения АР8. Кроме того, генотип TT в сайте C-159T промотора CD14 выступает в качестве прогностического маркера риска развития АР9. Это свидетельствует о том, что SNP ключевых генов могут служить важными молекулярными мишенями для оценки риска АР, обеспечения раннего предупреждения и достижения точной профилактики и лечения. Это дает важные зацепки для более глубокого понимания механизмов генетической предрасположенности к АР.
Многочисленные исследования показали, что аномальная экспрессия микроРНК (miRNA) является одним из основных факторов, определяющих возникновение и развитие широкого спектра заболеваний10. miRNA характеризуются стабильностью в биологических жидкостях организма, что делает их высокочувствительными молекулярными маркерами для диагностики заболеваний. miR-146a представляет собой тип молекулы некодирующей РНК с обширными биологическими функциями11. Полиморфизм rs2910164 локализован в области шпильки последовательности предшественника miR-146a. Вариация в этом локусе может влиять на эффективность процессинга и созревания pre-miR-146a, тем самым изменяя уровень экспрессии зрелой miR-146a и воздействуя на последующие иммунные и воспалительные ответы. Предыдущие исследования подтвердили, что гиперэкспрессия miR-146a может значительно снижать гиперреактивность дыхательных путей в моделях астмы у мышей и подавлять активацию сенсибилизированных лимфоцитов12. Путем таргетирования и ингибирования активности рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) miR-146a может эффективно уменьшать воспалительное повреждение при синусите13. Кроме того, гиперэкспрессия miR-146a может облегчать патологические симптомы в мышиной модели аллергического ринита (AR) за счет блокирования сигнального пути Toll-подобного рецептора 4 (TLR4)14. Эти наблюдения подчеркивают важную роль miR-146a в модуляции заболеваний дыхательной системы.
Существующие данные исследований генетического полиморфизма указывают на то, что частота аллеля G в локусе miR-146a rs2910164 тесно связана с гиперреактивностью дыхательных путей15. Данный SNP также рассматривается как потенциальный биомаркер риска развития астмы в корейской популяции15. Кроме того, группа Хименес-Моралеса дополнительно выявила, что генотип CC в локусе miR-146a rs2910164 обеспечивает защиту от астмы16. Однако отсутствовали соответствующие исследования, сообщающие о связи между полиморфизмом miR-146a rs2910164 и предрасположенностью к AR. Таким образом, целью данного исследования является проверка влияния полиморфизма miR-146a rs2910164 на AR, что позволит создать новую теоретическую базу для изучения патогенеза, клинической диагностики и лечения AR.
Протокол
Этическое заявление:
Все участники были полностью проинформированы о целях нашего эксперимента и подписали форму информированного согласия. Данное исследование было одобрено комитетом по этике Первой аффилированной больницы Луньяня Фуцзяньского медицинского университета (номер одобрения LYREC2023-k007-01). Все процедуры проводились в соответствии с соответствующими рекомендациями, правилами и Хельсинкской декларацией.
Набор участников, критерии отбора и сбор образцов
В период с января 2023 г. по май 2025 г. на базе амбулаторного отделения отоларингологии Первого аффилированного госпиталя города Лунъянь при Медицинском университете провинции Фуцзянь были набраны 211 человек с диагнозом АР и 180 здоровых участников (без АР). Критерии диагностики АР были заимствованы из рекомендаций Китайского общества аллергиков по диагностике и лечению аллергического ринита17. Пациенты должны были проявлять не менее двух клинических симптомов АР, включая зуд в носу, чихание, заложенность носа или насморк. Кроме того, при осмотре слизистой оболочки носа должны были быть выявлены бледность и отек, а результат кожной прик-тесты (SPT) или анализ сыворотки на IgE должен быть положительным. SPT проводился специализированным персоналом в кабинете аллергологического тестирования для обеспечения точности и согласованности результатов. Все пациенты с АР прошли оценку по опроснику качества жизни при риноконъюнктивите (RQLQ) и расчет общего индекса выраженности назальных симптомов (TNSS) при помощи медицинского персонала; полученные баллы были зафиксированы для последующего анализа.
В качестве контрольной группы (без AR) были привлечены здоровые добровольцы, проходившие плановые медицинские осмотры в больнице. Соответствующими критериям были участники без личного или семейного анамнеза AR, без астмы или других аллергических заболеваний в анамнезе, без хронического синусита или других воспалительных заболеваний полости носа, а также без инфекций дыхательных путей в течение предыдущего месяца. Кроме того, из исследования были исключены лица с серьезными заболеваниями сердца, печени, легких или почек, а также с любыми злокачественными новообразованиями.
Были собраны образцы периферической венозной крови у двух групп добровольцев. Часть венозной крови с антикоагулянтом была использована для экстракции ДНК и выделения РНК плазмы. Другая часть венозной крови была разделена для получения сыворотки, которая использовалась для определения сывороточных факторов (иммуноглобулина E (IgE), интерлейкина-4 (IL-4), IL-6 и IL-10).
Экстракция ДНК:
ДНК экстрагировали из 200 µL образцов периферической венозной крови с использованием набора для экстракции геномной ДНК из цельной крови (см. Таблицу материалов). Образцы крови собирали в пробирки с литий-гепариновым антикоагулянтом, после чего разделяли на аликвоты и замораживали при -20 °C для хранения. Конкретные процедуры проведения операции должны строго соответствовать инструкциям к набору. В завершение для элюции ДНК использовали 100 µL элюирующего буфера. Чистоту экстрагированного образца ДНК определяли с помощью анализатора нуклеиновых кислот/белков (спектрофотометра) (отношение OD₂₆₀/OD₂₈₀ составляло от 1,8 до 2,0). После анализа образцы ДНК хранили при -20 °C для последующего использования в экспериментах по генотипированию.
Определение генотипа
Для определения распределения генотипов miR-146a rs2910164 использовался набор для генотипирования SNP TaqMan. Информация о наборе внесена в список расходных материалов. Общий объем реакционной смеси ПЦР составлял 10 µL, включая 5 µL Master Mix, 0,5 µL смеси праймеров и зондов для типирования, 10 ng матричной ДНК и воду, не содержащую РНказ. Амплификацию ДНК проводили с использованием прибора для количественной ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией Roche LightCycler 480 II. Условия реакции: предварительная денатурация при 95 °C в течение 10 мин; 40 циклов (95 °C в течение 15 секунд, 60 °C в течение 1 мин), считывание флуоресценции FAM/VIC проводилось при 60 °C. После завершения амплификации собранные сигналы двойной флуоресценции FAM/VIC анализировали с помощью программного обеспечения LightCycler 480, затем данные по генотипам подвергали статистической обработке. Одиночный сигнал FAM соответствует одному гомозиготному генотипу, одиночный сигнал VIC — другому гомозиготному генотипу, а наличие обоих сигналов указывает на гетерозиготный генотип. Образцы с аномальными сигналами или противоречивыми результатами при повторном анализе тестировались повторно. В каждом эксперименте для контроля качества использовали как безматричный контроль, так и положительный контроль. Все образцы анализировали в трех технических повторностях.
ОТ-кПЦР
Экстракцию общей микроРНК из 100 µL плазмы проводили с использованием специализированного набора для выделения микроРНК. Информация о наборе внесена в список расходных материалов. Концентрацию РНК определяли с помощью спектрофотометра. Оптическая плотность OD₂₆₀/OD₂₈₀ выделенных качественных образцов микроРНК находилась в диапазоне от 1,8 до 2,0. Для обратной транскрипции с целью синтеза кДНК использовали 200 ng РНК; процедуру реакции проводили согласно стандартной инструкции к набору. Обратную транскрипцию выполняли в общем объеме 20 µL, включая инкубацию при 42 °C в течение 60 мин и инактивацию при 85 °C в течение 5 мин. Реакцию кПЦР готовили по установленному протоколу в общем объеме 20 µL. Состав реакционной смеси был следующим: 10 µL готовой смеси (pre-mix) для кПЦР, 0,4 µL прямого праймера, 0,4 µL обратного праймера, 1 µL матрицы кДНК и 8,2 µL воды, свободной от РНКаз. Использовали специфические праймеры для miR-146a и внутреннего референсного гена U6. Амплификацию проводили на приборе для количественной ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией Roche LightCycler 480 II. Режим термоциклирования для кПЦР был следующим: предварительная денатурация при 95 °C в течение 30 с, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 5 с, а также отжига и элонгации при 60 °C в течение 30 с. Все образцы анализировали в трех технических повторностях. Экспериментальные данные анализировали с помощью программного обеспечения LightCycler 480 Software. Используя U6 в качестве внутреннего референса для коррекции межостровковой вариабельности, сначала рассчитывали ΔCt (значение Ct для miR-146a минус значение Ct для U6), затем вычисляли ΔΔCt (ΔCt опытной группы минус ΔCt контрольной группы), и, наконец, определяли относительный уровень экспрессии miR-146a по формуле 2⁻ΔΔCt.
ELISA
Уровни IgE, IL-4, IL-6 и IL-10 в сыворотке определяли с помощью наборов для ELISA. Экспериментальные процедуры проводили в соответствии с инструкцией по применению. Конкретные этапы были следующими: сначала концентрированный промывочный раствор разбавляли, а стандарты разводили градиентно для подготовки рабочих растворов для построения стандартной кривой. Затем в лунки добавляли по 50 µL разбавителя, стандартного раствора и исследуемого образца, после чего инкубировали при 37 °C в течение 60 min. После инкубации лунки трижды промывали промывочным буфером. Затем добавляли 50 µL рабочего раствора конъюгата антитела с ферментом и инкубировали планшеты при 37 °C в течение 30 min. По завершении инкубации жидкость удаляли, лунки повторно промывали, после чего добавляли хромогенный раствор и инкубировали в течение 15 min при 37 °C в темноте. После добавления стоп-реагента измеряли оптическую плотность при 450 nm с помощью микропланшетного ридера. Концентрации образцов рассчитывали по стандартной кривой. Каждый образец анализировали трижды. Данные с коэффициентом вариации менее 10% считали достоверными. В ходе эксперимента для контроля качества использовали холостые и контрольные лунки. Диапазон детектирования и чувствительность набора соответствовали требованиям, указанным в руководстве производителя.
Статистическая обработка данных
Экспериментальные данные анализировали с помощью программного обеспечения SPSS и GraphPad Prism 9. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения (mean ± SD). Для оценки нормальности распределения непрерывных переменных использовали критерий Шапиро-Уилка, а для оценки однородности дисперсии — критерий Ливена. Сравнение непрерывных переменных между двумя группами проводили с помощью t-критерия для независимых выборок. Для сравнения нескольких групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки, а двухфакторный ANOVA применяли для оценки основных эффектов двух независимых факторов и эффекта их взаимодействия. Выбросы определяли и исключали на основании правила трех стандартных отклонений. Пропущенные данные в данном исследовании не обнаружены. Для анализа диагностической эффективности miR-146a при AR использовали кривую рабочих характеристик приемника (ROC-кривую). Соответствующие параметры ROC и 95% доверительные интервалы рассчитывали с помощью встроенных статистических алгоритмов. Для измерения линейной корреляции между экспрессией miR-146a и уровнями сывороточных факторов использовали корреляционный анализ Пирсона. Для скрининга факторов риска AR проводили одномерный и многомерный логистические регрессионные анализы. Переменные с p < 0.05 при одномерном анализе включали в модель многомерной логистической регрессии. Значение p < 0.05 считали статистически значимым.
Результаты
Характеристики участников и распределение генотипов
Были проведены статистический анализ исходных клинических данных двух групп испытуемых. Результаты показали значимые различия в уровнях сывороточного IgE, IL-4, IL-6 и IL-10. По сравнению с группой добровольцев без аллергического ринита (АР), в группе пациентов с АР концентрации сывороточного IgE, IL-4 и IL-6 были повышены, в то время как уровень IL-10 был снижен (Таблица 1). Распределение генотипов miR-146a rs2910164 определяли методом TaqMan-qPCR. Результаты анализа показали, что генотип GG (χ2=7,018, OR (95% CI) = 0,471 (0,269-0,825), p=0,008) и аллель G (χ2=7,474, OR (95% CI) = 0,637 (0,506-0,894), p=0,006) rs2910164 встречались в группе пациентов с АР чаще, чем в группе без АР. Распределение генотипов в локусе rs2910164 соответствовало равновесию Харди-Вайнберга (pHWE = 0,191) (Таблица 2).
Анализ экспрессии miR-146a в плазме крови
Был измерен уровень экспрессии miR-146a в плазме крови в двух исследуемых когортах. У пациентов с AR наблюдалось выраженное снижение уровня miR-146a (Рисунок 1A). Анализ ROC-кривой показал, что miR-146a обладает хорошей диагностической эффективностью при AR (Рисунок 1B). Значение AUC составило 0,891. При оптимальном пороговом значении 0,785 чувствительность составила 83,89%, специфичность — 79,44%, а индекс Юдена — 0,633. На основании генотипа rs2910164 miR-146a две группы испытуемых были соответственно разделены на три подгруппы: GG, GC и CC. Были сравнены различия в экспрессии miR-146a в каждой подгруппе. Статистические результаты показали, что в группе без AR экспрессия miR-146a не имела статистически значимых различий между подгруппами с разными генотипами (Рисунок 1C); в группе AR уровень экспрессии miR-146a в плазме крови в подгруппе с генотипом GG был значительно ниже, чем в подгруппах с генотипами GC и CC (Рисунок 1D). Приведенные данные указывают на то, что экспрессия miR-146a в плазме крови у пациентов с AR, являющихся носителями генотипа GG rs2910164, снижена.
Анализ цитокинов в сыворотке крови и их корреляция с экспрессией miR-146a
Затем был проведен статистический анализ уровней IgE, IL-4, IL-6 и IL-10 в сыворотке крови у субъектов с различными генотипами. Статистические результаты не выявили значимых различий в уровнях IgE, IL-4, IL-6 и IL-10 в сыворотке крови между различными подгруппами генотипов (Рисунок 2A-D); в группе AR уровни IgE, IL-4 и IL-6 в сыворотке крови у пациентов с генотипом GG были значимо выше, чем у пациентов с генотипами GC и CC, в то время как уровень IL-10 в сыворотке был ниже (Рисунок 2A-D). Для изучения линейной корреляции между экспрессией miR-146a в плазме и баллом по шкале TNSS, баллом по шкале RQLQ, а также уровнями IgE, IL-4, IL-6 и IL-10 в сыворотке крови использовался корреляционный анализ Пирсона. Результаты показали, что экспрессия miR-146a значимо отрицательно коррелировала с баллом TNSS, баллом RQLQ и уровнями IgE, IL-4 и IL-6 в сыворотке, в то время как с уровнем IL-10 в сыворотке наблюдалась положительная корреляция (Таблица 3). Эти данные свидетельствуют о том, что уровень экспрессии miR-146a тесно связан с тяжестью AR, а также с выраженностью аллергических реакций и воспаления.
Анализ факторов риска аллергического ринита
Для анализа факторов риска AR использовали одномерную логистическую регрессию; результаты показали, что на возникновение AR влияли IgE (OR = 1.719, 95% CI = 1.151-2.568, p = 0.008), IL-4 (OR = 1.602, 95% CI = 1.073-2.392, p = 0.021), IL-6 (OR = 1.566, 95% CI = 1.048-2.341, p = 0.029), IL-10 (OR = 0.649, 95% CI = 0.435-0.968, p = 0.034) и экспрессия miR-146a (OR = 0.149, 95% CI = 0.096-0.233, p < 0.001). После контроля confounding-факторов с помощью многофакторного логистического регрессионного анализа было статистически установлено, что независимыми факторами риска AR являлись IgE (OR=1.724, 95% CI = 1.092-2.722, p = 0.019), IL-4 (OR = 1.943, 95% CI = 1.206-3.131, p = 0.006), IL-10 (OR = 0.479, 95% CI = 0.296-0.773, p = 0.003) и экспрессия miR-146a (OR = 0.148, 95% CI = 0.093-0.235, p < 0.001) (Таблица 4).
Рисунок 1: Схематическая диаграмма рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Экспрессия miR-146a в плазме и диагностическая эффективность при AR.
(A) Относительная экспрессия miR-146a в плазме крови добровольцев без AR и пациентов с AR. (B) ROC-кривая, оценивающая диагностическую эффективность miR-146a в плазме при AR. (C) Экспрессия miR-146a в плазме среди подгрупп с генотипами GG, GC и CC в группе без AR. (D) Экспрессия miR-146a в плазме среди подгрупп с генотипами GG, GC и CC в группе AR. Данные представлены как среднее ± SD. ***p < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Концентрация цитокинов в сыворотке крови у субъектов с различными генотипами miR-146a rs2910164 в группах без AR и с AR.
Уровни в сыворотке (A) IgE, (B) IL-4, (C) IL-6 и (D) IL-10 в подгруппах с генотипами GG, GC и CC в группах без AR и с AR. Данные представлены как среднее ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; ns — статистически не значимо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Информация | не-AR | Дополненная реальность (AR) | pзначение p |
| Возраст (лет) | 42.37±12.43 | 41.81±11.86 | 0.316 |
| ИМТ (кг/м²2) | 23.72±2.36 | 23.58±2.71 | 0.302 |
| Пол (мужской, n) | 87 | 97 | 0.641 |
| Курильщик | 81 | 94 | 0.929 |
| IgE (МЕ/мл) | 36.17±10.44 | 116.52±24.38 | <0.001 |
| ИЛ-4 (нг/л) | 1.76±0.61 | 18.74±4.62 | <0.001 |
| ИЛ-6 (нг/л) | 1.29±0.57 | 9.63±3.79 | <0.001 |
| ИЛ-10 (нг/л) | 3.26±0.68 | 1.74±0.73 | <0.001 |
| TNSS | / | 5.92±1.82 | |
| RQLQ | / | 2.43±1.16 | |
| Сокращения: AR — аллергический ринит; BMI — индекс массы тела; IgE — иммуноглобулин E; IL — интерлейкин; TNSS — общая оценка назальных симптомов; RQLQ — опросник качества жизни при риноконъюнктивите; p
| |||
Таблица 1: Клинические характеристики участников исследования.
Сравнение демографических характеристик, уровней цитокинов в сыворотке крови и показателей клинической оценки в группах без AR и с AR. Сокращения определены в примечании к таблице.
| rs2910164 | без AR (n=180) (%) | АР (n=211) (%) | Х2 | pзначение p | ОШ (95% ДИ) |
| Модель кодоминирования | |||||
| ГГ | 31 (17.22%) | 57 (27.01%) | 1 | ||
| ГХ (газовая хроматография) | 82 (45.56%) | 96 (45.50%) | 2.832 | 0.092 | 0.637 (0.376-1.079) |
| CC | 67 (37.22%) | 58 (27.49%) | 7.018 | 0.008 | 0.471 (0.269-0.825) |
| Доминантная модель | |||||
| GG+ GC | 113 (62.78%) | 153 (72.51%) | 1 | ||
| CC | 67 (38.22%) | 58 (27.49%) | 4.232 | 0.04 | 0.639 (0.417-0.980) |
| Рецессивная модель | |||||
| ГГ | 31 (17.22%) | 57 (27.01%) | 1 | ||
| ГХ + ЦХ | 149 (82.78%) | 154 (72.99%) | 5.34 | 0.021 | 0.562 (0.344-0.919) |
| Аллели | |||||
| G | 144 (40.00%) | 210 (49.76%) | 1 | ||
| C | 216 (60.00%) | 212 (50.24%) | 7.474 | 0.006 | 0.637 (0.506-0.894) |
| pРВХ (равновесие Харди-Вайнберга) | 0.494 | 0.191 | |||
| Сокращения: AR — аллергический ринит; OR — отношение шансов; pРВХ (равновесие Харди-Вайнберга)>Значение 0,05 указывает на то, что группа соответствует равновесию Харди-Вайнберга. p < p < 0,05 указывает на статистическую значимость. Примечание: генотип GG был выбран в качестве референсной группы (OR = 1,000) для всех генетических моделей. | |||||
Таблица 2: Связь между полиморфизмом miR-146a rs2910164 и аллергическим ринитом.
Распределение генотипов и аллелей rs2910164 в группах без АР и с АР, проанализированное с использованием кодоминантной, доминантной, рецессивной и аллельной генетических моделей.
| Материалы и оборудование | miR-146a | ТНСС | RQLQ | IgE | ИЛ-4 | ИЛ-6 | ИЛ-10 |
| Корреляция Пирсона | 1 | -0.742 | -0.736 | -0.806 | -0.756 | -0.727 | 0.757 |
| pp-значение | / | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
| Аббревиатуры: TNSS, общая оценка назальных симптомов; RQLQ, опросник качества жизни при риноконъюнктивите; IgE, иммуноглобулин E; IL, интерлейкин; p<Значение 0,05 указывает на статистическую значимость. | |||||||
Таблица 3: Корреляция экспрессии miR-146a в плазме с клиническими и воспалительными параметрами.
Корреляционный анализ Пирсона экспрессии miR-146a в плазме с баллом TNSS, баллом RQLQ, уровнем IgE в сыворотке и уровнями цитокинов у участников исследования.
| Материалы и оборудование | Однофакторный регрессионный анализ | Многомерный регрессионный анализ | ||||
| ИЛИ | 95% ДИ | p-значение | ИЛИ | 95% ДИ | pзначение p | |
| Возраст | 0.984 | 0.661-1.465 | 0.937 | |||
| ИМТ | 1.301 | 0.799-2.119 | 0.29 | |||
| Пол | 1.099 | 0.738-1.638 | 0.641 | |||
| Курильщик | 1.018 | 0.683-1.519 | 0.929 | |||
| IgE | 1.719 | 1.151-2.568 | 0.008 | 1.724 | 1.092-2.722 | 0.019 |
| ИЛ-4 | 1.602 | 1.073-2.392 | 0.021 | 1.943 | 1.206-3.131 | 0.006 |
| ИЛ-6 | 1.566 | 1.048-2.341 | 0.029 | 1.489 | 0.924-2.353 | 0.088 |
| ИЛ-10 | 0.649 | 0.435-0.968 | 0.034 | 0.479 | 0.296-0.773 | 0.003 |
| экспрессия miR-146a | 0.149 | 0.096-0.233 | <0.001 | 0.148 | 0.093-0.235 | <0.001 |
| Сокращения: AR, аллергический ринит; BMI, индекс массы тела; IgE, иммуноглобулин E; IL, интерлейкин. | ||||||
Таблица 4: Логистический регрессионный анализ факторов, связанных с аллергическим ринитом.
Однофакторный и многофакторный логистические регрессионные анализы для оценки демографических переменных, сывороточных цитокинов и экспрессии miR-146a в плазме как факторов, связанных с AR.
Дополнительный файл 1: Исходные данные Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
Аллергический ринит (АР) представляет собой хроническое аллергическое воспалительное заболевание дыхательных путей. Основной механизм АР заключается в том, что после воздействия аллергенов на организм воспалительные поражения слизистой оболочки носа опосредуются IgE17,18. Клинические симптомы в основном включают зуд в носу, заложенность носа, чихание и прозрачные выделения из носа, что серьезно ухудшает качество жизни пациентов. Эпидемиологические и генетические исследования подтвердили, что генетическая предрасположенность оказывает жизненно важное и незаменимое влияние на возникновение и развитие АР19. Данное исследование дополнительно выявило, что полиморфизм miR-146a rs2910164 тесно связан с предрасположенностью к АР, и генотип GG rs2910164 может быть патогенным генотипом. Повышенная концентрация IgE, IL-4 и IL-6 в сыворотке крови, наряду со сниженным уровнем IL-10, наблюдаемые у пациентов с АР, указывают на усиление аллергических и воспалительных реакций, что соответствует иммунопатологическим характеристикам заболевания.
Предыдущие работы показали, что однонуклеотидный полиморфизм (SNP) miR-146a способствует патогенезу различных аллергических заболеваний, таких как ревматоидный артрит20, системная красная волчанка21 и воспалительные заболевания кишечника22. Раша и соавторы дополнительно сообщили, что частота распределения генотипа GG и аллеля G в локусе rs2910164 значительно коррелирует с предрасположенностью к воспалительным заболеваниям кишечника22. Группа Хай-Бо обнаружила, что генотип CC в локусе rs2910164 является защитным генотипом при псориазе. У лиц с генотипом GG риск развития псориаза значительно ниже23. В нескольких исследованиях сообщалось, что полиморфизм rs2910164 тесно связан с предрасположенностью к астме, и было подтверждено, что генотип GG значительно повышает риск развития астмы15,16,24. Данное исследование дополнительно выявило, что частота распределения генотипа GG miR-146a rs2910164 у пациентов с аллергическим ринитом (AR) была выше, чем в группе здорового контроля, что позволяет предположить, что генотип GG может повышать предрасположенность к AR. Наблюдаемое обогащение генотипом GG и аллелем G в группе AR дополнительно подтверждает потенциальный вклад генетической вариации miR-146a rs2910164 в предрасположенность к заболеванию. У пациентов с AR, имеющих генотип rs2910164 GG, наблюдалось повышение концентраций сывороточных IgE, IL-4, IL-6 и IL-10. Измененный цитокиновый профиль, наблюдаемый у лиц с генотипом GG, указывает на более сильный воспалительный и аллергический ответ, что может способствовать повышению предрасположенности к заболеванию. Этот результат свидетельствует о том, что генотип GG может участвовать в патогенезе AR, усиливая аллергический и воспалительный ответы.
Будучи ключевым регулятором воспалительного ответа, miR-146a оказывает мощный противовоспалительный эффект. Оверэкспрессия miR-146a регулирует нижележащие гены и значительно облегчает множественные повреждения, связанные с воспалением25,26,27. Предыдущие исследования подтвердили, что оверэкспрессия miR-146a может эффективно подавлять воспалительную реакцию при аллергическом конъюнктивите путем повышения экспрессии транскрипционного фактора — белка Forkhead box 3 (FOXP3)28. Дальнейшие эксперименты на животных показали, что нокдаун miR-146a у мутантных мышей приводит к более высокому риску развития эмфиземы по сравнению с мышами дикого типа, что дополнительно подтверждает защитную роль miR-146a при респираторных заболеваниях29. В модели синусита miR-146a ингибирует активацию Mucin5AC (MUC5AC), уменьшая воспаление слизистой оболочки и избыточную секрецию слизи13. Результаты данного исследования показали, что уровень miR-146a у пациентов с AR был снижен, а экспрессия miR-146a в плазме у пациентов с генотипом rs2910164 GG была еще ниже. Эти данные указывают на то, что генотип rs2910164 GG может влиять на предрасположенность к AR через связь со сниженной экспрессией miR-146a и нарушенной иммунной регуляцией. Генотип GG может снижать экспрессию miR-146a, ослабляя ее противовоспалительную регуляторную функцию и повышая восприимчивость к AR. Корреляционный анализ Пирсона дополнительно указал на связь между уровнем экспрессии miR-146a и тяжестью AR, а также воспалительным состоянием. Экспрессия miR-146a линейно отрицательно коррелировала с TNSS, RQLQ и сывороточными уровнями IgE, IL-4 и IL-6, и линейно положительно коррелировала с уровнем IL-10. Это свидетельствует о том, что у пациентов с AR с более низкой экспрессией miR-146a клинические симптомы выражены сильнее, качество жизни более нарушено, а аллергические реакции и воспалительные ответы более интенсивны.
Данное исследование представляло собой исследование случай-контроль. Анализ подтвердил значимую связь между полиморфизмом rs2910164 miR-146a и предрасположенностью к AR. Тем не менее, работа имеет определенные ограничения. С одной стороны, относительно небольшой размер выборки может ограничивать обобщаемость наших результатов и не позволяет точно охарактеризовать особенности распределения генотипа rs2910164 в популяции. С другой стороны, данное исследование демонстрирует лишь связь между полиморфизмом rs2910164 miR-146a и предрасположенностью к AR, но не может четко доказать причинно-следственную связь между полиморфизмом rs2910164 miR-146a и AR. Таким образом, в будущем будет проведено проспективное когортное исследование с включением большего количества пациентов, чтобы прояснить связь между полиморфизмом rs2910164 miR-146a и возникновением, прогрессированием и прогнозом AR, а также обеспечить более достаточную теоретическую базу для профилактики и лечения AR.
В целом, экспрессия miR-146a в плазме крови была снижена у пациентов с AR, а генотип GG rs2910164 был связан с повышенной предрасположенностью к заболеванию. Данное исследование предоставляет потенциальный молекулярный маркер для выявления лиц с повышенным риском развития AR и закладывает основу для дальнейшего изучения генетических механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования заболевания.
Раскрытие информации
В данной работе нет конфликта интересов.
Доступность данных:
Все данные, полученные или проанализированные в ходе данного исследования, представлены в этой статье в виде дополнительного файла. Дополнительные запросы можно направлять автору, ответственному за переписку.
Вклад авторов:
YMY внес значительный вклад в концепцию и разработку, сбор данных, либо анализ и интерпретацию данных, а также участвовал в подготовке рукописи. YYH помогал в сборе данных, анализе данных и статистическом анализе. GML и JCW участвовали в интерпретации результатов и провели критический пересмотр рукописи. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.
Благодарности
Не применимо.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| центрифужная пробирка объемом 15 мл | Corning | 430791 | Для разделения плазмы, разделения образца на аликвоты, процедуры экстракции нуклеиновых кислот |
| Applied Biosystems TaqMan Genotyping Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4371355 | 2× концентрированная мастер-смесь, оптимизированная для генотипирования SNP, содержащая Taq-полимеразу с функцией «горячего старта» (hot-start), дНТФ, ионы магния, реакционный буфер и референсный краситель ROX. Не требует ручной подготовки системы. Совместимая с вышеупомянутым набором для генотипирования SNP TaqMan, она обеспечивает стабильную систему ферментативной реакции для амплификации SNP и флуоресцентного генотипирования с хорошей воспроизводимостью и четкими результатами кластеризации. |
| Набор для генотипирования SNP TaqMan от Applied Biosystems (rs2910164, miR-146a) | Thermo Fisher Scientific | C__15946974_10 | Готовый набор праймеров и зондов для генотипирования однонуклеотидного полиморфизма (SNP) локуса rs2910164 миР-146a человека. Набор содержит специфические праймеры для ПЦР и два флуоресцентных зонда MGB. Метка VIC соответствует аллелю C, а метка FAM — аллелю G. Данный набор позволяет точно дифференцировать три генотипа (CC, CG, GG) в одной пробирке, что подходит для конечной аллельной дискриминации на приборах для количественной ПЦР (кПЦР). |
| Пробирки для сбора крови BD с антикоагулянтом литий-гепарином | BD Vacutainer | 367884 | Клиническая биохимия, экспресс-тесты и исследования в области гематологии |
| GraphPad | США | / | Профессиональное построение научных графиков & статистическое программное обеспечение, стандарт для биологии и медицины, не требующее написания кода. Основные возможности: t-критерии, ANOVA, анализ выживаемости, нелинейная регрессия (например, кривые «доза-эффект»); создание графиков для публикаций (столбчатые диаграммы, диаграммы рассеяния, кривые выживаемости) для qPCR, вестерн-блоттинга и клеточных анализов. |
| Набор для ИФА на иммуноглобулин E (IgE) | Цзяньчэн | H108-1-2 | Область применения: исследование иммунного ответа и аллергических заболеваний |
| Набор для ИФА на интерлейкин-10 (IL-10) | Цзяньчэн | H010-1-2 | Область применения: воспаление, иммунорегуляция, исследование клинических биомаркеров |
| Набор для ИФА (ELISA) на интерлейкин-4 (IL-4) | Цзяньчэн | H005-1-2 | Область исследований: Воспаление, иммунный ответ Th2, аллергическая реакция |
| Набор для ИФА на интерлейкин-6 (IL-6) | Цзяньчэн | H007-1-2 | Область применения: воспаление, иммунорегуляция, исследование клинических биомаркеров |
| Программное обеспечение LightCycler 480 (v1.5 /v1.6) | Roche Diagnostics | / | Официальное программное обеспечение Roche, позволяющее в один клик осуществлять сбор данных qPCR, количественный анализ, анализ кривых плавления и генотипирование SNP (конечный метод TaqMan + HRM). |
| Набор для улучшенного синтеза первой цепи кДНК микроРНК miRcute | TIANGEN | KR211-02 | Подходит для обратной транскрипции всех зрелых микроРНК |
| Набор для экстракции и изоляции миРНК из сыворотки/плазмы miRcute | TIANGEN | DP503 | Применимые образцы: сыворотка крови человека, плазма, супернатант клеточной культуры |
| Прибор Roche LightCycler 480 Instrument II (система ПЦР в реальном времени) | Roche Diagnostics | 05015278001 | Количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР) + генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), включая метод TaqMan + HRM-анализ кривых плавления с высоким разрешением |
| SPSS 27.0 | США | / | Универсальное программное обеспечение для медицинской и социально-научной статистики с меню-интерфейсом (без необходимости написания кода), идеально подходящее для анализа больших выборок & сложные дизайны. Основные функции: описательная статистика, ANOVA, регрессия, критерий хи-квадрат, анализ выживаемости, надежность, расчет размера выборки; поддержка очистки данных & многоформатный импорт (Excel/CSV) для клинических, опросных и эпидемиологических данных. |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | TIANGEN | FP205-02 | Мастер-микс с повышенной специфичностью; оптимизированный буфер с H-Bond фактором сводит к минимуму образование праймер-димеров & неспецифические продукты; Taq-полимераза с функцией «горячего старта» + ROX для LightCycler 480 II; высокая чувствительность & воспроизводимость; идеально подходит для генов с низким уровнем экспрессии, сложных образцов, высокопроизводительного генотипирования. |
| Микропланшетный фотометр Thermo Scientific Multiskan FC | Thermo | 51119180 | Высокотехнологичный многофункциональный планшетный ридер; абсорбция (включая 450 нм) + флуоресценция + люминесценция; линейность 0–4 Абс (±2%) при 450 нм, прецизионность СКО&<0,001 Abs; совместим с планшетами на 96/384 лунки, автоматический динамический диапазон; идеально подходит для ELISA, анализа жизнеспособности клеток, иммуноанализов, изучения молекулярных взаимодействий. |
| УФ-видимый спектрофотометр Thermo Scientific NanoDrop One | Thermo | / | Эталонный микрообъемный УФ-видимый спектрофотометр; 1–2 μL образец, кювета не требуется; прямое измерение нуклеиновых кислот (260 нм), белков (280 нм), OD600 с определением концентрации & показатели чистоты (A260/A280, A260/A230); полноспектральное сканирование от 190–850 нм, автокалибровка, сенсорный экран; идеально подходит для qPCR, NGS, контроля качества очистки белков. |
| Набор для экстракции геномной ДНК из цельной крови | TIANGEN | DP304-03 | Применимые образцы: периферическая цельная кровь, клетки крови, образцы тканей |
Ссылки
- Bernstein, J. A., Bernstein, J. S., Makol, R. & Ward, S. Allergic Rhinitis: A Review. JAMA. 331 (10), 866-877, (2024).
- Brozek, J. L. et al. Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma (ARIA) guidelines-2016 revision. J Allergy Clin Immunol. 140 (4), 950-958, (2017).
- Pagel, J. M. L. & Mattos, J. L. Allergic Rhinitis and Its Effect on Sleep. Otolaryngol Clin North Am. 57 (2), 319-328, (2024).
- Nappi, E. et al. Comorbid allergic rhinitis and asthma: important clinical considerations. Expert Rev Clin Immunol. 18 (7), 747-758, (2022).
- Grimm, D., Hwang, P. H. & Lin, Y. T. The link between allergic rhinitis and chronic rhinosinusitis. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 31 (1), 3-10, (2023).
- Wise, S. K. et al. International consensus statement on allergy and rhinology: Allergic rhinitis - 2023. Int Forum Allergy Rhinol. 13 (4), 293-859, (2023).
- Vignal, A., Milan, D., SanCristobal, M. & Eggen, A. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics. Genet Sel Evol. 34 (3), 275-305, (2002).
- Falahi, S. et al. Association between IL-33 Gene Polymorphism (Rs7044343) and Risk of Allergic Rhinitis. Immunol Invest. 51 (1), 29-39, (2022).
- Kamel, M. A. et al. Association of serum CD14 level and functional polymorphism C-159T in the promoter region of CD14 gene with allergic rhinitis. Clin Exp Med. 23 (8), 4861-4869, (2023).
- Vishnoi, A. & Rani, S. miRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Updated Overview. Methods Mol Biol. 2595 1-12, (2023).
- Vijayakumar, S., Yesudhason, B. V., Anandharaj, J. L., Kalaivanan, L. & Selvan Christyraj, J. R. S. Exosomes and Their miRNA as a Potential Biomarker in the Diagnosis of Parkinson's Disease. ACS Chem Neurosci. 16 (15), 2756-2766, (2025).
- Han, S., Ma, C., Bao, L., Lv, L. & Huang, M. miR-146a Mimics Attenuate Allergic Airway Inflammation by Impacted Group 2 Innate Lymphoid Cells in an Ovalbumin-Induced Asthma Mouse Model. Int Arch Allergy Immunol. 177 (4), 302-310, (2018).
- Yan, D. et al. Human Neutrophil Elastase Induces MUC5AC Overexpression in Chronic Rhinosinusitis Through miR-146a. Am J Rhinol Allergy. 34 (1), 59-69, (2020).
- Wang, J. et al. MiR-146a mimic attenuates murine allergic rhinitis by downregulating TLR4/TRAF6/NF-kappaB pathway. Immunotherapy. 11 (13), 1095-1105, (2019).
- Trinh, H. K. T. et al. Association of the miR-196a2, miR-146a, and miR-499 Polymorphisms with Asthma Phenotypes in a Korean Population. Mol Diagn Ther. 21 (5), 547-554, (2017).
- Jimenez-Morales, S. et al. MiR-146a polymorphism is associated with asthma but not with systemic lupus erythematosus and juvenile rheumatoid arthritis in Mexican patients. Tissue Antigens. 80 (4), 317-321, (2012).
- Bayar Muluk, N., Bafaqeeh, S. A. & Cingi, C. Anti-IgE treatment in allergic rhinitis. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 127 109674, (2019).
- Lv, R. et al. Research progress of anti-IGE treatment for allergic rhinitis. Am J Otolaryngol. 46 (3), 104646, (2025).
- Davila, I. et al. Genetic aspects of allergic rhinitis. J Investig Allergol Clin Immunol. 19 Suppl 1 25-31, (2009).
- Bogunia-Kubik, K. et al. Significance of Polymorphism and Expression of miR-146a and NFkB1 Genetic Variants in Patients with Rheumatoid Arthritis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 64 (Suppl 1), 131-136, (2016).
- El-Akhras, B. A. et al. mir-146a genetic polymorphisms in systemic lupus erythematosus patients: Correlation with disease manifestations. Noncoding RNA Res. 7 (3), 142-149, (2022).
- Ghorab, R. A. et al. MiR-146a (rs2910164) Gene Polymorphism and Its Impact on Circulating MiR-146a Levels in Patients with Inflammatory Bowel Diseases. Inflammation. 48 (3), 1193-1205, (2025).
- Gong, H. B., Zhang, S. L., Wu, X. J., Pu, X. M. & Kang, X. J. Association of rs2910164 polymorphism in MiR-146a gene with psoriasis susceptibility: A meta-analysis. Medicine (Baltimore). 98 (6), e14401, (2019).
- Dong, J., Sun, D. & Lu, F. Association of two polymorphisms of miRNA-146a rs2910164 (G > C) and miRNA-499 rs3746444 (T > C) with asthma: a meta-analysis. J Asthma. 58 (8), 995-1002, (2021).
- Zhou, Z., Zhu, Y., Gao, G. & Zhang, Y. Long noncoding RNA SNHG16 targets miR-146a-5p/CCL5 to regulate LPS-induced WI-38 cell apoptosis and inflammation in acute pneumonia. Life Sci. 228 189-197, (2019).
- Olivieri, F. et al. miR-21 and miR-146a: The microRNAs of inflammaging and age-related diseases. Ageing Res Rev. 70 101374, (2021).
- Xiong, J. R. et al. miR-146a Regulates Neuroinflammation and Immune Cell Function in Neurodegenerative Diseases. Curr Med Sci. 45 (4), 725-744, (2025).
- Guo, H. et al. MiR-146a upregulates FOXP3 and suppresses inflammation by targeting HIPK3/STAT3 in allergic conjunctivitis. Ann Transl Med. 10 (6), 344, (2022).
- Yoshikawa, H. et al. miR-146a regulates emphysema formation and abnormal inflammation in the lungs of two mouse models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 326 (1), L98-L110, (2024).