Окислительно-отзывчивые, поверхностно-усиленные рамановские микроиглы для мониторинга акупунктурных реакций у крыс с нарушенной толерантностью к глюкозе

Краткое содержание

В этом исследовании на крысах представлена активная микроигла с эффектом редокс-чувствительного к поверхности с усиленным раманским рассеянием (SERS) для одновременного вмешательства в акупунктуру и рациометрического отслеживания индексов SERS, связанных с локальной окислительной способностью и редокс-потенциалом у крыс с нарушенной толерантностью к глюкозе.

Аннотация

Нарушение толерантности к глюкозе (IGT) связано с нарушением окислительно-окислительного гомеостаза и повышенным окислительным стрессом, однако динамическое отслеживание in vivo изменений, связанных с редокс-окислением во время вмешательства с акупунктурой, остаётся технически сложным. В этом исследовании была разработана активная микроигла с усиленным поверхностным рассеянием (SERS) для одновременного вмешательства в акупунктуру и относительного рациометрического отслеживания индексов SERS, связанных с окислительной ёмкостью (OC) и редокс-потенциалом (RP), у крыс с IGT. Окислительно- и окислительно-чувствительные SERS-зонды были подготовлены путём функционализации золотых нанооболочек (GNS) с p-фениледиамином (p-PDA) для реактивности на OC и антрахинона для реакции на RP соответственно. Зонды загружались в две травленные канавки на иглоукалывающих иглах для создания активных микроигл с SERS. В этом исследовательском исследовании использовались самцы Спрага–Доули без специфических патогенов. Три крысы выступали в качестве нормальной контрольной группы, а 20 крыс получали пищу с высоким содержанием жиров и вводили стрептозотоцин (STZ) для индуцирования ИГТ. После скрининга 18 подходящих крыс с IGT были разделены на группы с высоким содержанием жиров и нормальной диеты, по 9 крыс в каждой диете. Каждая диетическая группа дополнительно делилась на подгруппы с акупунктурным точечным скручиванием, скручиванием без акупунктурного участка и с прямым вставлением акупунктурной точки, по 3 крысы в каждой подгруппе. Иглообработка проводилась дважды в день в течение 7 дней подряд, при этом были зафиксированы показатели глюкозы натощак (FPG), 2 часа после обедения (2hPG), а также OC- и RP-связанные SERS-индексы. Результаты показали, что иглоукалывание в точках акупунктуры с скручиванием связано с более низкими значениями FPG и 2hPG, а также изменёнными OC- и RP-связанными SERS-индексами в этой модели крыс IGT. Поскольку внешние калибровочные кривые, независимые биохимические окислительно-стрессовые анализы, тесты на выщелачивание зондов и анализы биосовместимости не включались, отношения SERS следует интерпретировать как относительные оптические индексы, связанные с редокслированием, а не как абсолютные биохимические концентрации или абсолютные значения редокс-потенциала. Эти результаты подтверждают возможность использования микроигл с активным SERS как исследовательской доклинической платформы для сочетания акупунктурного вмешательства с локальным ратиометрическим отслеживанием SERS у крыс с IGT.

Введение

Нарушение толерантности к глюкозе (IGT), снижение способности организма переносить глюкозу, представляет собой переходную стадию между нормальным уровнем глюкозы в крови и^{диабетической 1}. Таким образом, IGT является ключевым сигналом раннего предупреждения и обратимым этапом развития сахарного^{диабета 2 типа.} Клинические данные показывают, что примерно 30% населения с ИГТ перейдут в диабет 2 типа в течение 5–10^{лет 3}; однако при своевременном вмешательстве этот процент можно снизить до менее чем 10%⁴.

ИГТ — динамический и сложный процесс, и устойчивая среда с высоким уровнем глюкозы является ключевым триггером для нарушений окислительного^{метаболизма 5}. Когда организм находится в длительном состоянии гипергликемии, митохондриальная дыхательная цепь функционирует аномально, и скорость генерации реактивных видов кислорода увеличивается на 30–50%, что напрямую усиливает окислительную силу^{организма 6}; Одновременно высокий уровень сахара подавляет активность ключевых ферментов, таких как глутатионредуктаза, препятствуя антиоксидантной системе своевременно удалять избыточные реактивные кислородные вещества и дополнительно нарушая баланс окисления и восстановления. Кроме того, ИГТ сопровождается патологическими изменениями, включая инсулинорезистентность и лёгкое нарушение функции β-клеток, что приводит к формированию различных биологических и биохимических^{реакций 7,8}. Вместе с развитием редокс-состояния эти изменения ещё больше усугубляют нарушения метаболизма глюкозы и повышают потенциальный риск осложнений диабета, включая ретинопатию, нефропатию и сердечно-сосудистые^{заболевания 9,10}. Поэтому мониторинг окислительной емкости (OC) и редокс-потенциала (RP) у отдельных лиц или животных моделей с IGT должен улучшить наше понимание механизмов, лежащих в основе разработки IGT, и направлять разработку целенаправленных терапевтических стратегий.

Акупунктура имеет историю более 3000 лет и демонстрирует хорошую клиническую эффективность при лечении многих заболеваний¹¹. Кроме того, многочисленные экспериментальные исследования на животных показали, что акупунктура оказывает положительное влияние на регуляцию окислительных стрессов в животных моделях, усиливая антиоксидантную ферментную систему и снижая перекисление^{липидов 12}. Как традиционная китайская медицинская практика, акупунктура также показала значительные результаты в лечении диабета и ИГТ. Сообщается, что акупунктурные точки Гуаньюань (CV4) и Саньиньцзяо (SP6) активируют путь SIRT1/PGC-1α в скелетных мышцах, тем самым снижая инсулинорезистентность у мышей с диабетом^{ожирения 13}. Кроме того, акупунктурные точки Тяньшу (ST25) модулируют активность нейронов, ингибирующих глюкозу, расположенных в латеральной области гипоталамуса, и способствуют регуляции метаболизма^{гликолипидов 14}. Однако большинство исследований механизмов внутрисосудистой акупунктуры в основном сосредоточены на нейромодуляторной, иммуномодулирующей и желудочно-кишечной системах, где акупунктура может влиять на метаболизм глюкозы через модуляцию автономной функции или косвенно регулировать уровень глюкозы в крови путём улучшения баланса кишечной^{флоры 15,16}. Специфический механизм влияния акупунктуры на лечение IGT и её влияние на окислительный стресс не получили глубоких исследований и экспериментальных данных.

Поверхностно-усиленное рамановское рассеяние (SERS) обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, что позволяет обнаруживать широкий спектр аналитов. Нано-зонды SERS на основе нанооптической^{техники 17}, хитозановых мембран¹⁸ и предыдущих исследований показали, что иглоукалывающие иглы¹⁹ могут использоваться для обнаружения биомаркеров, нейромедиаторов и других аспектов клеточной биохимии in vivo. Особенно перспективные инструменты для глубокого тестирования тканей, позволяя проводить минимально инвазивный in situ мониторинг с последующим экс-виво анализом. Акупунктура, как хорошо зарекомендовавший себя терапевтический метод, имеет чрезвычайно широкий спектр клинических применений. Недавние исследования показали, что оптические волокна с поддержкой SERS, повязки для ран и устройства с микроиглой могут поддерживать in situ или минимально инвазивное отслеживание сигналов, связанных с редоксированием, в биологически значимых^{условиях 20,21}. Параллельно активные иголки с SERS и связанные с ними системы микроигл стали перспективными носителями для интеграции сенсорных возможностей с тканевым^{вмешательством 19}, что привело к появлению активных SERS-микроигл с in vivo ответом и возможностями обнаружения SERS in vitro.

Настоящее исследование основано на ранее опубликованной стратегии микроигл с активным SERS для обнаружения сигналов, связанных с окислительной ёмкостью и редокс-потенциалом, в моделях стресса, вызванного глюкозой. Однако настоящая работа отличается от предыдущего как биологическим контекстом, так и экспериментальной целью. В частности, в данном исследовании применяется активная SERS-платформа микроигл к модели нарушенной толерантности к глюкозе у крыс и интегрируется локальное ратиометрическое отслеживание SERS с вмешательством акупунктуры. Текущее исследование дополнительно сравнивает акупунктурные точки с соседними неакупунктурными участками, оценивает различные манипуляции с иглоукалыванием и отслеживает индексы SERS, ассоциированные с редоксированием, в течение 7-дневного периода вмешательства. По сравнению с ранее сообщавшимися оптическими волокнами, повязками для раны и микроиглами с активным SERS, предназначенными преимущественно для одноместного или однофункционального биохимического обнаружения, нынешняя платформа предлагает два нововведения. Во-первых, OC- и RP-чувствительные зонды интегрированы в две независимые травленные канавки на одной игле акупунктуры, что позволяет одновременно отслеживать комплементарные редокс-параметры. Во-вторых, игла для акупунктуры функционирует не только как носитель зонда SERS, но и как терапевтическое устройство, позволяя проводить редокс-мониторинг во время вмешательства акупунктуры, а не после процедуры. Как показано на рисунке 1, после введения микроигл в ткани образуются крошечные раны, и зонды в двух бороздах реагируют с тканями, позволяя им обнаруживать уровни OC и RP in vivo. Целью исследования было использование этих микроигл с активными SERS, чтобы изучить изменения в OC и RP у крыс с IGT и определить эффекты акупунктуры, сопоставленной с точками акупунктуры у этих животных, что позволило бы получить ценные сведения о механизме воздействия акупунктуры на лечение IGT и взаимосвязи между редокс-окислением и аномальными состояниями гипергликемии.

Протокол

Животные и модели IGT

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Исследовательского института Сучжоу Юго-Восточного университета (одобрение No SEU-IACUC-20250318007) и проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных. Крысы были добыты и содержались в условиях без специфических патогенов (SPF) при 25 °C с циклом света 12 часов и 12 часов темноты. Для процедур, требующих анестезии, крыс анестезировали с помощью изофлурана, подаваемого кислородом через индукционную камеру и поддерживаемого с помощью носового конуса. Изофлуран использовался в 3% для индукции и 1% для поддержания, с корректировкой концентрации в зависимости от частоты дыхания и процедурного ответа.

Достаточная глубина анестезии подтверждалась до иголки или инъекции при потере рефлекса выпрямления и отсутствия реакции на защемление пальца. Во время анестезии отслеживались дыхательные механизмы, положение тела и восстановление, а животные помещались на согревающую площадку для поддержания температуры тела. Животных содержали по 2 человека в клетке с бесплатным доступом к корму и воде, если только для тестирования на глюкозу не требовалось голодание. После прибытия крыс акклиматизировали в течение недели перед индукцией моделей. Благополучие животных отслеживалось ежедневно, включая общую активность, уход за собой, потребление пищи, вес тела, состояние места инъекции и восстановление после наркоза. В конце исследования крыс усыпляли согласно утверждённому протоколу для животных. Эвтаназия проводилась постепенным вдыханием CO₂ с наполнением, после чего подтверждалась смерть методом вывиха шейки матки. Животных, соответствовавших гуманным критериям конечной цели, включая тяжёлую потерю веса, постоянную неподвижность, аномальное дыхание, неспособность есть и пить, а также тяжёлое страдание, эвтаназировали немедленно, а не содержались до запланированного окончания. В этом исследовании использовались самцы Спрага–Доули весом 200 ± 20 г без специфических патогенов. После 1 недели акклиматизации крысы были случайным образом разделены на две группы: три крысы из нормальной группы получали обычную еду, а 20 крыс из модельной группы — жировой чау (50% базального чау + 10% сала + 25% сахарозы + 15% порошка желтка) в течение 3 недель. Животным из модельной группы вводили внутрибрюшную инъекцию 20 мг/кг раствора STZ 2% (растворённого в буфере 0,1 моль/л, pH 4,4 цитратного буфера) в течение 12 часов, после чего голодание 12 часов без ограничения воды. Те, кто был в нормальной группе, получали внутрибрюшинную инъекцию соответствующей дозы буферного раствора цитратного буфера после кормления обычной едой. Через неделю был проведён внутрибрюшнический тест на толерантность к глюкозе (IPGTT). Реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

Уровень глюкозы натощак (FPG) измерялся по забору крови с кончика хвоста у крыс в каждой группе после 12 часов голодания без ограничения воды, а через 2 часа после обеда — уровень глюкозы в крови (2hPG) после внутрибрюшнической инъекции 20% декстрозы 2 г/кг. В нормальной группе диапазон FPG составлял 5,1–6,6 ммоль/л, а диапазон глюкозы 2hPG — 7,3–9,4 ммоль/л, по сравнению с FPG ≤7,0 ммоль/л и диапазоном 2hPG 10–16 ммоль/л в модельной группе. Из 20 крыс, назначенных на индукцию модели IGT, 18 соответствовали заранее определённым критериям IGT после IPGTT и были включены в последующий интервенционный эксперимент. Две крысы были исключены, потому что их значения FPG или 2hPG выходили за пределы заранее определённого диапазона IGT. Затем 18 подходящих крыс были случайным образом распределены в группу с высоким содержанием жиров и группу с нормальным питанием, по 9 крыс в каждой группе. Каждая диетическая группа дополнительно делилась на три подгруппы: скручивание акупунктурной точкой, скручивание без акупунктурного участка и прямое вставление с помощью акупунктурной точки, по три крысы в каждой подгруппе. Это было исследовательское исследование разработки метода, направленное на оценку возможности сочетания акупунктурного вмешательства с рациометрическим отслеживанием на основе SERS в доклинической модели крыс IGT. Формального статистического расчёта мощности не проводилось. Размер подгруппы из трёх крыс был выбран на основе целесообразности, предварительных исследований SERS-микроигл и принципа восстановления животных. Крысы были случайным образом распределены экспериментатором; формальное распределение, сокрытие и ослепление не проводились.

Протоколы лечения акупунктурой были проверены с учётом доказательных клинических рекомендаций традиционной китайской медицины и возможности проведения экспериментов на^{животных 22}. Выбранные акупунктурные точки включали Чжунван (RN12/CV12), Шуифэнь (RN9/CV9), Иньцзяо (RN7/CV7), двусторонний Тяньшу (ST25), двусторонний Шуйдао (ST28) и двусторонний Цзусанли (ST36). RN12, RN9 и RN7 располагались на передней средней линии и рассматривались как одиночные средние точки, тогда как ST25, ST28 и ST36 рассматривались двусторонне. Пары точек акупунктуры были основаны на тех, что использовались для клинического лечения IGT²³. Адаптация была основана на литературе^24,25 с использованием дихотомического метода. У крыс акупунктурные точки локализованы по анатомическим ориентирам и пропорциональному преобразованию от стандартных мест человеческих акупунктурных точек. Точки брюшной RN/CV были выявлены вдоль передней средней линии с помощью отростка в модиковидном отростке, пупке и лобковой симфизы как анатомических ориентиров. ST25 был отмечен двусторонним на уровне пуповины, а ST28 — двусторонним в нижней области брюшной поверхности на том же боковом расстоянии от передней средней линии. ST36 был выявлен на передне-латеральной задней конечности в передней области большеберцовой кости, латерально от большеберцового бугорка. Соседние участки сравнения, не связанные с акупунктурой, были отмечены на 5 мм латерально от соответствующих акупунктурных точек и за пределами распознанной меридиановой линии, при этом избегали видимых сосудов, рубцов и предыдущих проколов. Перед уколыванием иглов крыс анестезиировали изофлураном согласно утверждённому протоколу животных и помещали в положение на спине на согревающей подушечке. Кожа брюшной и задних конечностей над каждым мишенью была выбрита и дезинфицирована 75% этанолом. SERS-активные микроиглы были введены примерно перпендикулярно коже на глубину примерно 10 мм. Для групп с точкой скручивания в акупунктурной точке в выбранные акупунктурные точки вводились активные SERS-микроиглы и аккуратно вращались в обоих направлениях в течение 20-минутного периода удержания. Для групп, не связанных с акупунктурными участками, та же процедура проводилась на соседних неакупунктурных участках сравнения диаметром 5 мм. Для групп прямого ввода в акупунктурные точки вводились активные SERS-микроиглы и удерживались 20 минут без скручивания. Все процедуры иголки выполнялись одним и тем же обученным оператором для минимизации межоператорских вариаций.

Иглирование проводилось два раза в день — в 10:00 и 15:00 — в течение 7 дней подряд. Перед каждой процедурой FPG измеряли после 8 часов голодания без ограничения воды. После каждой дневной процедуры иголки записывались ответы OC и RP. На седьмой день, после акупунктуры, была проведена IPGTT и зафиксированы значения 2hPG.

Предупреждения

Стрептозотоцин опасен и должен использоваться как токсичное химическое вещество. Подготовьте раствор стрептозотоцина в химическом вытяжном контейнере или сертифицированном шкафу для биобезопасности, надевая лабораторный халат, нитриловые перчатки, защитные очки и маску. Шприцы, иглы, салфетки, постельные принадлежности, клетки и отходы, связанные со стрептозотоцином, должны использоваться в соответствии с институциональными процедурами по обработке опасных биологических и химических отходов. Использованные иглы и шприцы следует немедленно выбрасывать в контейнеры, устойчивые к проколам, без обратного накопления.

Изготовление микроигл с активными SERS для обнаружения OC и RP

Были подготовлены иглы для акупунктуры, как ранее^{сообщалось 26}. Активные микроиглы SERS изготавливались с использованием одного и того же типа коммерческих игл из нержавеющей стали (0,25 мм × 26 мм) на протяжении всего исследования. Иглы вводились примерно перпендикулярно коже на глубину 10 мм. Для скручивающих групп ручное двунаправленное вращение применялось мягко и равномерно в течение 20 минут в течение одного и того же обученного оператора. Манипуляция не управлялась приборами; поэтому точная частота вращения и амплитуда не были количественно измерены. Это ограничение было признано в Обсуждении.

Изначально иглы замачивались в растворе PMMA с 20% (w/v) в MMA, затем сушили при комнатной температуре (25 °C) в течение одного дня. Далее были сделаны две параллельные вмятины одинакового размера и схожей формы и глубины в защитном слое PMMA (с расстоянием 5 мм друг от друга) с помощью небольшого лезвия ремесленного ножа, очищенного этанолом; затем иглы погружались в 0,5 млн серной кислоты, служившей электролитом в течение 10 секунд для электрохимического травления при напряжении 12 В, образуя две почти круглые канавки в местах нанесения ударов. В-третьих, после трёх промываний иглы погружались при комнатной температуре в течение 24 часов в раствор этанола, содержащем 0,1 моль L⁻¹ MPTES и 0,3 моль L⁻¹ APTES, тем самым придавая сульфгидриловую функциональность канавочным поверхностям. В-четвёртых, покрытие снималось, обмакнув иглу в MMA. Микроиглы, реактивные на редокс-потенциал, реактивные на SERS, были подготовлены на основе ранее описанного^{метода 27}. Субстрат SERS адсорбировался на одной из травленных канавок каждой иглы акупунктуры, после чего полученные активные SERS-микроиглы погружались в водный раствор p-PDA в концентрации 1 × ^10-4 моль/л в течение 60 минут при 37 °C, получая микроиглы, чувствительные к окислению, активные с SERS. Субстраты SERS на основе золотых нанооболочек были синтезированы, как описано^{ранее 28}. В настоящей работе эти микроиголки капали в другую канавку каждой иглоукалы, после чего они высохли естественным путем. Это дало SERS-активные микроиглы с OC и RP ответом.

Экс виво оценка реакции OC и RP на микроиглы с активной SERS

Ответы зондов OC и RP оценивались путём введения активных SERS-микроигл в ткань ex vivo. Для проверки отзывчивости OC-зонда на окислительные изменения были зафиксированы спектры SERS p-PDA до и после окисления. Спектры редокс-зондов SERS также были получены в сильно восстанавливающем растворе_NaBH4 и сильно окисляющем растворе_{HAuCl 4}. Селективность зонда OC оценивалась с использованием восстановительных агентов, включая 1 × ^10-4 M_{FeSO 4}, 1 × 10-4 M Na ₂SO₄ и 1 × ^10-4 M аскорбиновой кислоты, а также окислители, включая 1 × ^10-4 M_{CuSO 4}, 1 × 10-4 M H_2O2, 1 × ^10-4 M FeCl₃, и 1 × ^10-4 M_{HAuCl 4}. Все растворы были подготовлены при температуре 20 мМ PBS (pH 7,4), и зонды инкубировались с каждым раствором в течение 20 минут при 37 °C. Устойчивость микроигл с активной SERS оценивалась путём записи OC-реакций до и после реакции с 1 × ^10-4 моль/л_{FeCl 3} при комнатной температуре. Эти тесты ex vivo и на основе раствора использовались для подтверждения отзывчивости зонда в контролируемых условиях. Однако они не полностью воспроизводят сложность микросреды тканей in vivo, где локальное изменение pH, адсорбция белков, компоненты внеклеточного матрикса и другие биологические вещества могут влиять на сигналы SERS. Поэтому показания OC и RP in vivo интерпретировались как относительные редокс-ассоциированные индексы SERS, а не как матрично-независимые биохимические измерения.

Обнаружение ОК и РП на акупунктурных и неакупунктурных участках

Для оценки эффективности зондов OC и RP в точках акупунктуры и неакупунктурных точках активные SERS микроиглы были введены здоровым крысам в точках акупунктуры ST36 и RN12, а также на расстоянии 5 мм рядом с каждой из этих точек на глубине примерно 10 мм, на одинаковое время.

Влияние скручивания иглы на обнаружение OC и RP

Для оценки отзывчивости зондов OC и RP при различных методах иглоукаления в точки акупунктуры ST36 и RN12 были введены микроиглы с активным SERS, а также на расстоянии 5 мм рядом с этими точками у здоровых крыс на глубину около 10 мм. В каждой точке акупунктуры одна игла была скручена, тогда как соответствующая игла рядом с точкой — нет, и наоборот (игла, прилегающая к точке акупунктуры, была скручена, тогда как её аналог в точке акупунктуры — нет). Сигналы SERS от зондов собирались в одно и то же время введения для каждой иглы.

Изменения в OC и RP у крыс с IGT в отношении акупунктурных точек, скручивания игл и условий питания

Для оценки влияния точек акупунктуры, скручивания игл и условий питания на OC и RP у крыс с ИГТ крыс в группе с высоким содержанием жира были случайным образом распределены по трем группам (A1, A2 и A3; три крысы в каждой группе), а также в нормальной диетической группе (группы B1, B2 и B3; три крысы в каждой группе). Для крыс групп A1 и B1 микроиглы с активной SERS вводились в акупунктурные точки после седации и скручивались в течение 20 минут; та же процедура была проведена для крыс групп A2 и B2, за исключением того, что микроиглы были введены в 5 мм рядом с точками акупунктуры. Для крыс в A3 и B3 микроиглы с активной SERS вводились в акупунктурные точки без скручивания; Иглы оставили на месте 20 минут. Иглирование проводилось дважды в день — в 10:00 и 15:00 — в течение 7 дней. Перед каждым днём процедур использовался глюкометр для записи значений FPG для каждой группы крыс (после голодания, но без ограничения воды в течение 8 часов). После каждого дневного иголки измерялись и записывались ответы OC и RP. На седьмой день, после акупунктуры, была проведена IPGTT каждой группе крыс, и были зафиксированы показатели 2hPG.

Характеристика и измерение

Морфология микроигл с активной SERS была изучена с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Спектры SERS были получены при 25 °C с использованием рамановского спектрометра с рабочей дистанцией 50× (NA: 0,5) и лазером 785 нм. Для всех измерений время набора составляло 10 с, а система Рамана работала на номинальной лазерной мощности 600 мкВт при той же оптической конфигурации. Фактическая мощность лазера, подаваемая на поверхность ткани, в данном исследовании не измерялась напрямую. Поэтому спектры SERS использовались для относительных сравнений между группами при одинаковых условиях приобретения, и никаких выводов относительно абсолютной фототермальной безопасности тканей не было сделано. Коэффициенты интенсивности двух зондов SERS рассчитывались следующим подходом: отношение значений интенсивности при 1450 ^см−1 к значениям на 1500 ^см−1 было назначено индикатором для OC (I₁₄₅₀ ^см−1/_{I 1500} см⁻¹), после вычитания интенсивности при 1700 ^см−1 (в качестве фона) из каждого из двух пиков, соответственно, как и в предыдущих ^{отчетах 17}; и используя I₁₆₀₆ ^см−1/_{I 1666} см⁻¹ в качестве индикатора RP, интенсивность при 1700 ^см−1 (в качестве фона) вычиталась с каждого из двух пиков соответственно. Рассчитанные значения I₁₄₅₀ ^см−1/I₁₅₀₀ см⁻¹ и I₁₆₀₆ ^см−1/_{I 1666} см⁻¹ были проанализированы как относительные индексы SERS, полученные от SERS, для ответов, связанных с OC- и RP соответственно. Эти соотношения использовались для сравнения изменений между группами и временными точками при одинаковых настройках приобретения.

В настоящем исследовании не было установлена внешняя калибровочная кривая, чтобы преобразовать эти соотношения в абсолютные концентрации окислительных веществ или абсолютные значения электрохимического окислительно-потенциального потенциала. Каждый спектр записывался дважды в пяти разных точках зонда SERS в трёх реплицированных образцах. Origin использовался для обработки данных и создания карт. Для минимизации изменчивости, связанной с получением, для всех групп применялись одинаковые рабочие процессы по длине волны лазера, объектив, время захвата, настройка мощности лазера и спектральная обработка. Потенциальные фототермальные или фотохимические эффекты, вызванные лазерным облучением, не были независимо количественно измерены и признаны как ограничение. Статистические данные представлены как среднее ± стандартной ошибке среднего значения (SEM). Размер выборки и статистический тест, используемый для каждого эксперимента или панели рисунков, указаны в соответствующих легендах рисунков. Для экс виво экспериментов по валидации зонда в качестве анализа использовался зонд SERS или независимо подготовленная микроигла. Для анализа глюкозы в крови in vivo и индекса SERS в качестве биологического анализа использовалась крыса. Спектры, собранные из нескольких точек одного зонда, рассматривались как технические измерения и усреднялись перед анализом на уровне группы. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS. Сравнения между группами проводились с использованием статистических тестов, указанных в соответствующих надписях рисунков. Серийные измерения уровня глюкозы натощак и индекса SERS в течение 7-дневного периода интервенции интерпретировались как исследовательские продольные тенденции из-за малого размера подгруппы, и не применялись формальные повторные измерения или модель смешанных эффектов. Статистическая значимость была определена как p < 0,05. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Результаты

Изготовление микроигл с активными SERS для обнаружения OC и RP

Для выявления изменений в OC и RP были изготовлены микроиглы с активными SERS, содержащие соответствующие зонды. Репрезентативные изображения SEM подтвердили двухканавочную структуру микроигл с активным SERS. На рисунке 2A показано корпус иглы акупунктуры с двумя травленными канавками, на рисунке 2B показана канавка, нагруженная GNS, а на рисунке 2C — увеличенный вид GNS, распределённый внутри канавки. Эти изображения подтвердили, что вытравленные канавки могут служить локализованными точками загрузки для OC- и RP-реагирующих зондов SERS. Для обозначения степени окисления p-PDA использовалось отношение пиковых интенсивностей_{I 1450} ^см−1/_{I 1500} см⁻¹. На рисунке 3A показаны спектры SERS p-PDA до и после взаимодействия с 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃, тогда как на рисунке 3B представлены спектры для редокс-зонда в водных растворах 1 × 10⁻³ M NaBH4 и 1 × 10-4 M HAuCl₄. Ответ RP-зонда выражался в виде пикового коэффициента интенсивности (I₁₆₀₆ ^см-1/_{I 1666} ^см-1), который уменьшался с увеличением RP.

Для оценки селективности зонда, чувствительного к окислительной ёмкости, было измерено соотношение I₁₄₅₀ ^см−1/_{I 1500} см⁻¹ после воздействия различных восстановительных и окисляющих агентов. Независимые измерения зондом проводились с n = 3 на группу, а в качестве анализирующего блока использовался зонд SERS или независимо подготовленная микроигла (рисунок 3C). По сравнению с группой CK (тест Крускаля–Уоллиса, за которым последовал тест с множественными сравнениями Данна), восстановительные агенты_{FeSO 4} и Na₂SO₄ существенно не изменили соотношение I₁₄₅₀ ^см−1/_{I 1500} см⁻¹ (p > 0,05). Аскорбиновая кислота (AA, p < 0,001) также дала повышенное соотношение при текущем состоянии анализа, несмотря на то, что была включена в состав восстановительного агента. Поэтому ответ на AA был интерпретирован осторожно как специфичный для зонда спектральный ответ в этом растворе, а не как доказательство окисляющего поведения. В отличие от этого, окисляющие или связанные с окислением реагенты увеличивали соотношение в разной степени. Это отношение увеличивалось после воздействия_{CuSO 4} (p < 0,0001), H_2O2 (p < 0,0001), FeCl₃ (p < 0,0001) и HAuCl₄ (p < 0,0001). Для оценки устойчивости зонда OC при комнатной температуре спектры SERS собирались с интервалом в час в течение 6 часов до реакции зонда с 1 × 10⁻⁴ M_{FeCl 3} (рисунок 3D), и были рассчитаны соответствующие соотношения I₁₄₅₀ ^см−1/_{I 1500} ^см−1. После адсорбции зонда начальное значение оставалось стабильным примерно на уровне 0,20 ± 0,02, как и реакция с_FeCl3 примерно на 0,9 ± 0,10 в течение 6 часов. Эти результаты свидетельствуют о том, что p-PDA на ГНС стабилен в воздухе.

OC и RP ответы в точках акупунктуры и неакупунктурных точек

^{Предыдущие исследования показали,} что OC-зонд достигает максимальной реакции через 10 минут после установки. Рисунки 4A и B иллюстрируют реакцию микроиголок с активным SERS у здоровых крыс, помещённых в точки акупунктуры ST36 и RN12, а также у тех, что расположены в 5 мм рядом с этими точками, в течение 10 минут. В этих экспериментах n = 3 крысы на группу и спектры, собранные из нескольких точек одного зонда, рассматривались как технические копии и усреднялись перед анализом на уровне группы. Активные SERS-микроиглы эффективно реагировали на изменения OC и RP in vivo, при этом не было значимых различий между OC и RP в группе акупунктурных точек по сравнению с группой точек без акупунктуры (независимые образцы t-тест, p > 0,05).

Для дальнейшего определения влияния скручивания иглы на местные OC и RP in vivo, активные с SERS микроиглы были введены здоровым крысам в точках акупунктуры ST36 и RN12, а также на 5 мм дальше этих точек на глубину 10 мм. Во время маневра вращения на каждой точке акупунктуры стрелка, прилегающая к точке, раскручивалась и наоборот, а изменения значений OC и RP в точке прокола фиксировались (рисунки 4C–F). Не было значимых изменений в ОК и РП в зависимости от того, выполнялось ли скручивание в точках акупунктуры или неакупунктурных точках у здоровых крыс, а также не было эффекта скручивания в соседней точке (p > 0,05).

Изменения в ОК и РП у крыс с ИГТ, связанные с иглоукалыванием, скручиванием иглы и условиями питания

Для подтверждения успешного установления модели IGT у крыс были зафиксированы с помощью IPGT-анализа у модельных и контрольных крыс соответственно. Контрольная группа включала n = 3 крысы, а модельную группу — n = 18 крыс, соответствующих заранее определённым критериям нарушенной толерантности к глюкозе. Модельные крысы показали более высокий уровень глюкозы натощак, чем контрольные крысы (6,92 ммоль/л против 5,54 ммоль/л; Тест Mann–Whitney U, p < 0,01) и выше за 2 часа после еды, чем у контрольных крыс (11,52 ммоль/л против 7,92 ммоль/л; Тест Mann–Whitney U, стр . < 0.001) (рисунок 5), указывающий на успешную индукцию IGT у модельных животных.

Для проверки эффекта сочетания точек акупунктуры, скручивания иглы и условий питания на крыс с IGT был выбран типичный набор пар точек акупунктуры. 18 подходящих модельных крыс были затем разделены на группы с высоким содержанием жиров и нормального питания, при этом n = 9 крыс на одну диетическую группу. Каждая диетическая группа дополнительно делилась на три подгруппы вмешательства: скручивание акупунктурной точки, скручивание без акупунктурного участка и прямое вставление с точки акупунктуры, при этом n = 3 крысы на подгруппу. Значения FPG фиксировались перед каждым днём иголки (рисунки 6A–C), а значения 2hPG (рисунок 6D) измерялись после 7 дней иголки с помощью IPGTT в каждой группе. В этом исследовательском наборе данных не было выявлено явных различий в FPG или 2hPG между модельными группами с высоким содержанием жиров и нормальной диетой после иглоукалывания в точках иглоукалывания. Сравнения иголки с акупунктурной точкой и не-акупунктурного участка показали, что скручивание акупунктурной точки связано с пониженным уровнем глюкозы в крови при текущих экспериментальных условиях (независимые образцы t-тестов, p < 0,05). Поскольку размер подгруппы был мал, а питание, расположение акупунктурных точек и манипуляции скручиванием не могли быть полностью статистически разделены, эти результаты интерпретировались как предварительные наблюдения на животных моделях.

Изменения в индексах SERS, связанных с окислительной емкостью и редокс-потенциалом, отслеживались в течение 1 недели вмешательства акупунктуры у крыс с IGT. Для этих анализов было включено n = 3 крысы в каждой подгруппе, и каждая крыса рассматривалась как единица биологического анализа. У крыс с высоким содержанием жиров индекс SERS, связанный с окислительной ёмкостью, со временем снижался в группах с точкой скручивания акупунктурной точки и точкой прямого вставления, тогда как в группе скручивания без акупунктурного участка он оставался относительно выше (рисунок 7A). Индекс SERS, связанный с редокс-потенциалом, со временем увеличивался в группах скручивания акупунктурной точки и точки прямой вставки в точке акупунктуры, тогда как группа скручивания без сайта акупунктуры показала сравнительно слабое увеличение (рисунок 7B). Похожие тенденции наблюдались и у крыс с нормальным питанием IGT. Индекс SERS, связанный с окислительной ёмкостью, со временем снижался в группах скручивания в точке акупунктуры и точке прямой вставки в точке акупунктуры, при этом меньшим изменением в группе скручивания не акупунктурного участка (рисунок 7C). Индекс SERS, связанный с окислительно-окислительным потенциалом, со временем увеличивался в группах скручивания акупунктурной точки и точки прямой вставки в точке акупунктуры, тогда как группа скручивания без акупунктурного участка оставалась сравнительно ниже (см. рисунок 7D).

Для дальнейшего сравнения диетических условий при той же манипуляции акупунктурой были сравнины подгруппы с точкой скручивания акупунктуры из групп с высокожировой диетой и нормальной диетой. В этом сравнении индекс SERS, связанный с окислительной ёмкостью, со временем снижался в обоих условиях питания, при этом к 7-му дню наблюдалось более значительное снижение в подгруппе с нормальной диетой, искривляющей точку акупунктуры (рисунок 7E). Индекс SERS, связанный с окислительно-окислительным потенциалом, со временем увеличивался в обоих условиях питания, при этом в подгруппе с точкой скручивания в нормальном рационе (рисунок 7F) был более высоким на 7-й день (см. рисунок 7F). Эти результаты свидетельствуют о том, что скручивание акупунктурной точки и нормализация питания были связаны с изменениями локальных редокс-ассоциированных индексов SERS у крыс с IGT. Поскольку каждая подгруппа содержала только три крысы и не проводилось независимых биохимических тестов на окислительный стресс, эти результаты следует интерпретировать как исследовательские наблюдения на животных, а не как окончательные биохимические доказательства улучшения окислительного стресса.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Все численные сырые данные, используемые для генерации фигур и статистического анализа, включая измерения уровня глюкозы в крови, значения соотношения, полученные по SERS, и исходные данные для количественных панелей рисунков, были организованы и загружены в виде дополнительной таблицы 1. Для экспериментов с непрерывным мониторингом зондов, создаваемых непосредственно аналитическим прибором, экспортированные значения и репрезентативные инструментальные выходы, используемые для оценки работы зонда, включены в Дополнительный файл 1.

Рисунок 1: Методологический рабочий процесс для вмешательства в акупунктуру и локального ратиометрического отслеживания SERS с использованием двухканавочной активной микроиглы SERS . Схема иллюстрирует введение двухканавочной SERS-активной микроиглы в точку акупунктуры или соседний неакупунктурный участок, за которым следует рамановский спектральный захват. Авторы создали эту фигурку с помощью программного обеспечения WPS, и лицензия на авторские права не требуется. Сокращения: SERS = поверхностно-усиленное раманское рассеяние. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Репрезентативные SEM-изображения активных микроигл с SERS. (A) Корпус иглы для акупунктуры с двумя канавками; шкала = 200 мкм; увеличение = 77×. (B) Канавка, интегрированная с GNS; шкала = 20 мкм; увеличение = 1 000×. (C) увеличенное изображение бороздки в букве B; шкала = 2 мкм; увеличение = 30 000×. Сокращения: SEM = сканирующая электронная микроскопия; GNS = золотые нанооболочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Характеристика SERS-чувствительных к OC и RP-чувствительных зондов. (A) Нормализованные спектры p-PDA до и после взаимодействия с FeCl₃. (B) Нормализованные спектры SERS RP-зондов в растворах_{NaBH 4} и_{HAuCl 4} соответственно. (C) Соотношение₁₄₅₀ ^см−1/I₁₅₀₀ см⁻¹ для зондов OC в различных окисляющих и восстанавливающих растворах. n=3 независимых измерения зонда на группу. Тест Крускаля–Уоллиса, затем тест множественных сравнений Данна с группой CK. Данные представлены как среднее ± стандартной ошибке среднего значения (SEM). (D) Шестичасовая оценка стабильности зонда, чувствительного к OC, до и после реакции с FeCl₃. Сокращения: SERS = поверхностно-усиленное раманское рассеяние; CK = контрольная проверка; p-PDA = p-фениледиамин; AA = аскорбиновая кислота. p < 0,001, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Индексы SERS, связанные с OC- и RP, измеряемые различными методами иглоукалывания в местах акупунктуры и неакупунктуры у здоровых крыс.(A) Индекс SERS, связанный с OC, после прямого введения в точки акупунктуры и соседних неакупунктурных участках. (B) индекс SERS, связанный с RP, после прямого введения в точки акупунктуры и соседних неакупунктурных участках. (C) индекс SERS, связанный с OC, после прямого введения в неакупунктурные места и вкрутки иглы в точках акупунктуры. (D) индекс SERS, связанный с RP, после прямого введения в неакупунктурные участки и скручивания иглы в точках акупунктуры. (E) индекс SERS, связанный с OC, после прямого введения в точки акупунктуры и скручивания иглы в соседних неакупунктурных участках. (F) индекс SERS, связанный с RP, после прямого введения в точки акупунктуры и вкрутки иглы в соседних неакупунктурных участках. OC рассчитывался как_{I 1450} ^см-1/_{I 1500} ^см-1, а RP — как_{I 1606} ^см-1/_{I 1666} ^см-1. n=3 в каждой группе. Данные представлены как среднее ± SEM. Существенных различий между парными сравнениями не наблюдалось. Сокращения: OC = окислительная ёмкость; RP = редоксальный потенциал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Значения FPG и 2hPG согласно анализу IPGTT у модельных и контрольных крыс (CK). FPG и 2hPG были измерены для подтверждения установления модели крыс с нарушенной толерантностью к глюкозе. n = 3 крысы в контрольной группе и n = 18 крыс в модельной группе. Статистический анализ был проведён с помощью теста Манна–Уитни U, и результаты представлены как среднее ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Значения FPG и 2hPG для крыс с IGT во время процедур акупунктуры. (A) Значения FPG для группы, получающей акупунктуру, с поворотом иглы в точках акупунктуры и прямым введением иглы в точках акупунктуры (n = 3 на группу). (B) значения FPG для группы, получающей иглоукалывание с скручиванием в точках акупунктуры и неакупунктурных точек (n = 3 на группу). (C) значения FPG для диеты с высоким содержанием жиров и нормальных диетических групп (n = 3 на группу). (D) День 7 — значения 2hPG у крыс, питающихся с высоким содержанием жиров и нормального питания при повороте акупунктурной точки, скручивании без акупунктурного участка и непосредственного вставления в точку акупунктуры. (n = 3 на группу). Результаты представлены в виде среднего ± SEM. Планируемые парные сравнения конечных точек в панели D анализировались с помощью непарного двухстороннего t-теста Студента. *p < 0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Изменения в OC и RP у крыс в каждой группе в течение 1 недели акупунктуры .(A) Изменения в OC у крыс с высоким содержанием жира в IGT. (B) Изменения в RP у крыс с высоким содержанием жиров в IGT. (C) Изменения в OC у крыс с нормальным питанием IGT. (D) Изменения в RP у нормального питания крыс IGT. (E) сравнение индекса SERS, связанных с OC, между условиями с высоким содержанием жиров и нормального питания в подгруппе с точкой скручивания акупунктуры; (F) Сравнение индекса SERS, связанных с RP, между условиями с высоким содержанием жировки и нормального питания в подгруппе скручивания акупунктурной точки. n = 3 крысы на подгруппу. Данные представлены как среднее ± SEM. Серийные измерения интерпретировались как исследовательские продольные тенденции. Сокращения: OC = окислительная ёмкость; RP = редоксальный потенциал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: Репрезентативные результаты, генерируемые инструментами, для оценки отклика зонда. Этот файл содержит репрезентативные результаты непрерывного мониторинга, генерируемые непосредственно аналитическим инструментом и используемые для оценки эффективности отклика зонда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Исходная таблица данных для количественного анализа. Этот файл содержит числовые исходные данные, используемые для генерации фигур и статистического анализа, включая измерения уровня глюкозы в крови, значения соотношения, полученные по SERS, и количественные данные панели рисунков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Нарушенная толерантность к глюкозе представляет собой обратимую переходную стадию перед диабетом 2 типа и тесно связана с метаболическим дисбалансом, инсулинорезистентностью и дисрегуляцией, связанной с окислительным стрессом. Вмешательство в образ жизни и другие ранние терапевтические стратегии могут снизить риск прогрессирования от нарушенной толерантности к глюкозе к диабету, однако инструменты для динамического мониторинга локальных биохимических реакций во время вмешательства остаются^{ограниченными 30}. В экспериментальных и клинических исследованиях сообщается, что акупунктура влияет на метаболизм глюкозы и пути, связанные с окислительным стрессом. Однако большинство механистических исследований акупунктуры основаны на измерениях конечной точки кровоснабжения или тканей, и относительно немногие методы позволяют минимально инвазивное отслеживание локальных окислительно-восстановлительных ответов во время вмешательства в акупунктуру. Предыдущие клинические испытания лечения IGT подтвердили, что риск диабета можно значительно снизить с помощью вмешательств в образ жизни, включая изменения в питании, снижение массы тела и повышение физической^{активности 31}. Доказано, что акупунктура эффективна в улучшении метаболических индексов глюкозы и снижении голодания натощак и 2hPG. Таким образом, разъяснение взаимосвязи между акупунктурой, редокс-окислением и ИГТ может дать подходы к обращению ИГТ или вмешательству в его прогрессирование, тем самым снижая заболеваемость сахарным диабетом, а также даёт представление о патологии ИГТ и механизмах, лежащих в основе её развития.

В настоящем исследовании предлагается микроигла с двойной канавкой, чувствительная к окс-окислению с поверхностным усилением Рамана, для сочетания акупунктурного вмешательства с локальным ратиометрическим отслеживанием SERS в модели нарушенной толерантности к глюкозе у крыс. В этой системе две травлённые канавки на одной иглоукалывающей игле использовались для переноски зондов, реагирующих на окислительную ёмкость и редокс-потенциал. Такая конструкция позволила иглоукалывающей игле функционировать не только как инструмент вмешательства, но и как носитель датчика для относительных локальных окислительно-окислительно-связанных оптических показаний. Результаты показали, что иглоукалывание в точках акупунктуры с скручиванием связано с понижением уровней глюкозы натощак и 2hPG, а также с изменениями индексов SERS, связанных с окислительной ёмкостью и редокс-потенциалом, у крыс с нарушенной толерантностью к глюкозе. Эти результаты подтверждают возможность использования микроигл с активным SERS для изучения локальных реакций, связанных с редоксированием, во время вмешательства акупунктуры. В целом, результаты свидетельствуют о том, что иглоукалывание в точках акупунктуры с скручиванием было связано с понижением уровней FPG и 2hPG, а также с изменениями индексов SERS, связанных с OC- и RP, у крыс с IGT. Эти результаты подтверждают возможность использования активных микроигл с SERS для отслеживания локальных окислительно-ассоциированных оптических ответов во время вмешательства при акупунктуре. Однако, поскольку стандартные биохимические тесты на окислительный стресс, анализ выщелачивания и тесты на биосовместимость тканей не проводились, наблюдаемые изменения индекса SERS не следует интерпретировать как окончательное биохимическое доказательство улучшения окислительного стресса.

Для дальнейшего изучения той же гипотезы можно использовать несколько альтернативных подходов. Стандартные биохимические анализы на окислительный стресс, включая измерения соотношений реактивных видов кислорода, малондальдегида, супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатион-дисульфидов, могут быть использованы для проверки соответствия изменений в индексах, полученных из SERS, с обычными биомаркерами окислительного^{стресса 32,33}. Электрохимические окислительно-окислительные зонды, флуоресцентные редокс-сенсоры, хемилюминесцентные анализы, микродиализ с последующим биохимическим анализом, а также тканевая иммуногистохимическая или гистологическая валидация также могут предоставлять дополнительную информацию. Сочетание микроигольного датчика с активным SERS с этими независимыми подходами поможет определить, отражают ли наблюдаемые оптические изменения специфические биохимические редокс-изменения или более широкие локальные тканевые реакции на иголку и метаболический^{статус 34}.

Потенциальные применения этого метода выходят за рамки существующей модели нарушенной толерантности к глюкозе. Поскольку редокс-дисбаланс участвует в метаболических заболеваниях, повреждениях тканей, воспалении и восстановлении ран, активные микроиглы с SERS могут служить полезным доклиническим инструментом для мониторинга локальных редокс-реакций в моделях, связанных с диабетом, исследованиях заживления ран, моделях воспалительных заболеваний и других условиях минимально инвазивного^{вмешательства 35}. В исследованиях акупунктуры платформа может быть полезна для сравнения точек акупунктуры, неакупунктурных участков, различных манипуляций с иглоукалыванием и различных графиков вмешательств. Однако эти приложения остаются исследовательскими и требуют дополнительной технической и биологической валидации.

Следует отметить несколько ограничений. Во-первых, показания OC и RP рассчитывались как рациометрические индексы, полученные на основе SERS, и не калибровались по стандартным концентрациям окисляющих веществ или абсолютным значениям электрохимического редокс-потенциала. Поэтому настоящие результаты следует интерпретировать как относительные оптические ответы, связанные с редокс-ассоциированием при одинаковых условиях приобретения, а не как абсолютные биохимические измерения. Во-вторых, биологическая микросреда тканей может создавать дополнительные источники вариаций сигнала, включая локальные изменения pH, адсорбцию белков, компоненты внеклеточного матрикса и другие эффекты матрицы. Эти факторы не были полностью оценены в сывороточной или ткани-имитирующей среде. В-третьих, фактическая мощность лазера, подаваемая на поверхность ткани, и локальное изменение температуры во время рамановского набора не измерялись напрямую; поэтому возможные фототермальные или фотохимические эффекты не могут быть полностью исключёны. В-четвёртых, воспроизводимость геометрии канавок на уровне пакета и нагрузки на зонд не оценивалась количественно с помощью многоигольной SEM-визуализации или анализа эффективности нагрузки. Наконец, независимая биохимическая валидация, анализ с помощью зонда и локальное тестирование биосовместимости не проводились. В будущих исследованиях следует устанавливать калибровочные кривые в биологически значимых матрицах, сопоставлять индексы SERS со стандартными анализами на окислительный стресс и редокс-анализы, количественно оценивать выщелачивание в зонде, оценивать совместимость местных тканей после многократного вставления и валидировать устройство в крупных животных когортах. Микроиглы с активным SERS могут стать полезной платформой для сочетания вмешательства в акупунктуру с относительным рациометрическим отслеживанием SERS локальных редокс-ассоциированных индексов в доклинической модели крыс с IGT. Для утверждения абсолютного количественного мониторинга или трансляционного применения требуется дополнительная калибровка, биохимическая валидация, оценка с помощью зонда и исследования биосовместимости.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3-Аминопропилтриэтокссилан (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Меркаптопропил)триметоксисилан (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
Аскорбиновая кислота	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
Глюкометр	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
Полоски для определения глюкозы	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
Сульфат меди (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
Этиловый спирт (≥99,7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
Сульфат железа (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
Глюкоза (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
Перекись водорода (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
Хлорид железа (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
Метилметакрилат (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
Микро-Рамановский спектрометр	Renishaw	InVia Raman Microscope
p-Фенилендиамин (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
Полиметилметакрилат (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
Сканирующий электронный микроскоп	Zeiss	ULTRA Plus
Борогидрид натрия (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
Сульфит натрия (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
Иглы для иглоукалывания из нержавеющей стали	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
Статистическое программное обеспечение	International Business Machines Corporation	Version 2021
Стрептозотоцин (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
Тетрахлорозолотиста кислота (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
SPSS программное обеспечение	International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA	version 26.0
крысы	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Specific-pathogen-free male Sprague-Dawley
базовый корм	Anuokang Biotech.	SY10001
Жиромасло	MCE	HY-W127601
Сахароза	MCE	HY-B1779
Сухое яичное желточно-белковое	MCE	HY-B2235B
Цитриновая кислота моногидрат	Sigma-Aldrich	C1909
Дицитрат тринатрия дигидрат	Sigma-Aldrich	S4641
Цитратный буфер	beyotime	P0086
Фосфатно-буферный раствор соли	beyotime	ST448-1L
Изофлуран	Bioss	D54468
Система анестезии изофлураном для малых животных	RWD Life Science	R500
Камера индуктора и наконечник для носа	RWD Life Science	R500compatible accessories
Огревательная подушка	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
75% этанол	Boyu Bio.	YB60401
Коробка эвтаназии CO2	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365