Сорок взрослых самцов крыс Sprague–Dawley (SD) весом 240–280 г были приобретены у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology [Лицензия No: SCXK (Jing) 2021-0011]. Все крысы содержались в Центре лабораторных животных Пекинского университета китайской медицины в контролируемых условиях, с температурой в комнате 23°C ± 1°C, относительной влажностью 50% ± 5%, с циклом света и 12 часов темноты, с свободным доступом к корму и воде. Крысы акклиматизировались в течение 5 дней, в течение которых одновременно проводились тренировки на беговой дорожке. Животные проходили акклиматизацию на беговой дорожке один раз в день со скоростью 10 м/мин в течение 15 минут за сессию без электрической стимуляции, чтобы снизить стресс при обращении.
Согласно нашему предыдущему исследованию, успех индукции ПСС методом окклюзии средней церебральной артерии (MCAO) составляет примерно 60%15. Используя таблицу случайных чисел, 9 крыс были случайным образом выбраны заранее как фиктивная группа; Оставшиеся 31 крыса использовались для создания моделей. После успешного моделирования эти крысы случайным образом делили на модельную и группу MSSA. В итоге в каждую группу было включено девять крыс. Этот эксперимент был проведён в соответствии с принципами 3R по обеспечению благополучия лабораторных животных и одобрен Комитетом по этике животных Пекинского университета китайской медицины (BUCM 20250915-008).
Создание модели
Модель MCAO была установлена у крыс с использованием модифицированной техники внутрилюминального филамента. Крысы были анестезиированы 3% изофлураном для индукции, а анестезия поддерживалась с 1,5% изофлураном, подаваемым в кислороде с постоянной скоростью потока 1 л/мин на протяжении всей операции. Был сделан разрез шейной артерии по средней линии, затем тупая диссекция для обнажения правой общей сонной артерии (CCA), внешней сонной артерии (ECA) и внутренней сонной артерии (ICA). Нейлоновый монофиламентный шов (диаметр 0,36 ± 0,02 мм) был введён в ICA через ECA и продвинулся примерно на 18–20 мм до начала средней церебральной артерии (MCA) для достижения артериальной окклюзии. Сосуды были перевязаны, а разрез закрыт. Крыс затем помещали на грелку до восстановления после наркоза. Крысы в группе с фиктивной операцией подвергались аналогичному хирургическому воздействию CCA, ICA и ECA без установки внутрилюминального филамента.
После операции все крысы MCAO получили стандартизированный послеоперационный уход. Животных содержали на грелке при температуре 37°C первые 12 часов, чтобы предотвратить гипотермию. Хирургические разрезы очищались ежедневно в течение трёх дней подряд, ампициллин (100 мг/кг) вводился внутрибрюшническим инъекцией для профилактики инфекции, а размягчённая пища предоставлялась для поддержания достаточного питания. Общая активность, питание, состояние ран и моторика конечностей отслеживались ежедневно с 1 по 10 день после операции.
Неврологические дефициты оценивались исследователями, не относящимися к распределению по группам, с помощью шкалы неврологического дефицита Зеа Лонги, а мышечный тонус оценивался с помощью модифицированной шкалы Эшворта (MAS). Оценки проводились за день до операции (день −1), в день операции перед MCAO (день 0), а также в послеоперационные дни 1, 3, 5, 7 и 10. Крысы с показателями Зеа Лонга и MAS ≥1 на третий день послеоперационного периода считались успешными для успешной модели PSS.
Лечение MSSA
Вмешательства начались на 3-й день после операции. Место стимуляции акупунктуры кожи головы — это ипсилезсионная линия MS 6 (передняя теменно-височная косая линия). В соответствии с Национальным стандартом по стандартизированным манипуляциям акупунктурой на коже головы (GB/T 21709.2-2021), линия MS 6 простирается от GV 21 (Цяньдин) до GB 6 (Сюаньли).
Одноразовые стерильные иглоукалывающие иглы (0,25 × 13 мм) были введены под галеа апоневротика на GV 21 под углом примерно 15° относительно поверхности кожи головы и продвинуты к GB 6 вдоль передней теменно-височной косой линии до глубины примерно 10 мм. Быстрое вращение (200 оборотов в минуту) применялось непрерывно в течение 1 минуты. После 15 минут удержания иглы та же манипуляция с вращением повторялась один раз, в результате чего общее время удержания иглы составляло 30 минут. В течение всего периода удержания иглы крысы одновременно проходили упражнения на беговой дорожке с постоянной скоростью 10 м/мин.
Крысы из групп с фиктивным управлением и моделью не получали ни акупунктуру, ни упражнения на беговой дорожке. Для контроля неспецифического обращения и стресса сдерживания их аккуратно обрабатывали и фиксировали в держателях запасов без сжимания в течение 30 минут в день, что соответствует общей дневной продолжительности вмешательства группы MSSA.
Поведенческие оценки
Оценка Зеа Лонга для неврологических дефицитов:
Неврологические дефициты у крыс оценивались с помощью системы оценки ZeaLonga 16. Применялись следующие критерии: оценка 0 указывала на отсутствие неврологических нарушений и нормальное неограниченное движение; оценка 1 указывала на неполное выгибание передней или задней конечности противоположно поражённой стороне; оценка 2 указывает на круг в сторону противоположной стороны во время передвижения; балл 3 указывал на падение на противоположную сторону при ходьбе; а оценка 4 указывала на потерю сознания при отсутствии спонтанной ходьбы.
MAS для мышечного тонуса:
Тонус мышц оценивался с помощью MAS17. Критерии были определены следующим образом: степень 0, отсутствие повышения мышечного тонуса; степень 1 — небольшое повышение мышечного тонуса, с временным захватом или минимальным сопротивлением в конце пассивного сгибания и разгибания; степень 1+, заметное повышение мышечного тонуса, с временным захватом в среднем диапазоне движений и устойчивым сопротивлением во второй половине движения; 2-й степени, заметное увеличение мышечного тонуса, с сопротивлением на большей части движения, хотя конечность оставалась легко подвижной; 3-й степень — значительное повышение мышечного тонуса, что затрудняло пассивное сгибание и разгибание; и 4-й степень — ограниченное пассивное движение из-за жёсткости суставов. Оценка 1+ получила 2 балла, что дало максимальный балл MAS в этомисследовании 10 баллов.
Нейровизуализация T2WI для количественной оценки объёма инфаркта мозга
Все сканирования T2WI были получены с помощью МРТ-сканера PharmaScan, управляемого программным обеспечением ParaVision 360 (версия 3.5). Для количественного определения объёма инфаркта мозга была применена импульсная последовательность импульсов с турбо-быстрой ассоциацией с усилением релаксации (T2_TurboRARE, также называемая RARE/быстрым спин-эхом [FSE]). Параметры визуализации были настроены следующим образом: время повторения (TR) = 3000,0 мс, эхо (TE) = 33,0 мс, поле зрения (FOV) = 35,00 × 35,00мм 2, размер матрицы = 250 × 250, толщина среза = 0,80 мм, количество срезов = 35, количество возбуждений (NEX) = 3,0, и угол переворота (FA) = 180,0°. Области инфаркта мозга были вручную выделены по срезу в программном обеспечении ITK-SNAP (версия 4.4.0) одним исследователем, ослеплённым к групповому распределению с помощью изменений интенсивности сигнала и морфологических характеристик, соответствующих ишемическому инфаркту. Объём инфаркта мозга затем автоматически рассчитывался программным обеспечением.
Нейровизуализация DTI для оценки целостности микроструктуры белого вещества
Данные МРТ были получены с помощью магнитно-резонансного сканера PharmaScan мощностью 7,0 тонна. Анестезия была индуцирована с помощью 3% изофлурана, подаваемого в сжатом воздухе (0,4–0,6 л/мин) и поддерживалась с 1% изофлураном на протяжении всего набора DTI. Температура корпуса поддерживалась с помощью термостатически контролируемой водяной бани на протяжении всей процедуры визуализации.
Во время МРТ-сканирования сначала применялась трёхплоскостная последовательность локализации для позиционирования мозга крысы внутри магнита. DTI проводилась с использованием аксиальной однозарядной спин-эхо эхо-планарной последовательности с такими параметрами: TR/TE = 3000/27 мс, матрица = 90 × 75, FOV = 20 × 15мм 2, толщина среза = 0,7 мм, 30 направлений градиента диффузии и значения b 0 и 1000 с/мм 2. Для анализа DTI интересующие области были выделены во внешней капсуле на срезах мозга в 1,3 мм позади брегмы. Параметрические карты фракционной анизотропии (FA), средней диффузионности (MD), осевой диффузии (AD) и радиальной диффузии (RD) были воссозданы с помощью программного обеспечения ParaVision 360. Данные выражаются как отношение поражённого полушария и противоположного здорового полушария.
Окрашивание LFB для оценки миелиновых повреждений и ремиелинизации
Окрашивание LFB проводилось для оценки структурных повреждений миелинизированных аксонов во внешней капсуле. Повреждение миелина, характеризующееся редкостью и вакуолированием миелина, было количественно измерено путём измерения интегрированной оптической плотности (IOD) волокон с LFB-окрашением в ROI во внешней капсуле с помощью программного обеспечения ImageJ (версия 6.0; порог в тонах серого 35–225). На основе стереотаксического атласа мозга крыс18 для каждого животного были проанализированы три корональных сечения при брегме +1,0 мм, −1,3 мм и −1,6 мм, соответствующих передней, средней и средне-задней частям наружной капсулы. Средний IOD по трём секциям рассчитывался для представления каждого животного (n = 4 на группу). Значения ипсилатерального IOD были нормализованы на противоположную сторону и выражены впроцентах 19.
Электрофизиологические записи для оценки возбудимости спинального рефлекса
Спинальный моносинаптический H-рефлекс был зафиксирован с помощью биологической системы экспериментов. Крыс слегка анестезиировали α-хлоралозой (50 мг/кг, внутрибрюшинно) для сохранения возбудимости спинального рефлекса во время электрофизиологических записей. Левый седалищный нерв был обнажён тупой диссекцией и помещён на биполярные крючковые электроды для электрической стимуляции. На открытый нерв периодически наносили жирный витаминный раствор для поддержания гидратации тканей и нейронной жизнеспособности. Пара записывающих электродов из нержавеющей стали была введена в межкостные мышцы левой задней лапы, а в хвост — заземляющий электрод. H-рефлекс был вызван с помощью монополярно-биполярного импульсного стимулятора длительностью импульса 100 мкс. Порог H-рефлекса и моторный порог (МТ) определялись с помощью постепенной электрической стимуляции, при этом ток увеличивался на 0,05 мА шагами до максимальной интенсивности 3,0 мА, чтобы избежать необратимого повреждения периферических нервов.
Используя ту же интенсивность стимуляции, что вызывала максимальный H-рефлекс (H max), были доставлены импульсные стимулы разной частоты (0,3, 5 и 10 Гц) для получения амплитуд H-рефлексов на разных частотах стимуляции. Повторная импульсная стимуляция на частоте 0,3 Гц была применена для проверки того, что амплитуда M-волны остаётся в пределах 95% от исходного значения; в противном случае набор данных отбрасывался. Частотно-зависимое снижение H-рефлекса (FDD) рассчитывалось как процентное отношение амплитуд H-волны/M-волны (H/M) при 5 Гц и 10 Гц относительно 0,3 Гц, при этом соотношение H/M на 0,3 Гц служило базовым эталонным10.
Анализ данных
Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS (версия 20.0). Непрерывные данные представлены как среднее ± стандартного отклонения (SD). Нормальность данных оценивалась с помощью теста Шапиро–Вилка. Односторонний анализ дисперсии (ANOVA) использовался для сравнения традиционных результатов визуализации и других количественных переменных между группами. Когда была удовлетворена однородность дисперсии, проводились пост-хок тесты Бонферрони; в противном случае применялся тест T3 Даннетта. Поведенческие данные анализировались с использованием двусторонней ANOVA с фиксированными факторами в качестве экспериментальной группы и послеоперационного времени. Анализ корреляции Спирмана использовался для оценки ассоциаций между переменными исследования. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.