Методическая статья

Детекция антигенов иммунных клеток внутри опухоли в иммунокомпетентной модели стволоподобных клеток глиобластомы с помощью иммуногистохимии на основе субстрата

70 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72193

⸱

21 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании представлен детальный, воспроизводимый рабочий процесс иммуногистохимии на подложке для стабильного обнаружения одиночных и двойных антигенов в срезах опухолевой ткани, полученной из стволовых клеток глиобластомы и фиксированной в формалине и залитой парафином (FFPE). Протокол позволяет идентифицировать различные иммунные и опухолевые маркеры, решая при этом технические сложности, и может быть использован в других моделях опухолей.

Аннотация

Глиобластома (GBM) является наиболее распространенной и летальной первичной злокачественной опухолью головного мозга, для которой отсутствуют эффективные методы терапии. Она характеризуется глубоко иммуносупрессивным микроокружением опухоли, частично обусловленным наличием резистентных к лечению стволоподобных клеток глиобластомы (GSCs). В данной работе мы описываем воспроизводимые протоколы одноцветного и двухцветного иммуногистохимического (ИГХ) анализа на подложке для выявления поверхностных и внутриклеточных антигенов, ассоциированных с инфильтрирующими опухоль иммунными клетками, в формалиново-фиксированных парафиновых (FFPE) срезах опухолей головного мозга. Опухоли мозга были получены из GSCs мышей, которые ортотопически имплантировались иммунокомпетентным мышам. Рабочий процесс одноцветного ИГХ анализа использует хромогенную систему детекции на основе пероксидазы хрена (HRP) для визуализации отдельных антигенов иммунных клеток, тогда как рабочий процесс двухцветного ИГХ анализа использует стратегию последовательного окрашивания на основе щелочной фосфатазы (AP) для одновременного обнаружения двух антигенов иммунных клеток в одном срезе ткани, включая варианты с использованием первичных антител, полученных от одного и того же вида животных. Эти методы обеспечивают практическую и воспроизводимую основу для хромогенного анализа антигенов, ассоциированных с инфильтрирующими опухоль иммунными клетками, в тканях GBM и могут быть адаптированы для других доклинических моделей опухолей и, потенциально, для образцов FFPE человека.

Введение

Глиобластома (GBM) представляет собой агрессивную, высокоинвазивную и гетерогенную первичную злокачественную опухоль головного мозга, характеризующуюся низким уровнем выживаемости пациентов, несмотря на применение современных стандартных методов терапии1. Определяющей особенностью GBM является выраженно иммуносупрессивное микроокружение опухоли (TME), которое способствует развитию резистентности к стратегиям иммунотерапии2,3. Иммуносупрессии при GBM способствуют многочисленные механизмы, включая снижение инфильтрации эффекторными Т-клетками, а также индукцию дисфункции и истощения Т-клеток4. Кроме того, стволоподобные клетки глиобластомы (GSCs), являющиеся субпопуляцией клеток GBM, дополнительно способствуют уклонению от иммунного ответа, поддерживая иммунологически «холодное» TME, которое характеризуется ограниченной цитотоксической иммунной активностью5. Эти особенности подчеркивают важность точной характеристики популяций инфильтрирующих опухоль иммунных клеток и их функциональных состояний в TME при глиобластоме.

Иммуногистохимический анализ (ИГХ) остается одним из наиболее широко используемых методов оценки инфильтрации опухолевых тканей иммунными клетками, поскольку он сохраняет архитектуру ткани, позволяя визуализировать, локализовать и полуколичественно оценить клеточные маркеры in situ6,7,8,9,10,11,12. Предыдущие иммуногистохимические исследования и исследования иммунного профилирования существенно расширили наше понимание иммунного ландшафта GBM и позволили идентифицировать популяции иммунных клеток, связанные с прогрессированием опухоли и ответом на терапию12,13,14,15,16. Одноцветный хромогенный ИГХ особенно полезен для обнаружения отдельных иммунных маркеров в срезах тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE)12,13,15,17,18,19,20. Напротив, двухцветный хромогенный ИГХ позволяет одновременно визуализировать два маркера в одном срезе ткани, что облегчает оценку клеточного фенотипа, пролиферации или состояния активации12,19,21.

Несмотря на эти достижения, количество практических и стандартизированных протоколов хромогенного ИГХ на основе субстратов, применимых к иммунокомпетентным моделям ГБМ, производным от GSC, остается ограниченным. Более того, хромогенный ИГХ при ГБМ представляет собой более сложную задачу, чем при многих других солидных опухолях, из-за редкой и неоднородной инфильтрации иммунными клетками, выраженной интратуморальной гетерогенности, а также высокоиммуносупрессивного и сложного TME, что затрудняет точную визуализацию и интерпретацию нескольких клеточных популяций в одном срезе ткани2,3,4. Двойной хромогенный ИГХ создает дополнительные технические сложности, особенно когда оба первичных антитела получены у одного и того же вида животных; это требует тщательной оптимизации совместимости антител, стратегии последовательного окрашивания для одновременного детектирования двух антигенов в одном срезе ткани и подбора хромогенного субстрата для обеспечения четкой дифференциации маркеров при световой микроскопии.

В данной работе мы описываем воспроизводимые протоколы одно- и двухцветного иммуногистохимического (ИГХ) анализа на основе субстратов, которые позволяют успешно выявлять репрезентативные поверхностные и внутриклеточные антигены, ассоциированные с опухоль-инфильтрующими иммунными клетками, в иммунокомпетентной ортотопической модели ГБМ, производной от 005 GSC22,23,24. Эти хромогенные ИГХ-протоколы на основе субстратов могут быть адаптированы и для других доклинических моделей опухолей, а также потенциально для анализа образцов опухолей человека, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE). Полученные ткани головного мозга мыши фиксировали в 10% нейтральном буферизированном формалине в течение ночи (~12 ч) перед стандартной обработкой тканей и заливкой парафином, как было описано ранее19. Срезы из FFPE-блоков (толщиной 5 µm19) наносили на положительно заряженные предметные стекла и хранили при комнатной температуре до использования. Одноцветный ИГХ-анализ использует хромогенную систему детекции на основе пероксидазы хрена (HRP) с 3,3′-диаминобензидином (DAB) в качестве субстрата для получения коричневого сигнала, позволяющего визуализировать отдельные антигены при помощи световой микроскопии. Данный рабочий процесс подходит для выявления как мембранных, так и внутриклеточных антигенов в срезах тканей FFPE.

Двухцветное иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание позволяет одновременно обнаруживать два антигена в одном срезе ткани, однако оно требует дополнительной оптимизации для обеспечения совместимости антител и четкого разделения хромогенных сигналов. Двухцветное ИГХ-окрашивание относительно просто в реализации, если первичные антитела были получены в разных видах животных, что позволяет использовать видоспецифичные вторичные антитела. Однако одновременное обнаружение становится более сложным с технической точки зрения, если оба первичных антитела получены от одного и того же вида животных. Чтобы решить эту проблему, в описанном здесь рабочем процессе двухцветного ИГХ используется стратегия последовательного хромогенного окрашивания на основе щелочной фосфатазы (AP) с применением различных субстратов, что позволяет четко визуально дифференцировать сигналы двух антигенов при световой микроскопии.

Оба рабочих процесса включают этапы депарафинизации тканей, регидратации, восстановления антигенов, блокировки, окрашивания, дегидратации, просветления и замыкания. Приготовление реагентов имеет решающее значение для качества и воспроизводимости окрашивания (см. Supplementary File 1). Аналогично, надлежащие разведения первичных антител также критически важны для успешного протокола окрашивания; разведение проводится непосредственно перед использованием в 2.5% нормальной сыворотке лошади или козы, в зависимости от вида хозяина соответствующего вторичного антитела (см. Table 1). Список видоспецифичных вторичных антител, используемых для одноцветного и двухцветного окрашивания, также представлен в Table 2. При одноцветном ИГХ применяются реагенты для просветления и замыкания на основе ксилола, тогда как для двухцветного ИГХ требуются альтернативы без ксилола (например, Histo-Clear), поскольку субстрат частично растворим в ксилоле (см. список субстратов в Table 3).

Протокол

Данный протокол был выполнен в соответствии со всеми соответствующими нормативными и институциональными руководствами, включая требования Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) (номера протоколов IACUC: 2004N000067 и LA24-0045).

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько этапов протоколов ИГХ с одним и двумя цветами включают использование легковоспламеняющихся реагентов, в том числе этанола и осветлителей тканей. Соответственно, процедуры с использованием легковоспламеняющихся химических веществ, включая депарафинизацию, регидратацию, дегидратацию, осветление и заключение препарата, следует проводить в сертифицированном химическом вытяжном шкафу с соблюдением надлежащих правил лабораторной безопасности. Легковоспламеняющиеся реагенты должны подготавливаться и храниться в правильно маркированных стеклянных контейнерах с завинчивающимися крышками в специально предназначенных шкафах для хранения легковоспламеняющихся веществ в соответствии с правилами техники безопасности учреждения. Материалы и объемы реагентов рассчитаны на пакетную обработку до 48 предметных стекол (две штативы для окрашивания, по 24 стекла в каждой), хотя рабочий процесс может быть легко масштабирован в соответствии с требованиями эксперимента.

1. Одноцветное ИГХ для срезов опухолей головного мозга, фиксированных в формалине и залитых парафином

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем протоколе описывается одноцветное иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание на основе субстрата для детектирования репрезентативных поверхностных и внутриклеточных антигенов в срезах опухолей головного мозга, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE), полученных из ортотопической модели GSC 005.

  1. Депарафинизация (20 мин):
    1. Поместите предметные стекла в штатив из полиоксиметилена (ПОМ) и погрузите штатив в окрасочные стаканы, сначала в ксилол I, затем в ксилол II, по 10 мин в каждом, работая в вытяжном шкафу. Убедитесь, что срезы тканей полностью погружены в ксилол во время депарафинизации.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Выполняйте этот этап в химическом вытяжном шкафу с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, защитные очки, маску для лица и перчатки. Не допускайте высыхания срезов на этом или любом из последующих этапов, так как это может привести к повреждению тканей и потере срезов. Храните растворы ксилола в герметичных стеклянных контейнерах и используйте их повторно, если они выглядят чистыми.
  2. Постепенная регидратация (15 мин):
    1. Последовательно регидратируйте срезы в 100%, 90% и 70% этаноле по 5 мин в каждом. Для этого погрузите стекла в 100% этанол в окрасочном стакане на 5 мин (затем верните 100% этанол в стеклянный флакон для повторного использования), затем в 90% этанол на 5 мин (затем верните его во флакон) и, наконец, в 70% этанол на 5 мин (затем верните его во флакон).
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Выполняйте этот этап в химическом вытяжном шкафу и используйте СИЗ, как в пункте 1.1. Эти растворы этанола можно использовать повторно в разных экспериментах при условии их хранения в герметичных стеклянных контейнерах и их чистоты.
  3. Промывка водой (5 мин):
    1. Поместите стекла в дистиллированную воду на 5 мин; на этом процесс регидратации завершается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время выполнения этого этапа приготовьте от 600 мл (для 1 штатива) до 800 мл (для 2 штативов) 1× буферного раствора для демаскировки антигенов (10 мМ цитратный натрия буфер) в стеклянном стакане объемом 2 л, подходящем для микроволновой печи, согласно инструкциям, приведенным в Дополнительном файле 1.
  4. Демаскировка антигенов (~20 мин):
    1. Накройте стакан объемом 2 л со свежеприготовленным 10 мМ цитратным натрия буфером для демаскировки антигенов пищевой пленкой, чтобы предотвратить избыточное испарение во время предварительного нагрева и длительного микроволнового нагрева.
    2. Сделайте несколько отверстий в пленке, чтобы буфер не выплеснулся из-за избыточного давления, возникающего при кипении срезов тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте СИЗ, как в пункте 1.1.
    3. Предварительно нагрейте свежеприготовленный 10 мМ цитратный натрия буфер для демаскировки антигенов в течение 3 мин. Поместите штатив с регидратированными срезами тканей в предварительно нагретый раствор для демаскировки антигенов.
    4. Затем нагревайте срезы тканей в микроволновой печи в течение 15 мин на максимальной мощности (например, P10), внимательно наблюдая за стаканом, чтобы срезы оставались погруженными и не высыхали из-за испарения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы демаскировку антигенов можно проводить в пластиковом окрасочном кювете, помещенном в пароварку, примерно в течение 15 мин, что обеспечивает более мягкий метод нагрева и требует меньшего контроля. Цитратный натрия буфер (10 мМ, pH 6.0) был успешно валидирован и использовался в качестве буфера для демаскировки всех первичных антител, перечисленных в Таблице 1. В зависимости от первичного антитела и рекомендаций производителя для антител, не оценивавшихся в данном исследовании, могут потребоваться другие буферы, такие как EDTA или Tris-EDTA. 
  5. Охлаждение (10–20 мин):
    1. Извлеките стакан из микроволновой печи, поставьте его на рабочий стол и дайте ему остыть до комнатной температуры в течение 20 мин. Для ускорения охлаждения поместите стакан в ледяную водопроводную воду примерно на 10 мин.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Стакан будет очень горячим; используйте подходящие термостойкие перчатки или щипцы для стаканов. Используйте СИЗ, как в пункте 1.1.
  6. Промывка фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS) (~10 мин):
    1. Извлеките штатив из стакана и погрузите стекла в 1× раствор DPBS в окрасочном стакане.
    2. Промойте срезы дважды в 1× DPBS по 5 мин, используя осторожную статичную промывку, чтобы избежать отслоения ткани.
  7. Создание гидрофобного барьера (<1 мин/стекло):
    1. Во время промывки DPBS (этап 1.6) осторожно извлекайте каждое стекло по отдельности, аккуратно протирайте область вокруг среза ткани безворсовыми салфетками (например, Kim Wipes), избегая контакта с самой тканью.
    2. Используйте гидрофобный барьер, например, маркер PAP (пероксидаза-антипероксидаза), чтобы нарисовать водоотталкивающий контур вокруг каждого среза ткани, затем верните стекло в раствор DPBS в окрасочном стакане. Повторите эти действия для всех стекол.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрофобный барьер вокруг ткани предотвращает перетекание реагентов между срезами и помогает удерживать антитела на ткани.
  8. Блокирование эндогенной пероксидазы (5 мин):
    1. Слейте 1× DPBS из окрасочного стакана, затем добавьте 3% раствор H₂O₂, убедившись, что стекла или срезы тканей полностью погружены на 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительная инкубация в 3% H₂O₂ может повредить ткань. Блокирование активности эндогенной пероксидазы является критически важным этапом для предотвращения фона, вызванного эндогенной пероксидазой во время проявления цвета. Используйте СИЗ, как в пункте 1.1.
  9. Промывка DPBS (~12 мин):
    1. Слейте 3% раствор H₂O₂ и снова промойте стекла в 1× DPBS дважды по 5 мин.
    2. После второй промывки извлеките стекла из штатива, положите их горизонтально в увлажняющую камеру и добавьте дистиллированную воду по краям камеры.
    3. Не допускайте высыхания срезов, поэтому немедленно переходите к блокированию в пункте 1.10.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая увлажняющая камера, указанная в Таблице материалов, рассчитана на 30 стекол.
  10. Блокирование сывороткой (~70 мин):
    1. Добавьте по 50 µL 5% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) на каждый срез и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре, держа крышку увлажняющей камеры закрытой, чтобы предотвратить испарение блокирующего буфера со срезов тканей.
    2. Через 30 мин осторожно промокните стекла о безворсовые салфетки, разложенные на рабочем столе, чтобы удалить BSA.
    3. Затем добавьте нормальную сыворотку лошади или козы (одна капля на срез) в концентрации 2.5%, соответствующую виду животного-хозяина вторичного антитела, и инкубируйте срезы еще 30 мин при комнатной температуре с закрытой крышкой увлажняющей камеры; аккуратно промокните стекла абсорбирующей бумагой или безворсовыми салфетками, чтобы удалить сыворотку, и немедленно переходите к пункту 1.11.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания срезов. Подготовьте первичные антитела, разведенные в соответствующем блокирующем буфере (см. Таблицу 1), ближе к концу этапа блокирования, чтобы они были готовы к использованию в пункте 1.11 сразу после завершения блокирования.
  11. Инкубация с первичными антителами (~16 ч):
    1. Нанесите ~50 µL первичных антител, оптимально разведенных в соответствующем блокирующем буфере (см. Таблицу 1), на срезы тканей и инкубируйте в течение ночи (~16 ч) при 4 °C в увлажняющей камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что специально отведенные области увлажняющей камеры заполнены дистиллированной водой для поддержания влажности в течение ночи. Кроме того, примите меры, чтобы области/отсеки для предметных стекол с тканями не были заполнены дистиллированной водой, так как это может привести к затоплению срезов тканей.
  12. Промывка DPBS (0.1% Tween 20) (~18–20 мин):
    1. Поместите штатив в окрасочный стакан и заполните его промывочным буфером (1× DPBS, 0.1% Tween 20).
    2. После ночной инкубации извлеките стекла из увлажняющей камеры, удалите первичные антитела, осторожно промокнув стекла абсорбирующей бумагой, затем поместите стекла в штатив, погруженный в промывочный буфер (1× DPBS, 0.1% Tween 20) в окрасочном стакане, и слейте промывочный буфер.
    3. Затем промойте срезы в 1× DPBS (0.1% Tween 20) трижды по 5 мин, после чего извлеките стекла из штатива, положите их горизонтально в увлажняющую камеру и немедленно переходите к пункту 1.13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время каждой промывки может быть увеличено до 10–15 мин, если после проявления цвета в пункте 1.15 наблюдается высокий фоновый сигнал. Промывка должна быть осторожной и статичной (без раскачивания или встряхивания), чтобы предотвратить отслоение ткани от стекол.
  13. Инкубация со вторичными антителами (~32–35 мин):
    1. Добавьте одну каплю на срез соответствующего вторичного антитела, конъюгированного с HRP (антикроличье или антикрысиное IgG, в зависимости от случая; см. Таблицу 2), и инкубируйте срезы тканей в течение 30 мин при комнатной температуре с закрытой крышкой увлажняющей камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичное антитело можно развести 1:1 в PBS для уменьшения фона в пункте 1.15.
  14. Промывка DPBS (0.1% Tween 20) (~18–20 мин):
    1. После инкубации со вторичным антителом извлеките стекла из увлажняющей камеры и осторожно промокните их абсорбирующей бумагой, чтобы удалить вторичные антитела.
    2. Затем поместите стекла в штатив, погруженный в промывочный буфер (1× DPBS с 0.1% Tween 20) в окрасочном стакане, для краткой промывки, и слейте промывочный буфер.
    3. Затем промойте срезы тканей трижды 1× DPBS (0.1% Tween 20) по 5 мин.
      1. Перед началом этапа проявления хромогена (т. е. пункта 1.15) поместите отдельный штатив в окрасочный стакан, заполненный дистиллированной водой, в качестве подготовительного шага к пункту 1.16 для остановки хромогенной реакции.
      2. Во время финальной промывки свежеприготовьте рабочий раствор DAB (1 капля хромогена на 1 мл субстрата; см. Дополнительный файл 1).
  15. Проявление хромогена (30 с–5 мин):
    1. После третьей промывки в пункте 1.14 извлеките стекла из штатива и разложите их горизонтально на рабочем столе на белом фоне.
    2. Нанесите 50 µL рабочего раствора DAB на каждый срез и визуально контролируйте появление коричневого цвета на белом фоне или под световым микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте СИЗ, как в пункте 1.1. Использование белой абсорбирующей бумаги помогает визуализировать развитие коричневого цвета на стадии хромогена DAB. Проявление цвета может занять 20–60 с для одних маркеров и 2–5 мин для других (подробности см. в пункте 1.16).
  16. Остановка реакции (1–2 мин):
    1. Как только появится желаемый коричневый сигнал в пункте 1.15, немедленно остановите реакцию, окунув стекло в стакан с дистиллированной водой, подготовленный в пункте 1.14.3.1.
    2. Промывайте стекла в дистиллированной воде в течение 1 мин. Слейте дистиллированную воду, затем переходите к пункту 1.17 (докрашивание).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стекла могут оставаться в дистиллированной воде до 1 ч без влияния на окрашивание. Время, необходимое для проявления цвета, определяет момент начала этапа остановки реакции. Кроме того, если на одном стекле находится 2–3 маркера (например, CD3, CD4, CD8 или другие), как в данном исследовании, время реакции может различаться; например, в описанной здесь системе проявление цвета обычно занимает около 30 с для CD8+-клеток, 1–3 мин для CD3+ или CD4+-клеток или дольше (3–5 мин) для Granzyme B+ и Ki67+-клеток. Из-за разницы во времени проявления всего стекло нельзя погружать в дистиллированную воду для остановки реакции. Вместо этого останавливайте каждую реакцию индивидуально для каждого среза, добавляя 200–300 µL дистиллированной воды непосредственно на каждый срез.
  17. Докрашивание (<1 мин):
    1. Для усиления контраста с коричневым окрашиванием добавьте разведенный гематоксилин (1:3 в дистиллированной воде) в окрасочный стакан, обеспечив погружение стекол в разведенный гематоксилин примерно на 10–20 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если фон DAB слишком сильный, увеличьте время докрашивания (до 1 мин) или кратковременно используйте неразведенный гематоксилин.
  18. Промывка водопроводной водой (6 мин):
    1. Слейте гематоксилин из окрасочного стакана и верните его в стеклянный флакон для повторного использования.
    2. Промойте стекла в водопроводной воде в течение 1 мин, затем промойте под слабой струей водопроводной воды в течение 5 мин, держа срезы отвернутыми от прямого потока воды. Слейте воду и переходите к пункту 1.19.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные этапы до заключения препарата выполняются в вытяжном шкафу.
  19. Постепенная дегидратация (15–17 мин):
    1. Погрузите стекла в 70% этанол в окрасочном стакане на 5 мин (затем верните 70% этанол в стеклянный флакон для повторного использования), затем в 90% этанол на 5 мин (затем верните его во флакон) и, наконец, в 100% этанол на 5 мин (затем верните его во флакон).
    2. Переходите к пункту 1.20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот этап в химическом вытяжном шкафу. На этом этапе дегидратации используются те же растворы этанола, что и в пункте 1.2, и их можно использовать многократно, если они выглядят чистыми.
  20. Просветление:
    1. Используйте те же растворы ксилола I и II, которые использовались для депарафинизации (пункт 1.1), для очистки срезов тканей/стекол.
    2. Сначала погрузите стекла в раствор ксилола I в окрасочном стакане на 10 мин (затем верните ксилол I в стеклянный флакон для повторного использования), а затем в раствор ксилола II еще на 10 мин.
    3. Держите стекла в ксилоле II до завершения заключения препарата (т. е. пункта 1.21).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не допускайте высыхания срезов на этом этапе, так как высушенные срезы становятся хрупкими; таким образом, при необходимости срезы могут оставаться в ксилоле II дольше перед заключением.
  21. Заключение препарата:
    1. Извлекайте стекла по одному из ксилола II и кладите их горизонтально в химическом вытяжном шкафу. Нанесите одну каплю среды для заключения на основе ксилола на покровное стекло подходящего размера, затем накройте срез ткани покровным стеклом средой вниз.
    2. Осторожно нажмите на покровное стекло большим пальцем, чтобы равномерно распределить среду по всем трем срезам и удалить пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для покрытия трех срезов на одном стекле требуется покровное стекло 24 × 50 мм; для двух срезов — 24 × 40 мм; для одного среза — 24 × 24 мм. Важно завершить заключение в течение 30 с на одно стекло, так как среда для заключения может быстро высохнуть из-за постоянного потока воздуха в вытяжном шкафу, что приведет к быстрому испарению ксилола II со стекла и сделает срезы хрупкими.
  22. Высыхание на воздухе и световая микроскопия:
    1. Высушите стекла на воздухе в вытяжном шкафу в течение не менее 2 ч перед оценкой и визуализацией с помощью светового микроскопа. После высыхания храните заключенные препараты в коробках для стекол при комнатной температуре в течение нескольких лет.

2. Двухцветный ИГХ-анализ срезов опухоли головного мозга, фиксированных в формалине и залитых в парафин (FFPE)

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе описан процесс двухцветного хромогенного ИГХ-анализа на основе субстратов для одновременного обнаружения двух антигенов в одном срезе опухоли мозга, фиксированном в формалине и залитом парафином (FFPE). По сравнению с одноцветным ИГХ, двухцветный метод требует большего времени, так как предполагает последовательные циклы окрашивания с независимыми инкубациями первичных антител, включая этапы инкубации в течение ночи для каждого раунда окрашивания. Тем не менее, этот расширенный рабочий процесс позволяет надежно и одновременно обнаруживать антигены в одном срезе ткани, сохраняя морфологию ткани и обеспечивая четкое разделение хромогенных сигналов при световой микроскопии.

  1. Депарафинизация (20 мин):
    1. Выполните процесс депарафинизации, аналогичный описанному выше для одноцветного ИГХ в шаге 1.1, в вытяжном шкафу, используя при этом просветляющие агенты, не содержащие ксилола (например, Histo-Clear I и Histo-Clear II вместо ксилола).
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Используйте СИЗ, как в шаге 1.1, и выполняйте этот этап в вытяжном шкафу. Рекомендуется использовать Histo-Clear, так как хромоген частично растворим в ксилоле, а обработка без ксилола помогает сохранить интенсивность окрашивания при двухцветном ИГХ. Не допускайте высыхания срезов. Эти просветляющие растворы можно использовать повторно, если они хранятся в герметичных стеклянных контейнерах и выглядят чистыми.
  2. Постепенная регидратация (15 мин):
    1. Аналогично одноцветному ИГХ, как описано в шаге 1.2. Регидратируйте срезы последовательно с постепенным снижением концентрации этанола (100%, 90% и 70%) по 5 мин на каждом этапе.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется отдельный набор ступенчатых растворов этанола без ксилола, так как этанол, использованный для одноцветного ИГХ в шаге 1.2, вероятно, загрязнен Xylene II.
  3. Промывка водой (5 мин):
    1. Аналогично одноцветному ИГХ в шаге 1.3; поместите стекла в дистиллированную воду на 5 мин для завершения процесса регидратации.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогично шагу 1.3; в течение этих 5 мин приготовьте раствор для демаскировки антигенов.
  4. Демаскировка антигенов (~20 мин): Выполните процедуру демаскировки антигенов, аналогичную описанной для одноцветного ИГХ в шаге 1.4.
  5. Охлаждение (10–20 мин): Выполните процесс охлаждения, аналогичный описанному для одноцветного ИГХ в шаге 1.5.
  6. Промывка DPBS (10 мин): Выполните процесс смывания раствора для демаскировки антигенов, как описано для одноцветного ИГХ в шаге 1.6.
  7. Гидрофобный барьер (<1 мин/стекло):
    1. Во время промывки DPBS в шаге 2.6 создайте гидрофобный барьер вокруг срезов ткани, следуя той же процедуре/протоколу, что и в шаге 1.7.
    2. Используйте маркер для гидрофобного барьера, чтобы нарисовать водоотталкивающую границу вокруг каждого среза ткани, затем верните стекло в раствор для промывки DPBS в контейнере для окрашивания. Повторите эти действия для всех стекол.
  8. Блокировка щелочной фосфатазы (5 мин):
    1. После создания гидрофобных барьеров на всех срезах тканей извлеките стекла из контейнера для окрашивания, положите их горизонтально в увлажненную камеру, добавьте по одной капле раствора для блокировки эндогенной щелочной фосфатазы (например, BLOXALL) на срез и инкубируйте срезы в течение 5 мин. Немедленно перейдите к шагу 2.9.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в протоколе двухцветного ИГХ используются вторичные антитела, конъюгированные с AP, крайне важно блокировать активность эндогенной щелочной фосфатазы для снижения фонового сигнала при проявлении красного или синего цвета. Раствор для блокировки BLOXALL используется здесь для ингибирования эндогенной щелочной фосфатазы. Он также ингибирует эндогенную пероксидазу, поэтому данный раствор можно использовать в протоколе одноцветного ИГХ для блокировки активности эндогенной пероксидазы вместо 3% раствора H₂O₂.
  9. Промывка DPBS (10 мин):
    1. Промойте стекла в растворе 1× DPBS в контейнере для окрашивания дважды по 5 мин.
    2. После второй промывки извлеките стекла из контейнера для окрашивания, положите их горизонтально в увлажненную камеру и добавьте дистиллированную воду по краям камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания срезов, поэтому немедленно перейдите к блокировке неспецифического связывания антиген-антитело в шаге 2.10.
  10. Блокировка сывороткой (~70 мин):
    1. Выполните процесс блокировки сывороткой, аналогичный протоколу одноцветного ИГХ в шаге 1.10.
      1. Сначала проведите блокировку универсальным блокирующим буфером (5% BSA; 50 µL/срез) в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем 2,5% нормальной сывороткой лошади (одна капля/срез), соответствующей виду животного-хозяина вторичных антител IgG против кролика, конъюгированных с AP, еще в течение 30 мин при комнатной температуре с закрытой крышкой увлажненной камеры.
      2. По истечении этого времени осторожно промокните стекла абсорбирующей бумагой, чтобы удалить сыворотку, и перейдите к шагу 2.11.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте первичные антитела I (см. Таблицу 1) в течение последней минуты этапа блокировки, как описано в шаге 1.10.
  11. Инкубация с первичными антителами I (~16 ч):
    1. Выполните процесс инкубации с первичными антителами, аналогичный шагу 1.11. Например, добавьте ~50 µL антител кролика к CD3, разведенных 1:100 в 2,5% нормальной сыворотке лошади (см. Таблицу 1), на каждый срез ткани.
    2. Инкубируйте в течение ночи (~16 ч) при 4 °C в увлажненной камере.
  12. Промывка DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 мин):
    1. Выполните ту же процедуру промывки (3 этапа промывки по 5 мин каждый), что и в протоколе одноцветного ИГХ в шаге 1.12.
    2. После третьей промывки положите стекла горизонтально в увлажненную камеру. Немедленно перейдите к шагу 2.13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Примечания такие же, как в шаге 1.12: например, время каждой промывки можно увеличить до 10–15 мин; промывка должна быть бережной и статической. Не допускайте высыхания срезов.
  13. Инкубация со вторичными антителами I (~32–35 мин):
    1. Добавьте по одной капле на срез вторичных антител IgG против кролика, конъюгированных с AP (см. Таблицу 2), и инкубируйте срезы ткани в течение 30 мин при комнатной температуре с закрытой крышкой увлажненной камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела можно развести 1:1 в PBS для снижения фона в шаге 2.15.
  14. Промывка DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 мин):
    1. Выполните ту же процедуру промывки с 1× DPBS/0,1% Tween 20, что и в шаге 1.14.
    2. ПРИМЕЧАНИЕ: Во время последнего этапа промывки свежеприготовьте рабочий раствор субстрата (5 mL, как рекомендовано; см. Таблицу 3) в соответствии с инструкциями производителя (см. приготовление реагентов в Дополнительном файле 1).
  15. Проявление красного цвета (12–15 мин):
    1. После завершения шага 2.14 положите стекла горизонтально на рабочий стол на белый фон, например на белую абсорбирующую бумагу, как описано в шаге 1.15.
    2. Тщательно перемешайте свежеприготовленный рабочий раствор красного субстрата, затем добавьте по 50 µL на каждый срез ткани (остатки раствора удалите).
    3. Инкубируйте срезы ткани при комнатной температуре до появления красного цвета, периодически проверяя результат каждые 2–3 мин на белом фоне или под световым микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для проявления красного цвета, варьируется в зависимости от маркеров и может составлять 20–30 мин. Однако при окрашивании CD3+ клеток в срезах опухоли мозга 005 с использованием системы детекции AP красный цвет обычно проявляется в течение 12–15 мин.
  16. Промывка буфером (5 мин):
    1. Как только в шаге 2.15 появится желаемый сигнал красного цвета, промойте срезы в 1× DPBS/0,1% Tween 20 в течение 5 мин в контейнере для окрашивания.
    2. Во время этой промывки свежеприготовьте первичные антитела II в соответствующем блокирующем буфере (например, антитела кролика к Ki67, разведенные 1:100 в 2,5% нормальной сыворотке лошади; см. Таблицу 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от промывки дистиллированной водой, используемой при одноцветном ИГХ (шаг 1.16), здесь используется DPBS/0,1% Tween 20 не только для остановки реакции, но и для тщательного вымывания избытка хромогена и подготовки к второму циклу окрашивания.
  17. Инкубация с первичными антителами II (~16 ч):
    1. Поместите стекла в увлажненную камеру и добавьте ~50 µL свежеприготовленных антител кролика к Ki67 на каждый срез ткани. Инкубируйте в течение ночи (~16 ч) при 4 °C.
  18. Промывка DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 мин):
    1. Выполните ту же процедуру, что и в шаге 1.12.
    2. После третьей промывки извлеките стекла из контейнера для окрашивания и положите их горизонтально в увлажненную камеру. Немедленно перейдите к шагу 2.19.
  19. Инкубация со вторичными антителами II (~32–35 мин):
    1. Выполните ту же процедуру, что и в шаге 2.13. Добавьте по одной капле на срез антител IgG против кролика, конъюгированных с AP (см. Таблицу 2), и инкубируйте срезы ткани в течение 30 мин при комнатной температуре с закрытой крышкой увлажненной камеры.
  20. Промывка DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 мин):
    1. Выполните ту же процедуру промывки с 1× DPBS/0,1% Tween 20, что и в шаге 1.14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время последнего этапа промывки свежеприготовьте рабочий раствор субстрата (5 mL, как рекомендовано; см. Таблицу 3) в соответствии с инструкциями производителя (см. приготовление реагентов в Дополнительном файле 1).
  21. Проявление синего цвета (10–12 мин):
    1. После завершения шага 2.20 положите стекла горизонтально на рабочий стол на белый фон.
    2. Тщательно перемешайте свежеприготовленный рабочий раствор синего субстрата, затем добавьте по 50 µL на каждый срез ткани (остатки раствора удалите).
    3. Инкубируйте срезы ткани при комнатной температуре до появления синего цвета, периодически проверяя результат каждые 2–3 мин на белом фоне или под световым микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с проявлением красного цвета в шаге 2.15, время проявления синего цвета может составлять 20–30 мин. Однако при окрашивании Ki67+ клеток в срезах опухоли мозга 005 с использованием системы детекции AP синий цвет проявляется в течение 10–12 мин.
  22. Промывка буфером (5 мин):
    1. Как только в шаге 2.21 появится желаемый сигнал синего цвета, погрузите срезы в 1× DPBS/0,1% Tween 20 на 5 мин в контейнере для окрашивания. Удалите промывочный раствор.
  23. Промывка водой (1 мин): Промойте срезы в дистиллированной воде в течение 1 мин. После промывки слейте дистиллированную воду.
  24. Постепенное обезвоживание (15–17 мин):
    1. Погрузите стекла в 70% этанол в контейнере для окрашивания на 5 мин (затем верните 70% этанол в стеклянную бутыль для повторного использования), затем в 90% этанол на 5 мин (затем верните его в бутыль) и, наконец, в 100% этанол на 5 мин (затем верните его в бутыль).
    2. Повторите каждый этап в вытяжном шкафу. Перейдите к шагу 2.25.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе обезвоживания используются те же (безксилольные) растворы этанола из шага 2.2, которые можно использовать многократно, если они выглядят чистыми.
  25. Просветление без использования ксилола:
    1. Используйте те же безксилольные растворы (т. е. Histo-Clear), что и в шаге 2.1, для просветления срезов ткани/стекол.
      1. Сначала погрузите стекла в безксилольный раствор I в контейнере для окрашивания на 10 мин (затем верните безксилольный раствор I в стеклянную бутыль для повторного использования), а затем в безксилольный раствор II еще на 10 мин.
      2. Держите стекла в безксилольном растворе II до завершения заключения (т. е. шага 2.26).
        ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости срезы могут оставаться в безксилольном растворе II дольше для последующего заключения.
        ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Используйте СИЗ, как в шаге 1.1, и выполняйте этот этап в вытяжном шкафу.
  26. Заключение без использования ксилола:
    1. По одному извлекайте стекла из безксилольного раствора II и кладите их горизонтально в вытяжном шкафу. Нанесите одну каплю безксилольной среды для заключения на покровное стекло подходящего размера, затем накройте стекло, чтобы среда для заключения была обращена к срезам ткани.
    2. Осторожно прижмите покровное стекло большим пальцем, чтобы равномерно распределить среду для заключения по всем трем срезам и удалить пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Завершите заключение в течение 30 с на одно стекло, так как среда для заключения может быстро высохнуть. Используйте СИЗ, как в шаге 1.1, и выполняйте этот этап в вытяжном шкафу.
  27. Высушивание на воздухе и световая микроскопия: Высушите стекла на воздухе в вытяжном шкафу в течение не менее 2 ч перед оценкой и визуализацией с помощью светового микроскопа. После высыхания заключенные стекла могут храниться в кассетах для стекол при комнатной температуре в течение многих лет.

Результаты

Иммуногистохимия с одним цветом окрашивания с использованием хромогенной детекции на основе HRP обеспечила чёткое и воспроизводимое окрашивание в срезах парафиновых блоков опухоли головного мозга 005. Представительные изображения окрашивания поверхностных антигенов показаны на рисунке 1, демонстрирующие успешную детекцию маркеров Т-клеток (CD3, CD4, CD8), маркеров ассоциированных с опухолью макрофагов (TAM) (CD68, F4/80) и молекулы иммунных контрольных точек — лиганда программируемой смерти 1 (PD-L1). Во всех случаях положительное окрашивание визуализировали в виде чёткого коричневого хромогенного сигнала с использованием DAB в качестве хромогена, при сохранении морфологии ткани и минимальном фоновом окрашивании, что указывает на совместимость протокола иммуногистохимии с одним цветом окрашивания с различными антигенами, ассоциированными с мембраной.

Применимость протокола иммуногистохимии с одним цветом для выявления внутриклеточных антигенов показана на Рисунке 2. Характерные изображения окрашивания демонстрируют успешное обнаружение транскрипционных, сигнальных, пролиферативных, цитотоксических и апоптотических внутриклеточных маркеров, включая T-bet, FoxP3, фосфорилированный STAT1 (pSTAT1), Ki67, гранзим B и расщеплённый каспазу-3. Как и при окрашивании поверхностных антигенов, выявление внутриклеточных маркеров даёт чёткие коричневые хромогенные сигналы, сохраняя тканевую архитектуру и обеспечивая минимальное неспецифическое фоновое окрашивание (Рисунок 2), что показывает пригодность протокола для обнаружения как поверхностных, так и внутриклеточных антигенов.

Протокол двуцветной иммуногистохимии успешно использовался для одновременного выявления двух антигенов на одном и том же гистологическом срезе с применением последовательной хромогенной детекции на основе щелочной фосфатазы (AP). Как показано на Рисунке 3, совместное окрашивание CD3(красный)/Ki67(синий) и pSTAT1(красный)/CD68(синий), которые указывают на пролиферирующие Т-клетки и макрофаги, подобные М1, соответственно19, обеспечило четко различимые хромогенные сигналы при световой микроскопии, что демонстрирует эффективное одновременное выявление двух антигенов с ясным разделением цветов при использовании последовательного протокола окрашивания. Чтобы дополнительно продемонстрировать универсальность данного подхода двуцветного окрашивания, тот же протокол был успешно применен для совместного выявления нейронального маркера (NeuN в красном цвете) и зеленого флуоресцентного белка (GFP в синем цвете) в срезах опухолей головного мозга, полученных из опухолей 005 GSC, экспрессирующих GFP (Рисунок 4). Колокализация GFP и NeuN, вероятно, указывает на то, что 005 GSC дифференцируются в зрелые фенотипы, экспрессирующие нейрональный маркер NeuN21.

Изображения в Рисунок 1, Рисунок 2и Рисунок 3 представительны для четырёх независимых опухолей, по одному срезу на опухоль для всех окрашенных антигенов иммунных клеток, за исключением изображения F4/80, которое представляет две независимые опухоли, и изображения PD-L1, которое представляет три независимые опухоли, с двумя срезами как для F4/80, так и для PD-L1. Изображение на Рисунок 4 представляет собой один срез опухоли. Поскольку для последовательного окрашивания двух антигенов (например, CD3) использовали протокол двойного иммуногистохимического анализа+ и Ki67+, или CD68+ и pSTAT1+) на одном и том же участке ткани в двух–четырёх независимых опухолях и дополнительно подтверждено совместным окрашиванием GFP+ и NeuN+ клетки, эти результаты подтверждают воспроизводимость применения протокола двойной ИГХ. Аналогично, протокол одинарной ИГХ был успешно применён к 12 независимым антигенам иммунных клеток, что демонстрирует его широкую применимость в описанных здесь условиях окрашивания.

В совокупности эти типичные результаты показывают, что описанные основанные на субстратах одно- и двухцветные протоколы ИГХ обеспечивают практичные и воспроизводимые методы выявления широкого спектра поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах ФФПЭ ГМБ.

Иммуногистохимия иммунных маркеров CD3, CD4, CD8, CD68, F4/80, PD-L1, изображения под микроскопом.
Рисунок 1: Иммуногистохимия (ИГХ) в один цвет для поверхностных антигенов. Иммуногистохимическая окраска одного цвета (коричневого) на основе субстрата для поверхностных антигенов Т-клеток, инфильтрирующих опухоль (CD3)+, CD4+и CD8+), опухолеассоциированные макрофаги (CD68+ и F4/80+) и молекулу иммунных контрольных точек — лиганд программируемой смерти 1 (PD-L1)+с использованием системы детекции на основе пероксидазы хрена (HRP) в срезах опухоли головного мозга у мышей, полученных из стволовоподобных клеток глиобластомы (GSC) (подробности см. в разделе 1 протокола). Представлены типичные изображения иммуногистохимии (увеличение 10× для CD3, CD4 и CD8; увеличение 20× для CD68, F4/80 и PD-L1). Положительно окрашенные клетки окрашены в коричневый цвет. Масштабные бары = 100 μμm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Маркеры иммуногистохимии T-bet, FoxP3, p-STAT1, Ki67, GranB, CC3 в срезах ткани
Рисунок 2: Иммуногистохимия (ИГХ) в один цвет для внутриклеточных антигенов. Иммуногистохимическое окрашивание с использованием субстрата одного цвета (коричневого) для выявления внутриклеточного транскрипционного фактора (T-bet)+ и FoxP3+), сигнализация (pSTAT1+), пролиферативный (Ki67+), цитотоксический (гранзим B+, GranB) и апоптотических (расщепленный каспаз-3+, маркеры CC3) в срезах опухоли головного мозга с использованием системы детекции на основе пероксидазы хрена (HRP) в срезах мышиной глиобластомы, полученной из стволовоподобных клеток глиобластомы (GSC) (см. подробности в разделе 1 протокола). Представлены типичные изображения ИГХ (увеличение 10× для FoxP3, GranB и CC3; увеличение 20× для T-bet, pSTAT1 и Ki67). Положительные клетки окрашены в коричневый цвет. Масштабные линейки = 100 μμm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Гистологический анализ, маркеры CD3/Ki67 и pSTAT1/CD68, изображение под микроскопом, исследование пролиферации клеток.
Рисунок 3: Двухцветная иммуногистохимия (ИГХ) для пролиферирующих опухоле-инфильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ) и похожих на М1 опухоле-ассоциированных макрофагов (ОАМ). Двойное иммуногистохимическое окрашивание на основе субстрата (красное/синее) для CD3+(красный)/Ki67+(синие) пролиферирующие Т-клетки, инфильтрирующие опухоль, и pSTAT1+(красный)/CD68+(синие) макрофаги, подобные М1, с использованием системы детекции на основе щелочной фосфатазы (AP), на срезах опухоли глиобластомы у мышей, полученных из клеток-стаблей глиобластомы (GSC) (см. подробности в разделе 2 протокола). Представлены типичные изображения иммуногистохимии (увеличение 20×). На верхнем изображении — CD3+ клетки окрашены в красный цвет, Ki67+ клетки окрашены в синий цвет, а несколько колокализованных клеток обозначены чёрными стрелками. Аналогично, на нижнем изображении — pSTAT1+ окрашивают клетки в красный цвет, CD68+ клетки окрашены в синий цвет, а несколько ко-локализованных клеток указаны чёрными стрелками. Масштабные бары = 100 μμm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

окрашенная по NeuN/GFP ткань, опухоль против неопухолевой ткани, изображение под микроскопом, анализ клеточной дифференцировки
Рисунок 4: Двухцветная иммуногистохимия (ИГХ) для нейрональных клеток и положительных по зеленому флуоресцентному белку (GFP)+) клетки, подобные стволовым клеткам глиобластомы (GSCs). Двухцветное (красное/синее) иммуногистохимическое окрашивание на основе субстрата для NeuN+(красный)/GFP+(синий) с использованием системы детекции на основе щелочной фосфатазы (AP) на срезах опухоли головного мозга мышей, полученных из стволовоподобных клеток глиобластомы (GSC) (см. подробности в разделе 2 протокола). Представлен типичный образец иммуногистохимического окрашивания (увеличение 20×). NeuN+ (нейрональный маркер) окрашены в красный цвет, GFP+ (экспрессирующие 005 GSCs) окрашены в синий цвет, а несколько колокализованных клеток обозначены чёрными стрелками. Масштабная линейка = 100 μμm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Первичное антитело противКаталожный номерПоставщикРабочее разведениеБуфер разведения**Вид хозяинаСоответствующее вторичное антитело
CD3eab5690Abcam1:100Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
CD414-9766-80eBioscience1:200Козий сыворотокКрысаАнти-крысиный IgG
CD68ab125212Abcam1:100Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
CD8a14-0808-80eBioscience1:100Козий сыворотокКрысаАнти-крысиный IgG
Сплайсированный каспаз-39661CST1:100Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
F4/80ab111101Abcam1:100Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
FoxP3ab54501*Abcam1:450Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
GFPab183734Abcam1:200Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
Гранзим Bab4059Abcam1:150Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
Ki67ab16667Abcam1:100Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
NeuN24307CST1:400Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
PD-L1ab205921Abcam1:400Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
pSTAT19167CST1:100Конский сыворотокКроликАнти-кроличий IgG
T-betab91109Abcam1:100Конский сыворотокМышьАнти-мышиный IgG

Таблица 1: Список первичных антител. Первичные антитела, использованные в данном исследовании, вместе с их источниками, оптимизированными рабочими разведениями, рекомендованными буферами для разведения, видами-хозяевами и соответствующими вторичными антителами для иммуногистохимического окрашивания в один и два цвета.

Конъюгированные вторичные антителаНомер по каталогуВид хозяинаКоличество на образецПоставщик
HRP антитела к крысиному IgGMP-7444-15КозаОдна капля (недилуированные)Vector Laboratories
HRP антитела к кроличьему IgGMP-7401Лошадь
HRP антитела к мышиному IgGMP-7402-15Лошадь
AP антитела к крысиному IgGMP-5404-15Коза
AP антитела к кроличьему IgGMP-5401Лошадь

Таблица 2: Список вторичных антител. Реагенты для детекции второго уровня, оптимизированные для одно- и двухцветных протоколов иммуногистохимии, включая конъюгаты с ферментами (HRP или AP), виды животных-продуцентов, рекомендуемые объёмы применения и информацию о поставщиках.

СубстратФермент детекцииСостав буфераФормулировка реагентаВремя инкубацииПримечания
Вектор БлюЩелочная фосфатаза100 мМ Tris-HCl, рН 8,2–8,5, 0,1 % Tween 202 капли (80 µL) Реагент 1 + 2 капли (80 µL) Реагент 2 + 2 капли (45 µLРеагент 320–30 минДля двойного иммуногистохимического окрашивания синим; частично растворим в ксилоле; рекомендуются реагенты и среды для заключения без ксилола
Vector RedЩелочная фосфатаза 100 мМ Tris-HCl, рН 8,2–8,5, 0,1 % Tween 202 капли (80 µL) Реагент 1 + 2 капли (80 µL) Реагент 2 + 2 капли (80 µLРеагент 320–30 минДля двойного иммуногистохимического окрашивания красным
DAB Пероксидаза хреновая Буфер субстрата, предоставленный производителем1 капля хромогена добавляется к 1 мл субстрата ДАБПеременная величина (см. шаг 2.16)Дает коричневое окрашивание; канцероген, обращаться в соответствии с правилами безопасности

Таблица 3: Список хромогенных субстратов. В данной таблице приведены хромогенные субстраты, используемые для одинарной и двойной иммуногистохимии, включая совместимые детектирующие ферменты, способы приготовления и состав, время инкубации, а также важные рекомендации по обращению для оптимального развития хромогенного сигнала.

Дополнительный файл 1: Приготовление реагентов, буферов и субстратов. В этом файле приведены сведения о приготовлении, хранении и важных аспектах обращения со всеми реагентами, буферами, растворами для блокировки и хромогенными субстратами, используемыми в протоколах одно- и двухцветной иммуногистохимии.Нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В данной работе описывается детальный и воспроизводимый рабочий процесс субстратного хромогенного ИГХ-анализа для одно- и двухцветного детектирования поверхностных и внутриклеточных антигенов в FFPE-образцах тканей опухоли мозга, полученных из ортотопической модели GSC. Основной целью данного исследования являлась методологическая разработка практического пошагового протокола для надежного хромогенного детектирования антигенов в тканях GBM иммунокомпетентных животных.

Хромогенный иммуногистохимический анализ (ИГХ) остается широко используемым методом оценки клеточных маркеров в тканях, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE), поскольку он сохраняет архитектуру ткани, позволяя при этом пространственно локализовать антигены внутри микроокружения опухоли (TME)15,16. Воспроизводимое хромогенное окрашивание требует тщательной оптимизации множества технических параметров, включая демаскировку антигенов, условия блокировки, концентрацию антител, время проявления хромогена, а также правила обращения с тканью во время окрашивания и заключения в препарат. Незначительные отклонения на этих этапах могут привести к потере ткани, слабой интенсивности сигнала, избыточному фоновому окрашиванию или плохому сохранению морфологии. В данном протоколе рассматриваются распространенные технические проблемы и предоставляются подробные процедурные рекомендации для повышения единообразия и воспроизводимости окрашивания.

При использовании рабочего процесса одноцветного ИГХ репрезентативное окрашивание продемонстрировало успешное детектирование широкого спектра мембрано-ассоциированных и внутриклеточных антигенов, включая маркеры Т-клеток, маркеры, ассоциированные с макрофагами, молекулы иммунных контрольных точек, сигнальные белки, маркеры пролиферации и антигены, ассоциированные с апоптозом. Эти репрезентативные результаты подтверждают применимость данного протокола для детектирования различных классов антигенов в тканях ГБМ, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE), с использованием стандартной хромогенной системы детектирования на основе HRP.

Распространенной технической проблемой при проведении двойного хромогенного ИГХ является одновременное обнаружение двух антигенов в случаях, когда оба первичных антитела были получены в одном и том же виде хозяина, что может затруднить совместимость антител и дискриминацию сигналов. Для решения этой задачи мы разработали протокол последовательного двухцветного окрашивания на основе щелочной фосфатазы (AP) с использованием различных хромогенных субстратов, которые обеспечивают четкое визуальное разделение сигналов антигенов при световой микроскопии.

Репрезентативное совместное окрашивание на CD3/Ki67 и pSTAT1/CD68 продемонстрировало успешное одновременное обнаружение антигенов в одном и том же срезе ткани. Дополнительное применение данного рабочего процесса для совместного окрашивания на NeuN/GFP дополнительно подтверждает универсальность протокола последовательного двухцветного окрашивания за пределами анализа иммунных маркеров. Количественная оценка двухцветного ИГХ-окрашивания может быть проведена с помощью ручного подсчета или цифрового анализа изображений. Общие показатели включают количество или процент одиночно- и дважды положительных клеток, а также их распределение внутри опухоли. При использовании цифрового анализа рекомендуется применять единообразное определение пороговых значений и выбор областей анализа для обеспечения воспроизводимости результатов.

Для получения надежных результатов окрашивания при использовании протокола одноцветного ИГХ следует включить отрицательный контроль без добавления первичного антитела. Этот контроль не должен давать хромогенного сигнала в процессе проявления субстрата (этап 1.15), что подтвердит специфичность процедуры окрашивания. Для протокола двухцветного ИГХ рекомендуется использовать дополнительные отрицательные контроли, исключая первичный антитело I (этап 2.11), первичный антитело II (этап 2.17) или оба первичных антитела. Поскольку оба первичных антитела получены от одного и того же вида животных, данные контроли позволяют убедиться, что второе антикроличье вторичное антитело (этап 2.19) не распознает остаточное первичное антитело из первого цикла окрашивания, а также помогают исключить перенос или неспецифический хромогенный сигнал.

Хотя репрезентативные изображения, приведенные в данном протоколе, демонстрируют оптимальные результаты окрашивания, пользователи могут периодически сталкиваться с субоптимальными результатами, включая слабый или отсутствующий хромогенный сигнал, избыточное фоновое окрашивание, неравномерное окрашивание среза ткани или низкое соотношение сигнал/шум. Такие результаты обычно связаны с недостаточным демаскированием антигенов, субоптимальной концентрацией антител, недостаточным блокированием, чрезмерным проявлением хромогенного субстрата или высыханием ткани в процессе окрашивания. Эти проблемы, как правило, можно выявить путем сравнения с соответствующими положительными и отрицательными контролями и устранить путем оптимизации условий демаскирования антигенов, разведения антител, этапов блокирования, процедур промывки и времени инкубации с хромогеном, как описано в данном протоколе.

Одним из ограничений данного исследования является то, что применимость одно- или двухцветной ИГХ была продемонстрирована на репрезентативных срезах тканей одной и той же модели опухоли, а не была систематически применена к нескольким моделям опухолей или стадиям прогрессирования опухоли. Однако это ограничение не влияет на основную цель исследования, которая заключалась в разработке и документировании воспроизводимого методологического рабочего процесса для субстратной одно- и двухцветной хромогенной ИГХ. По сравнению с иммунофлуоресценцией, хромогенная ИГХ совместима с рутинной микроскопией в светлом поле, лучше сохраняет морфологию тканей и в меньшей степени подвержена влиянию аутофлуоресценции тканей. Хотя данный протокол был оптимизирован для ортотопической модели ГБМ, производной от иммунокомпетентных GSC, он может быть адаптирован для других доклинических моделей опухолей и, при оптимизации под конкретные маркеры, для образцов опухолей человека, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE). Интеграция с платформами цифровой патологии и анализа изображений может дополнительно расширить возможности этого метода для полуколичественного анализа тканей.

Раскрытие информации

S.D.R. является соавтором патентов, касающихся онколитических вирусов простого герпеса, которыми владеют и управляют Джорджтаунский университет и Массачусетский госпиталь общего профиля и по которым были получены роялти от компаний Amgen и Acti\Vec Inc.; также S.D.R. выступал в качестве консультанта и получал гонорары от компаний Replimune, Cellinta и Greenfire Bio, а также гонорары и доли в капитале от EG 427. Остальные авторы заявляют, что данная рукопись была подготовлена в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

D.S. частично поддерживался фондом Колледжа науки и технологий Сельскохозяйственного и технического государственного университета Северной Каролины (NCA&T), грантом для преподавателей (GRADS-4C) в NCA&T, а также грантом NIH (1R16NS147983-01). Аналогичным образом, S.D.R. частично поддерживался кафедрой нейробиологии имени Томаса А. Паппаса, а R.H.N. — грантом NIH (1R35GM153737). Мы благодарим доктора Индера Верму и доктора Ясуши Соду за предоставление GSC линии 005.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
стеклянные бутыли объемом 2 л CorningCORN1395-2LИспользуется для приготовления и хранения 10× ДПФС, 1× ДПБС, дистиллированная вода и цитратный буфер натрия
стакан Pyrex объемом 2 л Corning1000-2LИспользуется для восстановления антигенов с помощью микроволнового излучения в натрий-цитратном буфере (600–рабочий объем 800 мл)
2,5% нормальная сыворотка лошади или нормальная сыворотка козыЭти реагенты поставляются в комплекте со вторичными антителами от Vector Laboratories. Они используются для видоспецифического блокирования и разведения антител в зависимости от вида животного-хозяина вторичного антитела (антикроличьи или антикрысиные IgG) для минимизации неспецифического связывания и фонового окрашивания.
30% перекись водорода (H2О2)Fisher ScientificBP2633500
стеклянные флаконы объемом 500 млVWR InternationalVWRU10754-818Используется для приготовления и хранения легковоспламеняющихся реагентов для одноцветного ИГХ и безксилольных реагентов для двухцветного ИГХ
Абсорбирующая лабораторная бумага с салфетками KimwipesИспользуется в ходе процедур окрашивания для удаления избытка антител или промывочного раствора из срезов тканей перед последующими инкубациями, что позволяет минимизировать перенос реагентов и перекрестное загрязнение.
Анти-CD3eAbcamab5690
анти-CD4 eBioscience14-9766-80
Анти-CD68Abcamab125212
анти-CD8a eBioscience14-0808-80
Антитела к расщепленной каспазе-3CST9661
антитела к F4/80Abcamab111101
Анти-FoxP3Abcamab54501
Антитела к GFPAbcamab183734
Антитела к гранзиму BAbcamab4059
Анти-Ki67Abcamab16667
анти-NeuNCST24307
анти-PD-L1Abcamab205921
Анти-pSTAT1CST9167
анти-T-betAbcamab91109
ЩФ анти-кроличьи IgGVector LaboratoriesMP-5401
Щелочная фосфатаза (ЩФ) анти-крысиные IgGVector LaboratoriesMP-5404-15
блокирующий раствор BLOXALLVector LaboratoriesSP-6000-100Используется преимущественно в двухцветном иммуногистохимическом анализе для ингибирования активности эндогенной пероксидазы и щелочной фосфатазы
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Bioworld22070007-2Используется для приготовления 5% универсального блокирующего буфера для снижения неспецифического связывания
постоянныйmounting-реагент Cytoseal 60 Науки об электронной микроскопии18006Среда для заключения образцов, совместимая с ксилолом, используемая для одноцветного иммуногистохимического анализа
Субстрат и хромоген DABDAKOK346811-2Используется для одноцветного хромогенного детектирования на основе HRP. Приготовьте непосредственно перед использованием, добавив 1 каплю хромогена к 1 мл субстрата DAB в соответствии с инструкциями производителя.’согласно инструкциям. Неиспользованный рабочий раствор следует утилизировать после приготовления. DAB является потенциальным канцерогеном, поэтому работа с ним должна осуществляться в соответствии с институциональными правилами биологической и химической безопасности.
Дистиллированная водаИспользуется для приготовления реагентов, промывки и приготовления буферных растворов. Также может быть использована ультрачистая вода или вода Milli-Q.
DPBS (фосфатно-солевой буфер Ханкса-Дульбекко)’фосфатно-солевым буферным раствором) Corning55-031-PC
Этанол, 100% Decon Labs2701
Предметные стекла для микроскопа Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15Положительно заряженные предметные стекла для срезов тканей
Стеклянные покровные стеклаCorning или Millipore SigmaСледует выбрать подходящий размер в зависимости от количества срезов ткани на одном предметном стекле. Распространенные размеры включают: 24 мм × 24 мм (один срез ткани), 24 мм × 40 мм (два среза ткани), 24 мм × 50 мм (три среза ткани)
ГематоксилинFisher Scientific220-102
Histo-Clear (1 л)Electron Microscopy Sciences64111-01Безксилольный просветляющий агент, используемый для двухцветного ИГХ. Подготовьте два флакона объемом 500 мл с маркировкой Histo-Clear I и Histo-Clear II
HRP-конъюгированные антитела к IgG мышиVector LaboratoriesMP-7402-15
анти-кроличьи IgG с HRPVector LaboratoriesMP-7401
анти-rat IgG с HRPVector LaboratoriesMP-7444-15
Камеры увлажнения Stellar ScientificHS-120879Для инкубации срезов ткани с первичными и вторичными антителами
Маркер для создания гидрофобного барьера (PAP-маркер)Vector LaboratoriesH-4000Используется для создания водоотталкивающего барьера вокруг срезов ткани с целью удержания антител и реагентов во время инкубации и предотвращения перекрестного загрязнения нескольких срезов ткани на одном предметном стекле
салфетки KimwipesKimtech Science34155Используется для осторожного удаления остатков реагентов и промывочного буфера со срезов тканей
Магнитная мешалка IKAI-10001529Для приготовления стоковых растворов цитрата натрия и DPBS
Микроволновая печьPanasonic (модель: NN-L931BF)SN: 6H61050036объем 2,2 кубических фута. Требуется для термической демаскировки антигенов с использованием стеклянного стакана объемом 2 л
Световой микроскоп Nikon NikonSN: 707798Nikon Eclipse Ci-L серийный номер: 707798, световой модуль Sola light engine 5M5-LCR-VA серийный номер: 11787, программное обеспечение: NIS Elements BR 4.60.00 &ПО NIS Elements BR Analysis 4.60.00, Камеры: Nikon DS-Fi3 серийный номер: 110865 (цветная) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (ч/б)
pH-метр VWR International77619-152Для корректировки pH буфера для восстановления антигенов
Пищевая пленкаFisher Scientific01810Используется для неплотного накрытия буфера для восстановления антигенов во время нагрева в микроволновой печи с целью минимизации испарения и предотвращения высыхания ткани
Кассеты для предметных стекол из полиоксиметилена (ПОМ) MopecSP234Совместим с вышеупомянутыми контейнерами для окрашивания; каждая кассета вмещает до 24 предметных стекол
Аналитические весы Mettler Toledo30697420Для взвешивания цитрата натрия и порошка DPBS
ХолодильникThermo ScientificTSG3005CAДля хранения термолабильных реагентов и антител
Боксы для хранения предметных стеколFisher Scientific22-267294
Контейнеры/кюветы для окрашивания MopecSP233В каждый контейнер помещается одна стойка для окрашивания на 24 предметных стекла
Магнитные мешалки Fisher Scientific14-512-128Для приготовления стоковых растворов цитрата натрия и ДПБС (фосфатно-солевого буфера с декстрозой)
Цитрат натрия тригидрат Химические реактивы Thermo ScientificAA3643936
Tween 20 Thermo ScientificAAJ20605AP
постоянный закрепляющий среду VectaMount PT Vector LaboratoriesH-5600-60Безксилоловая среда для постоянного заключения, используемая для двухцветного ИГХ-анализа
Набор субстрата щелочной фосфатазы Vector Blue Vector LaboratoriesSK-5300Используется для проявления синего хромогенного сигнала при двухцветном иммуногистохимическом (ИГХ) анализе с использованием щелочной фосфатазы (ЩФ). Поскольку Vector Blue частично растворим в ксилоле, в рабочих процессах двухцветного окрашивания необходимо использовать безксилольные просветляющие агенты и среды для заключения препаратов.
Набор субстрата для щелочной фосфатазы Vector RedVector LaboratoriesSK-5100Используется для проявления красного хромогенного сигнала при двухцветном иммуногистохимическом анализе с использованием щелочной фосфатазы
Ксилол (1 л) StatLab8400-1Используется в качестве агента для депарафинизации и просветления при одноцветном иммуногистохимическом анализе (ИГХ). Подготовьте два флакона по 500 мл с надписями «Ксилол I» и «Ксилол II».

Ссылки

  1. Sipos D, et al. Glioblastoma: Clinical presentation, multidisciplinary management, and long-term outcomes. Cancers (Basel). 2025;17(1):146.
  2. Himes BT, et al. Immunosuppression in glioblastoma: Current understanding and therapeutic implications. Front Oncol. 2021;11:770561.
  3. Lin H, et al. Understanding the immunosuppressive microenvironment of glioma: mechanistic insights and clinical perspectives. J Hematol Oncol. 2024;17(1):31.
  4. Puviindran BJ, et al. Within and beyond the tumor: Mechanisms of glioblastoma-induced immunosuppression. Neurooncol Adv. 2025;7(Suppl 4):iv4-iv18.
  5. He J, Yan X, Hu S. Glioma stem cells: drivers of tumor progression and recurrence. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):293.
  6. Dharmapuri S, et al. Multiplexed immunohistochemical analysis of the immune microenvironment of biliary tract cancers pre- & post-neoadjuvant chemotherapy: case series. Ann Transl Med. 2024;12(4):78.
  7. Hatogai K, et al. Comprehensive immunohistochemical analysis of tumor microenvironment immune status in esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(30):47252-64.
  8. Liu X, et al. Spatial heterogeneity of infiltrating immune cells in the tumor microenvironment of non-small cell lung cancer. Transl Oncol. 2024;50:102143.
  9. Kazama A, et al. Tumor-infiltrating immune cell status predicts successful response to immune checkpoint inhibitors in renal cell carcinoma. Sci Rep. 2022;12(1):20386.
  10. Park DH, Kim YZ. Simple analysis using immunohistochemical staining for tumor-infiltrating lymphocytes in brain metastasis of small cell lung cancer. J Neurointensive Care. 2024;7(2):49-55.
  11. Bogajewska-Rylko E, et al. When is immunohistochemistry useful in assessing tumor necrotic tissue? Anticancer Res. 2021;41(1):197-201.
  12. Saha D, Rabkin SD. Immunohistochemistry for tumor-infiltrating immune cells after oncolytic virotherapy. Methods Mol Biol. 2020;2058:179-90.
  13. Saha D, et al. combinatorial effects of VEGFR kinase inhibitor Axitinib and oncolytic virotherapy in mouse and human glioblastoma stem-like cell models. Clin Cancer Res. 2018;24(14):3409-22.
  14. Li M, et al. Characterization and oncolytic virus targeting of FAP-expressing tumor-associated pericytes in glioblastoma. Acta Neuropathol Commun. 2020;8(1):221.
  15. Bommareddy PK, et al. Oncolytic herpes simplex virus expressing IL-2 controls glioblastoma growth and improves survival. J Immunother Cancer. 2024;12(4):e008880.
  16. Chernov A, Chutko A, Alaverdian D, Kashuro V, Galimova E. Chemotherapy sensitivity of primary glioblastoma cells and immunohistochemical markers to predict survival of patients with glioblastoma. Clin Transl Oncol. 2026;28(3):974-85.
  17. Saha D, Rabkin SD, Martuza RL. Temozolomide antagonizes oncolytic immunovirotherapy in glioblastoma. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000345.
  18. Jahan N, Talat H, Alonso A, Saha D, Curry WT. Triple combination immunotherapy with GVAX, anti-PD-1 monoclonal antibody, and agonist anti-OX40 monoclonal antibody is highly effective against murine intracranial glioma. Oncoimmunology. 2019;8(5):e1577108.
  19. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Macrophage polarization contributes to glioblastoma eradication by combination immunovirotherapy and immune checkpoint blockade. Cancer Cell. 2017;32(2):253-67.e5.
  20. Lu L, Saha D, Martuza RL, Rabkin SD, Wakimoto H. Single agent efficacy of the VEGFR kinase inhibitor axitinib in preclinical models of glioblastoma. J Neurooncol. 2015;121(1):91-100.
  21. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Oncolytic herpes simplex virus immunovirotherapy in combination with immune checkpoint blockade to treat glioblastoma. Immunotherapy. 2018;10(9):779-86.
  22. Marumoto T, et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 2009;15(1):110-6.
  23. Cheema TA, et al. Multifaceted oncolytic virus therapy for glioblastoma in an immunocompetent cancer stem cell model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(29):12006-11.
  24. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Curing glioblastoma: oncolytic HSV-IL12 and checkpoint blockade. Oncoscience. 2017;4(7-8):67-9.

Перепечатки и разрешения

Теги

Стволовые клетки глиобластомымикроокружение опухолипротокол иммуногистохимического анализахромогенная детекциядвухцветный ИГХ-анализFFPE-образцы опухоли головного мозгаопухоль-инфильтрирующие иммунные клеткиортотопическая имплантацияокрашивание с использованием щелочной фосфатазы

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.