Мы представляем воспроизводимую модель разрыва печени у мышей с массивным кровотечением, объединяющую потерю крови, травматическую коагулопатию и показатели выживаемости. Данная модель позволяет оценивать эффективность гемостатических вмешательств, включая применение рекомбинантного фактора VIIa и транексамовой кислоты, наряду с анализом свертываемости крови, фибринолиза и летальности, предоставляя экономически эффективную и масштабируемую платформу для механистических и трансляционных исследований кровотечений.
Методическая статья
Модель разрыва печени у мышей, упрощающая количественную оценку травматической геморрагической коагулопатии, воспаления и выживаемости
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Неконтролируемое кровотечение остается одной из основных причин предотвратимой смерти у пациентов с травмами, а коагулопатия, вызванная травмой (TIC), является определяющим фактором ранней смертности. Экспериментальные модели, которые достоверно воспроизводят кровотечение и связанные с ним коагулопатические реакции, необходимы для изучения механизмов патогенеза и оценки эффективности таргетных вмешательств. В данной работе мы описываем стандартизированную мышиную модель массивного кровотечения с использованием воспроизводимого разрыва печени (LL) для индукции кровопотери, которая может быть точно количественно определена с одновременным мониторингом системной коагулопатии, маркеров воспаления и показателей смертности.
Мышам проводят стандартизированную срединную лапаротомию с последующим LL, а объем кровопотери количественно определяют по количеству крови на пропитанных губках. Системные маркеры коагуляции, фибринолиза и воспаления собирают путем ретроорбитального забора крови до процедуры и через определенные последовательные интервалы после нее. LL с кровопотерей достоверно вызывает TIC (характеризующийся удлинением активированного частичного тромбопластинового времени (aPTT), увеличением количества тромбин-антитромбиновых (TAT) комплексов, селективным истощением факторов (F) коагуляции V и VIII с активацией фибринолиза). Параллельно активация воспаления подтверждается повышенным уровнем интерлейкина-6 (IL-6). Кроме того, данная модель позволяет проводить анализ выживаемости после восстановления срединного разреза.
В качестве трансляционного применения rhFVIIa и TXA используются для подтверждения того, что данная модель чувствительна к купированию кровотечения при фармакологической модуляции параметров коагуляции и фибринолиза. По сравнению с моделями на крупных животных, эта мышиная система представляет собой экономичный, универсальный и легко масштабируемый способ изучения инновационных таргетных методов вмешательства при травматическом кровотечении.
Введение
Травма является одной из главных причин смерти и инвалидности среди молодых взрослых (возраст < 45 лет)1,2, при этом неконтролируемое кровотечение выступает основным фактором ранней смертности3. Критическим фактором неблагоприятных исходов у тяжелопострадавших пациентов является развитие травматической коагулопатии (ТК)4,5. ТК представляет собой сложную многофакторную дисрегуляцию гемостаза, характеризующуюся истощением факторов свертывания V и VIII6,7, нарушением фибринолиза7,8,9 и системной воспалительной активацией10. ТК способствует продолжению кровотечения и ассоциируется с повышенной потребностью в трансфузиях11, полиорганной недостаточностью5 и летальным исходом, несмотря на достижения в области реанимации по принципу контроля повреждений и терапевтических вмешательств5.
Таким образом, экспериментальные модели, которые достоверно воспроизводят геморрагический шок с сопутствующими коагулопатическими изменениями, имеют важное значение для изучения механизмов патогенеза и оценки эффективности таргетных гемостатических вмешательств. Модели контролируемого кровотечения основаны на стандартизированном отборе крови, который может не вызывать повреждения тканей, что влияет на системный коагулопатический ответ, наблюдаемый при клинических травмах12. Следовательно, модели кровопотери, включающие повреждение паренхиматозных органов, должны обладать большей клинической релевантностью при условии возможности количественной оценки продолжительного кровотечения и системных реакций13,14,15,16. Более сложные модели сочетанной травмы (TIC) включают комбинации черепно-мозговой травмы, переломов длинных костей или конечностей, повреждений мягких тканей, лапаротомии и контролируемого геморрагического шока для воспроизведения множественных компонентов тяжелой травмы17,18. Хотя такие подходы обеспечивают более полное представление о политравме, многоэтапные процедуры нанесения повреждений и физиологические манипуляции могут повысить техническую сложность и экспериментальную вариабельность.
Несмотря на десятилетия исследований, клинически значимые и воспроизводимые экспериментальные модели TIC остаются ограниченными и неоднородными. В обзорах подчеркивалась необходимость в надежных моделях, которые более точно воспроизводят клиническую последовательность повреждения тканей и геморрагического шока, а также позволяют оценивать эффективность терапевтических вмешательств17,19. Сложные модели, требующие обширного инструментария, включая катетеризацию сердца и непрерывный гемодинамический мониторинг, могут предоставлять детальную физиологическую информацию, но также требуют специализированного оборудования и дополнительных процедурных манипуляций. Для устранения барьеров в исследованиях травм критически важным представляется упрощение экспериментального подхода при сохранении ключевых особенностей TIC. В данной работе мы описываем стандартизированную мышиную модель, приводящую к неконтролируемому геморрагическому шоку14, с использованием воспроизводимой LL, которая вызывает массивное кровотечение и воспроизводит основные признаки TIC. Эта модель позволяет оценивать коагуляционные и воспалительные ответы, включая общие показатели коагуляции (aPTT и генерация тромбина), селективное истощение факторов свертывания (FV и FVIII), что является характерным признаком TIC, маркеры фибринолиза и профилирование цитокинов. Чтобы продемонстрировать чувствительность и релевантность данной модели по отношению к травмам у человека, мы оцениваем влияние rhFVIIa (гемостатического средства) и TXA (антифибринолитического средства), используемых при реанимации при травмах, на степень тяжести кровотечения, прогрессирование коагулопатии и показатели выживаемости.
Данная модель также поддерживает серийный и терминальный забор крови, что позволяет проводить лонгитюдную оценку траекторий коагуляции и воспаления в зависимости от степени тяжести повреждения и терапевтического вмешательства. В совокупности эта модель представляет собой воспроизводимую и масштабируемую мышиную систему для изучения TIC в условиях массивного кровотечения и для оценки гемостатических и таргетных фармакологических вмешательств с использованием клинически значимых конечных точек, включая потерю крови, коагулопатию, фибринолиз, воспаление и выживаемость.
По сравнению с ранее опубликованными моделями разрыва печени у мышей, включая протокол, описанный Dyer et al.13, данный метод вносит несколько ключевых методологических улучшений. К ним относятся количественное гравиметрическое измерение потери крови, стандартизация степени тяжести повреждения путем нормирования массы поврежденной печени к массе тела, а также комплексный анализ TIC, фибринолиза и воспаления. Кроме того, модель позволяет проводить серийный отбор проб, фармакологическую модуляцию и анализ выживаемости с подробным описанием методов закрытия брюшной полости, что обеспечивает физическое восстановление животных вместо их эвтаназии. Все процедуры могут быть выполнены в рамках одного экспериментального подхода, что создает масштабируемую и трансляционную платформу для изучения кровотечения и направленных гемостатических вмешательств.
Протокол
Институциональный комитет по уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Сан-Диего (UCSD) одобрил все протоколы работы с животными. Мыши линии C57BL/6J разводились и содержались в внутреннем питомнике UCSD. В экспериментах использовали самцов и самок мышей в возрасте от 8 до 10 недель. Схематический обзор хода и временной шкалы эксперимента представлен на Дополнительном рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер выборок определялся на основе предварительных экспериментов, ожидаемой вариабельности отдельных конечных точек и предыдущего опыта работы с моделью разрыва печени у мышей. Окончательные размеры выборок для отдельных экспериментальных конечных точек и экспериментальных групп приведены в соответствующих подписях к рисункам. Для измерения массы печени данные из нескольких независимых экспериментов были объединены с целью оценки согласованности между экспериментальными когортами. В коагуляционные тесты, проведенные в разных экспериментальных сериях, включались ранее проанализированные образцы для контроля межсерийной согласованности и воспроизводимости.
1. Предварительная подготовка к эксперименту
- Сбор исходных проб (День -1)
- За 24 ч до начала эксперимента возьмите ~200 µL крови из ретроорбитального синуса каждой мыши (возрастом 8–10 недель) для установления базовых параметров.
- После забора крови подкожно введите ~200 µL стерильного физиологического раствора для инъекций.
- Содержите мышей в чистых клетках в стандартных лабораторных условиях при контролируемой температуре 20–24 °C, относительной влажности 30%–70% и 12-часовом цикле свет/темнота, обеспечив свободный доступ к корму и воде до дня эксперимента.
- Подготовка клетки (День 0)
- В день эксперимента пересадите мышь в чистую клетку, застеленную свежими бумажными полотенцами.
- Уберите корм и воду за 15 мин до начала эксперимента и не предоставляйте их до момента извлечения абсорбирующих губок после операции.
2. Подготовка инструментов и операционного поля
- Стерилизация инструментов
- Простерилизуйте хирургические инструменты, вату, аппликаторы и фильтровальную бумагу в автоклаве.
- Дезинфицируйте рабочую поверхность 70% этанолом.
- Подготовка операционного стола
- Разложите стерильные инструменты на стерильной салфетке.
- Подготовьте контейнер из нержавеющей стали с 70% этанолом и стерильной ватой для промежуточной очистки инструментов.
- Включите стерилизатор с микросферами и дождитесь нагрева до 150 °C для стерилизации инструментов между операциями на разных животных.
3. Подготовка к поддержанию температуры
- Подготовка изотермической грелки
- Активируйте изотермическую грелку непосредственно перед операцией в соответствии с инструкциями производителя.
- Настройте изотермическую грелку так, чтобы поддерживать температуру тела мыши в целевом диапазоне 36–37 °C на протяжении всего периода анестезии и хирургического вмешательства.
- Убедитесь в равномерном распределении тепла по поверхности грелки.
- Поместите грелку на операционную платформу и накройте стерильной салфеткой.
- Подключите операционный стол к системе изофлуранового наркоза.
4. Анестезия и предоперационные процедуры
- Введение в наркоз
- Введите мышь в состояние наркоза, поместив её в индукционную камеру с 2% изофлураном в потоке кислорода 2 L/min.
- Подтвердите достаточность анестезии с помощью рефлекса при сжатии пальца лапы.
- Зафиксируйте массу тела животного перед операцией.
- Анальгезия и введение препаратов
- Для анальгезии введите бупренорфин (3.25 mg/kg подкожно).
- Подготовьте необходимые гемостатические средства.
- Животным в опытных группах за 5 min до нанесения повреждения введите рекомбинантный человеческий активированный фактор VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) или транексамовую кислоту (10 mg/kg) путем ретроорбитальной внутривенной инъекции.
- Животным контрольной группы введите эквивалентный объем (~100 µL) стерильного физиологического раствора для инъекций.
5. Хирургическая подготовка
- Подготовка операционного поля
- Перенесите анестезированную мышь на операционный стол, расположенный на изотермической подложке.
- Поддерживайте анестезию с помощью носовой маски, используя 1,5%–2% изофлурана в потоке кислорода 2 L/min на протяжении всей хирургической процедуры.
- Положите мышь на спину и зафиксируйте все четыре конечности с помощью ленты.
- Выбрейте шерсть в области живота.
- Проведите асептическую обработку, поочередно используя повидон-йод и 70% этанол (три цикла).
6. Процедура нанесения разрыва печени
- Предварительное взвешивание материалов
- Заранее взвесьте две пробирки объемом 1.5 mL, одну из которых с 0.5 mL физиологического раствора, а вторую — пустую.
- Заранее взвесьте по три первичных и два вторичных абсорбирующих треугольника для каждого животного и запишите их общую массу.
- Заранее взвесьте по одной лодочке для взвешивания для каждого животного для последующего определения массы иссеченной ткани печени.
- Индукция повреждения печени
- Выполните срединную лапаротомию длиной примерно 0.5 inch (12.7 mm) для обнажения печени.
- Разместите два абсорбирующих треугольника вдоль правой и левой брюшных стенок, избегая контакта с печенью.
- Выведите левую долю печени наружу и определите границы доли для стандартизации объема удаляемой ткани. Избегайте непреднамеренного повреждения тканей.
- С помощью острых ножниц сделайте разрез примерно 75% доли одним контролируемым движением для обеспечения единообразия у всех животных.
- Перенесите иссеченную поврежденную ткань в предварительно взвешенную пустую пробирку для последующей количественной оценки степени тяжести повреждения.
- Введите третий абсорбирующий треугольник в брюшную полость для обеспечения равномерного сбора крови в фазе кровотечения.
- Быстрое закрытие брюшной полости для поддержания внутреннего кровотечения (критический этап)
- Немедленно закройте брюшную стенку в течение ~10–15 s с помощью двух хирургических автоклипс.
- Обеспечьте точное совмещение краев разреза для достижения полного закрытия без зазоров. Неполное закрытие может привести к внешней утечке крови и недооценке кровопотери.
- При закрытии прикладывайте равномерное, но осторожное натяжение, избегая сдавления содержимого брюшной полости, что может изменить динамику кровотечения.
- Усильте закрытие с помощью тканевого клея (2–3 капли), чтобы обеспечить полную герметичность брюшного отдела.
- Мониторинг после повреждения
- Взвесьте иссеченную ткань печени и нормируйте полученное значение по массе тела для количественного определения и подтверждения степени повреждения печени.
- Верните мышь в клетку, помещенную на изотермическую подстилку.
- Дайте кровотечению продолжаться в течение 60 min для групп конечной точки и выживаемости.
7. Сбор крови и количественное определение потери крови
- Сбор и обработка образцов крови
- Для когорты с конечной точкой повторно проведите анестезию мыши изофлураном через 60 мин после разрыва печени.
- Для когорты выживаемости повторно проведите анестезию мыши изофлураном через 6 ч и 7 дней после разрыва печени для забора крови.
- Соберите кровь путем ретроорбитальной пункции в пробирки, содержащие раствор цитрата натрия (соотношение крови к антикоагулянту 9:1), для приготовления плазмы.
- Центрифугируйте образцы при 2,000 × g в течение 10 мин, после чего проведите второе центрифугирование при 12,000 × g в течение 5 мин для получения обедненной тромбоцитами плазмы для последующих анализов на коагуляцию и фибринолиз.
- Измерение кровопотери
- Через 60 мин после разрыва печени повторно вскройте брюшную полость у животных обеих когорт (с конечной точкой и выживаемости) и извлеките абсорбирующие губки, содержащие кровь.
- Перенесите все пропитанные кровью губки в предварительно взвешенную пробирку со стерильным физиологическим раствором.
- Используйте дополнительные предварительно взвешенные абсорбирующие губки для сбора остаточной крови в брюшной полости.
- Взвесьте пробирку после сбора крови, чтобы определить окончательный вес пробирки.
- Рассчитайте кровопотерю, используя следующее гравиметрическое уравнение:
Кровопотеря (µL/g) = [(конечный вес пробирки − начальный вес пробирки – вес абсорбирующей губки) / вес тела мыши] × 1000.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все значения веса выражены в граммах. Коэффициент 1 000 переводит граммы крови в микролитры, исходя из плотности крови примерно 1 g/mL.
- Когорта выживаемости и лонгитюдных исходов
- После измерения кровопотери через 60 мин немедленно закройте разрез с помощью хирургических скоб и тканевого клея, чтобы обеспечить полную герметичность брюшной полости.
- Перед выходом из наркоза подкожно введите 400 µL стерильного физиологического раствора.
- Верните мышь в стандартную клетку и обеспечьте непрерывный мониторинг в период восстановления после анестезии; проведите осмотр через 2 ч, 6 ч и 24 ч после операции, затем осуществляйте ежедневный мониторинг до 7-го дня.
8. Послеоперационный уход
- Послеоперационный мониторинг
- Непрерывно наблюдайте за животными в период раннего восстановления после наркоза на предмет признаков дистресса или заболеваемости.
- Регистрируйте статус выживаемости и клинические наблюдения при каждом плановом обследовании.
- Поддерживающий уход
- Ежедневно в течение 3 дней подкожно вводите 400 µL стерильного физиологического раствора.
- Проводите анальгезию (бупренорфин, 3.25 mg/kg, подкожно) каждые 72 h в соответствии с утвержденным протоколом по уходу за животными.
- Содержите мышей в стандартных клетках со свободным доступом к корму и воде.
- Гуманные конечные точки
- Наблюдайте за животными на предмет достижения предопределенных гуманных конечных точек, включая выраженную или стойкую летаргию, невозможность передвигаться или самостоятельно получать пищу и воду, тяжелую дыхательную недостаточность, отсутствие реакции на раздражители или другие признаки тяжелого дистресса, указанные в утвержденном институциональном протоколе по уходу за животными.
- Эвтаназируйте животных, достигших предопределенных гуманных конечных точек, в соответствии с институциональными правилами.
- Продолжайте мониторинг выживаемости до 7-го дня или до достижения гуманной конечной точки.
9. Конечные процедуры и сбор тканей
- В заранее определенные конечные точки эксперимента подвергните мышей анестезии и проведите забор крови путем ретроорбитальной пункции.
- Проведите эвтаназию путем вдыхания CO₂ в соответствии с установленными институциональными правилами.
- Извлеките органы и подготовьте ткани для гистологического анализа согласно указанным далее процедурам.
10. Анализы на коагуляцию, фибринолиз и цитокины
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты, наборы для анализа и оборудование, используемые в данных процедурах, перечислены в Таблице материалов.
- Измерение АЧТВ
- Регистрируйте все показатели времени свертывания с помощью коагулометра, указанного в Таблице материалов.
- Смешайте 25 µL плазмы мыши с 25 µL реагента для определения АЧТВ и инкубируйте в течение 3 min при 37 °C. Инициируйте свертывание, добавив 25 µL CaCl₂ (25 mM), приготовленного в HBS (20 mM HEPES, 147 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7.4), и зафиксируйте время свертывания.
- Измерение активности FV, FII и FX
- Смешайте 5 µL плазмы мыши с 20 µL соответствующей плазмы с дефицитом фактора и 25 µL HBS, содержащего 0.5% бычьего сывороточного альбумина.
- Инкубируйте в течение 1 min при 37 °C и инициируйте свертывание, добавив реагент Innovin, указанный в Таблице материалов.
- Определите активность фактора относительно соответствующей калибровочной/контрольной системы.
- Измерение FVIII
- Определите уровень FVIII с помощью хромогенного анализа FVIII в соответствии с инструкциями производителя.
- Измерение фибриногена
- Определите концентрацию фибриногена методом Клаусса. Добавьте 10 µL плазмы мыши к 40 µL HEPES-солевого буфера, содержащего 0.01% бычьего сывороточного альбумина, и инкубируйте в течение 3 min при 37 °C.
- Инициируйте образование сгустка, добавив 25 µL тромбина (25 U/mL), и определите концентрацию фибриногена, используя калибровку анализа.
- Измерение биомаркеров плазмы
- Измерьте уровни комплексов TAT, комплексов PAP и D-димера в плазме с помощью коммерчески доступных наборов для анализа, указанных в Таблице материалов. Выполняйте каждый анализ в соответствии с инструкциями производителя.
- Используйте специфические для данного анализа стандарты, калибраторы и контроли, указанные производителями, и рассчитайте концентрации аналитов по соответствующим стандартным кривым.
- Измерение IL-6 в плазме
- Измерьте концентрацию IL-6 в плазме на исходном уровне, а также через 60 min и 6 h после разрыва печени, используя мультиплексный анализ цитокинов, указанный в Таблице материалов.
- Выполните анализ в соответствии с инструкциями производителя и проанализируйте данные с помощью программного обеспечения Q-View от производителя.
Результаты
Модель LL обеспечивает воспроизводимую и стандартизированную степень тяжести повреждения у мышей. На рисунке 1A показана стабильность массы поврежденной печени при нормализации по массе тела (%BW), при этом медианный показатель повреждения во всех экспериментальных группах составил 1,4% BW. Такая стабильность подтверждает надежность хирургического воздействия и обеспечивает воспроизводимость результатов между животными и в различных экспериментальных условиях. Возможность стандартизировать степень тяжести повреждения имеет решающее значение для оценки последующих физиологических реакций независимо от вариабельности повреждения тканей.
Валидация кровотечения и терапевтической модуляции в рамках данной модели продемонстрирована на Рисунке 1B. Мышам предварительно вводили физиологический раствор, прегемостатический агент rhFVIIa или антифибринолитический агент TXA, после чего объем кровопотери количественно определяли и нормировали по массе тела (µL/g). У мышей, получавших физиологический раствор, после LL наблюдалось значительное кровотечение, в то время как у мышей, получавших rhFVIIa или TXA, объем кровопотери был снижен. Эти результаты демонстрируют способность данной модели выявлять фармакологическую модуляцию кровотечения и оценивать эффективность гемостатических вмешательств в условиях неконтролируемого кровотечения.
Модель также воспроизводит ключевые особенности коагулопатии, вызванной травмой. Как показано на рисунке 1C, LL приводила к удлинению аПТВ, что указывает на нарушение свертываемости крови после повреждения. Лечение rhFVIIa или TXA ослабляло это удлинение, что свидетельствует о восстановлении коагуляционной функции. Аналогичным образом, генерация тромбина, оцениваемая по комплексам TAT, повышалась после LL и снижалась при лечении TXA, тогда как rhFVIIa не снижает уровни TAT (рисунок 1D), что предполагает модуляцию активации коагуляции.
Дальнейшая характеристика коагулопатии представлена на рисунке 2. LL привел к селективному истощению факторов свертывания V и VIII, что соответствует TIC, и эти изменения были устранены при лечении rhFVIIa или TXA (рисунок 2A,B). Напротив, уровни факторов II и X существенно не изменились (рисунок 2C,D), что указывает на то, что данные изменения происходят при сохранности факторов II и X, подтверждая преобладание фенотипа TIC над фенотипом, напоминающим disseminated intravascular coagulation (DIC).
Развитие фибринолиза после LL продемонстрировано на Рисунке 3. Уровни фибриногена снизились после травмы, что указывает на его потребление, и не были полностью восстановлены при применении rhFVIIa или TXA (Рисунок 3A). Напротив, уровни маркеров фибринолиза, включая комплексы плазмин-антиплазмин (PAP) и D-димер, после LL были повышены. rhFVIIa снизил уровни комплексов PAP, но не оказал значительного влияния на уровни D-димера. TXA снизил уровни как комплексов PAP, так и D-димера после LL (Рисунок 3B,C).
Наконец, на рисунке 4 оцениваются системный воспалительный ответ и показатели выживаемости. Уровни интерлейкина-6 (IL-6) в плазме измеряют через 60 мин и 6 ч после LL во всех группах лечения. Уровни IL-6 повышены в ранние временные точки во всех группах (рисунок 4A). Выживаемость в течение 7-дневного периода оценивают с помощью анализа Каплана-Мейера. Семидневная выживаемость составляет 75% в группе физиологического раствора, 55% в группе rhFVIIa и 80% в группе, получавшей TXA. Между группами физиологического раствора и TXA значимых различий не наблюдается, тогда как выживаемость в группе rhFVIIa значительно снижена по сравнению с группами физиологического раствора и TXA (рисунок 4B).
Рисунок 1: Валидация модели разрыва печени (LL): воспроизводимость степени повреждения, количественная оценка кровопотери и индукция коагулопатии. Тяжелое внутреннее кровотечение индуцируется срединной лапаротомией с последующим стандартизированным LL. Для оценки фармакологической модуляции кровотечения и коагулопатии мыши перед нанесением повреждения подвергались предварительной обработке физиологическим раствором (~100 µL), рекомбинантным активированным фактором VII человека (rhFVIIa; 3 mg/kg) или транексамовой кислотой (TXA; 10 mg/kg). (A) Степень повреждения количественно определяется как масса поврежденной печени, нормированная по массе тела (%BW), что демонстрирует воспроизводимую индукцию стандартизированного повреждения у разных животных. (B) Потеря крови определяется гравиметрическим методом и нормируется по массе тела (µL/g), что демонстрирует измеримое кровотечение, которое уменьшается при лечении TXA. (C) Активированное частичное тромбинопластиновое время (aPTT) и (D) тромбин-антитромбиновые (TAT) комплексы демонстрируют воспроизводимую индукцию коагулопатии после LL, при этом после лечения rhFVIIa или TXA наблюдается модуляция. Данные представлены в виде индивидуальных значений с медианой и межквартильным размахом; сравнения проводились с использованием непараметрического U-критерия Манна — Уитни (n = 5–21). ****P ≤ 0.0001. Адаптировано с разрешения Joseph et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Валидация коагулопатии, вызванной травмой (TIC), после разрыва печени (LL): селективное истощение факторов свертывания. Сильное внутреннее кровотечение индуцируется срединной лапаротомией с последующим стандартизированным LL. Перед нанесением травмы мышам вводят физиологический раствор (~100 µL), рекомбинантный человеческий активированный фактор VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) или транексамовую кислоту (TXA; 10 mg/kg) для оценки фармакологической модуляции коагулопатии. Параметры свертывания крови оценивают через 60 минут после LL. (A) Уровни фактора V и (B) фактора VIII демонстрируют воспроизводимое истощение после LL, что соответствует TIC. (C) Фактор II и (D) фактор X остаются относительно сохранными, что указывает на селективное истощение факторов свертывания, а не на их глобальное потребление. Данные представлены в виде отдельных значений с медианой и межквартильным размахом (n = 7–10). Статистические сравнения проводились с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Адаптировано с разрешения Joseph et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Валидация активации фибринолиза после разрыва печени (LL). Тяжелое внутреннее кровотечение индуцируют путем срединной лапаротомии с последующим стандартизированным LL. Для оценки фармакологической модуляции фибринолиза мышей перед нанесением травмы предварительно обрабатывают физиологическим раствором (~100 µL), рекомбинантным человеческим активированным фактором VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) или транексамовой кислотой (TXA; 10 mg/kg). Параметры фибринолиза оценивают через 60 минут после LL. (A) Уровни фибриногена демонстрируют снижение после травмы, что согласуется с активацией фибринолиза и истощением факторов коагуляции. (B) Уровни комплексов плазмин-антиплазмин (PAP) и (C) D-димера повышены после LL, что указывает на активную деградацию фибрина и системную активацию фибринолиза. Данные представлены в виде индивидуальных значений с медианой и межквартильным размахом (n = 8–13). Статистические сравнения проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Адаптировано с разрешения Joseph et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Валидация системного воспалительного ответа и оценка выживаемости после разрыва печени (LL). Тяжелое внутреннее кровотечение индуцируют путем срединной лапаротомии с последующим стандартизированным LL. Перед нанесением травмы мышам вводят физиологический раствор (100 µL), рекомбинантный человеческий активированный фактор VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) или транексамовую кислоту (TXA; 10 mg/kg). После травмы разрез брюшной полости закрывают с помощью зажимов для ран и тканевого адгезива, после чего животных возвращают в домашние клетки. Поддерживающий уход включает ежедневное подкожное введение физиологического раствора (400 µL) в течение первых трех дней после травмы. Образцы плазмы собирают через 60 min и 6 h после LL для оценки системной воспалительной активации. (A) Уровни интерлейкина-6 (IL-6) демонстрируют устойчивый системный воспалительный ответ после травмы. Данные представлены в виде индивидуальных значений с медианой и межквартильным размахом. Статистические сравнения проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна — Уитни (n = 9–13). (B) Семидневная выживаемость оценивали с помощью анализа Каплана — Майера, что демонстрирует способность модели поддерживать лонгитюдные конечные точки, основанные на исходах (n = 20). ****P ≤ 0.0001. Адаптировано с разрешения Joseph et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Схематический обзор модели разрыва печени и временной шкалы эксперимента.На данном рисунке обобщен ход эксперимента для стандартизированной мышиной модели разрыва печени (LL) при неконтролируемом кровотечении. Мышам проводят срединную лапаротомию с последующим воспроизводимым разрывом примерно 75% левой доли печени. Перед нанесением травмы мышам внутривенно через ретроорбитальную инъекцию за 5 мин до LL вводят либо физиологический раствор (~100 µL, контрольная группа), либо рекомбинантный человческий активированный фактор VII (rhFVIIa; 3 mg/kg), либо транексамовую кислоту (TXA; 10 mg/kg). Количественную оценку кровопотери проводят с помощью предварительно взвешенных абдоминальных салфеток, помещенных в брюшную полость в момент травмы, извлеченных через 60 мин после LL и взвешенных для определения общего объема кровопотери. Затем брюшную полость закрывают с помощью зажимов для ран и тканевого клея. Образцы крови собирают через ретроорбитальный доступ через 60 мин в группе конечной точки, а также через 6 h и 7 d в группе выживаемости. Плазму анализируют на параметры коагуляции, включая активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT), активность факторов свертывания, комплексы тромбин-антитромбин (TAT), комплексы плазмин-α2-антиплазмин (PAP) и D-димер через 60 мин. Профилирование цитокинов проводят через 60 мин и 6 h. Выживаемость мониторируют в течение 7 дней. Адаптировано с разрешения Joseph et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
В данном исследовании мы представляем воспроизводимую модель массивного кровотечения у мышей с использованием стандартизированного LL, которая объединяет количественную оценку кровопотери, характеристику TIC и воспаления, а также анализ выживаемости в рамках одного эксперимента. Модель обеспечивает стабильную степень тяжести повреждения, что подтверждается сопоставимым весом поврежденной печени, нормализованным по массе тела, позволяя при этом воспроизводимо оценивать кровотечение и системные гемостатические реакции в различных экспериментальных группах. Использование модели на мелких грызунах со стандартизированным повреждением и количественными показателями результатов позволяет эффективно оценивать несколько экспериментальных конечных точек в единой структуре, что способствует воспроизводимому и масштабируемому исследованию TIC без необходимости применения технически сложных процедур.
Важно отметить, что эта модель воспроизводит ключевые признаки TIC, включая увеличение общих показателей коагуляции (aPTT), усиление генерации тромбина, о чем свидетельствуют комплексы TAT, селективное истощение факторов коагуляции V и VIII, а также активацию фибринолиза, подтверждаемую повышенным уровнем комплексов PAP и образованием D-димеров. Эти изменения происходят при сохранном уровне факторов II и X, что указывает на преобладание фенотипа TIC, а не синдрома disseminated intravascular coagulation. Возможность одновременного количественного определения этих параметров обеспечивает трансляционно значимую основу для оценки нарушения гемостаза после травматического повреждения.
Ключевым преимуществом данной модели является включение выживаемости в качестве конечной точки в условиях травматического кровотечения. Для проверки клинически значимых стратегий спасения мы оценили действие rhFVIIa и TXA — двух препаратов, которые используются или исследуются для реанимации при травмах у людей. TXA продемонстрировал стабильный эффект в снижении потери крови, нормализации коагулопатии и фибринолитической активации, что привело к повышению выживаемости. Напротив, применение rhFVIIa сопровождалось значительным уровнем смертности, связанным с гиперкоррекцией гемостатических параметров и неполным контролем фибринолиза16.
Эти результаты подчеркивают важный аспект модели: выживаемость определяется сложным взаимодействием степени тяжести кровотечения, коагулопатии и системного ответа, а не изолированной коррекцией отдельных путей гемостаза. Представляется, что данная модель кровотечения чувствительна к интеграции биохимических параметров гемостаза с показателями выживаемости, которая является критическим определяющим фактором исхода в клинической практике. Хотя основным моделируемым повреждением в этой системе является тяжелое травматическое кровотечение, вторичное повреждение органов также может влиять на исход. В нашем предыдущем исследовании с использованием данной модели у мышей, получавших rhFVIIa, наблюдались легочные микротромбы и отложение фибрина, что было связано с повышенной смертностью; это указывает на возможный вклад тромбовоспалительного повреждения органов в общий исход16.
Хотя группа с имитацией операции в данном исследовании не была предусмотрена, ранее мы продемонстрировали, что лапаротомия без LL не приводила к развитию TIC, что указывает на необходимость дополнительной быстрой потери крови (шока) для возникновения характерных нарушений коагуляции, наблюдаемых при TIC14.
Для воспроизводимости данной модели важны несколько технических аспектов. Степень и локализация LL должны быть стандартизированы, поскольку вариации в объеме удаляемой ткани печени могут существенно повлиять на выраженность кровотечения и последующую коагулопатическую реакцию. В нашем протоколе удаляется ~75% левой доли печени, при этом вес поврежденной печени нормализуется по отношению к массе тела, что обеспечивает объективную оценку однородности травмы. Также критически важно быстрое и надежное закрытие брюшной полости для предотвращения внешней потери крови и поддержания условий ограниченного внутрибрюшного кровотечения в течение периода наблюдения. Для точного измерения потери крови следует последовательно извлекать предварительно взвешенные салфетки, используя одинаковую процедуру сбора и временные интервалы для всех экспериментальных групп. Эти шаги сводят к минимуму вариабельность, зависящую от оператора, и особенно важны, так как различия в начальной потере крови могут повлиять на последующую коагулопатию и выживаемость. Если до закрытия раны наблюдается избыточное кровотечение или происходит внешняя потеря крови, животное следует исключить из исследования.
Ограничением данной модели является ее сосредоточенность на повреждении одного органа, что не отражает гетерогенности политравмы, которая может включать переломы трубчатых костей, размозжение мягких тканей и другие сложные состояния шока. Однако такая локализация повреждения является намеренной особенностью модели, позволяющей изучать эффекты массивного кровотечения и TIC без дополнительной процедурной сложности и вариабельности, вносимых множественными видами травм. В заключение следует отметить, что данная мышиная модель LL представляет собой экономически эффективный (по сравнению с исследованиями на крупных животных), надежный и масштабируемый подход к изучению TIC и смертности, связанных с травматическим кровотечением. Благодаря сочетанию простой экспериментальной платформы на мелких грызунах со стандартизированным повреждением, количественным измерением потери крови, комплексным гемостатическим профилированием и оценкой выживаемости, данная модель является практической альтернативой более сложно оснащенным моделям травмы. Она позволяет проводить комплексную оценку потери объема крови, коагуляции (aPTT, FII, FV, FVIII, FX, TAT), фибринолиза (Fibrinogen, PAP, D-dimer) и показателей выживаемости в клинически значимом контексте, что делает ее подходящей для оценки антифибринолитических и таргетных гемостатических вмешательств.
Раскрытие информации
A.v.D. получал гонорары за участие в научно-консультативных советах, консультирование и выступления от компаний BioMarin, Regeneron, Pfizer, Bioverativ/Sanofi, CSL Behring, Novo Nordisk, Spark Therapeutics, Genentech и uniQure. A.v.D. является сооснователем Hematherix LLC, биотехнологической компании, разрабатывающей терапию на основе superFVa для лечения осложнений, связанных с кровотечениями. B.C.J., M.L.C. и R.M. не имеют конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарим доктора Лорана Мозье (Laurent Mosnier, PhD) за технические консультации.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| игла 25 G | BD Diagnostics | 305124 | |
| игла 30 G | BD Diagnostics | 305106 | |
| Система анестезии | Patterson Scientific | 78915712 | |
| реагент для определения АЧТВ — STA-C.K. Prest. 5 | Stago | 597 | |
| Автоклип | Fine Science Tools | 12022-19 | |
| Аппликатор для автоматических клипс | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Инструмент для удаления автоклипс | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma Aldrich | 10735078001 | |
| Хлорид кальция | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Капиллярная трубка – простой | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Ватный аппликатор | Medique | 19-090-701 | |
| Ватные тампоны | Fisher Scientific | 22-456-103 | |
| Набор для ИФА на D-димер | Invitrogen | EEL094 | |
| Изотермическая прокладка Delta Phase | Braintree Scientific | 50-195-4663 | |
| Этанол | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Ethiqa | Fidelis | SKU 072117 | |
| Плазма с дефицитом фактора II | Affinity Biologicals | FII-DP | |
| Плазма с дефицитом фактора V | Affinity Biologicals | FV-DP | |
| Плазма с дефицитом фактора VIII | Affinity Biologicals | FVIII-DP | |
| Плазма, обедненная фактором X | Affinity Biologicals | FX-DP | |
| Фильтровальная бумага, особо толстая, 7 см × 8,4 см | Fisher Scientific | PI88605 | |
| Пинцет Грефе | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Индукционная камера | Patterson Scientific | 78933385 | |
| Физраствор для инъекций | Hospira | 0409-4888-02 | |
| Innovin | Siemens Healthineers | 23-044-778 | |
| Изофлуран | Med Vet International | 50-304-2993 | |
| K824086 Chromogenix Coatest SP Factor VIII | Diapharma | K822585 | |
| Быстродействующий тканевый клей Liqui Vet | World Precision Instrument | 50-253-9340 | |
| Стерилизатор с микросферами | Fisher Scientific | 14-955-342 | |
| Микроцентрифужные пробирки – 1,5 мл | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Набор для мультиплексного анализа цитокинов мыши | Quansys Biosciences | 111049MS-13P | |
| Набор для анализа комплекса PAP | Biotechne | NBP3-06903 | |
| повидон-йод | Med Vet International | 50-283-2277 | |
| Рекомбинантный человеческий активированный фактор VII | Novo Nordisk | 0169-7001 | |
| Цитрат натрия | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Хирургическая простыня | Stoelting | 10-000-695 | |
| Хирургическая платформа Equaflow для мышей, блок распределения анестезии 5 | Patterson Scientific | 78919268 | |
| Хирургические ножницы | Fine Science Tools | 91405-11 | |
| Лента | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| набор для анализа TAT-комплекса | Siemens Healthineers | 23-044-704 | |
| Тромбин | Invitrogen | PIRP43100 | |
| Транексамовая кислота | Auromedics | 55150-0188-10 | |
| Триммер | Stoelting | 10-000-792 | |
| Система фильтрации на активированном угле WAG | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Лодочка для взвешивания | Fisher Scientific | 01-549-752 |
Ссылки
- Rhee P, et al. Increasing trauma deaths in the United States. Ann Surg. 2014;260(1):13-21.
- Kauvar DS, Lefering R, Wade CE. Impact of hemorrhage on trauma outcome: an overview of epidemiology, clinical presentations, and therapeutic considerations. J Trauma. 2006;60(6):S3-S11.
- Bernhardt IM, et al. Timing of trauma deaths due to uncontrolled bleeding have not changed in three decades: a multicenter study of patients in hemorrhagic shock. Am J Surg. 2025;250.
- Cohen MJ, Christie SA. Coagulopathy of trauma. Crit Care Clin. 2017;33(1):101-18.
- Kornblith LZ, Moore HB, Cohen MJ. Trauma-induced coagulopathy: the past, present, and future. J Thromb Haemost. 2019;17(6):852-62.
- Brohi K, et al. Acute traumatic coagulopathy: initiated by hypoperfusion: modulated through the protein C pathway? Ann Surg. 2007;245(5):812-8.
- Cohen MJ, et al. Early coagulopathy after traumatic brain injury: the role of hypoperfusion and the protein C pathway. J Trauma. 2007;63(6):1254-61; discussion 1261-2.
- Davenport RA, et al. Activated protein C drives the hyperfibrinolysis of acute traumatic coagulopathy. Anesthesiology. 2017;126(1):115-27.
- Moore HB, et al. Hyperfibrinolysis, physiologic fibrinolysis, and fibrinolysis shutdown: the spectrum of postinjury fibrinolysis and relevance to antifibrinolytic therapy. J Trauma Acute Care Surg. 2014;77(6):811-7; discussion 817.
- Johansson PI, et al. Traumatic endotheliopathy: a prospective observational study of 424 severely injured patients. Ann Surg. 2017;265(3):597-603.
- Vernon T, Morgan M, Morrison C. Bad blood: a coagulopathy associated with trauma and massive transfusion review. Acute Med Surg. 2019;6(3):215-22.
- Lie SL, Rognes IN. Human and animal models for studying hemorrhagic shock. Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2025;33(1):124.
- Dyer M, et al. Uncontrolled hemorrhagic shock modeled via liver laceration in mice with real time hemodynamic monitoring. J Vis Exp. 2017;(123).
- Joseph BC, et al. An engineered activated factor V for the prevention and treatment of acute traumatic coagulopathy and bleeding in mice. Blood Adv. 2022;6(3):959-69.
- Joseph BC, et al. Traumatic bleeding and mortality in mice are intensified by iron deficiency anemia and can be rescued with tranexamic acid. Res Pract Thromb Haemost. 2024;8(6):102543.
- Chumappumkal Joseph B, et al. The effects of recombinant human activated factor VII and tranexamic acid on traumatic bleeding and mortality in mice. Res Pract Thromb Haemost. 2026;10(3):103436.
- Ask A, et al. Spotlight on animal models of acute traumatic coagulopathy: an update. Transfus Apher Sci. 2022;61(2):103412.
- Mayer AR, et al. A systematic review of large animal models of combined traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Neurosci Biobehav Rev. 2019;104:160-77.
- Frith D, Cohen MJ, Brohi K. Animal models of trauma-induced coagulopathy. Thromb Res. 2012;129(5):551-6.
Перепечатки и разрешения
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно