В данной статье представлен протокол интравентрикулярной канюляции и инфузии трассера, адаптированный для исследований методом динамической контрастной магнитно-резонансной томографии (DCE-MRI) у грызунов. Протокол обеспечивает непрерывное введение трассера во время получения изображений, что позволяет проводить картирование транспорта трассера во всем мозге и оценивать его вымывание из мозга в рамках одного непрерывного сеанса сканирования.
Методическая статья
Визуализация транспорта спинномозговой жидкости с помощью магнитно-резонансной томографии с контрастным усилением посредством интравентрикулярной инфузии у грызунов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Интравентрикулярная (ICV) канюляция позволяет вводить экзогенные маркеры или терапевтические агенты непосредственно в боковой желудочек, который является отправной точкой пути циркуляции спинномозговой жидкости (СМЖ). Введенные молекулы переносятся общим потоком СМЖ через желудочки в субарахноидальное пространство и впоследствии проникают в паренхиму головного мозга. посредством периваскулярное пространство. Однако при традиционных методах интрацеребровентрикулярной (ИЦВ) канюляции обычно используются ферромагнитные канюли, которые несовместимы с МРТ-исследованиями, в связи с чем инфузию необходимо проводить вне сканера, а канюлю — извлекать перед началом визуализации. Время, затрачиваемое на транспортировку животного и настройку оборудования для сканирования, часто приводит к потере начальной и, вероятно, наиболее критической фазы транспорта трассера. В данной работе мы описываем совместимый с МРТ протокол ИЦВ канюляции и инфузии для грызунов, который обеспечивает непрерывное введение трассера непосредственно в сканере во время динамического сбора данных МРТ. Линия для инфузии полностью изготовлена из немагнитных материалов, что позволяет осуществлять непрерывное получение изображений в рамках одного сеанса. Данный подход хорошо подходит для динамических МРТ-исследований с контрастным усилением для изучения динамики спинномозговой жидкости, глимфатического транспорта, клиренса растворенных веществ и интратекального введения лекарственных препаратов.
Введение
Мозг является одним из самых метаболически активных и динамичных органов в организме; в нем постоянно образуются продукты распада, которые должны эффективно выводиться для поддержания нормальной функции нейронов1. Накопление метаболических отходов является характерным признаком нейродегенерации и старения мозга2. Центральную роль в этом процессе очистки играет глимфатическая система, способствующая удалению побочных продуктов метаболизма и токсичных отходов за счет объемного потока спинномозговой жидкости (СМЖ) и обмена СМЖ с интерстициальной жидкостью (межклеточной жидкостью)3,4,5, что облегчается за счет водных каналов аквапорина-4 (AQP4), расположенных на концах астроцитарных отростков6. Значительное понимание динамики СМЖ было получено путем изучения транспорта различных трейсеров СМЖ. МРТ с динамическим усилением контраста (DCE-MRI) с использованием контрастных веществ на основе гадолиния (GBCAs) особенно хорошо подходит для общемозговой оценки транспорта трейсеров7,8. Клиническая значимость этого подхода была продемонстрирована в ходе трансляционных исследований на людях. Интратекальное введение GBCAs с последующим серийным МРТ использовалось для оценки динамики СМЖ в человеческом мозге9. Последующие работы продемонстрировали распространение трейсера по всему мозгу с его последующим выведением в течение ночи10. Этот подход был недавно применен для выявления нарушений периартериального транспорта трейсера у лиц со сниженным резервным объемом внутричерепного давления, а также у пациентов с идиопатической нормальной гидроцефалией11. Эти исследования определяют DCE-MRI транспорта трейсеров СМЖ как клинически применимый подход и стимулируют разработку строгих, воспроизводимых доклинических методов для механистического исследования регуляции динамики СМЖ и выведения отходов.
Каннюлирование большой цистерны мозга (ICM) обычно используется в исследованиях глимфатической системы для доставки трейсеров12. Однако только около 20% ГБСК (GBCAs), введенных через этот путь, транспортируются в паренхиму мозга, в то время как большая часть выводится непосредственно в спинной мозг или лимфатическую систему8. Данный подход также сопряжен с риском повреждения мозжечка или ствола мозга, а надежная фиксация канюли для лонгитюдных исследований остается технически сложной задачей. Интравентрикулярное (ICV) каннюлирование стало более надежной альтернативой13,14,15. Недавнее исследование продемонстрировало его воспроизводимость и ключевые преимущества при доставке флуоресцентных трейсеров, включая стабильную фиксацию канюли, которая обеспечивает свободное перемещение животного и позволяет проводить повторные инъекции трейсеров в лонгитюдных исследованиях13.
Несмотря на эти преимущества, существующие протоколы канюляции желудочков мозга (ICV) не совместимы с исследованиями методом МРТ16. Поскольку канюляция ICV требует проникновения через паренхиму головного мозга, обычно используются ферромагнитные канюли, которые вызывают сильные артефакты магнитной восприимчивости на МРТ-изображениях. В результате инфузия трейсера должна проводиться вне сканера, а канюля удаляется перед переносом животного для визуализации. Типичный рабочий процесс включает получение базового скана, извлечение животного для канюляции и инфузии трейсера, а затем повторное позиционирование животного для последующих динамических сканирований. Такой прерывистый процесс исключает возможность непрерывного сбора данных с привязкой к базовому уровню и приводит к погрешностям позиционирования, которые могут исказить повоксельный кинетический анализ. Что более важно, поскольку фаза раннего накопления обычно является наиболее динамичной, но кратковременной частью кинетики трейсера, перенос животного и настройка сканера в этот промежуток времени приводят к потере наиболее информативных данных.
В данной работе мы представляем протокол, который устраняет эти ограничения путем интеграции совместимой с МРТ линии для инфузии в желудочки мозга (ICV) с возможностью подачи контрастного вещества непосредственно в сканере, что позволяет проводить непрерывную динамическую МРТ-визуализацию у грызунов. Такой подход обеспечивает количественное картирование транспорта трассера ликвора во всем головном мозге в рамках одного непрерывного сеанса визуализации. Данный протокол хорошо подходит для изучения динамики ликвора в масштабе всего мозга, глимфатического транспорта и кинетики клиренса растворенных веществ. Несмотря на то, что протокол описан здесь для взрослых крыс, его можно адаптировать для мышей, соответствующим образом скорректировав координаты канюлирования и параметры инфузии15.
Протокол
Описанный ниже протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Кейс-Вестерн-Резерв (A-3145-01-2023-0015) в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и Политикой Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.
1. Подготовка инфузионной линии
- Отрежьте сегмент медной канюли длиной 30 mm и отрезок полиэтиленового (PE) трубочки длиной 2 m, используя зубчатые ножницы.
- Под микроскопом аккуратно расширьте один конец PE-трубочки с помощью иглы 30 G, затем вставьте медную канюлю в расширенный конец и зафиксируйте соединение цианоакрилатным клеем. Подсоедините противоположный конец PE-трубочки к игле 30 G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Медь обладает высокой пластичностью; будьте осторожны, чтобы не сплющить просвет при резке. Избегайте деформации канюли или прокола трубочки во время сборки. Длина PE-трубочки должна обеспечивать размещение шприцевого насоса за пределами краевого поля сканера. - Заполните узел из канюли и трубочки дегазированным раствором трекера и подсоедините его к шприцу Hamilton объемом 50 µL. Обмотайте кончик шприца уплотнительной лентой из политетрафторэтилена (PTFE) для предотвращения утечки. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в процессе выполнения этой операции.
- Установите шприц Hamilton в шприцевой насос и наберите в шприц дополнительные 30 µL раствора трекера.
2. Процедура канюляции
- Взвесьте крысу и проведите анестезию путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (90 mg/kg) и ксилазина (10 mg/kg). Подтвердите достаточную глубину анестезии с помощью рефлекса отжимания лапы. При необходимости введите дополнительно одну треть от начальной дозы и повторно проверьте состояние животного перед началом процедуры.
- Выбрейте шерсть на голове и шее, удалите остатки волос и стерилизуйте открытые участки кожи салфетками с 70% этанолом.
- Закрепите крысу в стереотаксической раме и поместите под животное грелку, накрытую абсорбирующей бумагой. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза для предотвращения пересыхания роговицы.
- Отрегулируйте зажим для носа, чтобы выровнять череп. Выполните разрез по средней линии и раздвиньте кожу с помощью четырех гемостатических зажимов, чтобы обнажить брегму и лямбду. Нанесите на череп 3% перекись водорода для удаления остатков надкостницы и улучшения видимости ориентиров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точное выравнивание черепа имеет решающее значение для воспроизводимого размещения канюли. В качестве практической меры контроля качества сравните медиолатеральные (ML) и дорсовентральные (DV) координаты брегмы и лямбды: если череп выровнен правильно, разница между двумя ориентирами не должна превышать 0.2 mm по оси ML или DV. - Установите электрическую дрель с тонким сверлом на стереотаксический держатель и убедитесь, что держатель надежно зафиксирован.
- Поместите сверло в точку брегмы, затем сместите его на 0.7 mm кзади и на 1.4 mm латерально вправо. Опустите сверло до соприкосновения с поверхностью черепа и зафиксируйте DV-координату.
- Под контролем микроскопа продвигайте сверло с шагом 0.1 mm. Немедленно остановитесь при пробитии черепа (типичная толщина черепа взрослых крыс составляет 0.3–0.4 mm).
- Замените дрель на заранее подготовленную канюлю на стереотаксическом держателе. Кратковременно запустите инфузионный насос, пока жидкость не появится на кончике канюли, чтобы подтвердить отсутствие закупорок в пути следования жидкости.
- Убедитесь, что канюля установлена перпендикулярно поверхности черепа, затем совместите ее с отверстием. Продвигайте канюлю со скоростью 0.1 mm/s до конечной целевой глубины 3.5 mm ниже поверхности твердой мозговой оболочки.
- Нанесите каплю тканевого клея в месте соединения канюли с черепом. После отверждения клея зашейте разрез кожи и осторожно отогните медную канюлю параллельно поверхности черепа, чтобы избежать контакта с катушкой МРТ.
3. Настройка МРТ и динамическое сканирование
- Поместите передающую катушку для объема в изоцентр сканера.
- Переместите животное в совместимую с МРТ люльку в положении на животе. Подключите систему физиологического мониторинга, включая датчик дыхания и ректальный температурный зонд. Включите циркулирующую водяную баню для поддержания температуры тела на уровне ~37 °C.
- Поддерживайте надлежащую анестезию на протяжении всего сеанса сканирования, используя дополнительный изофлуран, подаваемый через носовой конус. Отрегулируйте концентрацию изофлурана в диапазоне от 0,25% до 1,0% для поддержания частоты дыхания на уровне 50–70 вдохов/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия кетамином и ксилазином, введенная перед операцией по канюляции, обеспечит остаточную седацию во время первоначального перемещения в люльку МРТ. Вводите изофлуран постепенно и непрерывно контролируйте частоту дыхания во время сканирования.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Изофлуран является летучим веществом, представляющим опасность при вдыхании; используйте активную систему удаления газов и минимизируйте воздействие на персонал. - Поместите инфузионный насос за пределами краевого поля магнита, установите скорость инфузии на 1 µL/min, а продолжительность инфузии — на 20 min, что соответствует общему объему инфузии 20 µL. Аккуратно расположите и закрепите инфузионную линию вдоль люльки, чтобы предотвратить натяжение и смещение.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Ферромагнитные предметы могут стать опасными снарядами при размещении рядом с МРТ-сканером. Держите все несовместимое с МРТ оборудование за пределами краевого поля. - Установите поверхностную фазированную катушку непосредственно над дорсальной частью черепа, центрировав ее по мозгу. Поместите небольшой кусочек абсорбирующей бумаги между катушкой и местом разреза, чтобы впитывать любые выделения из раны.
- Задвиньте люльку в магнит до тех пор, пока мозг не окажется в изоцентре. Убедитесь, что инфузионная линия и электроды физиологического мониторинга не пережаты.
- Выполните первоначальную настройку сканера и получите анатомические изображения, чтобы подтвердить правильное расположение канюли.
- После получения исходных изображений одновременно запустите инфузионный насос и динамическое сканирование; продолжайте сбор данных в течение в общей сложности 3 h (подробности сбора данных см. в Таблице 1).
Результаты
Хирургическая рабочая станция настроена для точного позиционирования сверла с целью воздействия на боковой желудочек (0,7 мм кзади и 1,4 мм латеральнее брегмы; Рисунок 1A,D). Линия для инфузии состоит из медной канюли длиной 30 мм, сегмента ПЭ-трубки длиной 2 м и иглы 30 G, подключенной к шприцу Hamilton (Рисунок 1B). Увеличенная длина трубки позволяет разместить шприцевой насос за пределами краевого поля сканера. После сверления трепанационного отверстия предварительно подготовленная линия для инфузии устанавливается на стереотаксическую опору, и канюля вводится в боковой желудочек на глубину 3,5 мм ниже поверхности твердой мозговой оболочки (Рисунок 1C). После фиксации канюлю сгибают параллельно поверхности черепа, чтобы предотвратить контакт с катушкой МРТ (Рисунок 1E).
Успешную канюляцию ICV можно подтвердить по анатомическим изображениям, на которых четко видны желудочковая система и путь прохождения канюли, что позволяет напрямую визуализировать кончик канюли в просвете желудочка как в сагиттальной (Рисунок 2A), так и в аксиальной (Рисунок 2B) проекциях. Эти изображения также позволяют исключить из DCE-MRI сканирования животных с неправильным расположением канюли, включая недостаточное введение, когда кончик заканчивается в мозолистом теле, и избыточное введение, когда кончик заходит в таламус. Пространственно-временное распределение трассера на DCE-MRI сканах может служить дополнительным подтверждением правильного расположения канюли, поскольку при неправильном размещении трассер попадает в паренхиму мозга, что приводит к кинетике, не соответствующей распространению трассера в желудочках.
Для сканирования методом ДКМРТ (DCE-MRI) инфузию контрастных веществ в желудочки мозга начинают после получения исходных снимков; динамическое получение изображений может длиться до 3 ч или дольше (Рисунок 2C). На Рисунке 2D представлены репрезентативные 3D T1-взвешенные изображения, полученные в разные моменты времени после введения контрастного вещества. К концу 20-минутной инфузии уже заметно усиление сигнала в инфузированном (ипсилатеральном) боковом желудочке, третьем и четвертом желудочках, а также в большой цистерне, что отражает быстрое распространение трассера за счет объемного потока по желудочково-субарахноидальному пути. Усиление сигнала также наблюдается в паренхиме, окружающей ипсилатеральный боковой желудочек, что указывает на транспорт трассера в перивентрикулярную ткань через эпендимальную мембрану.
Более количественная оценка транспорта контрастного вещества может быть получена с помощью методов параметрического картирования, таких как картирование T1 и T2 с использованием метода магнитного резонансного «отпечатка» (MRF; Рисунок 3). В интратекальных компартментах T1 быстро снижается во время инфузии, распространяясь от ипсилатерального бокового желудочка к третьему и четвертому желудочкам, при этом в большой цистерне (cisterna magna) наблюдается небольшая задержка начала сокращения T1. Контрастные вещества, введенные внутрижелудочково, также демонстрируют глубокое проникновение в паренхиму мозга, причем в перивентрикулярных областях (проксимально) снижение T1 происходит раньше и выраженнее, тогда как в более дистальных областях снижение T1 замедлено и менее pronounced. При использовании 3-часового протокола сканирования клиренс контрастного вещества из паренхимы мозга также может быть оценен по кинетике восстановления T1. В совокупности данный протокол позволяет осуществлять динамический мониторинг основных фаз транспорта трейсера в ЦСЖ, включая быстрое распределение по желудочкам, интратекальное распространение, захват паренхимой и последующий клиренс в рамках одного непрерывного сеанса МРТ.
Рисунок 1: Хирургическая установка и сборка линии инфузии для совместимой с МРТ канюляции желудочков головного мозга. (A) Хирургическая рабочая станция. Электрическая дрель расположена над операционным полем для сверления фрезевого отверстия. (B) Собранная линия инфузии, состоящая из иглы 30 G (красная стрелка), сегмента полиэтиленовой трубки длиной 2 m (зеленая стрелка) и медной канюли длиной 30 mm (синяя стрелка). (C) Предварительно установленная линия инфузии, закрепленная на стереотаксическом манипуляторе для имплантации канюли. (D) Координаты для имплантации канюли. (E) Окончательный вид перед закрытием; медная канюля согнута параллельно поверхности черепа, чтобы избежать контакта с катушкой МРТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Размещение канюли и динамический мониторинг транспорта контрастного вещества после интрацереброventricular (ICV) инфузии. (A,B) Визуализация расположения канюли (красные стрелки) на анатомических изображениях в сагиттальной и аксиальной проекциях соответственно. (C) Схема протокола визуализации. (D) Репрезентативные 3D T1-взвешенные изображения в выбранные моменты времени в сагиттальной (сверху), аксиальной (посередине) и корональной (снизу) проекциях. Масштабная линейка, 5 mm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка транспорта трейсера с помощью магнитного резонансного фингерпринтинга (MRF). (A) Карты T1 (сверху) и T2 (снизу), реконструированные на основе 3D-данных MRF в выбранные моменты времени после введения в желудочки мозга (ICV). Масштабная линейка, 5 mm. (B) Средние временные кривые T1 в интратекальных компартментах, включая ипсилатеральный боковой желудочек (LV), третий желудочек (V3), четвертый желудочек (V4) и большую цистерну (CM). Серая закрашенная область указывает на 20-минутный период инфузии. (C) Средние временные кривые T1 в паренхиме ткани проксимально и дистально от V4 и ипсилатерального LV. Расположение ROI для временных кривых показано на (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4Схемы транспорта трейсера ЦСЖ после интрацеребровентрикулярного (ИЦВ) введения. (A) Сагиттальный срез, демонстрирующий введение индикатора посредством Канюля для внутрижелудочкового введения (ICV) и последующее распределение потока жидкости по желудочковой системе в субарахноидальное пространство (красные стрелки), а также ее транспорт через эпендимальную мембрану в прилежащую паренхиму головного мозга (синие стрелки). LV: боковой желудочек; V3: третий желудочек; V3v: вентральная часть третьего желудочка; V4: четвертый желудочек; CM: большая цистерна.B) Увеличенная схема области, обведенной рамкой на (A) демонстрирует путь обмена между спинномозговой жидкостью (СМЖ) и интерстициальной жидкостью (ИЖ). СМЖ проникает в паренхиму вдоль параартериального пространства при содействии водных каналов аквапорина-4 (AQP4), экспрессируемых на ножках астроцитов, перемещается за счет конвективного потока через интерстициальное пространство и выводится через паравенозное пространство в дренирующую вену. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Параметры | ДКМРТ (3D FLASH) | 3D MRF |
| Тип последовательности | T1-взвешенный 3D FLASH | 3D MRF (стопка спиралей) |
| TR / TE (ms) | 20.0 / 2.7 | 10.0 / 2.0 |
| Угол отклонения | 10° | Переменный (график переменного угла отклонения) |
| Подготовка намагниченности | Отсутствует | Инверсия или T2-подготовка (6 из 8 сегментов) |
| Поле обзора | 36 × 24 × 24 mm³ | 60 × 60 mm² (в плоскости); 15 mm (поперек плоскости) |
| Размер матрицы | 144 × 96 × 96 | 300 × 300 (в плоскости); 30 (поперек плоскости) |
| Пространственное разрешение | 0.25 mm изотропное | 0.2 × 0.2 mm² (в плоскости); 0.5 mm (поперек плоскости) |
| Временное разрешение | 3 min/кадр | 7 min/кадр |
| Траектория k-пространства | Декартова | Траектории «стопка спиралей»; 48 интерливов для полного сэмплирования |
| Ускорение | Отсутствует (одиночное усреднение) | 48-кратное (24× в плоскости, 2× поперек плоскости) |
| Примечание | Все эксперименты по визуализации проводились на системе Bruker BioSpin 9.4 T, работающей на платформе ParaVision 360 v3.4. В качестве передатчика использовалась квадратурная объемная катушка 86 мм, а в качестве приемника — 4-канальная поверхностная фазированная решетка. | |
Таблица 1: Параметры сбора данных МРТ.
Обсуждение
Описанный здесь протокол объединяет канюляцию в желудочки мозга (ICV) с инфузией непосредственно во время сканирования и динамической МРТ-визуализацией, что позволяет проводить количественную оценку транспорта трассера ЦСФ по всему мозгу в рамках одного сеанса визуализации. Преимущества и ограничения инфузии в ICV лучше всего оцениваются в сравнении с инфузией в большую цистерну мозга (ICM). Инфузия в ICM позволяет избежать транспаренхимальной канюляции и поэтому является менее инвазивной. Однако, поскольку большая цистерна расположена в середине пути циркуляции ЦСФ, инфузия в ICM, особенно при более высоких скоростях введения, может вызвать временное изменение направления градиента давления, который движет циркуляцию ЦСФ17. Что более важно, трассеры, введенные в ICM, быстро распределяются в нижележащем субарахноидальном пространстве и, впоследствии, в периваскулярном пространстве. Хотя каналы AQP4 на концах отростков астроцитов облегчают обмен между ЦСФ и интерстициальной жидкостью (ISF), эти каналы непроницаемы для контрастных веществ на основе гадолиния (GBCAs) из-за их большого молекулярного размера. В результате трассеры, введенные в ICM, демонстрируют значительно более низкое контрастное усиление в паренхиме по сравнению с инфузией в ICV15, что делает инфузию в ICM менее подходящей для изучения клиренса растворенных веществ из мозга. Инфузия в ICV решает эти проблемы, доставляя трассеры вблизи мест эндогенного производства ЦСФ13,14. Более того, градиенты давления и концентрации при инфузии в ICV способствуют прямому транспорту трассеров через эпендимальный слой13,14,15, что позволяет использовать эти трассеры в качестве маркеров клиренса продуктов обмена (Рисунок 4).
Для достижения воспроизводимых результатов критически важны несколько технических деталей. Точное выравнивание черепа необходимо для последовательного наведения на боковой желудочек, так как из-за малого размера желудочка допустимая погрешность при установке канюли крайне мала. Не менее важна сборка линии инфузии, не имеющей засоров и утечек. Пузырьки воздуха или частичные окклюзии могут изменить профиль инфузии и исказить интерпретацию кинетики ранней фазы; в худшем случае большой пузырь может полностью перекрыть линию, что приведет к неудаче эксперимента. Распространенные проблемы при подготовке к МРТ включают утечку в месте соединения шприца и иглы, которую можно устранить с помощью уплотнительной ленты из PTFE, а также натяжение линии инфузии при установке в колыбель, которого можно избежать, закрепив трубку вдоль колыбели, чтобы предотвратить ее натягивание или перегиб.
Представленные здесь целевые координаты и глубина введения были оптимизированы для крыс линии Wistar в возрасте 12 недель и могут потребовать корректировки для других возрастов и линий. Инфузию в желудочки мозга (ICV) можно проводить и на мышах с внесением соответствующих изменений с учетом меньшей массы тела и размера желудочков15. Скорость инфузии и общий объем могут быть скорректированы в зависимости от физико-химических свойств контрастного вещества, включая размер молекул и релаксированность; однако, учитывая малый объем желудочковых отделов, более высокие скорости инфузии могут значительно повысить внутрижелудочковое давление, поэтому их следует использовать с осторожностью. Кроме того, медная канюля, использованная в данном исследовании, обладает достаточной прочностью на изгиб, необходимой для прокола твердой мозговой оболочки и прохождения через паренхиму одним прямым движением. Ее пластичность также облегчает изгиб, что является преимуществом при ограниченном пространстве в конфигурациях катушек18. Нагрев, индуцированный радиочастотным (РЧ) излучением, минимален в связи с малой длиной погруженной части канюли. Однако чрезмерная деградация меди может привести к высвобождению свободных ионов меди, вызывающих нейротоксичность; следовательно, медная канюля, вероятно, не подходит для хронической имплантации. Для конфигураций катушек, позволяющих использовать выступающую канюлю, катетеры из кварцевого стекла или PEEK обеспечивают достаточную механическую прочность для введения, позволяя при этом избежать проблем с токсичностью14,19,20.
Используемый здесь контрастный агент (Gd-DOTA) имеет молекулярную массу 558.65 Da, что в несколько раз превышает массу эндогенных метаболических растворенных веществ, таких как лактат (90 Da) и глюкоза (180 Da), однако значительно меньше размеров крупных белковых агрегатов, представляющих интерес при нейродегенерации, например, мономеров амилоида-β (~4.5 kDa) или тау-белка (~45–65 kDa). Это делает ГДК-содержащие контрастные вещества подходящими суррогатами для изучения кинетики клиренса низкомолекулярных растворенных веществ, однако полученные результаты нельзя напрямую экстраполировать на клиренс более крупных макромолекулярных веществ. Кроме того, поскольку водные каналы AQP4 непроницаемы для ГДК-содержащих контрастных веществ, результаты нельзя напрямую экстраполировать на обмен между ликвором и интерстициальной жидкостью, который облегчается каналами AQP4.
В данном исследовании процедура канюляции была немедленно дополнена сеансом визуализации с целью демонстрации реализуемости метода. Следует отметить, что имплантация канюли может вызвать воспалительную реакцию, способную подавить глимфатическую функцию13, и период ожидания в 24 ч позволил бы глимфатической функции восстановиться до исходного уровня21. Исследователям следует учитывать этот фактор при планировании работ, направленных на изучение глимфатической функции. Кроме того, в предыдущем исследовании сообщалось, что приток ликвора выше при использовании кетамина/ксилазина, чем при изофлуранной анестезии18. Соответственно, в данном протоколе для первичной индукции используется кетамин/ксилазин. Однако разовой дозы кетамина/ксилазина недостаточно для поддержания стабильной анестезии в течение всего комбинированного протокола канюляции и визуализации. Режим анестезии, использованный здесь, был адаптирован из предыдущего исследования, в котором применяли дексмедетомидин с низкой дозой изофлурана22. Он представляет собой компромисс между поддержанием физиологической стабильности в ходе длительного протокола и минимизацией подавления глимфатической функции, связанного с анестезией.
Несмотря на преимущества, инфузия в внутрижелудочковые отделы (ICV) имеет некоторые ограничения. Учитывая малый объем церебральной спинномозговой жидкости (~300 µL)23, можно ввести лишь ограниченный объем трейсеров. Кроме того, скорость инфузии (1 µL/min) сопоставима со скоростью продукции CSF (~1.6 µL/min)23,24; следовательно, в процессе инфузии ожидается кратковременное повышение желудочкового давления. Снижение объема или скорости инфузии может частично решить эту проблему, однако меньший объем трейсера может снизить чувствительность детектирования, а более низкая скорость инфузии увеличивает общее время введения, не устраняя полностью рост давления. Поэтому следует соблюдать осторожность при интерпретации динамики транспорта трейсера в период инфузии, хотя данное ограничение не препятствует достоверной характеристике последующих фаз распределения и клиренса. В совокупности данный протокол ICV-инфузии, совместимый с МРТ, представляет собой практичную и адаптируемую платформу для регистрации полного временного хода транспорта трейсеров в CSF in vivo, что открывает новые возможности для изучения динамики спинномозговой жидкости, клиренса растворенных веществ и их нарушения при заболеваниях.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.
Благодарности
Данная работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) в рамках грантов R01NS124206 и RF1AG094791. Ответственность за содержание несут исключительно авторы, и оно не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Рисунок 4 создан с помощью BioRender.com.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Гиподермическая игла 30 G x 1 дюйм с пластиковым основанием | Эксель | 26439 | |
| 50 µL, газоплотный шприц, с люер-конусом (LT) | Hamilton | 80901 | |
| Анатомический узкий пинцет | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Искусственная спинномозговая жидкость | ОГЛАВЛЕНИЕ | 3525 | |
| Attane Изофлуран 1000 мг/г | ScanVet | 55226 | |
| Медная капиллярная трубка, внешний диаметр 0,32 мм × внутренний диаметр 0,16 мм | Nippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd. | C1220-11-109 | |
| Медный зажим | IEUYO | FEBA 1801 | |
| Ватный тампон | Пуританин | 868-WCS | |
| Дотарем (гадотерат меглумин) для инъекций, 0,5 ммоль/мл | Guerbet | NDC 67684-2001-1 | |
| Сверление | Предварительная подготовка | Модель SR | |
| Сверло | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Держатель для сверла | Stoelting | 51630 | |
| Медицинский пинцет Dumont | Fine Science Tools | 11252-00, 11253-20 | |
| Глазная мазь | Регби | NDC 0536 | |
| Система E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Пинцет Грэфе | Fine Science Tools | 11052-10,11152-10 | |
| Нагревательная подушка | Braintree Scientific | 5381 | |
| Набор для высокотемпературного прижигания | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ketaminol Vet 100 мг/мл (кетамин) | Intervet International BV | 511519 | |
| Силиконовый адгезив KWIK-SIL, низкая токсичность, набор | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
| Игла 5/8 дюйма, одноразовая, стерильная, 26 G | BD | 305115 | |
| Полиэтиленовая трубка, внешний диаметр 0,61 мм × внутренний диаметр 0,28 мм | Scandidact | SKU252 | |
| Rompin Vet 20 мг/мл (ксилазин) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Лезвия скальпеля | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Ножницы | Fine Science Tools | 91460-11, 14007-14 | |
| Шпатель | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| Стереотаксическая рама | Stoelting | 51600U | |
| Хирургический иглодержатель | AgnTho’s | 12502-12 | |
| Шприцевой насос | Система насосов New Era | NE-4000 | |
| Ксилокаин 20 мг/мл (лидокаин) | AstraZeneca | 158543 |
Ссылки
- Balasubramanian V. Brain power. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118:e2107022118.
- Mattson MP, Arumugam TV. Hallmarks of brain aging: adaptive and pathological modification by metabolic states. Cell Metab. 2018;27:1176-1199.
- Iliff JJ, Wang M, Liao Y, Plogg BA, Peng W, Gundersen GA, et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 2012;4. doi:10.1126/scitranslmed.3003748.
- Nedergaard M. Garbage truck of the brain. Science. 2013;340:1529-1530.
- Benveniste H, Lee H, Volkow ND. The glymphatic pathway: waste removal from the CNS via. cerebrospinal fluid transport. Neuroscientist. 2017;23:454-465.
- Mestre H, Hablitz LM, Xavier AL, Feng W, Zou W, Pu T, et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 2018;7:e40070.
- Iliff JJ, Lee H, Yu M, Feng T, Logan J, Nedergaard M, et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J Clin Invest. 2013;123:1299-1309.
- Benveniste H, Lee H, Ozturk B, Chen X, Koundal S, Vaska P, et al. Glymphatic cerebrospinal fluid and solute transport quantified by MRI and PET imaging. Neuroscience. 2021;474:63-79.
- Eide PK, Ringstad G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: a possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiol Open. 2015;4:2058460115609635.
- Ringstad G, Valnes LM, Dale AM, Pripp AH, Vatnehol SAS, Emblem KE, et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 2018;3:e121537.
- Eide PK, Ringstad G. Functional analysis of the human perivascular subarachnoid space. Nat Commun. 2024;15:2001.
- Xavier ALR, Hauglund NL, von Holstein-Rathlou S, Li Q, Sanggaard S, Lou N, et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. 2018;(135):57378.
- Gahn-Martinez D, Giannetto MJ, Chang E, Beam N, Tobin P, Plá V, et al. Chronic intraventricular cannulation for the study of glymphatic transport. eNeuro. 2025;12:ENEURO.0537-24.2025.
- Decker Y, Müller A, Proulx ST. Contrast agent clearance dynamics and diffusion in the mouse brain after ventricular administration. Adv Sci (Weinh). 2025;12:2501502.
- Zhu Y, Zhu J, Ni C, Chen A, Li L, Gao Y, et al. Impact of infusion conditions and anesthesia on CSF tracer dynamics in mouse brain. Fluids Barriers CNS. 2026;23:23.
- DeVos SL, Miller TM. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. 2013;(75):50326.
- Ding G, Chopp M, Li L, Zhang L, Davoodi-Bojd E, Li Q, et al. MRI investigation of glymphatic responses to Gd-DTPA infusion rates. J Neurosci Res. 2018;96:1876-1886.
- Stanton EH, Persson NDÅ, Gomolka RS, Lilius T, Sigurðsson B, Lee H, et al. Mapping of CSF transport using high spatiotemporal resolution dynamic contrast-enhanced MRI in mice: effect of anesthesia. Magn Reson Med. 2021;85:3326-3342.
- Berger ML, Reither H, Schmid RW, Lassmann H. Manufacture and use of fused silica cannulas for intracerebral injections in freely moving rats. J Neurosci Methods. 1989;27:225-234.
- Zhang J, Tian W, Chen J, Yu J, Zhang J, Chen J. The application of polyetheretherketone (PEEK) implants in cranioplasty. Brain Res Bull. 2019;153:143-149.
- Plá V, Bork P, Harnpramukkul A, Olveda G, Ladrón-de-Guevara A, Giannetto MJ, et al. A real-time in vivo. clearance assay for quantification of glymphatic efflux. Cell Rep. 2022;40:111320.
- Benveniste H, Lee H, Ding F, Sun Q, Al-Bizri E, Makaryus R, et al. Anesthesia with dexmedetomidine and low-dose isoflurane increases solute transport via. the glymphatic pathway in rat brain when compared with high-dose isoflurane. Anesthesiology. 2017;127:976-988.
- Chiu C, Miller MC, Caralopoulos IN, Worden MS, Brinker T, Gordon ZN, et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 2012;9:3.
- Karimy JK, Kahle KT, Kurland DB, Yu E, Gerzanich V, Simard JM. A novel method to study cerebrospinal fluid dynamics in rats. J Neurosci Methods. 2015;241:78-84.
Перепечатки и разрешения
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно