Методическая статья

Нацеливание Cas9 для проведения экспериментов по спасению фенотипа в стабильно трансдуцированных нокаутных клетках HEK293

93 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72172

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

В этой статье

Краткое содержание

Данный протокол предусматривает удаление белка Cas9 после редактирования генома для обеспечения надежного проведения экспериментов по рекуперации в стабильно трансдуцированных нокаутных клеточных линиях.

Аннотация

Технология редактирования генов CRISPR-Cas9 произвела революцию в молекулярной биологии. Часто эту технологию используют для делеции гена, кодирующего интересующий белок. Полученный фенотип позволяет получить ценные сведения о функции белка. Функциональная значимость целевого белка может быть подтверждена путем повторного введения белка для восстановления утраченной функции (rescue). Обычно это достигается путем транс-введения кДНК, кодирующей белок, с использованием экспрессионного вектора. Однако в клеточных линиях с нокаутом, которые стабильно экспрессируют систему CRISPR-Cas9, вновь введенная экспрессионная плазмида также может быть расщеплена Cas9. Протокол, представленный здесь, предлагает стратегию преодоления этого потенциального препятствия в экспериментах по восстановлению функции. Данный подход продемонстрирован на клетках HEK293, в которых ген, кодирующий скаффолд-белок E3-убиквитинлигазы CUL4B, был нарушен с помощью CRISPR-Cas9. Трансдукция этих клеток направляющей РНК (gRNA), нацеленной на интегрированный трансген Cas9, привела к исчезновению детектируемого белка Cas9. Абляция Cas9 позволила восстановить экспрессию и функцию CUL4B после введения экспрессионной плазмиды CUL4B. Эти результаты служат доказательством концепции широко применимого подхода к изучению функций белков с помощью экспериментов по восстановлению функции.

Введение

CRISPR-Cas9 представляет собой мощный инструмент редактирования генома, созданный на основе природной адаптивной иммунной системы, которую прокариоты используют для защиты от инфекций бактериофагов. Благодаря низкой стоимости, высокой эффективности и простоте использования технология CRISPR-Cas9 превзошла другие инструменты редактирования генома, такие как нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN) и нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), в задачах точной генетической модификации, особенно в культурах клеток. Эта двухкомпонентная система состоит из нуклеазы Cas9 и направляющей РНК (гРНК). Посредством комплементарного спаривания оснований по Уотсону-Крику гРНК направляет Cas9 к геномной мишени, прилегающей к мотиву, прилегающему к протоспейсеру (PAM). Последовательность PAM служит критическим сайтом распознавания, который активирует работу нуклеазы. В этом сайте Cas9 создает двуцепочечный разрыв (DSB). В отсутствие гомологичного шаблона для репарации клетка восстанавливает DSB посредством негомологичного соединения концов (NHEJ). Этот механизм репарации может привести к возникновению инсерций или делеций (инделей), что вызывает мутации сдвига рамки считывания и функциональный нокаут целевого гена. Таким образом, нарушение работы целевого гена достигается путем введения Cas9 вместе с сконструированной гРНК. Последовательность гРНК из 20 нуклеотидов комплементарна геномному участку, непосредственно прилегающему к PAM. Результирующая потеря функции целевого гена позволяет выявить специфическую роль этого гена в клеточных процессах1.

Эксперимент по спасению, или анализ комплементации, предполагает восстановление недостающего белка для демонстрации обращения наблюдаемого фенотипа. Такой подход служит строгим контролем для исключения непреднамеренных экспериментальных эффектов, таких как эффекты, возникающие в результате «внецелевых» делеций CRISPR-Cas9. Наиболее распространенным методом повторного введения интересующего белка является трансфекция или трансдукция экзогенного экспрессионного вектора. Однако эта введенная ДНК подвержена тому же воздействию CRISPR-Cas9, что и эндогенный локус. Этот риск особенно высок в стабильно трансдуцированных клеточных линиях, где конститутивная экспрессия Cas9 сочетается с антибиотическим отбором для обеспечения гомогенной и стабильной популяции нокаутных клеток; такая стратегия часто требуется для клеточных линий, которые трудно трансфицировать или трансдуцировать, например, производных от иммунных, гемопоэтических или нейрональных линий.

Одним из способов избежать воздействия на вектор является введение экзогенной мРНК, кодирующей интересующий белок, что позволяет обойти расщепление, опосредованное Cas9, и исключить необходимость ядерной транскрипции. Однако по сравнению с плазмидной ДНК синтетическая мРНК дороже в производстве, обладает меньшей стабильностью и обеспечивает кратковременную экспрессию. Кроме того, она требует специфических химических модификаций, чтобы предотвратить запуск врожденных иммунных ответов в цитозоле2.

Чтобы избежать воздействия комплекса Cas9/гРНК на экспрессионные плазмиды, можно использовать инженерию «вобблер-оснований» кодирующей последовательности. Используя вырожденность генетического кода, можно ввести синонимичные мутации, чтобы устранить необходимую PAM-последовательность и/или нарушить комплементарность гРНК, не изменяя аминокислотную последовательность кодируемого белка. Однако применение синонимичных мутаций не лишено рисков. Такие изменения могут привести к субоптимальному использованию кодонов, что может нарушить кинетику трансляции и привести к неправильному фолдингу белка, снижению стабильности мРНК или вредным изменениям во вторичной структуре РНК3,4. Хотя и реже, другие возможные последствия включают появление криптических сигналов полиаденилирования, нарушение посттранскрипционных регуляторных мотивов и увеличение плотности CpG-островков5,6. Кроме того, модифицированные последовательности могут непреднамеренно вызвать клеточный стрессовый ответ, если resulting структура мРНК будет препятствовать продвижению рибосомы7,8.

Помимо проблем, связанных с использованием синтетических мРНК или инженерией «шаткого» основания (wobble-base engineering), конститутивная экспрессия Cas9 после редактирования вносит несколько сбивающих переменных в последующие анализы. Поскольку специфичность Cas9 может быть несовершенной, постоянная экспрессия повышает вероятность внецелевого расщепления, что приводит к кумулятивному накоплению непреднамеренных мутаций с течением времени9,10,11. Кроме того, хронический геномный надзор и повторяющиеся двухцепочечные разрывы (DSB) могут запустить устойчивый ответ на повреждение ДНК, что в конечном итоге ведет клетки к остановке клеточного цикла, старению или апоптозу12,13. Такая конститутивная продукция также создает метаболическую нагрузку, усиливая тем самым клональный дрифт, при котором клетки с низким уровнем экспрессии вытесняют клетки с высоким уровнем экспрессии, что приводит к нестабильным уровням трансгена в последовательных пассажах. Наконец, поскольку Cas9 является крупным прокариотическим белком, он может вызвать стресс через сигнальные пути врожденного иммунитета или перегрузить механизмы протеостаза хозяина, индуцируя ответ на разворачивание белков14,15,16.

Для смягчения этих осложнений было разработано несколько стратегий транзиторного ингибирования Cas9, включая белки Anti-CRISPR (Acrs) фагового происхождения17,18, низкомолекулярные ингибиторы или системы с присоединенным дегроном, такие как PROTAC19,20, а также механизмы оптогенетического контроля19,21. Однако эти подходы создают практические трудности, которые ограничивают их применимость в спасательных анализах (rescue assays). Белки Acrs действуют посредством молекулярной мимикрии и, следовательно, требуют стехиометрической оптимизации для обеспечения точности. Acrs также могут усиливать те же протеостатические и иммуногенные стрессы, которые связаны с гиперэкспрессией Cas9. Химическая модуляция привносит фармакокинетические сложности, потенциальную цитотоксичность, а также связанные с PROTAC «эффекты крючка» (hook effects), при которых избыточные концентрации лиганда парадоксальным образом препятствуют продуктивному формированию троичного комплекса22. Оптогенетические платформы ограничены клеточной фототоксичностью и необходимостью использования специализированного оборудования для поддержания стабильной подачи света19,21. Важно отметить, что, поскольку эти методы обеспечивают лишь временное или обратимое ингибирование, они зачастую оказываются недостаточными для применения в случаях, когда Cas9 экспрессируется конститутивно.

Напротив, самоинактивирующиеся системы CRISPR предлагают окончательное решение за счет автономного и необратимого разрушения трансгена Cas9 сразу после успешного редактирования целевого гена. Устраняя остаточную нуклеазную активность, этот подход навсегда защищает последующие спасательные векторы от расщепления, одновременно снижая долгосрочный протеостатический стресс и вероятность нецелевого геномного дрейфа. Хотя самонаправляющие gRNA могут быть доставлены с помощью транзиентной трансфекции рибонуклеиновых белков или липидных комплексов23,24, эти методы подвержены эффекту разбавления и стохастической вариативности, что приводит к формированию «мозаичной» популяции, в которой некоторые клетки избегают инактивации25,26,27.

Чтобы преодолеть эти ограничения, в описанном здесь протоколе используется лентивирусная система доставки для самоинактивации Cas9, что дает определенные практические преимущества при модификации стабильных клеточных линий. Лентивирусная доставка обеспечивает сцепленное наследование трансгена Cas9 и его собственного регулятора, эффективно предотвращая «ускользание за счет разбавления», характерное для быстро делящихся популяций. Кроме того, увеличенная емкость лентивирусных векторов позволяет коэкспрессировать селективные маркеры для получения гомогенной популяции с делецией Cas9, а их широкий тропизм, обеспечиваемый псевдотипированием VSV-G, способствует высокоэффективной доставке в труднотрансфицируемые типы клеток25,28,29.

В качестве демонстрации принципа действия данного метода в настоящем протоколе подробно описывается самоинактивация Cas9 для облегчения фенотипического спасения скаффолд-белка E3-убиквитинлигазы CUL4B в клетках HEK293 с нокаутом CUL4B30.

Протокол

В данном исследовании использовались установленные иммортализованные линии клеток человека (HEK293 и HEK293FT); участие людей, использование первичных тканей человека или проведение экспериментов на животных не предполагалось. Таким образом, одобрение институционального комитета по этике не требовалось.

1. Создание лентивирусной конструкции-специфичной gRNA для Cas9

  1. Вставьте последовательность специфической для Cas9 гРНК (Таблица 1) в лентивирусный вектор pLentiGuide-Puro.
  2. Замените ген устойчивости к антибиотику на тот, который отличается от маркера устойчивости, используемого для селекции стабильно трансдуцированной клеточной линии CRISPR-Cas9.
  3. Подтвердите успешную вставку и точность последовательности как специфической для Cas9 гРНК, так и заменяющего гена устойчивости к антибиотику с помощью секвенирования по Сэнгеру с использованием вектор-специфичных праймеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе ген устойчивости к пуромицину (PuroR) был заменен геном устойчивости к гигромицину B (HygroR) для создания вектора Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro. Альтернативными генами устойчивости к антибиотикам являются бластицидин S (BlastR), G418/генетицин (NeoR) и зеоцин (ZeoR).

2. Получение лентивируса, кодирующего специфическую для Cas9 гРНК

  1. Посев 2.5 × 106 клетки HEK293FT в чашке для культивирования тканей диаметром 10 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте клетки в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM; с высоким содержанием глюкозы) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (далее именуемой cDMEM) и инкубируйте их при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO22Клетки HEK293FT используются потому, что они обеспечивают более высокие титры лентивируса по сравнению с другими клеточными линиями, производными от HEK293.31.
  2. Инкубируйте клетки в течение 12 ч до достижения конфлюэнтности не менее 60% перед проведением трансфекции.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Все процедуры с использованием лентивирусных векторов третьего поколения следует проводить в условиях второго уровня биобезопасности (BSL-2), используя соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) и утвержденные процедуры дезинфекции (например, шкаф биологической безопасности II класса, вторичную герметизацию и 70% этанол), как описано в работе Pauwels et al.32.
  3. Приготовьте стандартную смесь для трансфекции фосфатом кальция (CaPhos). Разбавьте 20 µg общего количества плазмидной ДНК в стерильной воде для молекулярно-биологических исследований до конечного объема 450 µLДобавьте 50 µL 2,5 М CaCl22затем следует 500 µL из 2× Фосфатно-солевой буфер с HEPES (HBS; pH 7,05) в объеме, достаточном для получения конечного объема 1 мл в микроцентрифужной пробирке на 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте верифицированную по последовательности, преимущественно суперскрученную плазмидную ДНК, соответствующую следующим критериям качества: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 = 2,0–2,2 и содержание эндотоксина <0,1 ЕЕ/µgПриготовьте смесь для трансфекции, используя приблизительно эквимолярное соотношение следующих компонентов: 5 µg Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5.6 µg pLP1 (Gag/Pol), 3.8 µg pLP2 (Rev) и 5.6 µg pLP/VSVG (гликопротеин вируса везикулярного стоматита).
  4. Тщательно перемешайте раствор для трансфекции CaPhos путем осторожного пипетирования.
  5. Покапельно добавьте 1 мл смеси для трансфекции CaPhos в культуру клеток HEK293FT.
  6. Осторожно покачайте чашку с культурой, чтобы равномерно распределить трансфекционные комплексы.
  7. Инкубируйте клетки в течение 12 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекция фосфатом кальция, как правило, не зависит от использования стандартных поддерживающих антибиотиков33Однако для более чувствительных методов трансфекции, таких как липофекция, рекомендуется использовать среду без антибиотиков, поскольку полианионные антибиотики могут препятствовать образованию ДНК-липидных комплексов.34.
  8. Откачайте и удалите культуральную среду.
  9. Однократно промойте клетки 10 мл стерильного раствора 1 комнатной температуры× фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).
  10. Отоспитайте и удалите PBS.
  11. Добавьте 10 мл свежей среды cDMEM комнатной температуры.
  12. Верните клетки в инкубатор и дайте лентивирусным частицам накопиться в культуральной среде в течение 36 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При данных условиях расчетный выход неконцентрированного супернатанта лентивируса составляет примерно 1,0 × 106 transducing units (TU)/мл через 48 ч, однако фактический титр следует определить экспериментально по методу, описанному Kutner et al.35 или Barde и др.36Хранить супернатант лентивируса при −80 °C в течение периода до 2 лет. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания, так как они могут привести к снижению вирусного титра примерно на 55%37,38,39,40.

3. Сбор лентивируса с кодирующей Cas9-специфичной гРНК и трансдукция целевых клеток

  1. Seed 1.0 × 106 адгезивные клетки-мишени в чашке диаметром 10 см, обработанной для культивирования тканей.
  2. Инкубируйте целевые клетки в течение 12 ч перед лентивирусной трансдукцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: целевыми клетками являются клетки HEK293 со стабильной экспрессией Streptococcus pyogenes Cas9, а CUL4Bтаргетирующая гРНК (Таблица 1), а также ген устойчивости к пуромицину (PuroR). Культивируйте клетки в среде cDMEM, содержащей 10 µg/mL пуромицином и подтвердите нарушение экспрессии CUL4B с помощью вестерн-блот-анализа до самоинактивации Cas9. Все последующие эксперименты проводите с использованием клеток HEK293 ранних пассажейΔCUL4B клетки
  3. Соберите среду, содержащую лентивирус, осторожно перенеся супернатант из культуры клеток-продуцентов HEK293FT в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл, стараясь не нарушить целостность монослоя клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизируйте клетки-продуценты HEK293FT в соответствии с установленными правилами биобезопасности32.
  4. Центрифугируйте собранный супернатант при 1 000 × г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT), чтобы осадить любые остаточные клетки-продуценты HEK293FT.
  5. Отосппирируйте и удалите культуральную среду из ранее высеянных клеток HEK293ΔCUL4B клетки
  6. Перенесите 7 мл осветленного супернатанта лентивируса в чашку Петри диаметром 10 см с клетками HEK293.ΔCUL4B клетки. Избегайте воздействия на осадок на дне центрифужной пробирки и оставляйте не менее 1 мл остаточного супернатанта, чтобы минимизировать перенос клеток-продуцентов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Профильтруйте супернатант через 0.45 µm при необходимости профильтруйте полученный раствор для дальнейшего удаления остаточных клеток-продуцентов. Утилизируйте оставшийся супернатант в соответствии с правилами биобезопасности32При расчетном титре 1,0 × 106 Ед/мл, инокулят объемом 7 мл должен обеспечить множественность заражения (MOI) в диапазоне от 3,5 до 5,541.
  7. Инкубируйте трансдуцированные клетки HEK293ΔCUL4B клетки в течение 24 ч для обеспечения полной лентивирусной трансдукции и интеграции.
  8. Оспирируйте и удалите вирусную супернатант.
  9. Однократно промойте клетки 10 мл стерильного раствора 1 комнатной температуры× Фосфатно-солевой буфер.
  10. Отоспширируйте и удалите PBS.
  11. Добавьте 10 мл свежей среды cDMEM комнатной температуры.
  12. Верните клетки в инкубатор и культивируйте их в течение четырех дней для экспрессии трансгена и осуществления разрыва Cas9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если лентивирусный вектор Cas9 gRNA не кодирует флуоресцентный репортер, трансдуцируйте параллельную контрольную культуру с аналогично созданным лентивирусным вектором, экспрессирующим флуоресцентный репортер. Используйте контрольную культуру для оценки эффективности трансдукции и сроков истощения целевого гена с помощью качественной флуоресцентной микроскопии или количественной проточной цитометрии. В данном исследовании экспрессия GFP легко определялась с помощью флуоресцентной микроскопии через четыре дня после трансдукции.

4. Антибиотический отбор трансдуцированных клеток с Cas9-специфичной гРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Через четыре дня после трансдукции целевые клетки должны достичь или почти достичь состояния конфлюэнтности, после чего их необходимо перенести в сосуд для культивирования большего объема. Перенос клеток следует проводить одновременно с началом антибиотического отбора.

  1. Отососите и удалите культуральную среду из клеток HEK293ΔCUL4B .
  2. Однократно промойте клетки 10 mL стерильного 1× фосфатно-солевого буфера (PBS) комнатной температуры.
  3. Отососите и удалите PBS.
  4. Добавьте в чашку с культурой 2 mL стерильного раствора трипсина-ЭДТА комнатной температуры.
  5. Инкубируйте клетки в течение 5 min для обеспечения их открепления.
  6. Добавьте 8 mL cDMEM комнатной температуры для нейтрализации трипсина.
  7. Перенесите клеточную суспензию в стерильную коническую пробирку объемом 15 mL.
  8. Тритурируйте клеточную суспензию 15–20 раз для полного диспергирования клеточных агрегатов.
  9. Центрифугируйте клетки при 200 × g в течение 10 min при комнатной температуре.
  10. Пока клетки центрифугируются, подготовьте флакон T150 с обработанной поверхностью для культивирования тканей, содержащий 20 mL cDMEM с добавлением 250 µg/mL гигромицина B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация гигромицина B, необходимая для селекции, может варьироваться в зависимости от типа клеток. Постройте кривую гибели, используя 50–500 µg/mL гигромицина B, чтобы определить минимальную концентрацию, необходимую для уничтожения всех нетрансдуцированных клеток в течение 7–10 дней. Если в векторе Cas9 gRNA используется альтернативный маркер устойчивости к антибиотикам, постройте кривую гибели, используя 2–10 µg/mL бластицидина S, 400–800 µg/mL G418/Geneticin или 50–400 µg/mL zeocin.
  11. Отососите и удалите супернатант, не затрагивая осадок клеток.
  12. Ресуспендируйте клеточный осадок в 10 mL cDMEM с добавлением 250 µg/mL гигромицина B.
  13. Перенесите 10 mL клеточной суспензии в подготовленный флакон T150, содержащий 20 mL селективной среды.
  14. Осторожно покачайте флакон для равномерного распределения клеток.
  15. Инкубируйте клетки в условиях селекции в течение трех дней.
  16. На 3-й день селекции отососите селективную среду и замените ее 30 mL свежего cDMEM с добавлением 250 µg/mL гигромицина B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замена селективной среды позволяет удалить неадгезивные погибшие клетки, восполнить запас питательных веществ и поддерживать активность антибиотика.
  17. Продолжайте инкубацию до тех пор, пока выживший монослой клеток не достигнет примерно 90% конфлюэнтности, что обычно происходит через дополнительные четыре дня.

5. Подтверждение элиминации Cas9 и in trans восстановления CUL4B

ПРИМЕЧАНИЕ: Когда клетки достигнут примерно 90% конфлюэнтности, подтвердите делецию Cas9 в первых экспериментах и немедленно криоконсервируйте оставшуюся популяцию клеток42. Такой подход сводит к минимуму развитие вторичных компенсаторных механизмов.

  1. Высейте клетки HEK293ΔCUL4B ранних пассажей, стабильно экспрессирующие целевую gRNA для Cas9 (далее именуемые HEK293ΔCUL4BΔcas9), в четыре лунки 6-луночного планшета для культивирования тканей с плотностью 2,5 × 105 клеток на лунку.
  2. Высейте клетки HEK293ΔCUL4B в четыре лунки отдельного 6-луночного планшета. Высейте родительские клетки HEK293 хотя бы в одну дополнительную лунку в качестве контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте культуры HEK293ΔCUL4B и родительские HEK293 в качестве контролей экспрессии Cas9 и CUL4B соответственно.
  3. Инкубируйте все культуры в течение 12 ч для обеспечения полной адгезии клеток и активной пролиферации.
  4. Приготовьте смеси для трансфекции фосфатом кальция (CaPhos), содержащие 0, 0,5, 1,0 или 2,0 µg pCMV-FLAG-CUL4B. Доведите общее количество плазмидной ДНК в каждой смеси до постоянного значения 10 µg, добавив пустой вектор pCMV.
  5. Разбавьте каждую смесь ДНК стерильной водой для молекулярной биологии до конечного объема 180 µL, добавьте 20 µL 2,5 M CaCl2, а затем добавьте 200 µL 2× HEPES-буферного физиологического раствора (HBS; pH 7,05), чтобы получить конечный объем 400 µL в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 mL.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании экспрессионных плазмид под управлением сильных промоторов (например, CMV) проведите титрование ДНК для достижения уровней экспрессии белка, сопоставимых с эндогенной экспрессией. Используйте верифицированную по последовательности, преимущественно суперскрученную плазмидную ДНК со значениями A260/A280 1,8–2,0, A260/A230 2,0–2,2 и уровнем эндотоксинов <0,1 EU/µg.
  6. Тщательно перемешайте каждый раствор для трансфекции CaPhos осторожным пипетированием.
  7. Покапельно добавьте по 200 µL каждой смеси для трансфекции в соответствующую лунку с клетками HEK293ΔCUL4BΔcas9. Меняйте наконечники дозатора между образцами для предотвращения перекрестного загрязнения.
  8. Покапельно добавьте оставшиеся 200 µL каждой соответствующей смеси для трансфекции в соответствующую лунку с клетками HEK293ΔCUL4B.
  9. Инкубируйте трансфецированные культуры в течение 12 ч.
  10. Аспирируйте культуральную среду из каждой лунки.
  11. Однократно промойте клетки 1 mL стерильного 1× PBS комнатной температуры.
  12. Аспирируйте и удалите PBS.
  13. Добавьте по 2 mL свежего cDMEM комнатной температуры в каждую лунку.
  14. Инкубируйте культуры еще 24 ч для экспрессии CUL4B и последующих функциональных реакций.
  15. Соберите клетки, используя стандартные процедуры трипсинизации.
  16. Перенесите каждую клеточную суспензию в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL.
  17. Однократно промойте каждую клеточную суспензию 1× PBS.
  18. Кратковременно центрифугируйте образцы при 14 000 × g при комнатной температуре для осаждения клеток.
  19. Аспирируйте и удалите супернатант PBS.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: β-меркаптоэтанол является летучим раздражителем кожи и дыхательных путей с сильным запахом. Работайте с базовыми растворами в сертифицированном вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты, включая химически стойкие перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Утилизируйте загрязненные наконечники, пробирки и отходы в соответствии с правилами учреждения по обращению с опасными отходами.
  20. Лизируйте каждый клеточный осадок непосредственно в 200 µL буфера для образцов Лэммли с добавлением 5% (об/об) β-меркаптоэтанола.
  21. Денатурируйте белки, нагревая образцы при 95 °C в течение 15 мин.
  22. Разделите 20–40 µg общего белка на дорожку с помощью стандартного электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).
  23. Перенесите разделенные белки на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану.
  24. Блокируйте мембрану в течение 30 мин при комнатной температуре с использованием блокирующего буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте блокирующий буфер, используя либо 5% (мас/об) обезжиренное сухое молоко, либо 5% (мас/об) бычий сывороточный альбумин (BSA), растворенные в стандартном промывочном буфере (0,1% Tween 20 в 1× Трис-буферном физиологическом растворе или 1× PBS).
  25. Промойте мембрану трижды по 10 мин каждый раз, используя стандартный промывочный буфер.
  26. Инкубируйте мембрану с первичными антителами к CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6 или α-TUBULIN в течение 12 ч при 4 °C при осторожном покачивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разведите первичные антитела 1:1 000 в стандартном промывочном буфере.
  27. Удалите раствор первичных антител и промойте мембрану трижды по 10 мин каждый раз, используя стандартный промывочный буфер.
  28. Инкубируйте мембрану с соответствующим вторичным антителом (anti-mouse или anti-rabbit IgG), конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), в течение 12 ч при 4 °C при осторожном покачивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разведите вторичные антитела 1:3 000 в блокирующем буфере.
  29. Удалите раствор вторичных антител и промойте мембрану трижды по 10 мин каждый раз, используя стандартный промывочный буфер.
  30. Равномерно нанесите усиленный хемолюминесцентный (ECL) субстрат на мембрану и инкубируйте в течение 1 мин.
  31. Зафиксируйте хемолюминесцентные сигналы с помощью системы цифровой визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании подтвердите успешный нокаут гена с помощью секвенирования по Сэнгеру целевого участка генома после ПЦР-амплификации выделенной геномной ДНК43.

Результаты

Для создания нокаутных линий с делецией Cas9 для последующей экспериментальной реконституции в клетках HEK293FT с использованием стандартных упаковочных плазмид (pLP1, pLP2 и pLP/VSVG) был получен лентивирус, кодирующий gRNA, нацеленную на Cas9 (Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro). Полученный вирусный супернатант собирали и использовали для трансдукции целевых клеток. Выживаемость при селекции гигромицином B подтвердила успешную лентивирусную трансдукцию, а последующий вестерн-блот анализ подтвердил делецию Cas9 (Рисунок 1).

Белок CUL4B легко обнаруживался в родительских клетках HEK293, но отсутствовал в клетках HEK293ΔCUL4B и HEK293ΔCUL4BΔcas9, трансфецированных пустым вектором. В соответствии с потерей CUL4B, белки WDR5 и CDC6 продемонстрировали ожидаемое увеличение и снижение стационарного уровня экспрессии соответственно, что подтверждает нарушение функции CUL4B. Белок Cas9 обнаруживался в клетках HEK293ΔCUL4B, но не определялся в родительских клетках HEK293 и клетках HEK293ΔCUL4BΔcas9 , что подтверждает успешную абляцию Cas9. Как и ожидалось, трансфекция плазмиды экспрессии CUL4B в клетки HEK293ΔCUL4B привела лишь к минимальному восстановлению экспрессии белка CUL4B. Напротив, после трансфекции клеток HEK293ΔCUL4BΔcas9 наблюдалась интенсивная экспрессия CUL4B, сопровождавшаяся восстановлением экспрессии нижестоящих белков, о чем свидетельствует снижение уровня WDR5 и повышение уровня CDC6. В совокупности эти данные демонстрируют, что абляция Cas9 позволяет эффективно восстановить экспрессию и функцию CUL4B, предотвращая опосредованное Cas9 расщепление спасательной плазмиды (Рисунок 2).

figure-results-1
Рисунок 1: Экспериментальный план стратегической абляции Cas9 и валидации восстановления CUL4B. В данном рабочем процессе описывается создание клеток с CRISPR-нокаутом и абляцией Cas9 путем ко-трансфекции клеток-продуцентов HEK293FT плазмидами pLP1, pLP2, pLP/VSVG и конструктом Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro с помощью метода трансфекции фосфатом кальция. Полученный лентивирусный супернатант собирают, центрифугируют для удаления остаточных клеток-продуцентов и используют для трансдукции целевых клеток. После селекции успешность абляции Cas9 подтверждают с помощью вестерн-блоттинга для создания чистой линии нокаутных клеток, готовых к экспериментальной реконституции CUL4B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Восстановление экспрессии и функции CUL4B в клетках HEK293, отредактированных с помощью CRISPR-Cas9. (A) Схема этапов трансфекции. Клетки HEK293ΔCUL4B   и HEK293ΔCUL4BΔcas9 трансфецировали либо пустым вектором, либо возрастающими количествами pCMV-FLAG-CUL4B. Клетки собирали через 36 ч после трансфекции, белки лизатов разделяли методом SDS-PAGE. (B) Вестерн-блот-анализ эффективности восстановления и функциональный контроль нижележащих мишеней. Указанные белки визуализировали с помощью вестерн-блоттинга. WDR5 и CDC6 служили контролями функции CUL4B. α-TUBULIN использовали в качестве контроля загрузки. Исходные клетки HEK293 служили контролем базовой экспрессии. Блоты являются репрезентативными для повторных экспериментов (n = 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Целевой генПоследовательность гРНК (5'′→3′)PAM (5′→3′)Местоположение мишениОписание мишени
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 экзон 3N-концевая область открытой рамки считывания (ORF) человеческого гена CUL4B для нокаута путем сдвига рамки считывания
Cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)консервативный внутренний участок трансгена Cas9 для индукции самоинактивирующих инделей

Таблица 1: Последовательности гидовой РНК CRISPR-Cas9 и характеристики геномных мишеней.

Обсуждение

Данный протокол обеспечил надежное восстановление экспрессии и функции целевого белка в линиях клеток с нокаутом, созданных с помощью CRISPR-Cas9, в которых Cas9 была удалена после редактирования. Примечательным наблюдением в этой работе стала значительная степень, в которой конститутивная экспрессия Cas9 подавляет плазмидную экспрессию трансгена. Сильной стороной этого протокола является его способность восстановить как утраченный белок, так и связанный с ним фенотип. Этот метод также создает основу для фенотипического исследования широкого спектра модификаций белков. Например, введение фосфомиметического варианта (например, замена серина на аспарагиновую кислоту) может дать ценную информацию о роли этой посттрансляционной модификации без влияния нативного белка.

Следовательно, данный протокол широко применим к стандартным адгезивным (например, HeLa, A549) и суспензионным (например, Jurkat, THP-1) клеточным линиям. Однако такая схема последовательного отбора может оказаться непрактичной для первичных или неделящихся клеток (например, первичных нейронов или макрофагов). В этих чувствительных системах быстрая элиминация нетрансдуцированных клеток-байstandenров приводит к выбросу цитотоксического детрита и проапоптотических стрессовых сигналов в общую микросреду, что вызывает косвенную токсичность46,47. Аналогичным образом метод может оказаться неэффективным для высокоадаптивных анеуплоидных раковых линий (например, глиобластомы U87 или меланомы A375), склонных к ускользанию от CRISPR-опосредованного фенотипа за счет быстрых хромосомных перестроек или стремительного отбора уже существующих резистентных клонов48,49. В конечном счете, применимость метода зависит от способности клеточной линии переносить метаболическую нагрузку при экспрессии двух векторов, выдерживать указанное косвенное селективное давление и поддерживать стабильную кинетику роста на протяжении всего многонедельного протокола.

Хотя данный подход служит универсальным доказательством концепции для большинства клеточных линий, его реализация требует тщательного баланса между эффективностью доставки и сохранением целостности генома. Как было отмечено, использование лентивирусной доставки для «самонацеленной» gRNA обеспечивает получение гомогенной популяции с делецией Cas9, особенно в труднотрансфицируемых клетках. Однако риск инсерционного мутагенеза вследствие полуслучайной интеграции остается значимым фактором. Эти риски можно контролировать путем оптимизации MOI. В пермиссивных линиях, таких как HEK293, MOI в диапазоне 1–5 обеспечивает высокую степень насыщения при минимизации цитотоксичности и мутагенеза, вызванного интеграцией41. Напротив, рефрактерные иммунные или нейрональные клетки обычно требуют MOI от 10 до 50, что часто обуславливает необходимость применения таких усилителей, как полибрен и/или спинокуляция, для достижения аналогичной эффективности50,51,52,53,54,55.

Этот технический компромисс распространяется и на выбор между поликлональными и моноклональными селекционными популяциями. Клетки HEK293ΔCUL4BΔcas9 , полученные в данной работе, являются поликлональными; такой выбор ускоряет сроки проведения экспериментов, позволяя избежать многонедельного расширения популяции, необходимого для субклонирования единичных клеток. Кроме того, поликлональный пул отражает средний фенотип культуры, что эффективно нивелирует влияние клональных артефактов или проблем, связанных с интеграцией в конкретный сайт. Хотя моноклональные линии с большей вероятностью дают воспроизводимые результаты благодаря генетической гомогенности, представленные здесь данные свидетельствуют о том, что поликлональная селекция является жизнеспособной и зачастую более предпочтительной альтернативой в тех случаях, когда приоритетом являются скорость и репрезентативность популяции.

Временная стабильность полученного фенотипа также может быть критически важной переменной. В представленной здесь системе регуляторное влияние CUL4B на WDR5 и CDC6 ослабевало в ходе последовательных пассажей нокаут-линий клеток, что коррелировало с компенсаторным повышением экспрессии паралога CUL4A (данные не представлены). Это перекликается с результатами Накагавы и др., которые показали, что CUL4A может частично восстанавливать функцию CUL4B в клетках с дефицитом CUL4B44. Такая гомеостатическая компенсация часто встречается в клеточной биологии, особенно при воздействии на белок с высокой структурной гомологией и функциональной избыточностью по отношению к другим клеточным белкам.

Для преодоления этих вторичных компенсаторных механизмов можно использовать два различных стратегических подхода, в зависимости от целей эксперимента и используемой клеточной линии. Исследователям, для которых приоритетом является эффективность или которые работают с высокоадаптивными клеточными линиями, необходим сжатый график эксперимента. Эта стратегия предполагает немедленную проверку потери целевого белка, в идеале при достижении культурой 90% конфлюэнтности после селекции, с последующим незамедлительным применением самоинактивируемого Cas9 для таргетирования и проведением функциональных тестов. Принятие такого ускоренного рабочего процесса позволяет с большей вероятностью зафиксировать первичные биологические последствия нокаута до того, как механизмы клеточного гомеостаза успеют активировать избыточные паралоги или иным образом исказить результирующий фенотип.

В качестве альтернативы для исследований, требующих долгосрочной стабильности или высокоточных экспериментов по восстановлению функции (rescue experiments), особенно в моделях, устойчивых к трансфекции, таких как иммунные и нейрональные клетки, жизнеспособным решением является использование системы с тетрациклиновым контролем (Tet-On/Off)56,57. Несмотря на то, что внедрение этой индуцибельной структуры требует дополнительных раундов лентивирусной трансдукции и использования различных маркеров устойчивости к антибиотикам, она обеспечивает механизм устойчивого восстановления целевого белка для стабилизации клеточной среды перед запуском транзиторных событий «потери и восстановления» (loss and rescue), опосредованных доксициклином57.

Раскрытие информации

Авторы использовали Google Gemini для уточнения технической терминологии и редактирования рукописи. ИИ использовался как инструмент для улучшения лингвистического оформления и не участвовал в первоначальном синтезе данных, концептуализации исследования или основном написании текста. Авторы проверили и отредактировали полученный результат и несут полную ответственность за содержание окончательной рукописи. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана за счет стартовых средств, предоставленных Le Moyne College, Комитетом по исследованиям и разработкам Le Moyne College, Студенческим исследовательским комитетом Le Moyne College, Фондом иезуитского центра исследований и инноваций в преподавании имени Уолтера Л. '66 и Мэри Энн Поланд, а также кафедрой биологических и экологических наук Le Moyne College. Авторы выражают благодарность за использование BioRender.com при подготовке графических иллюстраций. Рисунок 1 был создан в BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3), а верхняя панель рисунка 2 была создана в BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
антитело к Cas9Cell Signaling65832Это мышиное моноклональное антитело обеспечивает специфическое обнаружение S. pyogenes Cas9 в лизатах человека, что делает его идеальным для проверки самонаправленного gRNA-опосредованного удаления Cas9.
антитело к CDC6Cell Signaling3387Это кроличье моноклональное антитело обеспечивает специфическое обнаружение человеческого CDC6, что делает его идеальным для мониторинга последующих функциональных эффектов CUL4B.
антитело к CUL4BSigma-AldrichC9995Это аффинити-очищенное кроличье поликлональное антитело обеспечивает специфическое обнаружение человеческого CUL4B без перекрестной реактивности с его близкородственным паралогом CUL4A.
вторичное антитело anti-mouse IgG, конъюгированное с HRPCell Signaling7076Это лошадиное антитело к IgG мыши конъюгировано с пероксидазой хрена (HRP) и оптимизировано для хемилюминесцентного обнаружения мышиных моноклональных первичных антител.
вторичное антитело anti-rabbit IgG, конъюгированное с HRPCell Signaling7074Это козье антитело к IgG кролика конъюгировано с пероксидазой хрена (HRP) и оптимизировано для хемилюминесцентного обнаружения кроличьих поликлональных и моноклональных первичных антител.
антитело к WDR5Cell Signaling13105Это кроличье моноклональное антитело обеспечивает специфическое обнаружение человеческого WDR5, что делает его идеальным для мониторинга последующих функциональных эффектов CUL4B.
антитело к α-TUBULINCell Signaling3873Это мышиное моноклональное антитело нацелено на человеческий альфа-тубулин и идеально подходит в качестве единообразного контроля загрузки для нормализации при анализе вестерн-блоттинга.
Набор для трансфекции фосфатом кальцияThermoFisher ScientificK278001Этот набор содержит эффективные реагенты для транзиентной трансфекции, оптимизированные для масштабируемого и экономичного производства лентивирусных векторов в адгезивных клетках-продуцентах HEK293FT.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation custom synthesisпоследовательность cas9 gRNA: CGTGATCACCGACGAGTACA, последовательность PAM: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation custom synthesisпоследовательность cas9 gRNA: CGTGATCACCGACGAGTACA, последовательность PAM: AGG
Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко GibcoD5796Эта среда с высоким содержанием глюкозы, дополненная L-глутамином и пируватом натрия, оптимизирована для поддержания роста, жизнеспособности и метаболической стабильности быстропролиферирующих линий клеток млекопитающих (напр., HEK293FT)
Сыворотка эмбриона теленка, Premium (термоинактивированная)Corning35-016-CVЭта сыворотка премиум-класса, подвергнутая термоинактивации, обеспечивает необходимые факторы роста и гормоны, сводя к минимуму комплемент-опосредованную цитотоксичность для линий клеток млекопитающих.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573Эта хорошо охарактеризованная линия клеток эмбриональной почки человека обладает высокой трансфектабельностью и служит надежной стандартной моделью для исследования фенотипов нокаута генов и систем восстановления белков.
клетки HEK293FT ThermoFisher ScientificR70007Этот быстрорастущий, высокотрансфектабельный вариант линии эмбриональной почки человека стабильно экспрессирует большой T-антиген SV40, что делает его оптимизированным для максимизации вирусных титров при производстве лентивирусных векторов.
Гигромицин BsigmaaldrichH7772Этот аминонуклеозидный антибиотик используется в качестве селективного агента в культуре клеток млекопитающих для выделения стабильных трансдуктантов, экспрессирующих маркер устойчивости к гигромицину.
плазмида pCLIP-All-hCMV-Puro (CUL4B gRNA)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bпоследовательность CUL4B gRNA: ATCAAACCCTACAAACTCCA, последовательность PAM: AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/AЭта плазмида для экспрессии в клетках млекопитающих использует промотор цитомегаловируса (CMV) для конститутивной экспрессии белка Cullin 4B (CUL4B) с FLAG-меткой; предоставлена в качестве подарка от Jianping Jin.
Вектор для экспрессии в клетках млекопитающих pCMV-M1Addgene23007Пустой контрольный вектор экспрессии (подарок от Linda Wordeman)
pLentiGuide-PuroAddgene52963Этот лентивирусный переносящий вектор обеспечивает экспрессию настраиваемой gRNA под управлением человеческого промотора U6, а также маркер устойчивости к пуромицину под управлением промотора EF-альфа для CRISPR-таргетинга в клетках, экспрессирующих Cas9; предоставлен в качестве подарка от Feng Zhang.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 Лентивирусный вектор, кодирующий GFP, для оценки эффективности трансдукции (подарок от Kevin Janes)
ПуромицинSigma-AldrichP8833Этот аминонуклеозидный антибиотик используется в качестве селективного агента в культуре клеток млекопитающих для выделения стабильных трансдуктантов, экспрессирующих маркер устойчивости к пуромицину.
Стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS)Corning21-040-CVЭтот стандартный сбалансированный солевой раствор используется для промывки монослоев клеток с целью эффективного удаления остатков культуральной среды, сывороточных белков или ферментов без нарушения осмотического давления или жизнеспособности клеток.
Трипсин ЭДТА 1XCorning25-051-CIЭтот стандартный раствор для ферментативной диссоциации используется для открепления адгезивных клеток млекопитающих от культуральных сосудов путем расщепления пептидных связей, в то время как ЭДТА хелатирует двухвалентные катионы для разрушения межклеточной адгезии.
Смесь для упаковки лентивирусов ViraPowerThermoFisher ScientificK497500Эта оптимизированная смесь упаковочных плазмид (pLP1, pLP2 и pLP/VSVG) используется для ко-трансфекции клеток-продуцентов для обеспечения высокотитровой сборки и производства репликативно-некомпетентных лентивирусных экспрессионных векторов.

Ссылки

  1. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing: The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Leonhardt C, et al. Single-cell mRNA transfection studies: Delivery, kinetics and statistics by numbers. Nanomedicine. 2014;10(4):679-688.
  3. Liu Y, Yang Q, Zhao F. Synonymous but not silent: The codon usage code for gene expression and protein folding. Annu Rev Biochem. 2021;90:375-401.
  4. Chamary JV, Hurst LD. Evidence for selection on synonymous mutations affecting stability of mRNA secondary structure in mammals. Genome Biol. 2005;6(9):R75.
  5. Mauro VP, Chappell SA. A critical analysis of codon optimization in human therapeutics. Trends Mol Med. 2014;20(11):604-613.
  6. Bauer AP, et al. The impact of intragenic CpG content on gene expression. Nucleic Acids Res. 2010;38(12):3891-3908.
  7. Kudla G, Murray AW, Tollervey D, Plotkin JB. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science. 2009;324(5924):255-258.
  8. Simms CL, Yan LL, Zaher HS. Ribosome collision is critical for quality control during no-go decay. Mol Cell. 2017;68(2):361-373.e5.
  9. Fu Y, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-826.
  10. Babu K, et al. Bridge helix of Cas9 modulates target DNA cleavage and mismatch tolerance. Biochemistry. 2019;58(14):1905-1917.
  11. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013;31(9):827-832.
  12. Ihry RJ, et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med. 2018;24(7):939-946.
  13. Haapaniemi E, Botla S, Persson J, Schmierer B, Taipale J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med. 2018;24(7):927-930.
  14. Yang S, Li S, Li XJ. Shortening the half-life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Rep. 2018;25(10):2653-2659.e3.
  15. Kafri M, Metzl-Raz E, Jona G, Barkai N. The cost of protein production. Cell Rep. 2016;14(1):22-31.
  16. Mehta A, Merkel OM. Immunogenicity of Cas9 protein. J Pharm Sci. 2020;109(1):62-67.
  17. Liu Q, Zhang H, Huang X. Anti-CRISPR proteins targeting the CRISPR-Cas system enrich the toolkit for genetic engineering. FEBS J. 2020;287(4):626-644.
  18. Marino ND, Pinilla-Redondo R, Csörgő B, Bondy-Denomy J. Anti-CRISPR protein applications: Natural brakes for CRISPR-Cas technologies. Nat Methods. 2020;17(5):471-479.
  19. Gangopadhyay SA, et al. Precision control of CRISPR-Cas9 using small molecules and light. Biochemistry. 2019;58(4):234-244.
  20. Pandit B, et al. Bio-orthogonal chemistry-based strategy to turn off CRISPR-Cas9 activity in solution and live cells. NAR Mol Med. 2026;3(1):ugag008. Available from: https://doi.org/10.1093/narmme/ugag008
  21. Bubeck F, et al. Engineered anti-CRISPR proteins for optogenetic control of CRISPR-Cas9. Nat Methods. 2018;15(11):924-927.
  22. Kostic M, Jones LH. Critical assessment of targeted protein degradation as a research tool and pharmacological modality. Trends Pharmacol Sci. 2020;41(5):305-317.
  23. Kim S, Kim D, Cho SW, Kim J, Kim JS. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-1019.
  24. Hendel A, et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 2015;33(9):985-989.
  25. Merienne N, et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Rep. 2017;20(12):2980-2991.
  26. Kelkar A, et al. Doxycycline-dependent self-inactivation of CRISPR-Cas9 to temporally regulate on- and off-target editing. Mol Ther. 2020;28(1):29-41.
  27. Dai Y, et al. Self-inactivating AAV-CRISPR at different ages enables sustained amelioration of Huntington's disease deficits in BAC226Q mice. Sci Adv. 2026;12(12):eaea8052.
  28. Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014;11:783-784.
  29. Parr-Brownlie LC, et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 2015;8:14.
  30. Dobransky A, Root M, Hafner N, Marcum M, Sharifi HJ. CRL4-DCAF1 ubiquitin ligase-dependent functions of HIV viral protein R and viral protein X. Viruses. 2024;16(8)1313.
  31. Thermo Fisher Scientific. ViraPower Lentiviral Expression Systems User Guide. 2026. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/virapower_lentiviral_system_man.pdf
  32. Pauwels K, et al. State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr Gene Ther. 2009;9(6):459-474.
  33. Guo L, et al. Optimizing conditions for calcium phosphate-mediated transient transfection. Saudi J Biol Sci. 2017;24(3):622-629.
  34. Thermo Fisher Scientific. Cationic Lipid Transfection. 2026. Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/methods/cationic-lipid-transfection.html
  35. Kutner RH, Zhang XY, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4(4):495-505. Available from: https://doi.org/10.1038/nprot.2009.22
  36. Barde I, Salmon P, Trono D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 2010;53(1):4.21.1-4.21.23. Available from: https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/0471142301.ns0421s53
  37. Kumru OS, et al. Physical characterization and stabilization of a lentiviral vector against adsorption and freeze-thaw. J Pharm Sci. 2018;107(11):2764-2774.
  38. American Type Culture Collection. Lentiviral Vector Reference Material Information Sheet. 2026. Available from: https://www.atcc.org/-/media/product-assets/documents/protocols/virology/lentiviral-vector-reference-material-information-sheet.pdf?rev=a934bd06c07f4969b0aafec16506cd44
  39. Higashikawa F, Chang L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 2001;280(1):124-131.
  40. Kowolik CM, Yee JK. Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein. Mol Ther. 2002;5(6):762-769.
  41. Pichavant C, Tremblay JP. Generation of lentiviral vectors for use in skeletal muscle research. In: DiMario JX, editor. Myogenesis: Methods and Protocols. Humana Press; Totowa, NJ; 2012. p. 285-295.
  42. Stacey GN, Masters JR. Cryopreservation and banking of mammalian cell lines. Nat Protoc. 2008;3(12):1981-1989.
  43. Bauer DE, Canver MC, Orkin SH. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. J Vis Exp. 2015;(95):e52118.
  44. Nakagawa T, Xiong Y. X-linked mental retardation gene CUL4B targets ubiquitylation of H3K4 methyltransferase component WDR5 and regulates neuronal gene expression. Mol Cell. 2011;43(3):381-391.
  45. Zou Y, et al. CUL4B promotes replication licensing by up-regulating the CDK2-CDC6 cascade. J Cell Biol. 2013;200(6):743-756.
  46. Dachs GU, Hunt MA, Syddall S, Singleton DC, Patterson AV. Bystander or no bystander for gene-directed enzyme prodrug therapy. Molecules. 2009;14(11):4517-4545.
  47. Prise KM, O'Sullivan JM. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2009;9(5):351-360.
  48. Clark MJ, et al. U87MG decoded: The genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 2010;6(1):e1000832.
  49. Cormier JN, et al. Heterogeneous expression of melanoma-associated antigens and HLA-A2 in metastatic melanoma in vivo. Int J Cancer. 1998;75(4):517-524.
  50. Sigma-Aldrich. Successful Transduction Using Lentivirus. Darmstadt, Germany; 2023. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/technical-article/genomics/advanced-gene-editing/successful-transduction-lentivirus
  51. Swainson L, Mongellaz C, Adjali O, Vicente R, Taylor N. Lentiviral transduction of immune cells. Methods Mol Biol. 2008;415:301-320.
  52. Davis HE, Morgan JR, Yarmush ML. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 2002;97(2-3):159-172.
  53. Denning W, et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: Effect of sera and polycations. Mol Biotechnol. 2013;53(3):308-314.
  54. O'Doherty U, Swiggard WJ, Malim MH. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 2000;74(21):10074-10080.
  55. Sano S, et al. Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models. J Vis Exp. 2019;(152):e59977.
  56. Gossen M, Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(12):5547-5551.
  57. Gossen M, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 1995;268(5218):1766-1769.

Перепечатки и разрешения

Теги

BiologyCRISPRCas9KnockoutLentivirusTransductionStableSelectionRescueRestorationTransgeneTransfectionPlasmid
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.