Пилюли Цзогуй модулируют сопряжение остеобластов и остеокластов у овариэктомированных крыс: трехфакторное исследование 3x3

Краткое содержание

В данном исследовании с использованием трехфакторного дизайна (3х3) оценивается влияние таблеток Цзогуй на постменопаузальный остеопороз у овариэктомированных крыс. Результаты подтверждают синергетический эффект компонентов Инь и Ян на костный метаболизм и связанные с ним маркеры сигнального пути EphB4/ephrinB2, хотя полученные данные о механизмах носят корреляционный, а не причинно-следственный характер.

Аннотация

Постменопаузальный остеопороз вызван разрывом связи между процессами образования и резорбции костной ткани, связанным с дефицитом эстрогенов. В данном исследовании количественно оценивались независимые и интерактивные эффекты субформул «питающих Инь» состава таблеток Цзогуй (Zuogui Pill) на модели овариэктомированных крыс, а также изучались связи с сигнальным путем EphB4/ephrinB2/RhoA/щелочная фосфатаза. В соответствии с руководством ARRIVE 2.0, 130 безыммунных самок крыс линии Sprague-Dawley были рандомизированы на 13 групп (n=10 в группе), включая девять групп в рамках трехфакторного дизайна (3х3). Конечные точки включали определение уровней P1NP, CTX-1, минеральной плотности костной ткани (МПК) бедренной кости, измеренной методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA), гистологический анализ трабекул, а также экспрессию матричной рибонуклеиновой кислоты и белков, измеренную с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и вестерн-блоттинга. Полная формула (I2A2) была связана с более высокими значениями P1NP, более низкими значениями CTX-1 и более высокой МПК по сравнению с группой модели. Факторный анализ выявил взаимодействие Инь-Ян между P1NP и МПК, что подтверждает фармакологический синергизм. Молекулярные изменения были связаны с повышенной экспрессией EphB4/ephrinB2/ALP и сниженной экспрессией RhoA. Эти результаты подтверждают связь между лечением таблетками Цзогуй, улучшением фенотипа костной ткани и модуляцией маркеров сигнального пути; подтверждение причинно-следственной зависимости пути требует валидации с использованием ингибиторов, нокаута генов и кокультивирования.

Введение

Постменопаузальный остеопороз (ПМО) затрагивает большое число женщин и характеризуется нарушением баланса между образованием и резорбцией костной ткани, связанным с дефицитом эстрогенов^1,2. Рецепторно-лигандная система EphB4/ephrinB2 опосредует взаимодействие между остеобластами и остеокластами; сигналинг EphB4 поддерживает дифференцировку остеобластов и активность щелочной фосфатазы (ALP), в то время как обратный сигналинг ephrinB2 может сдерживать остеокластогенез через механизмы, связанные с RhoA^3,4. Снижение сопряженности процессов в костной ткани при дефиците эстрогенов дает механическое обоснование для оценки терапевтических воздействий, влияющих на обе клеточные составляющие ремоделирования.

Современные методы терапии остеопороза, включая антирезорбтивные и анаболические препараты, снижают риск переломов, однако их применение может быть ограничено комплаентностью пациентов, стоимостью, противопоказаниями, эффектами рикошета или нежелательными явлениями при длительном использовании⁵. Следовательно, поиск потенциальных методов лечения, которые стимулируют костеобразование, ограничивая при этом избыточную резорбцию, остается научно актуальным.

Пилюли Цзогуй (ZGP; Zuo Gui Wan) — это классический многокомпонентный препарат, используемый в традиционной китайской медицине при дефиците эссенции почек, теоретическом паттерне, связанном с ослаблением костной ткани. Компоненты, питающие Инь, включают Rehmannia glutinosa (подготовленный корень, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (корневище, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (плод, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (плод, Gou Qi Zi, 12 g), желатин из пластрона Chinemys reevesii (желатин, полученный из пластрона, Gui Ban Jiao, 12 g) и Cyathula officinalis (корень, Chuan Niu Xi, 9 g). Компоненты, усиливающие Ян, включают Cuscuta australis (семена, Tu Si Zi, 12 g) и желатин из рогов Cervus elaphus (желатин, полученный из рогов, Lu Jiao Jiao, 12 g). Согласно классической теории, принцип поиска Ян внутри Инь предполагает, что травы, усиливающие Ян, могут потенцировать основу, питающую Инь, а не действовать просто как независимые добавки. Клинические данные и доклинические исследования продемонстрировали противоостеопоротическую активность ZGP или вмешательств с применением ZGP, включая воздействие на BMD (минеральную плотность кости), остеогенез и фармакокинетические показатели^6,7,8,9,10.

Новизна данного исследования заключается в формальном трехфакторном разделении (3x3) компонентов, питающих Инь и укрепляющих Ян, на овариэктомированных (OVX) крысах с одновременной оценкой фенотипов костной ткани и маркеров сигнального пути EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Такой дизайн позволяет более непосредственно проверить теорию совместимости формул, чем исследования, в которых используется только полный рецепт или один контрольный образец, при этом учитывается, что изменения маркеров пути остаются ассоциативными, если они не заблокированы или не подавлены механистически¹¹.

Протокол

Все процедуры в данном исследовании были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского университета Внутренней Монголии (номер одобрения YKD202404105) и проводились в соответствии с руководством ARRIVE 2.0¹².

Дизайн исследования

Исследование проводилось на базе экспериментальной платформы для животных Медицинского университета Внутренней Монголии. Был применен полный факторный план 3×3 с двумя факторами: базовым составом, питающим Инь (I; три уровня дозировки: 0, 27, 54 г в эквиваленте сырья) и составом, укрепляющим Ян (A; три уровня дозировки: 0, 8, 16 г в эквиваленте сырья), что в совокупности дало девять факторных ячеек и четыре контрольные группы. Факторный план представлен в Таблице 1. I2A2 представляет собой полную формулу ZGP в клинически эквивалентной дозе. Конверсия дозы выполнялась методом площади поверхности тела (коэффициент крыса:человек = 6,25)¹³.

Животные, рандомизация и ослепление

Сто тридцать специфически патоген-свободных самок крыс линии Sprague-Dawley (возрастом 6 месяцев, массой 220–250 g) были распределены по группам с помощью компьютерной таблицы случайных чисел. Коды распределения были помещены в последовательно запечатанные конверты исследователем, не участвовавшим в оценке результатов. Крыс содержали по 3–4 особи в вентилируемых клетках при 12-часовом цикле свет/темнота, температуре 22 ± 2 ^oC и влажности 50–60% со свободным доступом к воде, стандартным кормом для грызунов с документально подтвержденным содержанием кальция и фосфора, а также с возможностью двигательной активности и обогащением среды обитания. Молекулярные анализы, гистологическая оценка, количественный анализ изображений и денситометрия проводились исследователями, не знавшими о распределении животных по группам. Размер выборки был определен с помощью априорного анализа статистической мощности, в результате чего было установлено n = 10 на группу.

Модель OVX и лекарственная терапия

Двусторонняя овариэктомия (OVX) проводилась под воздействием ингаляционного изофлурана, подаваемого с помощью прецизионного испарителя. Анестезия индуцировалась при концентрации 3–4% в кислороде и поддерживалась на уровне 1,5–2,5% через носовую маску. Достаточная глубина наркоза подтверждалась отсутствием педального рефлекса и пальпебрального рефлекса при стабильном дыхании. Успешность OVX оценивали по отсутствию вагинального эструсного цикла на 5-й день и по снижению минеральной плотности костной ткани (BMD) через 12 недель после операции. После валидации модели в течение 8 недель проводилось введение препарата зондом (1 mL/100 g/день). Отвары готовили путем последовательной водной экстракции при кипении (100 °C, обратный холодильник): в 10-кратном объеме в течение 2 ч, затем в 8-кратном объеме в течение 1,5 ч, с последующей фильтрацией через четыре слоя медицинской марли и концентрированием при пониженном давлении до 0,968 g сырого лекарственного вещества/mL. Концентрированный экстракт хранили при 4 °C и использовали в течение 7 дней после приготовления. В качестве положительного контроля использовали гранулы Gusukang (1,8 g/kg/день) и диэтилстильбестрол (0,04 mg/kg/день). По завершении эксперимента крыс глубоко наркотизировали 5% изофлураном до исчезновения педального и корнеального рефлексов, после чего проводили обескровливание и цервикальную дислокацию. Смерть подтверждали по прекращению сердцебиения и дыхания. Тушки и ткани утилизировали как биологические отходы; химические остатки утилизировали как опасные отходы; иглы и лезвия помещали в утвержденные контейнеры для острых предметов.

Показатели исхода

Уровни P1NP и CTX-1 в сыворотке крови определяли методом сэндвич-ИФА (Jiyinmei)¹⁴. МКБ бедренной кости количественно определяли с помощью DXA. Гистологический анализ трабекул проводили с использованием окрашивания гематоксилином и эозином при 200-кратном увеличении. Экспрессию генов оценивали методом RT-qPCR с использованием метода 2^-ΔΔCt, нормируя по глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH). Экспрессию белков оценивали с помощью вестерн-блоттинга и количественного анализа в ImageJ (см. Таблицу материалов). Наблюдаемые молекулярные массы и каталожная информация об антителах приведены в Дополнительной таблице 1. Последовательности праймеров были следующими: EphB4 прямой/обратный, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.

Статистический анализ

Нормальность распределения оценивали с помощью теста Шапиро-Уилка, а гомогенность дисперсии — с помощью теста Левена перед проведением параметрического анализа. Данные представлены как среднее значение ± SD, и все планки погрешностей на количественных графиках обозначают SD. Для оценки основных эффектов и взаимодействия I и A в девяти факториальных ячейках применялся двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA); в качестве размера эффекта использовалась частная эта-квадрат (ηp²). Попарные сравнения между всеми 13 группами проводились с использованием однофакторного ANOVA с поправкой Бонферрони. Статистический анализ выполняли в программе GraphPad Prism. Символы значимости определены следующим образом: *, **, ***, **** указывают на p <0.05, p <0.01, p <0.001, p <0.0001 по сравнению с моделью; #, ##, ###, #### указывают на те же пороги по сравнению с ZGP полной формулы.

Результаты

Валидация модели с помощью вагинальной цитологии

Успешность OVX была подтверждена у всех овариэктомированных животных, о чем свидетельствовало прекращение эстрального цикла в течение 5 дней после операции (Рисунок 1A), в то время как у животных из группы ложнооперированных сохранился 4-дневный цикл (Рисунок 1B). Через 12 недель DXA показал более низкую МПК бедренной кости в группе модели OVX, чем в контрольной группе ...

Обсуждение

Термин факториального взаимодействия указывает на неаддитивный характер взаимосвязи между компонентами ZGP, питающими Инь и укрепляющими Ян. Этот результат согласуется с традиционным принципом «поиска Ян внутри Инь», согласно которому компоненты, укрепляющие Ян, должны активировать или потенцировать базу, питающую Инь¹⁵. Данный вывод следует интерпретировать как фармакологический синергизм на уровне состава. Он не позволяет идентифицировать отдельные активные компоненты, ответственные за этот эффе...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1% раствор аммиака	N/A	N/A	Подкрашивающий раствор после дифференцировки гематоксилином.
1% спиртовой раствор соляной кислоты	N/A	N/A	Раствор для дифференцировки при окрашивании гематоксилином.
2x qPCR Mix	N/A	N/A	Мастер-микс для количественной ПЦР. Исходный объем реакции: 12.5 uL на реакцию.
4% раствор параформальдегида	N/A	N/A	Фиксация образцов левой бедренной и большеберцовой костей для гистологического анализа.
5x буфер для нанесения образцов	N/A	N/A	Денатурация образцов перед электрофорезом.
Первичные антитела к ALP	Affinity Biosciences	N/A	Антитела для вестерн-блоттинга. Исходное разведение: 1:2000. Для JoVE требуются RRID и номер лота.
Пара праймеров для ALP	N/A	N/A	Уровень мРНК ALP измеряли методом qRT-PCR, однако в исходной таблице праймеров последовательности праймеров ALP отсутствуют. Требуется подтверждение автора.
Реагент антител с биотином	Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei	Компонент набора	Добавляется в лунки с образцами во время проведения ELISA.
Желатин из рога Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Компонент для укрепления Ян. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4. Желатин расплавляли в отваре.
Желатин из пластрона Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4. Желатин расплавляли в отваре.
Хлороформ	N/A	N/A	Разделение фаз при экстракции РНК.
Охлаждающий стол	Leica	1150	Криогенная или охлаждающая поддержка для процесса изготовления срезов.
Cornus officinalis, Shan Zhu Yu	Beijing Tongrentang	N/A	Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4.
Cuscuta australis, Tu Si Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Компонент для укрепления Ян. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4.
Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi	Beijing Tongrentang	N/A	Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 9 g, пропорция 3.
PBS, обработанный DEPC	N/A	N/A	Промывка поясничных позвонков L4-L5 перед заморозкой в жидком азоте.
Диэтилстильбестрол	N/A	N/A	Положительный контроль западной медицины. Доза в источнике: 0.04 mg/kg/сут, 1 mL/100 g/сут. В исходном документе также содержится несоответствие в китайской номенклатуре, которое следует привести к единому названию «диэтилстильбестрол».
Dioscorea opposita, Huai Shan Yao	Beijing Tongrentang	N/A	Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4.
Смесь dNTP	N/A	N/A	Включена в реакцию обратной транскрипции.
Реагент для ECL-хемилюминесценции	N/A	N/A	Реагент для детекции при вестерн-блоттинге.
Цветообразующий реагент A для ELISA	Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei	Компонент набора	Реагент для проявления цвета в ELISA.
Цветообразующий реагент B для ELISA	Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei	Компонент набора	Реагент для проявления цвета в ELISA.
Стоп-раствор для ELISA	Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei	Компонент набора	Используется для прекращения цветовой реакции ELISA.
Реагент ELISA с ферментативной меткой	Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei	Компонент набора	Добавляется в незаполненные лунки при проведении ELISA.
Первичные антитела к EphB4	Proteintech	N/A	Антитела для вестерн-блоттинга. Исходное разведение: 1:2000. Для JoVE требуются RRID и номер лота.
Пара праймеров для EphB4	N/A	ПЦР-продукт 232 bp	Прямой: CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Обратный: GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Опечатка в исходной таблице: «Rat RphB4» следует заменить на «Rat EphB4».
Первичные антитела к ephrinB2	Affinity Biosciences	N/A	Антитела для вестерн-блоттинга. Исходное разведение: 1:2000. Для JoVE требуются RRID и номер лота.
Пара праймеров для ephrinB2	N/A	ПЦР-продукт 172 bp	Прямой: CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Обратный: ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT.
Этанол, абсолютированный и градуированный (95%, 85%, 75%)	N/A	N/A	Градиентная дегидратация и регидратация при окрашивании гематоксилином и эозином.
Самки крыс Sprague-Dawley	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	Сертификат на животных и номер лицензии в исходной статье не указаны	Без специфических патогенов, возраст 6 месяцев, здоровые небеременные самки. В китайском оригинале указан вес от 230 до 270 g; в раннем английском черновике — от 220 до 250 g. Перед подачей необходимо окончательно подтвердить диапазон.
Первичные антитела к GAPDH	Servicebio	N/A	Антитела для контроля нагрузки. Исходное разведение: 1:2000. Для JoVE требуются RRID и номер лота.
Пара праймеров для GAPDH	N/A	ПЦР-продукт 253 bp	Прямой: ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Обратный: TTTGAGGGTGCAGCGAACTT.
Программное обеспечение GraphPad Prism	GraphPad Software	Версия 9.4.1; RRID:SCR_002798	Статистический анализ и построение графиков. Данные о нормальности распределения, однородности дисперсии, ANOVA, поправке Бонферрони и размерах эффекта должны быть сохранены в выходных файлах.
Гранулы Гусукан (Gusukang)	Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	Положительный контроль традиционной китайской медицины. Доза в источнике: 1.8 g/kg/сут или 0.5 mL/100 g/сут.
Раствор для окрашивания гематоксилином	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Гистологическое окрашивание. В исходной методике окрашивание гематоксилином проводилось в течение 5 мин.
Высокоскоростная микроцентрифуга	N/A	TG16W	Центрифугирование для процедур с сывороткой и нуклеиновыми кислотами.
Двухэнергетический рентгеновский абсорбциометр Hologic	Hologic	N/A	Анализ минеральной плотности кости. В источнике указано сканирование бедренной кости in vivo и ex vivo.
Программное обеспечение ImageJ	National Institutes of Health	RRID:SCR_003070	Денситометрическая количественная оценка полос вестерн-блоттинга. Версия в исходной статье не указана.
Индукционная плита	Midea	N/A	Указана в таблице приборов китайского оригинала.
Изофлуран	N/A	N/A	Анестезия для двусторонней овариэктомии и позиционирования при DXA. В пересмотренном протоколе следует указать индукцию, поддержание, путь введения и критерии глубины анестезии.
Изопропанол	N/A	N/A	Осаждение РНК при экстракции.
Жидкий азот	N/A	N/A	Мгновенная заморозка образцов поясничных позвонков.
Lycium barbarum, Gou Qi Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4.
Считыватель микропланшетов	N/A	AMR-100	Детекция абсорбции ELISA на 450 nm.
Мойка микропланшетов	N/A	APW-200	Этап промывки планшетов ELISA.
Обратная транскриптаза MMLV	N/A	N/A	Фермент обратной транскрипции.
Нейтральный монтирующий клей	Sinopharm Group	N/A	Среда для заключения стекол, окрашенных гематоксилином и эозином.
Нормальный физиологический раствор	N/A	N/A	Растворитель для зондового введения в холостую контрольную группу, группу ложнооперированных животных и модельную группу.
Праймер Oligo(dT)18	N/A	N/A	Используется для обратной транскрипции.
Пенициллин	N/A	N/A	Профилактика послеоперационных инфекций. Доза в источнике: 20 000 U/kg внутримышечно в течение 3 дней.
Скороварка	Xinfei	N/A	Указана в таблице приборов китайского оригинала.
Ингибитор протеаз	N/A	N/A	Добавляется при экстракции белков.
Буфер для лизиса белков	N/A	N/A	Экстракция белков из костной ткани для вестерн-блоттинга.
Мембрана PVDF	N/A	N/A	Мембрана для переноса при вестерн-блоттинге, активированная метанолом.
Прибор для qRT-PCR	N/A	N/A	Количественная ПЦР с обратной транскрипцией для EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP и GAPDH.
Набор ELISA для определения CTX-1 у крыс	Jiyinmei	JYM0026Ra	Сэндвич-ELISA для определения С-концевого телопептида коллагена 1 типа в сыворотке. Детекция на 450 nm.
Набор ELISA для определения P1NP у крыс	Jiyinmei	JYM0030Ra	Сэндвич-ELISA для определения N-концевого пропептида проколлагена 1 типа в сыворотке. Детекция на 450 nm.
Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang	Beijing Tongrentang	N/A	Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 24 g, пропорция 8.
Первичные антитела к RhoA	Proteintech	N/A	Антитела для вестерн-блоттинга. Исходное разведение: 1:2000. Для JoVE требуются RRID и номер лота.
Пара праймеров для RhoA	N/A	ПЦР-продукт 177 bp	Прямой: GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Обратный: ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Терминология приведена к единому виду: с RHoA на RhoA.
Ингибитор РНказы	N/A	N/A	Включен в реакцию обратной транскрипции.
Вода, свободная от РНказ	N/A	N/A	Растворение РНК после высушивания.
Ротационный микротом	Leica	2245	Гистологическое секционирование.
Вторичные антитела для вестерн-блоттинга	N/A	N/A	Исходное разведение: 1:15000. Для JoVE требуются реактивность хозяина и RRID.
Обезжиренное молоко, 5%	N/A	N/A	Блокирующий реагент для вестерн-блоттинга, комнатная температура в течение 2 ч.
Аппарат для размазывания и подсушивания мазков	Jinhua Yidi	N/A	Подготовка стекол для гистологии.
Пентобарбитал натрия, 3%	N/A	N/A	Терминальная анестезия перед сбором крови из брюшной аорты в китайском исходном документе. Процедуру окончательного усыпления и метод подтверждения необходимо проверить.
Стандартный разбавитель образцов	Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei	Компонент набора	Используется для последовательного разведения стандартов в процедуре ELISA.
Буфер TBST	N/A	N/A	Промывочный буфер для вестерн-блоттинга.
Термостатический инкубатор-шейкер	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	N/A	Лабораторная инкубация и перемешивание.
Реагент TRIzol	N/A	N/A	Экстракция РНК из 100 mg костной ткани.
Вертикальный микроскоп	Leica	DM1000	Гистологическая визуализация при окрашивании гематоксилином и эозином с увеличением 200x.
Термостатический инкубатор с водяной рубашкой	N/A	GNP-9080	Инкубация при проведении анализов.
Водорастворимый раствор эозина	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Гистологическое докрашивание. В исходной методике окрашивание эозином проводилось в течение 3 мин.
Система электрофореза для вестерн-блоттинга	N/A	N/A	Разделение белков. Электрофорез в источнике: изначально 80 V, затем 120 V.
Система визуализации вестерн-блоттинга	N/A	N/A	Визуализация хемилюминесцентных мембран. Для подачи требуются неотрезанные изображения мембран.
Система переноса для вестерн-блоттинга	N/A	N/A	Перенос белка на мембрану PVDF. Условия переноса в источнике: 400 mA, 90 мин, ледяная баня.
Ксилол	N/A	N/A	Обезжиривание и просветление тканей при гистологии.
Травяные компоненты пилюли Цзогуй (Zuogui)	Beijing Tongrentang	N/A	Состав из восьми трав: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, желатин из пластрона Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis и желатин из рога Cervus elaphus.