Влияние акупунктуры кожи головы в стиле движения на микроструктуру наружной капсулы и возбудимость спинального рефлекса в модели спастичности после инсульта у крыс

Краткое содержание

Этот протокол описывает акупунктуру кожи головы с движением в модели спастичности после инсульта у крыс и демонстрирует её оценку с помощью поведенческих, магнитно-резонансных томографий, гистологических и электрофизиологических оценок для изучения изменений наружной микроструктуры капсулы и возбудимости спинального рефлекса.

Аннотация

Спастичность после инсульта (ПСС) серьёзно ухудшает моторную функцию и качество жизни после инсульта. Нарушение кортико-ретикулоспинального пути и нарушение супраспинального нисходящего ингибирования считаются важными патологическими механизмами; однако нейронные и микроструктурные механизмы, лежащие в основе терапевтических эффектов акупунктуры скальпа с движением (MSSA), остаются неполностью изучены. Целью данного исследования было изучение влияния MSSA на PSS с помощью мультимодальной оценки, интегрирующей нейровизуализацию, электрофизиологию и гистологию в модели окклюзии средней церебральной артерии у крыс. Для количественного определения объёма инфаркта мозга была проведена магнитно-резонансная томография с T2-взвешенным видом, а для оценки микроструктурной целостности белого вещества наружной капсулы использовалась диффузионная тензорная томография. Окрашивание Luxol Fast Blue (LFB) оценивало целостность миелина внутри наружной капсулы, а записи H-рефлексов оценивали возбудимость спинального рефлекса. Были проведены корреляционные анализы для изучения взаимосвязи между объёмом инфаркта, микроструктурой белого вещества, возбудимостью спинного рефлекса и степенью спастичности. MSSA уменьшил объём инфаркта мозга, смягчил микроструктурные повреждения наружных капсул и ослабил демиелинизацию. Кроме того, MSSA улучшил аномальные параметры H-рефлекса, нормализовал возбудимость спинального рефлекса и снизил спастичность. Корреляционные анализы показали, что крупные инфаркты связаны с более сильным повреждением наружной капсулы, тогда как лучше сохранившаяся целостность белого вещества — с улучшенной регуляцией спинального рефлекса и менее выраженной спастичностью. Эти результаты свидетельствуют о том, что MSSA может облегчать PSS, снижая ишемическое повреждение мозга, сохраняя микроструктурную целостность наружной капсулы и улучшая связанную с кортико-ретикулоспинальной нисходящей функцией нисходящей функции, предоставляя доклинические доказательства в пользу терапевтического применения.

Введение

Спастичность после инсульта (ПСС) — это распространённое и инвалидизирующее следствие ишемического инсульта, клинически определяемое повышением мышечного тонуса, зависящего от скорости и длины. Это состояние часто приводит к аномальной осанке конечностей и дисфункциональным движениям, что серьёзно снижает моторную независимость пациентов и качество жизни, а также накладывает значительные экономические и опекунские нагрузки по всему^{миру 1,2}. Как типичное проявление синдрома верхних моторных нейронов, патогенез ПСС в первую очередь объясняется преувеличенной гипервозбудимостью рефлексов растяжения позвоночника. Накопленные нейроанатомические и нейрофизиологические исследования показали, что потеря нисходящей тормозной модуляции из экстрапирамидальной системы в спинномозговые рефлексные цепи является ключевым патологическим механизмом, лежащим в основе инициации и прогрессирования ПСС, при этом кортико-ретикулоспинальный путь служит основной нейронной цепью, опосредовывающей этот нисходящий ^{регуляторный контроль 3,4,5}.

Техника иглоукалывания является ключевым фактором эффективности акупунктуры и занимает ключевое место в клинической практике акупунктуры. Акупунктура с использованием движения (MSSA) — это уникальная техника иглоукалывания, специально разработанная для вмешательства в ПСС, которая сочетает акупунктуру кожи головы с одновременными активными или пассивными упражнениями на^{конечности 3}. Многочисленные клинические испытания показали, что MSSA обеспечивает лучшие результаты по сравнению с акупунктурой кожи головы или реабилитацией физических упражнений, снижая тяжесть спастичности, восстанавливает двигательную функцию и улучшает повседневную жизнь у переживших ^{инсульт} 6,7,8,9. Наши предыдущие исследования на животных дополнительно показали, что MSSA оказывает более выраженный антиспастический эффект, чем обычная акупунктура кожи головы в моделях PSS на крыс. Механистически эти терапевтические эффекты связаны с улучшением церебральной перфузии в ишемической полумясти, снижением возбудимости рефлекса растяжения позвоночника и повышенной экспрессией котранспортера калия-хлорида 2 (KCC2) в мотонейронах переднего рога спинного мозга. Эта молекулярная модуляция может дополнительно усиливать ингибирующую передачу γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), тем самым способствуя снижению^{спастичности 10,11}.

Существующие механистические исследования MSSA остаются ограниченными, и ранее не было исследований, специально изучающих, как верхнее внутримозговое белое вещество в экстрапирамидальных нисходящих путях влияет на развитие PSS. Внешняя капсула образует критически важный сегмент белого вещества в кортико-ретикулоспинальном пути; Он содержит кортико-тегментальные волокна, которые передают кортикальные сигналы к ретикулярному формированию ствола мозга, тем самым способствуя надспинному тормозному контролю спинальных рефлексных^{цепей 12,13}. В соответствии с этой анатомической ролью, многочисленные исследования картирования поражения и симптомов на основе вокселей показали, что повреждение внешней капсулы связано с спастичностью верхней и нижней конечностей после^{инсульта} 12,13,14. Эти анатомические и клинические наблюдения поддерживают выбор внешней капсулы в качестве основной области интереса (ROI). На сегодняшний день нет данных in vivo, подтверждающих, сохраняет ли MSSA микроструктурную целостность внешней капсулы или связаны ли такие изменения с изменениями возбудимости спинального рефлекса. Клинические оценки, основанные на поведенческих оценках, традиционной магнитно-резонансной томографии (МРТ) и электрофизиологических исследованиях, позволяют проводить только корреляционные анализы и могут зависеть от гетерогенности пациента, продолжительности заболевания и других клинических факторов. В отличие от этого, стандартизированные модели PSS на крысах обеспечивают строгий контроль экспериментальных переменных и единообразные протоколы вмешательства, тем самым предоставляя дополнительную платформу для механистических исследований.

Сосредоточившись на микроструктуре белого мозга и нейрофизиологической функции, это исследование интегрировало мультимодальные подходы, включая T2-взвешенную визуализацию (T2WI), диффузионную тензорную визуализацию (DTI), H-рефлексную электрофизиологическую запись, целенаправленное окрашивание наружной капсулы Luxol Fast Blue (LFB) и поведенческие оценки. Установив интегрированную рамку корреляции структуры-функции-поведения, данное исследование было направлено на изучение взаимосвязей между инфарктом мозга, наружной микроструктурой капсулы, возбудимостью спинального рефлекса и спастичностью после лечения MSSA в модели ПСС у крыс. Результаты направлены на предоставление доклинических доказательств в пользу связи между сохраненной целостностью внешней капсулы и снижением гипервозбудимости спинального рефлекса после MSSA, а также теоретической основой для трансляционного применения MSSA в реабилитации PSS.

Протокол

Сорок взрослых самцов крыс Sprague–Dawley (SD) весом 240–280 г были приобретены у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology [Лицензия No: SCXK (Jing) 2021-0011]. Все крысы содержались в Центре лабораторных животных Пекинского университета китайской медицины в контролируемых условиях, с температурой в комнате 23°C ± 1°C, относительной влажностью 50% ± 5%, с циклом света и 12 часов темноты, с свободным доступом к корму и воде. Крысы акклиматизировались в течение 5 дней, в течение которых одновременно проводились тренировки на беговой дорожке. Животные проходили акклиматизацию на беговой дорожке один раз в день со скоростью 10 м/мин в течение 15 минут за сессию без электрической стимуляции, чтобы снизить стресс при обращении.

Согласно нашему предыдущему исследованию, успех индукции ПСС методом окклюзии средней церебральной артерии (MCAO) составляет примерно 60^%15. Используя таблицу случайных чисел, 9 крыс были случайным образом выбраны заранее как фиктивная группа; Оставшиеся 31 крыса использовались для создания моделей. После успешного моделирования эти крысы случайным образом делили на модельную и группу MSSA. В итоге в каждую группу было включено девять крыс. Этот эксперимент был проведён в соответствии с принципами 3R по обеспечению благополучия лабораторных животных и одобрен Комитетом по этике животных Пекинского университета китайской медицины (BUCM 20250915-008).

Создание модели

Модель MCAO была установлена у крыс с использованием модифицированной техники внутрилюминального филамента. Крысы были анестезиированы 3% изофлураном для индукции, а анестезия поддерживалась с 1,5% изофлураном, подаваемым в кислороде с постоянной скоростью потока 1 л/мин на протяжении всей операции. Был сделан разрез шейной артерии по средней линии, затем тупая диссекция для обнажения правой общей сонной артерии (CCA), внешней сонной артерии (ECA) и внутренней сонной артерии (ICA). Нейлоновый монофиламентный шов (диаметр 0,36 ± 0,02 мм) был введён в ICA через ECA и продвинулся примерно на 18–20 мм до начала средней церебральной артерии (MCA) для достижения артериальной окклюзии. Сосуды были перевязаны, а разрез закрыт. Крыс затем помещали на грелку до восстановления после наркоза. Крысы в группе с фиктивной операцией подвергались аналогичному хирургическому воздействию CCA, ICA и ECA без установки внутрилюминального филамента.

После операции все крысы MCAO получили стандартизированный послеоперационный уход. Животных содержали на грелке при температуре 37°C первые 12 часов, чтобы предотвратить гипотермию. Хирургические разрезы очищались ежедневно в течение трёх дней подряд, ампициллин (100 мг/кг) вводился внутрибрюшническим инъекцией для профилактики инфекции, а размягчённая пища предоставлялась для поддержания достаточного питания. Общая активность, питание, состояние ран и моторика конечностей отслеживались ежедневно с 1 по 10 день после операции.

Неврологические дефициты оценивались исследователями, не относящимися к распределению по группам, с помощью шкалы неврологического дефицита Зеа Лонги, а мышечный тонус оценивался с помощью модифицированной шкалы Эшворта (MAS). Оценки проводились за день до операции (день −1), в день операции перед MCAO (день 0), а также в послеоперационные дни 1, 3, 5, 7 и 10. Крысы с показателями Зеа Лонга и MAS ≥1 на третий день послеоперационного периода считались успешными для успешной модели PSS.

Лечение MSSA

Вмешательства начались на 3-й день после операции. Место стимуляции акупунктуры кожи головы — это ипсилезсионная линия MS 6 (передняя теменно-височная косая линия). В соответствии с Национальным стандартом по стандартизированным манипуляциям акупунктурой на коже головы (GB/T 21709.2-2021), линия MS 6 простирается от GV 21 (Цяньдин) до GB 6 (Сюаньли).

Одноразовые стерильные иглоукалывающие иглы (0,25 × 13 мм) были введены под галеа апоневротика на GV 21 под углом примерно 15° относительно поверхности кожи головы и продвинуты к GB 6 вдоль передней теменно-височной косой линии до глубины примерно 10 мм. Быстрое вращение (200 оборотов в минуту) применялось непрерывно в течение 1 минуты. После 15 минут удержания иглы та же манипуляция с вращением повторялась один раз, в результате чего общее время удержания иглы составляло 30 минут. В течение всего периода удержания иглы крысы одновременно проходили упражнения на беговой дорожке с постоянной скоростью 10 м/мин.

Крысы из групп с фиктивным управлением и моделью не получали ни акупунктуру, ни упражнения на беговой дорожке. Для контроля неспецифического обращения и стресса сдерживания их аккуратно обрабатывали и фиксировали в держателях запасов без сжимания в течение 30 минут в день, что соответствует общей дневной продолжительности вмешательства группы MSSA.

Поведенческие оценки

Оценка Зеа Лонга для неврологических дефицитов:

Неврологические дефициты у крыс оценивались с помощью системы оценки Zea^{Longa 16}. Применялись следующие критерии: оценка 0 указывала на отсутствие неврологических нарушений и нормальное неограниченное движение; оценка 1 указывала на неполное выгибание передней или задней конечности противоположно поражённой стороне; оценка 2 указывает на круг в сторону противоположной стороны во время передвижения; балл 3 указывал на падение на противоположную сторону при ходьбе; а оценка 4 указывала на потерю сознания при отсутствии спонтанной ходьбы.

MAS для мышечного тонуса:

Тонус мышц оценивался с помощью MAS¹⁷. Критерии были определены следующим образом: степень 0, отсутствие повышения мышечного тонуса; степень 1 — небольшое повышение мышечного тонуса, с временным захватом или минимальным сопротивлением в конце пассивного сгибания и разгибания; степень 1+, заметное повышение мышечного тонуса, с временным захватом в среднем диапазоне движений и устойчивым сопротивлением во второй половине движения; 2-й степени, заметное увеличение мышечного тонуса, с сопротивлением на большей части движения, хотя конечность оставалась легко подвижной; 3-й степень — значительное повышение мышечного тонуса, что затрудняло пассивное сгибание и разгибание; и 4-й степень — ограниченное пассивное движение из-за жёсткости суставов. Оценка 1+ получила 2 балла, что дало максимальный балл MAS в этом^{исследовании 10} баллов.

Нейровизуализация T2WI для количественной оценки объёма инфаркта мозга

Все сканирования T2WI были получены с помощью МРТ-сканера PharmaScan, управляемого программным обеспечением ParaVision 360 (версия 3.5). Для количественного определения объёма инфаркта мозга была применена импульсная последовательность импульсов с турбо-быстрой ассоциацией с усилением релаксации (T2_TurboRARE, также называемая RARE/быстрым спин-эхом [FSE]). Параметры визуализации были настроены следующим образом: время повторения (TR) = 3000,0 мс, эхо (TE) = 33,0 мс, поле зрения (FOV) = 35,00 × 35,00^{мм 2}, размер матрицы = 250 × 250, толщина среза = 0,80 мм, количество срезов = 35, количество возбуждений (NEX) = 3,0, и угол переворота (FA) = 180,0°. Области инфаркта мозга были вручную выделены по срезу в программном обеспечении ITK-SNAP (версия 4.4.0) одним исследователем, ослеплённым к групповому распределению с помощью изменений интенсивности сигнала и морфологических характеристик, соответствующих ишемическому инфаркту. Объём инфаркта мозга затем автоматически рассчитывался программным обеспечением.

Нейровизуализация DTI для оценки целостности микроструктуры белого вещества

Данные МРТ были получены с помощью магнитно-резонансного сканера PharmaScan мощностью 7,0 тонна. Анестезия была индуцирована с помощью 3% изофлурана, подаваемого в сжатом воздухе (0,4–0,6 л/мин) и поддерживалась с 1% изофлураном на протяжении всего набора DTI. Температура корпуса поддерживалась с помощью термостатически контролируемой водяной бани на протяжении всей процедуры визуализации.

Во время МРТ-сканирования сначала применялась трёхплоскостная последовательность локализации для позиционирования мозга крысы внутри магнита. DTI проводилась с использованием аксиальной однозарядной спин-эхо эхо-планарной последовательности с такими параметрами: TR/TE = 3000/27 мс, матрица = 90 × 75, FOV = 20 × 15^{мм 2}, толщина среза = 0,7 мм, 30 направлений градиента диффузии и значения b 0 и 1000 с/^{мм 2}. Для анализа DTI интересующие области были выделены во внешней капсуле на срезах мозга в 1,3 мм позади брегмы. Параметрические карты фракционной анизотропии (FA), средней диффузионности (MD), осевой диффузии (AD) и радиальной диффузии (RD) были воссозданы с помощью программного обеспечения ParaVision 360. Данные выражаются как отношение поражённого полушария и противоположного здорового полушария.

Окрашивание LFB для оценки миелиновых повреждений и ремиелинизации

Окрашивание LFB проводилось для оценки структурных повреждений миелинизированных аксонов во внешней капсуле. Повреждение миелина, характеризующееся редкостью и вакуолированием миелина, было количественно измерено путём измерения интегрированной оптической плотности (IOD) волокон с LFB-окрашением в ROI во внешней капсуле с помощью программного обеспечения ImageJ (версия 6.0; порог в тонах серого 35–225). На основе стереотаксического атласа мозга крыс¹⁸ для каждого животного были проанализированы три корональных сечения при брегме +1,0 мм, −1,3 мм и −1,6 мм, соответствующих передней, средней и средне-задней частям наружной капсулы. Средний IOD по трём секциям рассчитывался для представления каждого животного (n = 4 на группу). Значения ипсилатерального IOD были нормализованы на противоположную сторону и выражены в^{процентах 19}.

Электрофизиологические записи для оценки возбудимости спинального рефлекса

Спинальный моносинаптический H-рефлекс был зафиксирован с помощью биологической системы экспериментов. Крыс слегка анестезиировали α-хлоралозой (50 мг/кг, внутрибрюшинно) для сохранения возбудимости спинального рефлекса во время электрофизиологических записей. Левый седалищный нерв был обнажён тупой диссекцией и помещён на биполярные крючковые электроды для электрической стимуляции. На открытый нерв периодически наносили жирный витаминный раствор для поддержания гидратации тканей и нейронной жизнеспособности. Пара записывающих электродов из нержавеющей стали была введена в межкостные мышцы левой задней лапы, а в хвост — заземляющий электрод. H-рефлекс был вызван с помощью монополярно-биполярного импульсного стимулятора длительностью импульса 100 мкс. Порог H-рефлекса и моторный порог (МТ) определялись с помощью постепенной электрической стимуляции, при этом ток увеличивался на 0,05 мА шагами до максимальной интенсивности 3,0 мА, чтобы избежать необратимого повреждения периферических нервов.

Используя ту же интенсивность стимуляции, что вызывала максимальный H-рефлекс (_{H max}), были доставлены импульсные стимулы разной частоты (0,3, 5 и 10 Гц) для получения амплитуд H-рефлексов на разных частотах стимуляции. Повторная импульсная стимуляция на частоте 0,3 Гц была применена для проверки того, что амплитуда M-волны остаётся в пределах 95% от исходного значения; в противном случае набор данных отбрасывался. Частотно-зависимое снижение H-рефлекса (FDD) рассчитывалось как процентное отношение амплитуд H-волны/M-волны (H/M) при 5 Гц и 10 Гц относительно 0,3 Гц, при этом соотношение H/M на 0,3 Гц служило базовым эталонным¹⁰.

Анализ данных

Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS (версия 20.0). Непрерывные данные представлены как среднее ± стандартного отклонения (SD). Нормальность данных оценивалась с помощью теста Шапиро–Вилка. Односторонний анализ дисперсии (ANOVA) использовался для сравнения традиционных результатов визуализации и других количественных переменных между группами. Когда была удовлетворена однородность дисперсии, проводились пост-хок тесты Бонферрони; в противном случае применялся тест T3 Даннетта. Поведенческие данные анализировались с использованием двусторонней ANOVA с фиксированными факторами в качестве экспериментальной группы и послеоперационного времени. Анализ корреляции Спирмана использовался для оценки ассоциаций между переменными исследования. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

MSSA улучшает неврологические функциональные нарушения

Двусторонние повторяющиеся измерения ANOVA выявили значимые основные эффекты времени (F[2.613, 62.71] = 315.3, p < 0.001) и группы (F[2, 24] = 142.9, p < 0.001), а также значительное взаимодействие времени × групповое взаимодействие (F[12, 144] = 99.94, p < 0.001) для неврологических показателей Zea Longa. За день до операции у всех крыс из групп с фиктивной операцией, модели и MSSA был балл Zea Longa 0, что указывало на сохранение базовой неврологической функции без неврологических нарушений. Начиная с первого послеоперационного дня, баллы Zea Longa постепенно увеличивались как в модельной, так и в группе MSSA. Значимой разницы между этими группами с первого по пятый день после операции не наблюдалось (p > 0,05). При продолжении вмешательства показатели Zea Longa в группе MSSA были значительно ниже, чем в модельной группе на 7-й и 10-й день после операции (p < 0,001), что свидетельствует о улучшении неврологической функции (рисунок 1A).

Рисунок 1. Акупунктура с движением на коже головы улучшает неврологические нарушения и снижает мышечный тонус у крыс с послеинсультной спастичностью. (A) Показатели неврологического дефицита Zea Longa, измеряемые до окклюзии средней церебральной артерии (MCAO; день −1), непосредственно перед MCAO (день 0), а также в послеоперационные дни 1, 3, 5, 7 и 10. (B) Баллы по модифицированной шкале Эшворта, измеряемые в соответствующие временные точки. Пунктирная вертикальная линия указывает на MCAO на 0-й день. Данные представлены как среднее ± стандартного отклонения (SD). Полоски ошибок обозначают SD. ***p < 0,001 для сравнений, указанных скобками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

MSSA снижает объём инфаркта мозга

У крыс, оперируемых с имитацией, были нормальные показатели T2WI с однородной интенсивностью паренхимального сигнала по всему мозгу. Патологическая гиперинтенсивность, инфаркт мозга, морфологические аномалии или расширение желудочков не наблюдалось (рисунок 2A). В отличие от этого, модельная группа проявила выраженную гиперинтенсивность T2 в ипсилатеральном полушарии головного мозга, соответствующую ишемической инфарктной области, а также заметное увеличение желудочков (рисунок 2A). Количественный морфометрический анализ показал, что объём инфаркта мозга значительно снизился в группе MSSA по сравнению с модельной группой (p < 0,001; Рисунок 2B). Вмешательство MSSA показано на рисунке 2C.

Рисунок 2. Акупунктура на коже головы в стиле движения снижает объём инфаркта мозга у крыс с послеинсультной спастичностью. (A) Репрезентативные изображения мозга с T2-взвешенным изображением (T2WI) из групп акупунктуры головы с фиктивным управлением и движением (MSSA) при 1,00, 0,20, −0,92 и −1,88 мм относительно брегмы. (B) Количественная оценка объёма инфаркта мозга по T2WI. Отдельные символы представляют отдельных животных. (C) Фотография вмешательства MSSA, выполненного одновременно с упражнениями на беговой дорожке. Данные представлены в виде среднего ± SD. Полоски ошибок обозначают SD. ***p < 0,001 по сравнению с модельной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

MSSA снижает мышечную спастичность после инсульта

Для баллов MAS двусторонние повторяющиеся измерения ANOVA выявили значимые основные эффекты времени (F[2.158, 51.79] = 183.7, p < 0.001) и группы (F[2, 24] = 57.68, p < 0.001), а также значительное время × групповое взаимодействие (F[10, 120] = 58.70, p < 0.001). У всех крыс был балл MAS 0 за день до операции и на первый день после операции, что отражает нормальный исходный мышечный тонус без спастичности. С третьего дня после операции показатели MAS постепенно увеличивались в группах модели и MSSA, что указывает на развитие спастичности конечностей после инсульта, при этом существенных различий между двумя группами на данный момент не наблюдалось. С 5-го по 10-й день после операции показатели MAS в группе MSSA были значительно ниже, чем в модельной группе (p < 0,01 до p < 0,001), что указывает на облегчение PSS (рисунок 1B).

MSSA сохраняет микроструктурную целостность белого вещества во внешней капсуле

Репрезентативные карты параметров DTI показаны на рисунке 3A. На 10-й день послеоперационного периода по сравнению с группой, оперированной с фиктивной операцией, модельная группа проявила заметное снижение соотношения фракционной анизотропии (rFA) внутри внешней капсулы (p < 0,001; Рисунок 3B), сопровождаясь значительным увеличением соотношений средней диффузии (rMD) и радиальной диффузии (rRD) (оба p < 0,001; Рисунок 3C,D). По сравнению с модельной группой, MSSA значительно увеличил rFA (p < 0,001; Рисунок 3B) и значительно снизил rMD и rRD (оба p < 0,01; Рисунок 3C,D). Значимой разницы в отношении аксиальной диффузии (rAD) между группами не наблюдалось (p > 0,05; Рисунок 3E). Положение крыс во время получения DTI и анатомическое расположение внешней капсулы ROI показаны на рисунке 3F,G.

Рисунок 3. Акупунктура на коже головы в стиле движения изменяет параметры диффузионного тензорного изображения у крыс с послеинсультной спастичностью. (A) Репрезентативные отображения фракционной анизотропии (FA), средней диффузионности (MD), осевой диффузии (AD) и радиальной диффузии (RD) из групп акупунктуры скальпа с помощью фиктивного и движущегося стиля (MSSA) на −1,30 мм относительно брегмы. (B–E) Количественная оценка соотношений ипсилезионной и контралатеральной FA (rFA), MD (rMD), RD (rRD) и AD (rAD) соответственно. Отдельные символы представляют отдельных животных. (F) Фотография крысы, расположенной для диффузионной тензорной визуализации (DTI). (G) Схематическое и соответствующее магнитно-резонансное изображение, показывающее интересующие наружные области капсулы. Данные представлены как среднее ± SD. Полоски ошибок обозначают SD. #p < 0,05, а ###p < 0,001 по сравнению с группой, управляемой с подделкой; **p < 0,01 и ***p < 0,001 по сравнению с модельной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

MSSA улучшает целостность миелина во внешней капсуле

Окрашивание LFB проводилось для оценки целостности миелина во внешней капсуле. С гистологической точки зрения миелинизированные волокна имели целостную морфологию и регулярное расположение в группе, оперируемой с подработкой, тогда как в наружной капсуле крыс-моделей MCAO наблюдались заметные потери миелина и структурная дезорганизация (рисунок 4A). Количественный анализ показал, что относительный IOD окрашивания LFB был значительно ниже в модельной группе, чем в группе с фиктивным использованием (p < 0,001; Рисунок 4B). По сравнению с модельной группой, группа MSSA показала значительно более высокие относительные значения IOD (p < 0,001; Рисунок 4B), свидетельствуя о улучшении целостности миелина во внешней капсуле после обработки MSSA.

Рисунок 4. Акупунктура на коже головы в стиле движения снижает наружное повреждение миелина от капсулы у крыс с послеинсультной спастичностью. (A) Репрезентативные панорамные срезы мозга, окрашенные Luxol Fast Blue (LFB), и увеличенные изображения на противоположные и ипсилезсионные наружные области капсулы, представляющие интерес (ROI) из групп фиктивно-управляемой, модельной и движущейся акупунктурой кожи головы (MSSA). Синие и красные блоки на панорамных изображениях указывают соответственно контралатеральные и ипсилезионные ROI. Масштабные полосы на увеличенных изображениях = 50 мкм. (B) Количественная оценка относительной интегрированной оптической плотности (IOD) окрашивания LFB в ипсилезионной внешней капсуле, нормализованная в противоположную сторону. Отдельные символы символизируют отдельных животных; n = 4 на группу. Данные представлены в виде среднего ± SD. Полоски ошибок представляют SD. ###p < 0,001 по сравнению с группой, управляемой с имитацией; p < 0,001 по сравнению с модельной группой; △p < 0,05 для сравнения, указанного в скобке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

MSSA подавляет гипервозбудимость H-рефлекса позвоночника

Репрезентативные записи M- и H-волн показаны на рисунке 5A, а электрофизиологическая система записи — на рисунке 5B. На 10-й день послеоперационного периода электрофизиологическая оценка показала, что по сравнению с группой с фиктивной операцией модельная группа демонстрировала значительно повышенный моторный порог (МТ; p < 0,001) и соотношение максимальной амплитуды H-волны к максимальной M-волне (H_max/M_max) (p < 0,001), умеренное увеличение задержки M-волн (p < 0,05), а также соответствующее снижение задержки H-рефлекса (p < 0,05; Рисунок 5C–H). По сравнению с модельной группой, группа MSSA демонстрировала значительно более низкий уровень MT (p < 0,001) и соотношение H_max/_m max (p < 0,001), а также значительно более высокий порог H-рефлекса (p < 0,001; Рисунок 5C–H). Существенных различий в интенсивности стимуляции, необходимой для получения_{H max}, экспрессированного как кратное MT, между группами модели и MSSA не было выявлено (рисунок 5H). Кроме того, при нормализации соотношения H/M на 0,3 Гц H-рефлекс FDD постепенно снижался с увеличением частоты стимуляции во всех трёх группах (рисунок 5I). При обоих частотах 5 Гц и 10 Гц соотношение H/M было значительно ниже в группе MSSA, чем в модельной группе ( обе p < 0,001), что указывает на частичное восстановление H-рефлексного FDD к физиологической картине (рисунок 5J; Таблица 1).

Рисунок 5. Акупунктура на коже головы в стиле движения снижает гипервозбудимость спинального рефлекса у крыс с послеинсультной спастичностью. (A) Репрезентативные наложенные следы M-волн и H-волн из групп с фиктивной моделью и движения в стиле акупунктуры кожи головы (MSSA). (B) Фотография электрофизиологической системы записи, показывающая место стимуляции седалищного нерва, записывающие электроды и заземляющий электрод. (C–H) Количественная оценка моторного порога (MT), максимального соотношения амплитуды H-волны к максимальной M-волне (_{H max}/_{M max}), задержки H-волн, порога H-рефлекса, задержки M-волн и интенсивности стимуляции, вызывающей_{H max} , выраженных как кратное MT соответственно. Отдельные символы представляют отдельных животных. (I) Репрезентативные H-рефлексные следы, полученные на частотах стимуляции 0,3 Гц, 5 Гц и 10 Гц в каждой группе. (J) Частотно-зависимое снижение H-рефлекса, выраженное как отношение H/M при 5 Гц и 10 Гц, нормализованное к соотношению H/M при 0,3 Гц. Затененные области представляют SD средних значений. Данные представлены как среднее ± SD. Полоски ошибок обозначают SD. #p < 0,05 и ###p < 0,001 по сравнению с группой, управляемой имитацией; p < 0,001 по сравнению с модельной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Группа	MT (mA)	Mmax (mV)	Hmax (mV)	M задержка (ms)	Задержка H (ms)	Порог H-рефлекса (×MT)	Hmax (×MT)	Соотношение H/M (0,3 Гц)	Соотношение H/M (5 Гц)	Соотношение H/M (10 Гц)
Фш (n = 9)	0,808 ± 0,218	11.119 ± 7.802	2.804 ± 2.896	4.567 ± 0.731	11.311 ± 0.849	1.296 ± 0.251	1,554 ± 0,264	0,452 ± 0,264	0,304 ± 0,155	0,176 ± 0,137
Модель (n = 9)	1.855 ± 0.203###	3.282 ± 2.040##	2.307 ± 1.296	5.333 ± 0.893	10.456 ± 1.056	0,729 ± 0,299	1,517 ± 0,303	0.826 ± 0.120##	0.741 ± 0.129###	0,684 ± 0,131###
MSSA (n = 9)	0,663 ± 0,236	5.908 ± 2.751	1.497 ± 0.688	4.744 ± 0.590	10.978 ± 0.602	1,939 ± 0,819	1.832 ± 1.557	0,556 ± 0,238*	0,390 ± 0,193**	0,142 ± 0,134

Таблица 1: Электрофизиологические параметры H-рефлекса у крыс с послеинсультной спастичностью. Электрофизиологические измерения, полученные из фиктивных, модельных и движущихся групп акупунктуры скальпа (MSSA), включая моторный порог (MT), максимальную амплитуду M-волны (_{M max}), максимальную амплитуду H-волны (_{H max}), задержку M-волны, H-волновую задержку, порог H-рефлекса, выраженный как кратное MT (×MT), интенсивность стимуляции вызывающей_{H max} выражается как кратное MT (×MT) и H/M, измеряемых на частотах стимуляции 0,3, 5 и 10 Гц. Данные представлены как среднее ± SD. ##p < 0,01 и ###p < 0,001 по сравнению с группой, управляемой с подработкой; *p < 0,05, **p < 0,01, и ***p < 0,001 по сравнению с модельной группой.

Корреляции между объёмом инфаркта T2WI, метриками DTI внешней капсулы, электрофизиологическими индексами и показателями MAS

Впервые были исследованы корреляции между объёмом инфаркта мозга, измеренным по T2WI, и показателями DTI внешней капсулы. В объединённом анализе объем инфаркта был сильно отрицательно коррелирован с rFA (ρ = −0,902, p < 0,001) и положительно коррелировал с rMD и rRD (ρ = 0,511, p = 0,03; ρ = 0,661, p = 0,003; Рисунок 6A–D). В анализе подгрупп не было выявлено значимых корреляций между объёмом инфаркта и параметрами DTI. Затем были оценены связи между метриками DTI внешней капсулы, электрофизиологическими показателями возбудимости спинального рефлекса и мышечным тонусом, оценёнными MAS. В объединённом анализе более низкий rFA был связан с более высоким соотношением_{H max}/_M max (ρ = −0,895, p < 0,001), тогда как более высокий rRD — с более низким порогом H-рефлекса (ρ = −0,504, p = 0,03; Рисунок 6E,F). Кроме того, более высокие соотношения_{H max}/_M и более низкие пороги H-рефлекса были связаны с более высокими баллами MAS (ρ = 0,760, p < 0,001; ρ = −0,479, p = 0,01; Рисунок 6G, H). Анализ подгрупп показал значительную отрицательную корреляцию между порогом H-рефлекса и баллом MAS только в модельной группе (ρ = −0,736, p = 0,03), тогда как значимые корреляции не наблюдались в группах с фиктивным управлением или MSSA.

Рисунок 6. Связи между объёмом инфаркта мозга, параметрами диффузионного тензорного изображения, индексами H-рефлексов и мышечным тонусом у крыс с послеинсультной спастичностью. (A–D) Ассоциации объёма инфаркта мозга, полученного по T2-взвешенной визуализации (T2WI), с ипсилезионными и контралатеральными соотношениями фракционной анизотропии (rFA), средней диффузии (rMD), радиальной диффузии (rRD) и аксиальной диффузии (rAD) соответственно. (E) Связь между rFA и максимальным соотношением амплитуды H-волны и максимальной M-волны (H_max/M_max). (F) Связь между порогом rRD и H-рефлекса. (G) Ассоциация между баллом H_max/M_max и модифицированной шкалой Эшворта (MAS). (H) Связь между порогом H-рефлекса и баллом MAS. Круги, квадраты и треугольники представляют собой соответственно группы акупунктуры кожи головы (MSSA) с фиктивным управлением, моделей и в стиле движения. Пунктирные линии соответствуют линейной регрессионной кривой подгонки, порождённой на основе измеренных данных. Общие и групповые коэффициенты корреляции Спирмана (ρ) и соответствующие значения p отображаются в каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Доступность данных:

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в опубликованную статью и в дополнительный материал. Исходные наборы данных, подтверждающие результаты данного исследования, приведены в Дополнительной таблице 1.

Дополнительная таблица 1. Исходные наборы данных, поддерживающие количественные анализы, представленные в этом исследовании. Рабочая тетрадь содержит сырые экспериментальные данные, используемые для поведенческих оценок, анализа инфарктного объёма T2 взвешенной визуализации (T2WI), метрик диффузионного тензорного изображения (DTI), количественной оценки окрашивания Luxol Fast Blue (LFB) и электрофизиологических измерений H-рефлекса для всех экспериментальных групп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

С точки зрения традиционной китайской медицины, ПСС относится к категории мышечно-сухожильных заболеваний, при этом основной патогенез называется церебральным повреждением, а спастичность конечностей — поверхностным^{проявлением 20}. Терапевтические стратегии должны учитывать как первичное поражение мозга, так и вторичные периферические^{проявления 21}. Логика MSSA подчеркивает целостную регуляцию от ишемического мозга до спастических конечностей, с терапевтическими целями — стимулировать кровообращение, разблокировать меридианы, расслаблять сухожилия и облегчать спастичность. Техника иглоукалывания играет ключевую роль в эффективности акупунктуры, и выбор подходящей техники, адаптированной к характеру заболевания, критически важен для достижения благоприятных клинических результатов. MSSA — это характерный метод акупунктуры кожи головы для PSS, который сочетает акупунктуру с активным или пассивным движением конечностей во время удержания^{иглы 3}. Недавний систематический обзор и мета-анализ показали, что MSSA оказывает превосходный эффект в снижении спастичности мышц, улучшении моторной функции и улучшении повседневной жизни у пациентов с ПСС по сравнению с обычной акупунктурой кожи головы или реабилитацией упражнений⁹. Примечательно, что одновременное применение акупунктуры кожи головы и реабилитации упражнений, реализованных в MSSA, даёт лучшие результаты, чем асинхронное вмешательство, что подтверждается клиническими доказательствами среднего качества⁹. MS 6, как определено в GB/T 21709.2-2021, представляет собой акупунктурную линию передней париетовисочной косой кожи головы, выбранную по анатомической значимости и установленной клинической^{полезности 9}. Она лежит над первичной и вторичной моторными корами, которые являются основными источниками нисходящих кортикобежных проекций, формирующих ретикулярный выход ствола мозга и модулирующих возбуждение позвоночного рефлекса. Клинически MS 6 является самой распространённой линейкой акупунктуры кожи головы для ПСС, что подтверждается вышеупомянутым мета-анализом, что делает её оптимальной целью для модуляции моторных путей в данном исследовании. Эти результаты подчеркивают отличительные процедурные характеристики и потенциальные клинические преимущества MSSA в управлении ПСС. Доклинические исследования также показали, что MSSA улучшает церебральную перфузию в ишемической полутени, а также модулирует возбудимость мотонейронов переднего рога спинного рога, обеспечивая предварительную механистическую поддержку для своего^{терапевтического применения 10,11}.

В современной неврологической теории патогенез ПСС в первую очередь связан с тремя взаимосвязанными патологическими процессами: нарушенным ингибированием супраспинального нисходящего движения, аномальной обработкой внутриспинального сигнала и изменёнными внутренними свойствами мышц. Среди них механизмы, с помощью которых супраспинальные нисходящие пути регулируют возбудимость спинального рефлекса, остаются неполностью изучены². Ретикулоспинальный тракт (РСТ) играет важную роль в поддержании баланса дуги рефлекса растяжения. Латеральный РСТ получает возбуждающий сигнал от контралатеральной премоторной коры и дополнительной моторной области через кортико-ретикулярный путь, опускается внутри дорсолатерального фуникуляса спинного мозга и осуществляет тормозной контроль над активностью рефлексов растяжения позвоночника. В отличие от этого, медиальная РСТ не регулируется контралатеральной корой, опускается внутри вентромедиального фуникуляса и способствует активности растягивательного рефлекса. Кортикальный инсульт нарушает кортико-ретикулярный путь, снижает возбуждающий вход в образование медуллярной ретикулярной системы и приводит к преобладанию медиальной РСТ активности. Этот дисбаланс способствует гипервозбудливости рефлексов растяжения позвоночника и клиническому проявлению спастичности конечностей³. Клинические нейровизуализационные исследования связали ПСС с поражениями премоторной коры, путамена, задней конечности внутренней капсулы и внешней капсулы^12,14,22. Среди них наружная капсула представляет собой ключевой проводник белого вещества в кортико-ретикулоспинальном пути — крупном экстрапирамидальном тракте, интегрирующем кортикальные входы, синапсы в ядрах ретикулярного ствола мозга и проецируя на спинный мозг для нисходящего тормозного контроля над α-мотонейронами и интернейронами²³. Эта анатомическая структура подтверждается нейронным трассированием и исследованиями DTI, которые последовательно определяют внешнюю капсулу как основное соединение между корой головного мозга, базальными ганглиями и стволом мозга^23,24. Примечательно, что спастичность всё чаще признаётся сетевым расстройством, возникающим вследствие нарушения баланса между несколькими нисходящими моторными системами, включая как кортикоспинальные, так и экстрапирамидальные пути, а не из-за дисфункции одного тракта. В этом контексте внешняя капсула служит представительной структурой для исследования экстрапирамидальных вкладов в ПСС, поскольку её участие постоянно связано с повышенной активностью спинального рефлекса, тогда как изолированные кортикоспинальные поражения чаще вызывают слабость без пропорциональной спастичности. Соответственно, мы выбрали внешнюю капсулу в качестве основной возврата инвестиций для изучения микроструктурных изменений белого вещества, связанных с тяжёлостью спастичности. В соответствии с этой системой, T2WI не выявил явного инфаркта мозга в группе с фиктивной операцией, тогда как заметные инфарктные поражения наблюдались в модельной группе. Лечение MSSA значительно улучшило неврологическую функцию, оценённую по шкале Зеа Лонги, что свидетельствует о нейропротективном эффекте при ишемическом повреждении мозга. Эффект MSSA, сохраняющий инфаркт, может включать несколько синергетических механизмов. Во-первых, показано, что MSSA усиливает региональную церебральную перфузию в ишемической полутети.¹⁰, создавая более благоприятную микросреду для выживания нейронов. Кроме того, хотя прямые доказательства существования MSSA в настоящее время ограничены, механистические исследования акупунктуры кожи головы показали несколько других путей, которые также могут способствовать участию, включая стимулирование ангиогенеза через активацию сигнального пути MATN2/WNT3a/β-катенина²⁵ а также ослабление постишемического нейровоспаления через подавление дифференцировки Th17, опосредованной RORγt, и восстановления баланса Th17/Treg²⁶. Эти данные позволяют предположить, что MSSA может использовать аналогичные нейропротективные механизмы, выходящие за рамки своих гемодинамических эффектов. Однако относительный вклад каждого пути остаётся предстоит определить и требует дальнейшего изучения.

DTI обеспечивает чувствительную количественную оценку микроструктуры белого вещества, при этом FA отражает целостность волокна, RD служит маркером демиелинизации, а AD отражает целостность^{аксонов 23}. В настоящем исследовании наружная капсула была выбрана в качестве ROI для оценки микроструктурных изменений, связанных с кортико-ретикулоспинальным путём при ПСС. По сравнению с группой, оперировавшейся с фиктивной схемой, у модельных крыс наблюдалось значительное снижение относительного FA вместе с заметным увеличением относительного MD и RD, что свидетельствует о нарушении целостности белого вещества, отёке мозга и демиелинизации внутри внешней капсулы. Окрашивание LFB дополнительно показало явную потерю миелина и дезорганизацию пучков белого вещества, что подтверждает гистологическую поддержку результатов DTI. В совокупности результаты нейровизуализации и гистологии указывают на то, что ишемическое повреждение связано с выраженным микроструктурным нарушением внешней капсулы, которая была ослаблена после лечения MSSA. H-рефлекс — это хорошо известная электрофизиологическая мера для оценки возбуждеемости α-мотонейронного бассейна и регуляции сверхспинального^{нисходящего движения 27}. _{Максимальное} соотношение H_max/M отражает общую возбудимость спинальных мотонейронов, тогда как порог H-рефлекса отражает пресинаптическое торможение, опосредованное спинальными интернейронами вместе с интегрированными супраспинальными нисходящими^{входами 27}. Нарушение кортико-ретикулоспинального пути, вызванное инсультом, ослабляет нисходящую тормозную регуляцию, что приводит к гипервозбудимости спинного мотоневрона, характеризующейся увеличенным соотношением H_max/_M max и снижением порога H-рефлекса²⁷. Наши предварительные эксперименты исследовали молекулярные механизмы, лежащие в основе антиспастических эффектов MSSA, демонстрируя, что эта терапия может повышать экспрессию KCC2 в позвоночнике и восстанавливать функцию ингибитора^{ГАМКергической 10}. Опираясь на эти молекулярные открытия позвоночника, настоящее исследование дополнительно проясняет механизмы верхнего супраспинального движения, вызывающие преувеличенные рефлексы позвоночника, демонстрируя, что микроструктурное повреждение наружной капсулы в кортико-ретикулоспинальном пути связано с заметно повышенной возбудимостью позвоночника. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что MSSA может способствовать реконструкции надспинальных нисходящих ингибиторных путей и обратить гипервозбудимость спинального рефлекса у крыс с ПСС.

Учитывая поперечный характер данных по пересечению, все корреляционные анализы следует интерпретировать как исследовательские и генерирующие гипотезы, а не как доказательства причинно-следственных связей. Были проведены корреляционные анализы для изучения взаимосвязи между инфарктной нагрузкой, микроструктурной целостностью внешней капсулы, возбудимостью спинального рефлекса и степенью спастичности. У всех животных большие объёмы инфаркта были связаны с более тяжёлыми микроструктурными нарушениями, вызванными DTI, внутри внешней капсулы, что указывает на связь между первичным ишемическим повреждением и изменениями вторичного белого вещества вдоль кортико-ретикулоспинального пути. Примечательно, что эти общие корреляции, по-видимому, были обусловлены в первую очередь межгрупповыми различиями, а не внутригрупповыми индивидуальными вариациями, поскольку значимые корреляции не наблюдались внутри одной отдельной группы. Более высокий относительный FA (rFA) был связан с более низким соотношением_{H max}/_{M max} , тогда как более высокий относительный RD (rRD) — с более низким порогом H-рефлекса, что соответствует представлению о сохранении целостности внешней капсулы с более эффективной нисходящей регуляцией ингибитора. Кроме того, более высокие соотношения_{H max}/_{M max} и низкие пороги H-рефлексов были связаны с более высокими показателями MAS, что подтверждает связь между электрофизиологическими изменениями и тяжесть спастичности. Анализ подгрупп также показал, что общие корреляционные закономерности преимущественно обусловлены межгрупповыми различиями. Примечательно, что значительная отрицательная корреляция между порогом H-рефлекса и показателем MAS наблюдалась только в модельной группе, что указывает на то, что нарушенная пресинаптическая ингибация может быть связана с большей спастичностью при нелеченных патологических условиях.

Следует учитывать несколько ограничений. Во-первых, отсутствие контрольных групп, ориентированных только на акупунктуру и только упражнения, исключает анализ их независимых и синергетических вкладов. Будущие исследования с использованием этих сравнительных групп помогут прояснить механизмы, лежащие в основе комбинированного вмешательства. Во-вторых, период наблюдения ограничивался острой фазой (послеоперационные дни 0–10), выбранной на основе окна пиковой спастичности в постоянной модели MCAO. Остаётся неизвестным, приносит MSSA устойчивые терапевтические преимущества после острой стадии, и валидация в хронических моделях PSS будет важна для определения его долгосрочного трансляционного потенциала. В-третьих, хотя MAS широко используется для оценки мышечного тонуса, он по своей сути субъективен и полуколичествен. Для дополнения этого ограничения H-рефлекс одновременно оценивался как объективная электрофизиологическая мера возбудимости спинального рефлекса. В-четвёртых, размер выборки был скромным из-за технических требований, связанных с мультимодальными оценками, и исследования с большим количеством животных повысили бы статистическую мощь и надёжность результатов. В итоге все конечные точки оценивались только на 10-й день после операции. Будущие исследования, включающие лонгитюдные оценки в несколько временных моментов, дадут более полное понимание временной траектории нейропластических изменений, вызванных MSSA.

Будущие исследования могут исследовать механизмы нейрогенеза и ремиелинизации после вмешательства MSSA. Поскольку DTI не может напрямую визуализировать регенерацию нейронов, дополнительные подходы, такие как нейронное трассирование и иммуногистохимия, могут дополнительно характеризуть нейронную пластичность и ремиелинизацию. С трансляционной точки зрения, метрики DTI наружной капсулы, особенно FA и RD, могут помочь стратификации пациентов с инсультом по тяжести повреждения кортико-ретикулоспинального пути и выявить тех, кто наиболее вероятно получит пользу от MSSA. Такой подход, основанный на биомаркерах, может облегчить отбор пациентов и стратификацию лечения в будущих клинических испытаниях, хотя его клиническая полезность ещё предстоит проверить в проспективных когортах инсульта. В заключение исследование изучало нейронные механизмы, связанные с лечением MSSA при ПСС, используя интегрированную структуру, включающую оценку инфаркта на основе T2WI, оценку микроструктуры белого вещества с помощью DTI, электрофизиологию H-рефлексов и гистологический анализ LFB. Результаты свидетельствуют о том, что MSSA связан с уменьшением объёма инфаркта мозга, сохранением микроструктурной целостности наружной капсулы и улучшением нисходящей тормозной регуляции кортико-ретикулоспинального пути. Эти изменения сопровождались нормализацией возбудимости спинального рефлекса и снижением спастичности. В совокупности результаты дают механистические инсайты и доклинические доказательства, подтверждающие потенциальное трансляционное применение MSSA в управлении ПСС.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
α-Хлоралоз	GoldBio	C-118-250	Анестетик для регистрации H-рефлекса
Абсолютный этиловый спирт	Beijing Tong Guang Fine Chemicals Co., Ltd.	VS104021-500 мл	Гистологический реагент
Иглы для акупунктуры (0,25 × 13 мм)	Beijing Zhongyan Taihe Acupuncture Needle Co., Ltd.	НД	Одноразовые стерильные иглы для акупунктуры головы
Ампициллин	Beijing Rui Da Heng Hui Technology Development Co., Ltd.	HD-3018-500г	Антибиотик для профилактики послеоперационных инфекций
Электрофизиологическая система для исследований биологических функций (BL420N)	Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd.	НД	Электрофизиологическая регистрационная система
Программное обеспечение для анализа тензорного диффузионного изображения (ParaVision 360)	Bruker	НД	Получение МРТ и реконструкция ДТИ
Экологически безопасный раствор для депарафинизации и прояснения	Servicebio	G1128-500МЛ	Гистологический реагент
Полностью автоматический вращающийся микротом	Leica Microsystems	RM2255	Разрезка ткани
Огревающий поддон	Suzhou Caiyang Electric Heating Technology Co., Ltd.	TT180×150-1XD	Поддержка температуры после операции
ImageJ 6.0	National Institutes of Health	НД	Количественный анализ изображений
Изофлуран	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	I8000-25г	Ингаляционный анестетик
ITK-SNAP 4.4.0	University of Pennsylvania	НД	Сегментация мозгового инфаркта
Раствор Луксола быстрого синего	Servicebio	G1030-100МЛ	Окрашивание миелина
Монофиламентный нейлоновый шов (0,36 ± 0,02 мм)	Beijing Cinontech Co., Ltd.	НД	Индукция МКАО
Параформальдегид (4% в PBS)	Servicebio	TBAB0102	Фиксация ткани
Сканер магнитного резонанса PharmaScan 7.0 Т	Bruker	НД	Получение МРТ
SPSS Statistics 20.0	IBM	НД	Статистический анализ
Крысы Спраг-Доуэли (SPF, самцы)	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	НД	Экспериментальные животные
Система термостатически контролируемой водяной ванны	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co., Ltd.	ZX-5A	Поддержка температуры во время МРТ
Беговая дорожка для грызунов	Clever	TreadScan	Тренировки во время акклиматизации и МССА