Методическая статья

Оптимизированный протокол создания модели стеноза аортального клапана у мышей путем введения проводника

120 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72218

⸱

21 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cardiac Structure and Function, Institute of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, 3Cardiac Structure and Function Research Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе подробно описана оптимизированная модель стеноза аортального клапана у мышей C57BL/6, индуцированного проводником. Специальная платформа для поддержки сосудов, напечатанная на 3D-принтере, обеспечивает точный контроль кровотечения, что позволяет достичь 95% выживаемости через 24 часа (19/20) и 90% общего успеха модели через 4 недели (18/20).

Аннотация

Стеноз аортального клапана (САК) является серьезным сердечно-сосудистым заболеванием, распространенность которого растет в стареющем населении, однако дефицит тканей пораженного клапана существенно ограничивает исследования механизмов заболевания и разработку методов терапии. В данном протоколе создана и оптимизирована воспроизводимая модель САК на мышах путем усовершенствования метода повреждения клапана с помощью проводника по методике Хонды за счет контролируемого купирования кровотечения. Самцам и самкам мышей линии C57BL/6 наносили повреждение аортального клапана с помощью проводника; процедура была улучшена за счет использования специально разработанной 3D-печатной платформы для поддержки сосудов, которая обеспечивает точный контроль кровотечения при введении и извлечении проводника. Показатели исхода включали выживаемость через 24 ч, эхокардиографическую оценку через 4 недели и гистопатологическую валидацию. Оптимизированный протокол обеспечил выживаемость 95% через 24 ч (19 из 20 животных); среди выживших 94,7% (18 из 19) соответствовали заранее определенному критерию гемодинамического успеха через 4 недели, что дает общий показатель успеха модели 90% (18 из 20 животных), подтвержденный эхокардиографией и гистологическим анализом. Эта стандартизированная модель представляет собой надежную, воспроизводимую платформу для изучения механизмов дегенерации клапана и оценки потенциальных терапевтических вмешательств.

Введение

Клапанные заболевания сердца остаются серьезным бременем для системы здравоохранения как в развитых, так и в развивающихся странах, при этом их распространенность растет параллельно со старением населения1. Хотя транскатетерная имплантация аортального клапана (TAVI) изменила подход к лечению тяжелого аортального стеноза2,3, клеточные и молекулярные механизмы, вызывающие дегенерацию клапана, до сих пор изучены недостаточно, и не существует одобренной фармакологической терапии для замедления или обращения вспять прогрессирования заболевания4,5. Основным препятствием в исследовании заболеваний клапанов является ограниченная доступность пораженных тканей для анализа6,7. Образцы человеческого аортального клапана трудно получить в достаточном количестве, а животные модели, достоверно воспроизводящие патологические изменения клапана, также были крайне редки8. Этот пробел стимулировал постоянные усилия по разработке животных моделей, которые воспроизводят гемодинамические и гистологические признаки стеноза аортального клапана (САК).

Традиционные диетические подходы, такие как длительное кормление с высоким содержанием жиров мышей ApoE⁻/⁻, требуют 20–24 недель и характеризуются низким процентом успеха, так как лишь у небольшой части животных развивается выраженный стенотический фенотип9,10,11,12. Модель повреждения клапана, индуцированная проводником, описанная Honda et al., позволила устранить многие из этих недостатков за счет механического повреждения створок клапана через доступ к сонной артерии13. Оригинальная методика включает диссекцию сонной артерии, ретроградное проведение проводника к аортальному клапану, многократное царапанье створок и ротацию проводника, что вызывает быстрые гемодинамические изменения в течение нескольких дней и приводит к формированию стабильного стенотического фенотипа к 4 неделе13,14,15,16. Благодаря относительной скорости и прямому воздействию метод Honda получил широкое распространение в современных исследованиях клапанов. Однако остается ряд важных пробелов. Полные детали процедуры не были полностью задокументированы в литературе, отсутствует стандартизация между лабораториями, а роль контроля кровотечения — основного определяющего фактора периоперационной заболеваемости в данной модели — никогда не рассматривалась систематически. Эти несоответствия снижают воспроизводимость и ограничивают возможность трансляции результатов в клинику.

Было выдвинуто предположение, что систематическая оптимизация контроля кровотечения может существенно повысить выживаемость в периоперационном периоде и надежность модели. В данном протоколе представлен усовершенствованный и стандартизированный подход, основанный на методе Honda, с внедрением специально разработанной 3D-печатной платформы для поддержки сосудов. Это устройство позволяет регулировать продольное натяжение сонной артерии, обеспечивая полный временный гемостаз во время введения и извлечения проводника без раздавливания сосуда. Благодаря такому подходу оптимизированный протокол обеспечивает 95% выживаемость через 24 ч (19 из 20 животных); среди выживших 94,7% (18 из 19) соответствуют заранее определенному критерию гемодинамического успеха через 4 недели, что дает общий показатель успеха модели 90% (18 из 20 животных). Пошаговая документация процедуры представлена для обеспечения воспроизводимости в различных лабораториях.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры с животными, описанные в данном протоколе, проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Больницы Западного Китая (протокол № 20240311055). В работе использовались самцы мышей C57BL/6 (8–10 недель; примерно 22–25 g) и самки мышей C57BL/6 (8–10 недель; примерно 18–20 g). Все материалы, реагенты, инструменты, программное обеспечение и специализированные устройства, используемые в данном протоколе, включая специализированную платформу для поддержки сосудов, напечатанную на 3D-принтере, перечислены в Таблице материалов.

1. Предоперационная подготовка и хирургический разрез

  1. Анестезируйте мышь с помощью изофлурана (3% для индукции, 1,5–2% для поддержания), распыленного в 100% кислороде. Подтвердите достаточную глубину анестезии, убедившись в отсутствии педального рефлекса (сжатие пальца ноги).
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Изофлуран является летучим анестетиком. Используйте его при наличии системы активного удаления паров или в хорошо проветриваемом помещении, используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и соблюдайте правила техники безопасности вашего учреждения.
  2. Нанесите офтальмическую мазь на оба глаза. Поместите мышь в положение на спине на терморегулируемую хирургическую платформу, поддерживающую температуру 37 °C.
  3. Подготовьте операционное поле, удалив шерсть в передней области шеи с помощью химического крема для депиляции.
  4. Продезинфицируйте кожу, проведя три чередующихся цикла обработки повидон-йодом (или хлоргексидином) и 70% спиртом (или теплым стерильным физраствором), завершив процедуру антисептиком.
  5. Для проведения превентальной местной анальгезии введите 0,5% лидокаин подкожно вдоль запланированной линии разреза.
  6. Затем с помощью микрохирургических ножниц сделайте продольный разрез кожи по срединной линии (приблизительно 1,0–1,5 cm) на передней части шеи, сместив разрез немного вправо относительно средней линии трахеи.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Микрохирургические ножницы, иглы, проводники и другие острые предметы могут стать причиной травмы. Обращайтесь с ними осторожно и утилизируйте использованные острые предметы в специальные контейнеры для утилизации.

2. Изоляция сосуда и наложение швов

  1. Под хирургическим стереомикроскопом обнажите правую общую сонную артерию (RCCA), используя тупую диссекцию через вышележащие слои фасции и мышц. Осторожно отделите RCCA от прилежащего блуждающего нерва и окружающей соединительной ткани, стараясь избегать механического раздражения блуждающего нерва.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей процедуры поддерживайте слюнные железы и обнаженные ткани во влажном состоянии, орошая их теплым стерильным физиологическим раствором для предотвращения высыхания.
  2. Наложите постоянную лигатуру на дистальный конец RCCA с помощью шелковой нити 6-0, завязав надежный узел, который не проскальзывает.
  3. Наложите незатянутый скользящий узел из шелковой нити 6-0 вокруг проксимального сегмента RCCA, оставив его ослабленным для последующего использования при введении проводника.

3. Применение платформы и артериотомия

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед операцией стерилизуйте распечатанную на 3D-принтере платформу с помощью газа этиленоксида (EtO) с последующим достаточным проветриванием, а все металлические хирургические инструменты стерилизуйте в автоклаве.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Оксид этилена токсичен, огнеопасен и канцерогенен. Используйте стерилизацию EtO только в специализированных сертифицированных помещениях, обеспечьте надлежащую аэрацию и соблюдайте установленные в учреждении правила утилизации отходов.

  1. Осторожно вставьте напечатанную на 3D-принтере платформу для поддержки сосудов под изолированный сегмент правой общей сонной артерии (RCCA), расположив перевернутую V-образную вершину непосредственно под сосудом.
  2. Медленно отрегулируйте положение платформы, чтобы увеличить продольное натяжение RCCA, закрепив предварительно наложенные швы в последовательно более высоких боковых выемках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перевернутая V-образная вершина имеет угол 120°, что позволяет ей соответствовать кривизне сосуда, не сдавливая его стенку. Прекратите увеличивать натяжение в тот момент, когда артериальная пульсация перестанет быть визуально заметной. Этот критический визуальный конечный пункт обеспечивает временный гемостаз без избыточного повреждения сосуда.
  3. С помощью микрохирургических ножниц выполните небольшую поперечную артериотомию (примерно на половину окружности сосуда) на стабилизированном сегменте RCCA. При правильно установленном натяжении кровотечение должно быть минимальным или отсутствовать.

4. Введение проводника и повреждение клапана

  1. Под микроскопическим контролем введите проводник (диаметром 0,014 дюйма / 0,36 мм) в просвет артерии через поперечную артериотомию в ретроградном направлении по направлению к корню аорты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данный калибр является стандартным для опубликованных моделей повреждения проводником и приближен к диаметру просвета правой общей сонной артерии (RCCA) мыши (~0,4–0,5 мм), что обеспечивает соотношение диаметра проводника к сосуду примерно 0,7–0,9.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Проводник может перфорировать сосуды или окружающие ткани. Медленно продвигайте его под визуальным контролем; утилизируйте использованные проводники как острые предметы или загрязненные хирургические отходы.
  2. Затяните предварительно наложенный проксимальный скользящий узел вокруг сосуда и проводника для достижения полного гемостаза в месте введения. После закрепления скользящего узла осторожно удалите напечатанную на 3D-принтере платформу из-под сосуда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При возникновении непредвиденного кровотечения во время введения или если диаметр проводника создает чрезмерное трение, временно переместите платформу, чтобы помочь с гемостазом, или слегка ослабьте натяжение платформы, чтобы дать просвету сосуда расшириться перед повторной попыткой введения.
  3. Осторожно продвигайте проводник в ретроградном направлении через RCCA, за дугой аорты по направлению к аортальному клапану. Под контролем эхокардиографии в режиме реального времени подтвердите, что кончик проводника пересек аортальный клапан и entered в левый желудочек.
  4. При полностью затянутом проксимальном скользящем узле для поддержания гемостаза выполните механическое повреждение клапана, совершив 100 возвратно-поступательных движений проводником через аортальный клапан, после чего выполните 100 вращательных движений проводника по створкам клапана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество в 100 возвратно-поступательных и 100 вращательных движений было установлено в ходе обширной внутренней оптимизации как число, наилучшим образом сочетающее время процедуры с надежным индуцированием гемодинамически значимого стеноза.

5. Извлечение проводника и закрытие раны

  1. После завершения повреждения клапана медленно извлеките проводник из сосуда.
  2. Сразу же замените проксимальный скользящий узел на постоянный неразвязывающийся узел, чтобы перевязать проксимальную правую общую сонных артерию (RCCA) и предотвратить послеоперационное кровотечение.
  3. Закройте разрез кожи прерывистыми швами нейлоновой нитью 5-0 или хирургическими зажимами для ран.
  4. Не назначайте послеоперационный прием нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). Не вводите периоперационные антибиотики, так как процедура проводится в асептических условиях.
  5. Переместите животное в чистую, обогреваемую клетку для восстановления и непрерывно наблюдайте за ним до полного восстановления способности к передвижению.

6. Эхокардиографическая оценка трансвальвулярной гемодинамики

  1. Проведите эхокардиографическую оценку всех выживших мышей через 4 недели после операции для определения степени стеноза аортального клапана.
  2. Осуществите индукцию анестезии, поместив животное в индукционную камеру с 3% изофлураном в 100% кислороде. Подтвердите глубину анестезии, убедившись в отсутствии рефлекса отдергивания лапы. Депилируйте переднюю стенку грудной клетки с помощью химического крема для удаления волос. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза для предотвращения высыхания роговицы.
  3. Переместите анестезированную мышь на платформу для визуализации с регулируемой температурой в положение на спине.
  4. Зафиксируйте лапы к поверхностным электродам электрокардиографа (ЭКГ) для непрерывного мониторинга частоты сердечных сокращений. Титруйте концентрацию изофлурана (обычно 1,0–1,5%) для поддержания стабильной физиологической частоты сердечных сокращений в диапазоне 450–550 ударов в мин.
  5. Очистите переднюю стенку грудной клетки и нанесите обильный слой предварительно подогретого акустического контактного геля.
  6. Получение изображений в B-режиме
    1. Используя ультразвуковую систему Vevo 3100 с датчиком MX550D (40 MHz), нажмите кнопку управления B-Mode для начала двухмерной визуализации в реальном времени.
    2. Расположите датчик в левой парастернальной позиции для получения длинной оси левого желудочка, аортального клапана и восходящей аорты в парастернальном сечении. Оптимизируйте глубину, ширину и усиление 2D-сигнала.
  7. Получение данных в M-режиме и измерение параметров левого желудочка
    1. Из положения длинной оси в парастернальном сечении нажмите кнопку управления M-Mode. Расположите линию сканирования поперек левого желудочка на уровне папиллярных мышц.
    2. Нажмите Start для начала регистрации. После получения стабильной кривой, охватывающей не менее трех сердечных циклов, нажмите Save.
    3. В программе Vevo LAB с помощью инструмента LV Trace обведите эндокард в конце диастолы и конце систолы, зафиксируйте внутренние размеры левого желудочка, толщину передней и задней стенок (LVAWd, LVPWd) и массу левого желудочка.
  8. Переместите и измените угол наклона датчика для получения специализированного изображения дуги аорты.
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: Получение данного специфического ракурса дуги аорты крайне важно для точного измерения трансвальвулярной скорости, так как это обеспечивает оптимальное совмещение ультразвукового луча с направлением кровотока через аортальный клапан.
  9. Цветовое доплеровское картирование
    1. В режиме визуализации дуги аорты нажмите кнопку Color. Расположите цветовое окно над аортальным клапаном и проксимальной частью восходящей аорты.
    2. Отрегулируйте шкалу цветов и усиление так, чтобы систолический струю был четко виден без алиайзинга. Нажмите Start, затем Save.
  10. Измерение скорости методом импульсно-волнового доплера
    1. Нажмите кнопку управления PW Doppler. Расположите контрольный объем в самой узкой части струи (vena contracta) и примените коррекцию угла (<60°).
    2. Нажмите Start для начала записи спектральной кривой; после регистрации не менее трех сердечных циклов нажмите Save. В Vevo LAB измерьте пиковую трансвальвулярную скорость с помощью инструмента Peak Velocity, рассчитав среднее значение как минимум по трем циклам.

7. Гистологическая обработка и окрашивание корня аорты

  1. После эхокардиографической оценки подтвердите глубокую анестезию, убедившись в полном отсутствии рефлекса отдергивания лапы. Выполните перелом шейных позвонков как вторичный метод эвтаназии в соответствии с Руководством AVMA по эвтаназии животных (издание 2020 г.) и утвержденными в учреждении протоколами.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Трупы животных, иссеченные ткани и материалы, загрязненные кровью, являются биологическими/животными отходами. Утилизируйте их в соответствии с правилами биологической безопасности учреждения и правилами содержания животных.
  2. Выполните торакотомию с помощью хирургических микроножниц для обнажения сердца.
  3. Введите перфузионную иглу в верхушку левого желудочка и промойте системный кровоток холодным стерильным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Признаком успешной перфузии является обесцвечивание печени и легких.
  4. Извлеките целое сердце и погрузите его в 4% параформальдегид (PFA) при комнатной температуре минимум на 24 ч для обеспечения полной фиксации.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Параформальдегид токсичен и вызывает раздражение. Работайте с 4% PFA в химическом вытяжном шкафу, используя соответствующие СИЗ, и утилизируйте отходы PFA как опасные химические отходы.
  5. Перенесите фиксированную ткань в автоматический процессор тканей для последовательного обезвоживания через серию градиентных растворов этанола с последующим просветлением ксилолом и инфильтрацией парафином при 65 °C.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Ксилол огнеопасен и токсичен, а горячий парафин может вызвать ожоги. Работайте с ксилолом в вытяжном шкафу или в утвержденном процессоре и утилизируйте отходы, содержащие ксилол, как опасные химические отходы.
  6. Залейте обработанные сердца в парафиновые блоки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная ориентация сердца при заливке имеет решающее значение. Расположите сердце так, чтобы можно было выполнить поперечные срезы через корень аорты на уровне трех створок клапана.
  7. С помощью ротационного микротома сделайте серийные поперечные срезы толщиной 4–5 µm в плоскости аортального клапана, убедившись, что захвачены все три створки. Закрепите срезы на стеклянных предметных стеклах и храните при комнатной температуре.
  8. Выполните окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) выбранных стекол для оценки морфологии тканей, структурного ремоделирования и толщины створок клапана.
  9. Выполните окрашивание по методу фон Косса на соседних серийных срезах для обнаружения и количественной оценки дистрофической кальцификации, которая проявляется в виде темно-коричневых или черных минеральных отложений в створках клапана.

8. Имитация хирургической процедуры (ложнооперация)

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном разделе описывается процедура ложнооперированного (sham) контроля. Мыши группы ложнооперированного контроля подвергаются тем же процедурам анестезии, подготовки кожи, обнажения сосуда, артериотомии и ретроградного введения проводника, что и животные в группе с повреждением аорты проволокой (AWI); при этом проводник продвигается до надклапанного уровня, но не проводится через аортальный клапан, и механическое повреждение клапана не выполняется.

  1. Проведите анестезию мыши и подготовьте операционное поле, как описано в этапах с 1.1 по 1.5.
  2. Под контролем стереомикроскопа обнажите правую общую сонную артерию (RCCA) методом тупой диссекции, как описано в этапе 2.1.
  3. Наложите постоянную лигатуру на дистальный конец RCCA шелковой нитью 6-0 и завяжите свободный проксимальный скользящий узел (как в этапах 2.2–2.3).
  4. Выполните поперечную артериотомию и введите проводник, как описано в этапах с 3.1 по 4.2.
  5. Под контролем эхокардиографии продвигайте проводник в ретроградном направлении до надклапанного уровня восходящей аорты, убедившись, что кончик проводника НЕ пересекает аортальный клапан.
    ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ выполняйте движения по выталкиванию-вытягиванию или ротационные движения, которые могут привести к повреждению клапана, описанные в этапе 4.4. Извлеките проводник и немедленно перевяжите проксимальный отдел RCCA, как описано в этапах 5.1–5.2.
  6. Ушейте разрез кожи прерывающимися швами нейлоновой нитью 5-0 или с помощью зажимов для ран.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в группе AWI, интраоперационная анальгезия обеспечивается местной инфильтрацией лидокаином (этап 1.5). Перенесите животное в подогреваемую клетку для восстановления и наблюдайте до полного восстановления двигательной активности.
  7. Мышей группы Sham подвергайте такому же послеоперационному мониторингу, эхокардиографической оценке через 4 недели и гистологической обработке, как и мышей группы AWI.

9. Статистический анализ и дизайн исследования

  1. В ходе исследования 20 мышам (10 самцов, 10 самок) была проведена процедура AWI, а 6 мышам линии C57BL/6 (3 самца, 3 самки) была проведена имитация процедуры (Sham).
  2. Измерьте пиковую трансвальвулярную скорость (критерий, определяющий успех моделирования) у всех выживших животных (19 AWI, 6 Sham).
  3. Проанализируйте подробные эхокардиографические и гистологические показатели в заранее определенной сбалансированной по полу подгруппе из 6 мышей AWI (3 самца, 3 самки).
  4. Убедитесь, что все эхокардиографические и гистологические измерения проводятся исследователями, не знающими о распределении животных по группам (слепой метод).
  5. С помощью теста Шапиро-Уилка проверьте данные на нормальность распределения перед проведением параметрического анализа. Сравните две независимые группы (AWI и Sham) с помощью непарного двухстороннего t-критерия Стьюдента.
  6. Проанализируйте и представьте данные о выживаемости с использованием метода Каплана-Мейера.
  7. Выполните все анализы в программе GraphPad Prism. Представьте данные как среднее значение ± SEM, где p < 0,05 считается статистически значимым.

Результаты

Разработка платформы с 3D-печатью для остановки кровотечения

Для устранения периоперационного кровотечения — основного источника заболеваемости и смертности в традиционной модели стеноза аортального клапана (AVS), индуцированного проводником, — была разработана платформа 3D-печатной сосудистой поддержки (Рисунок 1). Платформа была изготовлена методом стереолитографии (SLA) из биосовместимой фотополимерной смолы (соответствующей стандартам USP Class VI / ISO 1093) с номинальной толщиной 1,07 мм. После печати детали промывали в изопропиловом спирте для удаления незатвердевшей смолы и подвергали последующему доотверждению под воздействием ультрафиолетового излучения. Полный файл проекта (.stp) прилагается, чтобы платформу можно было воспроизвести на стандартных SLA-системах. Платформа имеет инвертированную V-образную апикальную поверхность с углом при вершине, равным 120° (Рисунок 1A–B), который соответствует кривизне изолированной правой общей сонной артерии, не вызывая чрезмерного сжатия стенки. Несколько ступенчатых боковых вырезов (Рисунок 1C–D) это позволяет оператору задействовать предварительно наложенные швы и приложить к сосуду регулируемое продольное натяжение. Натяжение постепенно увеличивают до тех пор, пока артериальная пульсация не исчезнет — этот визуальный конечный пункт указывает на достижение адекватного временного гемостаза. Такой подход обеспечивает стабильность операционного поля для проведения артериотомии и введения проводника, позволяя при этом избежать чрезмерного сдавливания стенки сосуда.

Интраоперационное подтверждение положения проводника

Правильность расположения проводника проверяли на двух этапах процедуры. Сначала под прямым стереомикроскопическим контролем наблюдали за введением проводника в просвет RCCA через поперечную артериотомию в ретроградном направлении (Рисунок 2A). Затем с помощью эхокардиографии в режиме реального времени подтвердили, что кончик проводника пересек аортальный клапан и entered в левый желудочек. При визуализации в B-режиме проводник определялся как гиперэхогенный линейный артефакт, пересекающий плоскость аортального клапана (Рисунок 2B). Цветовое допплеровское картирование выявило локальный турбулентный поток на уровне аортального клапана, что послужило дополнительным подтверждением расположения проводника через створки клапана (Рисунок 2C; Дополнительное видео 1).

Периоперационная выживаемость и показатель успешности модели

Интеграция платформы с регулируемым натяжением в хирургический процесс обеспечила высокую выживаемость на раннем этапе. Анализ Каплана-Мейера показал, что выживаемость через 24 ч после операции составила 95% (19 из 20 мышей; Рисунок 3A). Посмертное исследование единственного погибшего животного не выявило признаков массивного кровотечения, структурных повреждений или ишемии миокарда, что позволяет предположить, что смерть была вызвана осложнениями, связанными с анестезией, а не хирургической травмой. Успешность создания модели через 4 недели оценивали по заранее определенному критерию: пиковая скорость трансвальвулярного кровотока более 2 0 mm/s в сочетании с подтверждающими гистологическими данными. Из 19 выживших животных этот порог был достигнут у 18 (94,7%), что дало общий показатель успешности модели 90% для всей когорты (18 из 20 мышей; Рисунок 3B). Результаты были сопоставимы для обоих полов: выживаемость через 24 ч составила 9 из 10 у самцов и 10 из 10 у самок, а показатель успешности модели через 4 недели составил 9 из 10 (90%) для обоих полов; единственный случай периоперационной смерти пришелся на самца (связано с анестезией), а единственный случай неудачи модели — на выжившую самку.

Эхокардиографическое подтверждение аортального стеноза

Трансторакальная эхокардиография через 4 недели после операции подтвердила гемодинамические изменения, соответствующие тяжелому аортальному стенозу в группе AWI. Количественные показатели эхокардиографии представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM); функциональные параметры и параметры ремоделирования левого желудочка анализировались у 6 мышей группы Sham и 6 мышей группы AWI, в то время как пиковая трансвальвулярная скорость измерялась у всех выживших мышей группы AWI и контролей Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Фракция выброса левого желудочка в группе AWI через 4 недели была несколько ниже, чем в контрольной группе Sham (56.21 ± 1.15% против 61.57 ± 2.12%; p = 0.0503; Рисунок 3C), однако эта разница не достигла статистической значимости. Записи импульсно-волнового доплера продемонстрировали выраженное увеличение скорости трансвальвулярной струи в группе AWI, которая достигла 2740.89 ± 104.10 mm/s по сравнению с 98.0 ± 126.24 mm/s в контрольной группе Sham (Рисунок 3D). Количественный анализ подтвердил высокозначимое повышение пиковой скорости трансвальвулярной струи в группе AWI относительно контролей Sham (p < 0.001; Рисунок 3E). Соответственно ранней фазе адаптации к перегрузке давлением, в группе AWI наблюдалось концентрическое ремоделирование левого желудочка: толщина передней стенки в диастоле была значительно увеличена (LVAWd 1.14 ± 0.02 против 0.96 ± 0.03 mm; p = 0.0016; Рисунок 3F), тогда как толщина задней стенки в диастоле и масса левого желудочка были выше, но не достигли статистической значимости (LVPWd 1.01 ± 0.12 против 0.76 ± 0.02 mm, p = 0.0650, Рисунок 3G; масса LV 124.51 ± 10.63 против 104.47 ± 2.45 mg, p = 0.0961, Рисунок 3H).

Гистопатологическая валидация ремоделирования и кальцификации клапанов

Гистологическое исследование корней аорты подтвердило данные эхокардиографии. Количественные гистологические показатели представлены как среднее значение ± SEM и были проанализированы для 6 мышей группы Sham и 6 мышей группы AWI. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) в группе AWI выявило выраженное утолщение створок и структурную дезорганизацию — признаки, которые отсутствовали в контрольной группе Sham (Рисунок 3I). Количественная морфометрия подтвердила значительное увеличение средней толщины створок клапана в группе AWI по сравнению с группой Sham (p < 0.001; Рисунок 3J). Окрашивание по методу фон Косса продемонстрировало обширную дистрофическую кальцификацию в утолщенных створках клапана группы AWI, которая определялась как темно-коричневые или черные минеральные отложения. В контрольной группе Sham отложения минералов были незначительными (Рисунок 3K). Количественный анализ изображений показал значительное увеличение общей площади кальцификации (µm2) в группе AWI относительно контроля Sham (p < 0.01; Рисунок 3L).

Схемы механических компонентов; промаркированные разделы A-D, иллюстрирующие конструктивные спецификации.
Рисунок 1Конструкция платформы для сосудистой поддержки, напечатанной на 3D-принтере, показанная в четырех проекциях. (A) Вид спереди-слева под углом. (B) Вид справа-сзади в косой проекции. (C) Вид сбоку на общую продольную геометрию платформы. (D) Вид под углом, подчеркивающий область вершины в форме перевернутой буквы V. Обозначения компонентов: 110, корпус платформы; 120, боковые рычаги; 121, ступенчатые боковые выемки; 130, рабочий конец; 140, вершина вставки в форме перевернутой буквы V; 150, опорная поверхность, контактирующая с сосудом; 160, переходный склон между соседними выемками; 190, правая общая сонная артерия (RCCA). Платформа изготовлена из биосовместимой фотополимерной смолы (структурная толщина: 1,07 мм). Трехмерный структурный чертеж был создан авторами на основе оригинального файла CAD-проекта (.stp) платформы для поддержки сосудов с помощью FreeCAD — бесплатного программного обеспечения для визуализации и моделирования CAD с открытым исходным кодом. Сторонние публикации или защищенные авторским правом чертежи не использовались. Оригинальный файл CAD-проекта доступен в качестве дополнительного файла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Хирургическая установка с введением катетера; ультразвуковые изображения кровотока и визуализация сосудов.
Рисунок 2Интраоперационное и эхокардиографическое подтверждение положения проводника. (A) Интраоперационная фотография, демонстрирующая ретроградное введение проводника (стрелка) через поперечную артериотомию в просвет правой общей сонной артерии (ПОСА) под прямым стереомикроскопическим контролем. (B) Эхокардиографическое изображение в B-режиме, на котором виден проводник (определяется как гиперэхогенный линейный артефакт; стрелка), пересекающий аортальный клапан и входящий в левый желудочек. (C) Изображение цветового допплеровского картирования при эхокардиографии, демонстрирующее локальный турбулентный поток на уровне аортального клапана, что подтверждает положение направляющего провода через створки клапана. Визуализация трансвальвулярного потока с помощью цветового допплеровского картирования в режиме реального времени во время позиционирования направляющего провода представлена на Дополнительное видео 1. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ выживаемости, график сравнения, скорость трансвальвулярного струйного потока, эхокардиограмма, результаты гистологического исследования.
Рисунок 3: Показатели выживаемости, гемодинамики, желудочкового ремоделирования и гистопатологические результаты оптимизированной модели повреждения аорты проволокой (AWI). (A) Кривая выживаемости Каплана-Мейера для мышей с AWI (n = 20) через 24 ч. (B) Успех (красный) и неудача (черный) моделирования в группе AWI через 4 недели (n = 20); успехом считалась пиковая трансвальвулярная скорость > 2 00 мм/с. (C) фракция выброса (ФВ; p = 0.0503). (D) Репрезентативные эхокардиограммы с использованием импульсно-волнового (PW) допплера мыши из группы ложного вмешательства (слева) и мыши с инфарктом передней стенки левого желудочка (AWI) (справа). (Е) пиковая трансвальвулярная скорость (n = 19 AWI, n = 6 Sham; p < 0.0001). (F) толщина передней стенки левого желудочка в диастоле (LVAWd; p = 0.0016). (G) толщина задней стенки левого желудочка в диастоле (LVPWd; p = 0.0650). (H) Масса левого желудочка (p = 0.0961). (I) Репрезентативные срезы корня аорты, окрашенные гематоксилином и эозином (Sham — слева; AWI — справа). (J) Толщина створки аортального клапана (p < 0.0001). (К) Репрезентативные срезы корня аорты, окрашенные по методу фон Коббе (Sham, слева; AWI, справа). (L) Общая площадь отложения кальция (µm2; p < 0,01). Масштабные отрезки = 500 µmНа всех количественных столбчатых диаграммах столбцы представляют средние значения, а планки погрешностей — стандартную ошибку среднего (SEM). Количественные сравнения между группами Sham и AWI на панелях C, E–H, J и L проводились с помощью двухстороннего t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Количественные данные получены от групп Sham и AWI (n = 6 в каждой группе), за исключением пиковой трансвальвулярной скорости на панели E, которая измерялась у всех выживших мышей группы AWI и контрольной группы Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительное видео 1: Цветовое допплеровское эхокардиографическое отображение трансвальвулярного кровотока во время позиционирования проводника. На видео в режиме реального времени представлена цветовое допплеровское изображение на уровне аортального клапана во время процедуры AWI, демонстрирующее локальный турбулентный поток, вызванный позиционированием проводника через створки клапана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В данном протоколе представлено детальное описание стабильной и безопасной животной модели аортального стеноза. Особенностью данного подхода является использование вспомогательной платформы, которая облегчает введение проводника в общую сонную артерию. Платформа изготовлена методом стереолитографической (SLA) печати из биосовместимой фотополимерной смолы (структурная толщина 1,07 mm) и имеет перевернутую V-образную апикальную поверхность с углом вершины 120°; полный файл проекта свободно доступен в виде дополнительного файла .stp. Это устройство обеспечивает плавное введение проводника, позволяет объективно контролировать периоперационную потерю крови и тем самым гарантирует краткосрочную и долгосрочную выживаемость мышей в данной модели. С момента первого описания модель, индуцированная проводником, была дополнительно усовершенствована и охарактеризована, включая варианты с различной степенью тяжести, при которых интенсивность повреждения титруется для создания стеноза от легкого до тяжелого17, а также в недавних отчетах были задокументированы ее периоперационные осложнения18; настоящий протокол опирается на эти работы, систематически решая проблему периоперационного кровотечения.

Несколько этапов данного протокола являются критически важными для успешного создания модели и заслуживают особого внимания. Во-первых, степень продольного натяжения, создаваемого с помощью 3D-печатной платформы, должна быть точно откалибрована: натяжение следует увеличивать только до тех пор, пока артериальная пульсация не станет визуально незаметной. Недостаточное натяжение приводит к продолжающемуся кровотечению во время артериотомии, тогда как чрезмерное натяжение создает риск повреждения эндотелия и разрыва сосуда. Во-вторых, проксимальный скользящий узел должен быть надежно затянут вокруг сосуда и проводника перед удалением платформы; преждевременное удаление платформы при недостаточно закрепленном узле является наиболее частой причиной кровоизлияния во время процедуры. В-третьих, необходимо подтвердить введение проводника в левый желудочек под контролем эхокардиографии. Без этого этапа проверки оператор не может быть уверен, что проводник правильно позиционирован у аортального клапана, и неполное повреждение приведет к неудаче при создании модели.

Можно ожидать и контролировать несколько распространенных осложнений. Если при введении проводника возникает кровотечение, платформу следует перепозиционировать под сосуд для восстановления временного гемостаза перед продолжением процедуры. У животных с сонными артериями меньшего калибра небольшое снижение натяжения платформы может расширить просвет сосуда для размещения проводника. Данная модель имеет несколько ограничений, которые следует учитывать при интерпретации результатов. Механическое повреждение проволокой вызывает острое механическое и воспалительное повреждение клапана, что отличается от хронического, липид-зависимого дегенеративного процесса, характерного для кальцифицирующего аортального стеноза у людей17,19,20,21. Следовательно, гистологические признаки — хотя и воспроизводят утолщение створок и дистрофическую кальцификацию — могут не полностью повторять все молекулярные события человеческого заболевания. Протокол был разработан и валидирован на мышах линии C57BL/6 обоих полов в возрасте 8–10 недель; однако применимость к другим линиям или старым животным требует независимой валидации. Половые различия в диаметре сонной артерии и анатомии сердца могут влиять на сложность операции и гемодинамические исходы; исследователям рекомендуется указывать пол как биологическую переменную в последующих анализах22. Кроме того, постоянное лигирование правой общей сонной артерии является неотъемлемой частью процедуры; хотя Виллизиев круг обеспечивает коллатеральную перфузию головного мозга у мышей и явных неврологических нарушений не наблюдалось, нельзя исключать незначительные когнитивные или цереброваскулярные эффекты. Исходная (допроцедурная) эхокардиография не проводилась; соответствующая ложнооперированная группа служила контролем нормального функционирования клапана; при возможности рекомендуется проведение исходного сканирования для обеспечения внутриживотного сравнения и выявления редких спонтанных аномалий аортального клапана, зарегистрированных у мышей C57BL/6 (~0,3% в немодифицированных линиях). Аортальная недостаточность в данном исследовании систематически не оценивалась; частота вызванной повреждением аортальной недостаточности и ее связь со степенью тяжести стеноза требуют отдельной оценки и будут рассмотрены в будущих работах.

Также следует рассмотреть потенциальные недостатки данной платформы. Устройство может оказывать механическое раздражение прилегающих структур, включая блуждающий нерв, который проходит вдоль сонной артерии; этот риск минимизируется за счет закругленных тупых краев платформы, её вершины с углом 120°, соответствующим форме сосуда, а также кратковременности применения. В данном исследовании не было отмечено нарушений дыхания или других явных осложнений, вызванных устройством. По сравнению с общепринятыми альтернативными подходами, этот оптимизированный протокол обладает несколькими практическими преимуществами. Диетические модели на мышах ApoE⁻/⁻ требуют 20–24 недель кормления жирами и приводят к вариативности стенотических фенотипов, при этом у многих животных не развивается гемодинамически значимое заболевание. Настоящий протокол позволяет получить стабильный стенотический фенотип в течение 4 недель с общим процентом успеха 90% (18 из 20 животных). По сравнению с оригинальным методом Honda с использованием проводника, основным преимуществом данного протокола является систематический контроль периоперационного кровотечения с помощью 3D-печатной платформы.

Кровотечение при введении проводника признано осложнением оригинальной методики, однако этой проблеме уделялось недостаточно внимания. По данным ретроспективного опыта той же лаборатории при использовании традиционной процедуры (без платформы, более 400 случаев), значительное интраоперационное кровотечение наблюдалось примерно в 40% случаев, при этом летальность после кровотечения составила ~60%, а выживаемость через 24 часа — ~75%, причем кровотечение — главным образом в месте доступа к сонной артерии — стало основной причиной практически всех периоперационных смертей. Это согласуется с данными Qian et al., которые определили кровотечение в месте пункции сонной артерии как главную причину периоперационной смерти в данной модели. Благодаря контролю кровопотери использование 3D-печатной платформы повысило 24-часовую выживаемость до 95%, при этом в данной когорте не было зафиксировано смертей, вызванных кровотечением. Поскольку кровотечение больше не является основным ограничивающим фактором, интенсивность механического повреждения может варьироваться для создания различной степени тяжести стеноза. Такая возможность настройки имеет прямое трансляционное значение: для потенциальных терапевтических средств с умеренным эффектом может потребоваться более выраженное исходное повреждение, чтобы выявить различия, связанные с лечением, которые в более легкой модели могли бы остаться незамеченными.

Данная модель хорошо подходит для нескольких категорий последующих исследований. Поскольку стенотический фенотип развивается в определенные и воспроизводимые временные сроки, модель может служить платформой для доклинической оценки потенциальных методов фармакологической терапии, направленных на замедление кальцификации или фиброза клапана23. Модель также совместима с генетическими подходами: данный протокол может быть применен к трансгенным или нокаутным мышам на генетическом фоне C57BL/6 для анализа вклада конкретных сигнальных путей в прогрессирование заболевания клапана. Кроме того, конечная точка через 4 недели предоставляет практическое окно для последовательного эхокардиографического мониторинга развития заболевания или ответа на лечение. Файлы дизайна 3D-печатной платформы могут быть свободно переданы в виде дополнительного файла в формате .stp, а стандартизация этого устройства между лабораториями, как ожидается, позволит дополнительно повысить воспроизводимость результатов между различными центрами.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов или конфликтов интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана Национальным основным проектом в области науки и технологий по неинфекционным хроническим заболеваниям (2026ZD0554300); Национальным природным научным фондом Китая (U23A20395, 82170375, 82500455); Природным научным фондом провинции Сычуань (2026NSFSC0552); Фондами фундаментальных исследований центральных университетов; научно-техническими проектами автономного района Сицзан, Китай (XZ202501ZY0120); а также проектом «1.3·5» Больницы Западного Китая Сычуаньского университета (ZYGD23021, 23HXFH009). Авторы благодарят Ципу Фэна (Центр экспериментов на животных Больницы Западного Китая Сычуаньского университета) за помощь в проведении ультразвукового исследования мелких животных.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Платформа для поддержки сосудов, напечатанная на 3D-принтереИндивидуальное изготовлениеН/ДИндивидуальная платформа для поддержки сосудов, напечатанная на 3D-принтере; прилагается дополнительный CAD-файл в формате .stp.
4% параформальдегидServicebioG1101-3MLФиксация тканей
Нейлоновая шовная нить 5-0Jinhuan MedicalF503Закрытие кожи прерывистыми швами
Шелковая шовная нить 6-0Jinhuan MedicalRC411Перманентное лигирование дистального отдела правой общей сонной артерии (RCCA) и проксимальный скользящий узел
Акустический контактный гель (предварительно нагретый)KepplerKL-250Эхокардиография
Биосовместимая фотополимерная смолаFormlabsRS-F2-BMCL-01Материал для SLA-печати, использованный для изготовления индивидуальной платформы для поддержки сосудов на 3D-принтере.
Мыши C57BL/6 (8–10 недель; самцы 22–25 г, самки 18–20 г)GemPharmatechC57BL/6Использованы оба пола; содержание в стандартных условиях
Газ этиленоксидИнституциональный центр стерилизацииН/ДСтерилизация индивидуальной платформы для поддержки сосудов, напечатанной на 3D-принтере.
FreeCADFreeCAD Project Association1.1.1CAD-визуализация и создание 3D-чертежа конструкции из файла .stp.
GraphPad PrismGraphPad Software9.0Статистический анализ и построение графиков
Проводник, диаметр 0,014 дюймаBoston ScientificH749393071900Механическое повреждение клапана аорты
Набор для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E)BeyotimeC0105SМорфология и толщина створок
ИзофлуранRWD Life ScienceR510-22-23% для индукции; 1,5–2% для поддержания в 100% O2
ЛидокаинShijiazhuang Pharmaceutical GroupH14024045Предварительная местная инфильтрация в месте разреза (0,5%, шаг 1.5)
Микрохирургические ножницыRWD Life ScienceF11022-11Разрез кожи, артериотомия, торакотомия
Датчик MX550D (40 МГц)FUJIFILM VisualSonicsMX550DЭхокардиография
Крем для удаления волос NairNair255 гДля депиляции передней поверхности шеи и грудной клетки
Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)ServicebioG4202-100MLПерфузия
Ротационный микротомLeica BiosystemsRM2125 RTSСерийное срезание с толщиной 4–5 µm
Стереомикроскоп (хирургический)OlympusSZX7Изоляция сосудов и микрохирургия
Система ультразвуковой диагностики высокого разрешения Vevo 3100FUJIFILM VisualSonicsVevo 3100Эхокардиография
Набор для окрашивания по методу фон КоссаServicebioG1043-20MLВыявление дистрофической кальцификации
КсилолNanjing Chemical Reagent Co., Ltd.C0430530209Прозрачивание тканей при обработке парафином.

Ссылки

  1. Otto CM, Newby DE, Hillis GS. Calcific aortic stenosis: a review. JAMA. 2024;332(23):2014–2026.
  2. Vincent F, et al. Transcatheter aortic valve replacement in bicuspid aortic valve stenosis. Circulation. 2021;143(10):1043–1061.
  3. Kraler S, et al. Calcific aortic valve disease: from molecular and cellular mechanisms to medical therapy. Eur Heart J. 2021;43(7):683–697.
  4. Blaser MC, Bäck M, Lüscher TF, Aikawa E. Calcific aortic stenosis: omics-based target discovery and therapy development. Eur Heart J. 2025;46(7):620–634.
  5. Lindman BR, et al. Calcific aortic stenosis. Nat Rev Dis Primers. 2016;2(1):16006.
  6. Yu Chen H, et al. Dyslipidemia, inflammation, calcification, and adiposity in aortic stenosis: a genome-wide study. Eur Heart J. 2023;44(21):1927–1939.
  7. Peeters FECM, et al. Calcific aortic valve stenosis: hard disease in the heart: a biomolecular approach towards diagnosis and treatment. Eur Heart J. 2018;39(28):2618–2624.
  8. Cai D, Saint L, Markley J, Chen SY. Novel humanized aortic valve calcification model. Circ Res. 2025;136(12):1632–1635.
  9. Rattazzi M, et al. Calcification of advanced atherosclerotic lesions in the innominate arteries of ApoE-deficient mice: potential role of chondrocyte-like cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(7):1420–1425.
  10. Aikawa E, et al. Arterial and aortic valve calcification is abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 2009;119(13):1785–1794.
  11. Hjortnaes J, et al. Arterial and aortic valve calcification inversely correlates with osteoporotic bone remodeling: a role for inflammation. Eur Heart J. 2010;31(16):1975–1984.
  12. Aikawa E, et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 2007;116(24):2841–2850.
  13. Honda S, et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014;34(2):270-278. doi:10.1161/ATVBAHA.113.302610.
  14. Zhu Z, et al. Models for calcific aortic valve disease in vivo and in vitro. Cell Regen. 2024;13:6.
  15. Zhong G, et al. Activation of Piezo1 promotes osteogenic differentiation of aortic valve interstitial cells through YAP-dependent glutaminolysis. Sci Adv. 2023;9(22):eadg0478.
  16. Li S, et al. Targeted inhibition of PTPN22 is a novel approach to alleviate osteogenic responses in aortic valve interstitial cells and aortic valve lesions in mice. BMC Med. 2023;21(1):252.
  17. Niepmann ST, et al. The graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics the human functional and morphological disease phenotype. Clin Res Cardiol. 2019;108(8):847–856.
  18. Qian N, et al. A novel mouse model of calcific aortic valve stenosis. Anim Models Exp Med. 2024;7(4):523–532.
  19. Iqbal F, et al. Sortilin enhances fibrosis and calcification in aortic valve disease by inducing interstitial cell heterogeneity. Eur Heart J. 2023;44(10):885–898.
  20. Billig H, et al. Aortic valve stenosis and osteoporosis: insights from a mouse model. BMC Cardiovasc Disord. 2025;25(1):562.
  21. Artiach G, et al. Omega-3 polyunsaturated fatty acids reduce aortic valve disease via the resolvin E1-ChemR23 axis. Circulation. 2020;142(8):776–789.
  22. Clayton JA, Collins FS. NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 2014;509(7500):282–283.
  23. Li B, et al. IGF1-mediated mesenchymal-endothelial transition as a potential regulatory target in calcific aortic valve disease. BMC Med. 2025;23(1):600.

Перепечатки и разрешения

Теги

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.