В данном исследовании с использованием трехфакторного дизайна (3х3) оценивается влияние таблеток Цзогуй на постменопаузальный остеопороз у овариэктомированных крыс. Результаты подтверждают синергетический эффект компонентов Инь и Ян на костный метаболизм и связанные с ним маркеры сигнального пути EphB4/ephrinB2, хотя полученные данные о механизмах носят корреляционный, а не причинно-следственный характер.
Исследовательская статья
Пилюли Цзогуй модулируют сопряжение остеобластов и остеокластов у овариэктомированных крыс: трехфакторное исследование 3x3
21 просмотров
⸱
11 сентября 2026 г.
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Постменопаузальный остеопороз вызван разрывом связи между процессами образования и резорбции костной ткани, связанным с дефицитом эстрогенов. В данном исследовании количественно оценивались независимые и интерактивные эффекты субформул «питающих Инь» состава таблеток Цзогуй (Zuogui Pill) на модели овариэктомированных крыс, а также изучались связи с сигнальным путем EphB4/ephrinB2/RhoA/щелочная фосфатаза. В соответствии с руководством ARRIVE 2.0, 130 безыммунных самок крыс линии Sprague-Dawley были рандомизированы на 13 групп (n=10 в группе), включая девять групп в рамках трехфакторного дизайна (3х3). Конечные точки включали определение уровней P1NP, CTX-1, минеральной плотности костной ткани (МПК) бедренной кости, измеренной методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA), гистологический анализ трабекул, а также экспрессию матричной рибонуклеиновой кислоты и белков, измеренную с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и вестерн-блоттинга. Полная формула (I2A2) была связана с более высокими значениями P1NP, более низкими значениями CTX-1 и более высокой МПК по сравнению с группой модели. Факторный анализ выявил взаимодействие Инь-Ян между P1NP и МПК, что подтверждает фармакологический синергизм. Молекулярные изменения были связаны с повышенной экспрессией EphB4/ephrinB2/ALP и сниженной экспрессией RhoA. Эти результаты подтверждают связь между лечением таблетками Цзогуй, улучшением фенотипа костной ткани и модуляцией маркеров сигнального пути; подтверждение причинно-следственной зависимости пути требует валидации с использованием ингибиторов, нокаута генов и кокультивирования.
Введение
Постменопаузальный остеопороз (ПМО) затрагивает большое число женщин и характеризуется нарушением баланса между образованием и резорбцией костной ткани, связанным с дефицитом эстрогенов1,2. Рецепторно-лигандная система EphB4/ephrinB2 опосредует взаимодействие между остеобластами и остеокластами; сигналинг EphB4 поддерживает дифференцировку остеобластов и активность щелочной фосфатазы (ALP), в то время как обратный сигналинг ephrinB2 может сдерживать остеокластогенез через механизмы, связанные с RhoA3,4. Снижение сопряженности процессов в костной ткани при дефиците эстрогенов дает механическое обоснование для оценки терапевтических воздействий, влияющих на обе клеточные составляющие ремоделирования.
Современные методы терапии остеопороза, включая антирезорбтивные и анаболические препараты, снижают риск переломов, однако их применение может быть ограничено комплаентностью пациентов, стоимостью, противопоказаниями, эффектами рикошета или нежелательными явлениями при длительном использовании5. Следовательно, поиск потенциальных методов лечения, которые стимулируют костеобразование, ограничивая при этом избыточную резорбцию, остается научно актуальным.
Пилюли Цзогуй (ZGP; Zuo Gui Wan) — это классический многокомпонентный препарат, используемый в традиционной китайской медицине при дефиците эссенции почек, теоретическом паттерне, связанном с ослаблением костной ткани. Компоненты, питающие Инь, включают Rehmannia glutinosa (подготовленный корень, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (корневище, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (плод, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (плод, Gou Qi Zi, 12 g), желатин из пластрона Chinemys reevesii (желатин, полученный из пластрона, Gui Ban Jiao, 12 g) и Cyathula officinalis (корень, Chuan Niu Xi, 9 g). Компоненты, усиливающие Ян, включают Cuscuta australis (семена, Tu Si Zi, 12 g) и желатин из рогов Cervus elaphus (желатин, полученный из рогов, Lu Jiao Jiao, 12 g). Согласно классической теории, принцип поиска Ян внутри Инь предполагает, что травы, усиливающие Ян, могут потенцировать основу, питающую Инь, а не действовать просто как независимые добавки. Клинические данные и доклинические исследования продемонстрировали противоостеопоротическую активность ZGP или вмешательств с применением ZGP, включая воздействие на BMD (минеральную плотность кости), остеогенез и фармакокинетические показатели6,7,8,9,10.
Новизна данного исследования заключается в формальном трехфакторном разделении (3x3) компонентов, питающих Инь и укрепляющих Ян, на овариэктомированных (OVX) крысах с одновременной оценкой фенотипов костной ткани и маркеров сигнального пути EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Такой дизайн позволяет более непосредственно проверить теорию совместимости формул, чем исследования, в которых используется только полный рецепт или один контрольный образец, при этом учитывается, что изменения маркеров пути остаются ассоциативными, если они не заблокированы или не подавлены механистически11.
Протокол
Все процедуры в данном исследовании были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского университета Внутренней Монголии (номер одобрения YKD202404105) и проводились в соответствии с руководством ARRIVE 2.012.
Дизайн исследования
Исследование проводилось на базе экспериментальной платформы для животных Медицинского университета Внутренней Монголии. Был применен полный факторный план 3×3 с двумя факторами: базовым составом, питающим Инь (I; три уровня дозировки: 0, 27, 54 г в эквиваленте сырья) и составом, укрепляющим Ян (A; три уровня дозировки: 0, 8, 16 г в эквиваленте сырья), что в совокупности дало девять факторных ячеек и четыре контрольные группы. Факторный план представлен в Таблице 1. I2A2 представляет собой полную формулу ZGP в клинически эквивалентной дозе. Конверсия дозы выполнялась методом площади поверхности тела (коэффициент крыса:человек = 6,25)13.
Животные, рандомизация и ослепление
Сто тридцать специфически патоген-свободных самок крыс линии Sprague-Dawley (возрастом 6 месяцев, массой 220–250 g) были распределены по группам с помощью компьютерной таблицы случайных чисел. Коды распределения были помещены в последовательно запечатанные конверты исследователем, не участвовавшим в оценке результатов. Крыс содержали по 3–4 особи в вентилируемых клетках при 12-часовом цикле свет/темнота, температуре 22 ± 2 oC и влажности 50–60% со свободным доступом к воде, стандартным кормом для грызунов с документально подтвержденным содержанием кальция и фосфора, а также с возможностью двигательной активности и обогащением среды обитания. Молекулярные анализы, гистологическая оценка, количественный анализ изображений и денситометрия проводились исследователями, не знавшими о распределении животных по группам. Размер выборки был определен с помощью априорного анализа статистической мощности, в результате чего было установлено n = 10 на группу.
Модель OVX и лекарственная терапия
Двусторонняя овариэктомия (OVX) проводилась под воздействием ингаляционного изофлурана, подаваемого с помощью прецизионного испарителя. Анестезия индуцировалась при концентрации 3–4% в кислороде и поддерживалась на уровне 1,5–2,5% через носовую маску. Достаточная глубина наркоза подтверждалась отсутствием педального рефлекса и пальпебрального рефлекса при стабильном дыхании. Успешность OVX оценивали по отсутствию вагинального эструсного цикла на 5-й день и по снижению минеральной плотности костной ткани (BMD) через 12 недель после операции. После валидации модели в течение 8 недель проводилось введение препарата зондом (1 mL/100 g/день). Отвары готовили путем последовательной водной экстракции при кипении (100 °C, обратный холодильник): в 10-кратном объеме в течение 2 ч, затем в 8-кратном объеме в течение 1,5 ч, с последующей фильтрацией через четыре слоя медицинской марли и концентрированием при пониженном давлении до 0,968 g сырого лекарственного вещества/mL. Концентрированный экстракт хранили при 4 °C и использовали в течение 7 дней после приготовления. В качестве положительного контроля использовали гранулы Gusukang (1,8 g/kg/день) и диэтилстильбестрол (0,04 mg/kg/день). По завершении эксперимента крыс глубоко наркотизировали 5% изофлураном до исчезновения педального и корнеального рефлексов, после чего проводили обескровливание и цервикальную дислокацию. Смерть подтверждали по прекращению сердцебиения и дыхания. Тушки и ткани утилизировали как биологические отходы; химические остатки утилизировали как опасные отходы; иглы и лезвия помещали в утвержденные контейнеры для острых предметов.
Показатели исхода
Уровни P1NP и CTX-1 в сыворотке крови определяли методом сэндвич-ИФА (Jiyinmei)14. МКБ бедренной кости количественно определяли с помощью DXA. Гистологический анализ трабекул проводили с использованием окрашивания гематоксилином и эозином при 200-кратном увеличении. Экспрессию генов оценивали методом RT-qPCR с использованием метода 2-ΔΔCt, нормируя по глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH). Экспрессию белков оценивали с помощью вестерн-блоттинга и количественного анализа в ImageJ (см. Таблицу материалов). Наблюдаемые молекулярные массы и каталожная информация об антителах приведены в Дополнительной таблице 1. Последовательности праймеров были следующими: EphB4 прямой/обратный, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.
Статистический анализ
Нормальность распределения оценивали с помощью теста Шапиро-Уилка, а гомогенность дисперсии — с помощью теста Левена перед проведением параметрического анализа. Данные представлены как среднее значение ± SD, и все планки погрешностей на количественных графиках обозначают SD. Для оценки основных эффектов и взаимодействия I и A в девяти факториальных ячейках применялся двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA); в качестве размера эффекта использовалась частная эта-квадрат (ηp2). Попарные сравнения между всеми 13 группами проводились с использованием однофакторного ANOVA с поправкой Бонферрони. Статистический анализ выполняли в программе GraphPad Prism. Символы значимости определены следующим образом: *, **, ***, **** указывают на p <0.05, p <0.01, p <0.001, p <0.0001 по сравнению с моделью; #, ##, ###, #### указывают на те же пороги по сравнению с ZGP полной формулы.
Результаты
Валидация модели с помощью вагинальной цитологии
Успешность OVX была подтверждена у всех овариэктомированных животных, о чем свидетельствовало прекращение эстрального цикла в течение 5 дней после операции (Рисунок 1A), в то время как у животных из группы ложнооперированных сохранился 4-дневный цикл (Рисунок 1B). Через 12 недель DXA показал более низкую МПК бедренной кости в группе модели OVX, чем в контрольной группе с ложной операцией (0.214 ± 0.020 против 0.281 ± 0.019 mg/cm3; p с поправкой Бонферрони < 0.001), что подтверждает создание модели потери костной массы, индуцированной OVX, перед началом лечения.
Минеральная плотность костной ткани
Полная формула ZGP (I2A2) показала самое высокое восстановление BMD среди факториальных субформул и была статистически сопоставима с обоими положительными контролями (Таблица 2, Рисунок 2). Все факториальные субформулы увеличили BMD по сравнению с модельной группой. Показатели только высокого уровня питания Инь (I3A1: 0.253 mg/cm3) и только высокого уровня усиления Ян (I1A3: 0.243 mg/cm3) оставались ниже, чем у полной формулы ZGP (I2A2: 0.307 mg/cm3), что подтверждает наличие взаимодействия, а не простого дозового эффекта.
Сывороточные маркеры обновления костной ткани
По сравнению с контрольной группой, применение ZGP в полной дозе было связано с повышением уровня P1NP (+51%; 95% ДИ: 210,3–327,5 pg/mL; p <0,0001) и снижением уровня CTX-1 (-16%; p <0,01), что соответствует улучшению баланса между образованием и резорбцией костной ткани (Рисунок 3A,B). В некоторых сравнениях группы монотерапии в высоких дозах демонстрировали более высокие абсолютные значения P1NP, однако факториальный анализ подтвердил преимущество оптимизированной комбинированной активности, а не максимального дозового ответа в одной группе. Полные данные по группам представлены в Таблице 3.
Факторный ANOVA и синергическое взаимодействие
Двусторонний факторный анализ ANOVA девяти факторных ячеек выявил значимые основные эффекты факторов питания Инь и укрепления Ян, а также значимые члены взаимодействия I и A по всем основным конечным точкам (Таблица 4). Эффект взаимодействия для P1NP (ηp2 = 0,74) свидетельствует о том, что компоненты, укрепляющие Ян, усиливали действие компонентов, питающих Инь, в данных экспериментальных условиях.
Плотность костной ткани (валидация модели)
Плотность бедренной кости в группе Модель (OVX) была ниже, чем в контрольной группе (Blank) и группе с ложно-оперированными животными (Sham), что подтверждает успешную индукцию фенотипа потери костной массы при OVX перед началом лечения, как показано на рисунке 4.
Экспрессия EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP
Для анализа методом RT-qPCR использовали биологические образцы каждой группы с проведением реакций в трех технических повторах, а денситометрия вестерн-блоттинга выполнялась на независимых биологических лизатах (Рисунок 5 и Рисунок 6). По сравнению с группой модели, применение полной формулы ZGP было связано с более высокими уровнями EphB4 (0.498 ± 0.009 против 0.048 ± 0.002; p < 0.0001), ephrinB2 (0.411 ± 0.036 против 0.048 ± 0.003; p < 0.0001) и ALP (0.842 ± 0.019 против 0.090 ± 0.003; p < 0.0001), а также с более низким уровнем RhoA (1.658 ± 0.028 против 7.332 ± 0.430; p < 0.0001). Данные молекулярные результаты интерпретируются как ассоциации с маркерами путей, а не как доказательство причинно-следственной медиации.
Доступность данных
Исходные файлы данных, использованные для получения результатов настоящего исследования, представлены в виде Дополнительного файла с кодом, прилагаемого к данной статье
Рисунок 1. Репрезентативные образцы цитологии влагалища, использованные для подтверждения цикличности эстра после овариэктомии (окрашивание гематоксилином и эозином, 200x). (A) Репрезентативный мазок из влагалища овариэктомированной крысы, демонстрирующий стойкую нециклическую цитологию. (B) Репрезентативный мазок из влагалища крысы после ложной операции, демонстрирующий нормальную цикличность эстра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. МПК бедренной кости во всех группах. Планки погрешностей обозначают SD. Статистические символы указывают на сравнения с поправкой Бонферрони относительно группы модели или группы ZGP с полной формулой, как определено в разделе «Статистический анализ». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Маркеры обновления костной ткани в сыворотке крови. (A) P1NP, маркер формирования костной ткани. (B) CTX-1, маркер резорбции костной ткани. Планки погрешностей обозначают SD. Статистические символы указывают на сравнения с поправкой Бонферрони относительно модели или ZGP с полной формулой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Плотность бедренной кости, подтверждающая потерю костной массы, индуцированную OVX перед началом лечения. Столбчатая диаграмма, сравнивающая плотность бедренной кости (mg/cm3) в группах Blank (без овариэктомии, без лечения), Sham-operated (ложнооперированные) и Model (OVX) на этапе валидации модели перед началом лечения. Столбцы представляют среднее значение ± SD (n = 10 на группу). *** = p < 0.001 по сравнению с группой Blank и по сравнению с группой Sham (однофакторный ANOVA с коррекцией Бонферрони). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Относительная экспрессия мРНК генов. Уровни экспрессии (A) EphB4, (B) ephrinB2, (C) RhoA, (D) ALP, рассчитанные методом 2^-ΔΔCt с нормализацией по GAPDH. Для qPCR использовали технические трипликаты для каждого биологического образца. Планки погрешностей обозначают SD. Статистические символы указывают на сравнения с поправкой Бонферрони. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6. Экспрессия белков, определенная методом вестерн-блоттинга. На панелях представлены репрезентативные иммуноблотты для EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP и контрольного белка GAPDH, выбранные из независимых биологических образцов. Денситометрия была нормализована по GAPDH с помощью ImageJ. Наблюдаемые молекулярные массы: EphB4, 110 kDa; ephrinB2, 36 kDa; RhoA, 22 kDa; ALP, 39 kDa; GAPDH, 37 kDa (см. Дополнительную таблицу 1). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Фактор питания инь (I) | ||||
| I₁ (0 г) | I₂ (27 г) | I₃ (54 г) | ||
| Фактор усиления ян (A) | A₁ (0 г) | I₁A₁ (Модель) | I₂A₁ (Инь) | I₃A₁ (Хай-Инь) |
| A₂ (8 г) | I₁A₂ (Янг) | I₂A₂ (ZGP)†) | I₃A₂ (Hi-Yin+Yang) | |
| A₃ (16 г) | I₁A₃ (Хи-Янг) | I₂A₃ (Инь+Хи-Ян) | I₃A₃ (Full-Hi) | |
Таблица 1: Факторный план 3х3 и экспериментальные группы. В таблице представлены 13 экспериментальных групп, распределенных по факторному плану 3х3 с учетом уровней доз средств питания Инь (I) и укрепления Ян (A), а также 4 контрольные группы. †I₂A₂ = полный состав таблеток Цзогуй в клинически эквивалентной дозе. Пересчет дозы выполнялся методом площади поверхности тела (крыса : человек = 6,25).
| Группа | Факториальная клетка | МПК (мг/см2)³, x̄ ± СО) | в сравнении с моделью |
| Холостой контроль | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| Имитация операции | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| Модель (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| Укрепляющий янг | I₁A₂ | 0.258 ± 0.011 | ** |
| Высокоактивный усилитель ян | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| Питающий инь | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| Высокий уровень питания Инь | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| Инь + Хи-Ян | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| Хай-Инь + Ян | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| Полный рост | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| полная формула ZGP | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| Положительный контроль TCM | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| Контроль западной медицины | — | 0.307 ± 0.009 | **** |
Таблица 2: МПК бедренной кости во всех группах (n=10/группа, среднее ± SD). * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p<0.001, **** = p<0.0001 по сравнению с моделью (коррекция Бонферрони).
| Группа | Клетка | P1NP (pg/mL, x̄ ± SD) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± SD) |
| Холостой контроль | — | 1388.8 ± 29.7****#### | 33.4 ± 6.8****#### |
| Ложнооперированные | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| Модель (OVX) | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| Укрепляющая Ян | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| Высокая укрепляющая Ян | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| Питающая Инь | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 88.2 ± 7.6** |
| Высокая питающая Инь | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| Инь + Высокая Ян | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| Высокая Инь + Ян | I₃A₂ | 990.2 ± 116.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| Полная высокая | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| Полная формула ZGP | I₂A₂ | 794.8 ± 66.0**** | 88.2 ± 6.0**** |
| Положительный контроль ТКМ | — | 967.7 ± 49.9****# | 66.3 ± 6.1****#### |
| Контроль западной медицины | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
Таблица 3: Уровни P1NP и CTX-1 в сыворотке крови во всех группах (n=10/группа, среднее значение ± SD). ** = p <0.01, **** = p <0.0001 по сравнению с группой модели; # = p <0.05, ## = p <0.01, ### = p <0.001, #### = p <0.0001 по сравнению с ZGP (критерий Бонферрони). 95% ДИ для P1NP в группе ZGP по сравнению с моделью: 210.3–327.5 pg/mL.
| Результат | Фактор | df | F | p-значение | Частичный η² |
| P1NP (пг/мл) | Инь (I) | 2, 81 | 17.84 | <0.001 | 0.31 |
| Янг (А) | 2, 81 | 6.22 | 0.003 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 57.21 | <0.001 | 0.74 | |
| МПК (мг/см²³) | Инь (I) | 2, 81 | 31.90 | <0.0001 | 0.44 |
| Ян (А) | 2, 81 | 28.70 | <0.0001 | 0.41 | |
| I × A | 4, 81 | 24.60 | <0.0001 | 0.55 | |
| CTX-1 (нг/мл) | Инь (I) | 2, 81 | 14.22 | <0.001 | 0.26 |
| Янг (А) | 2, 81 | 5.88 | 0.004 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 19.43 | <0.001 | 0.49 |
Таблица 4: Основные эффекты и члены взаимодействия трехфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) 3x3 с апостериорными сравнениями с поправкой Бонферрони. В качестве размера эффекта указан частный эта-квадрат. df обозначает число степеней свободы.
Дополнительная таблица 1. Информация об антителах для вестерн-блоттинга.В таблице перечислены белки-мишени, наблюдаемая молекулярная масса, поставщики, каталожные номера, виды животных-хозяев и рабочие разведения первичных и вторичных антител, использованных в данном исследовании.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл с данными 1. Необработанные экспериментальные данные, подтверждающие исследование.Этот архив содержит исходные файлы данных, использованные для получения результатов, представленных в рукописи, включая индивидуальные измерения BMD, необработанные данные ELISA, значения Ct RT-qPCR с результатами амплификации и кривыми плавления, оригинальные изображения вестерн-блоттинга и файлы денситометрического анализа, репрезентативные изображения гистологической микроскопии, а также файлы выходных данных приборов, относящиеся к этим экспериментам.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
Термин факториального взаимодействия указывает на неаддитивный характер взаимосвязи между компонентами ZGP, питающими Инь и укрепляющими Ян. Этот результат согласуется с традиционным принципом «поиска Ян внутри Инь», согласно которому компоненты, укрепляющие Ян, должны активировать или потенцировать базу, питающую Инь15. Данный вывод следует интерпретировать как фармакологический синергизм на уровне состава. Он не позволяет идентифицировать отдельные активные компоненты, ответственные за этот эффект.
EphB4 и ephrinB2 являются биологически вероятными медиаторами связи между остеобластами и остеокластами3,4, однако имеющиеся данные носят корреляционный характер. Наблюдаемое увеличение уровней EphB4, ephrinB2 и ALP при снижении RhoA согласуется с улучшением этой связи, но не доказывает, что данный путь является необходимым или достаточным для действия ZGP. Для проверки причинно-следственной зависимости необходимы ингибиторы сигнальных путей, подходы с использованием антител к EphB4 или блокирующих ephrinB2 антител, модуляция RhoA/ROCK16, нокдаун генов и эксперименты по совместному культивированию остеобластов и остеокластов.
Клиническое внедрение требует осторожности. Пересчет дозы для крыс в эквивалентную дозу для человека позволяет провести первоначальное масштабирование, однако определение дозировки для людей также требует проведения фармакокинетических, фармакодинамических исследований и изучения долгосрочной безопасности. Стандартизированный препарат ZGP должен пройти химическое профилирование с помощью HPLC или LC-MS, определение лимитов содержания соединений-маркеров, проверку воспроизводимости от серии к серии, тестирование на наличие загрязнителей, а также документальное подтверждение источников сырья, методов экстракции, концентрации и производственной практики17. При нормативном регулировании также необходимо учитывать взаимодействие между компонентами, совместимость с существующими противоостеопорозными препаратами и сравнительные клинические результаты, такие как снижение частоты переломов, а не только показатели BMD.
Данное исследование имеет несколько ограничений. Модель крыс с овариэктомией (OVX) вызывает резкий дефицит эстрогенов и не может в полной мере воспроизвести менопаузу у людей, старение, иммунную регуляцию, продолжительность жизни, сопутствующие заболевания или долгосрочную динамику ремоделирования костной ткани18,19. Системные эндокринные эффекты могут вносить вклад в наблюдаемые результаты, поэтому нельзя presuppose наличие прямого сигналинга в костных клетках. Отсутствие ингибирования путей или нокдауна генов не позволяет делать утверждения о причинно-следственных механизмах. Отсутствие профилирования методами ВЭЖХ или ЖХ-МС ограничивает воспроизводимость и не позволяет attributed эффекты конкретным компонентам. Количественная оценка микроархитектоники трабекулярной кости не проводилась. В будущих исследованиях следует использовать микро-КТ или количественный гистоморфометрический анализ, включая BV/TV, Tb.N, Tb.Th и Tb.Sp, для более комплексной оценки структурных изменений кости20. Вариабельность партий растительного сырья, процедуры экстракции и требования к контролю качества остаются важными барьерами для трансляции результатов.
У крыс с индуцированным овариэктомией (OVX) постменопаузальным остеопорозом (PMOP) применение полного состава пилюль Цзогуй (Zuogui Pill) было связано с повышением минеральной плотности костной ткани (BMD), благоприятными показателями маркеров обновления костной ткани в сыворотке крови и скоординированными изменениями маркеров пути EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Факторный анализ «три на три» подтверждает синергетическое взаимодействие между компонентами, питающими Инь, и компонентами, усиливающими Ян, что согласуется с традиционной теорией совместимости формул. Эти данные обосновывают дальнейшее исследование ZGP в качестве многоцелевого препарата-кандидата для лечения PMOP, однако до окончательного подтверждения механизмов действия или трансляционного потенциала необходимы исследования с использованием ингибиторов, эксперименты по сайленсингу генов, ко-культивирование остеобластов и остеокластов, химический профилинг, количественный анализ микроархитектоники кости, изучение фармакокинетики, долгосрочные испытания безопасности и клинические исследования.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Данная работа была поддержана Фондом естественных наук Внутренней Монголии (грант № 2025LHMS08047), Общим проектом Медицинского университета Внутренней Монголии (грант № YKD2025MS015) и Фондом поддержки начинающих докторантов Медицинского университета Внутренней Монголии (грант № YKD2023BSQD007). Финансирующие организации не принимали участия в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1% раствор аммиака | N/A | N/A | Подкрашивающий раствор после дифференцировки гематоксилином. |
| 1% спиртовой раствор соляной кислоты | N/A | N/A | Раствор для дифференцировки при окрашивании гематоксилином. |
| 2x qPCR Mix | N/A | N/A | Мастер-микс для количественной ПЦР. Исходный объем реакции: 12.5 uL на реакцию. |
| 4% раствор параформальдегида | N/A | N/A | Фиксация образцов левой бедренной и большеберцовой костей для гистологического анализа. |
| 5x буфер для нанесения образцов | N/A | N/A | Денатурация образцов перед электрофорезом. |
| Первичные антитела к ALP | Affinity Biosciences | N/A | Антитела для вестерн-блоттинга. Исходное разведение: 1:2000. Для JoVE требуются RRID и номер лота. |
| Пара праймеров для ALP | N/A | N/A | Уровень мРНК ALP измеряли методом qRT-PCR, однако в исходной таблице праймеров последовательности праймеров ALP отсутствуют. Требуется подтверждение автора. |
| Реагент антител с биотином | Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei | Компонент набора | Добавляется в лунки с образцами во время проведения ELISA. |
| Желатин из рога Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Компонент для укрепления Ян. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4. Желатин расплавляли в отваре. |
| Желатин из пластрона Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4. Желатин расплавляли в отваре. |
| Хлороформ | N/A | N/A | Разделение фаз при экстракции РНК. |
| Охлаждающий стол | Leica | 1150 | Криогенная или охлаждающая поддержка для процесса изготовления срезов. |
| Cornus officinalis, Shan Zhu Yu | Beijing Tongrentang | N/A | Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4. |
| Cuscuta australis, Tu Si Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Компонент для укрепления Ян. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4. |
| Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi | Beijing Tongrentang | N/A | Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 9 g, пропорция 3. |
| PBS, обработанный DEPC | N/A | N/A | Промывка поясничных позвонков L4-L5 перед заморозкой в жидком азоте. |
| Диэтилстильбестрол | N/A | N/A | Положительный контроль западной медицины. Доза в источнике: 0.04 mg/kg/сут, 1 mL/100 g/сут. В исходном документе также содержится несоответствие в китайской номенклатуре, которое следует привести к единому названию «диэтилстильбестрол». |
| Dioscorea opposita, Huai Shan Yao | Beijing Tongrentang | N/A | Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4. |
| Смесь dNTP | N/A | N/A | Включена в реакцию обратной транскрипции. |
| Реагент для ECL-хемилюминесценции | N/A | N/A | Реагент для детекции при вестерн-блоттинге. |
| Цветообразующий реагент A для ELISA | Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei | Компонент набора | Реагент для проявления цвета в ELISA. |
| Цветообразующий реагент B для ELISA | Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei | Компонент набора | Реагент для проявления цвета в ELISA. |
| Стоп-раствор для ELISA | Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei | Компонент набора | Используется для прекращения цветовой реакции ELISA. |
| Реагент ELISA с ферментативной меткой | Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei | Компонент набора | Добавляется в незаполненные лунки при проведении ELISA. |
| Первичные антитела к EphB4 | Proteintech | N/A | Антитела для вестерн-блоттинга. Исходное разведение: 1:2000. Для JoVE требуются RRID и номер лота. |
| Пара праймеров для EphB4 | N/A | ПЦР-продукт 232 bp | Прямой: CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Обратный: GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Опечатка в исходной таблице: «Rat RphB4» следует заменить на «Rat EphB4». |
| Первичные антитела к ephrinB2 | Affinity Biosciences | N/A | Антитела для вестерн-блоттинга. Исходное разведение: 1:2000. Для JoVE требуются RRID и номер лота. |
| Пара праймеров для ephrinB2 | N/A | ПЦР-продукт 172 bp | Прямой: CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Обратный: ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| Этанол, абсолютированный и градуированный (95%, 85%, 75%) | N/A | N/A | Градиентная дегидратация и регидратация при окрашивании гематоксилином и эозином. |
| Самки крыс Sprague-Dawley | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Сертификат на животных и номер лицензии в исходной статье не указаны | Без специфических патогенов, возраст 6 месяцев, здоровые небеременные самки. В китайском оригинале указан вес от 230 до 270 g; в раннем английском черновике — от 220 до 250 g. Перед подачей необходимо окончательно подтвердить диапазон. |
| Первичные антитела к GAPDH | Servicebio | N/A | Антитела для контроля нагрузки. Исходное разведение: 1:2000. Для JoVE требуются RRID и номер лота. |
| Пара праймеров для GAPDH | N/A | ПЦР-продукт 253 bp | Прямой: ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Обратный: TTTGAGGGTGCAGCGAACTT. |
| Программное обеспечение GraphPad Prism | GraphPad Software | Версия 9.4.1; RRID:SCR_002798 | Статистический анализ и построение графиков. Данные о нормальности распределения, однородности дисперсии, ANOVA, поправке Бонферрони и размерах эффекта должны быть сохранены в выходных файлах. |
| Гранулы Гусукан (Gusukang) | Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | Положительный контроль традиционной китайской медицины. Доза в источнике: 1.8 g/kg/сут или 0.5 mL/100 g/сут. |
| Раствор для окрашивания гематоксилином | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Гистологическое окрашивание. В исходной методике окрашивание гематоксилином проводилось в течение 5 мин. |
| Высокоскоростная микроцентрифуга | N/A | TG16W | Центрифугирование для процедур с сывороткой и нуклеиновыми кислотами. |
| Двухэнергетический рентгеновский абсорбциометр Hologic | Hologic | N/A | Анализ минеральной плотности кости. В источнике указано сканирование бедренной кости in vivo и ex vivo. |
| Программное обеспечение ImageJ | National Institutes of Health | RRID:SCR_003070 | Денситометрическая количественная оценка полос вестерн-блоттинга. Версия в исходной статье не указана. |
| Индукционная плита | Midea | N/A | Указана в таблице приборов китайского оригинала. |
| Изофлуран | N/A | N/A | Анестезия для двусторонней овариэктомии и позиционирования при DXA. В пересмотренном протоколе следует указать индукцию, поддержание, путь введения и критерии глубины анестезии. |
| Изопропанол | N/A | N/A | Осаждение РНК при экстракции. |
| Жидкий азот | N/A | N/A | Мгновенная заморозка образцов поясничных позвонков. |
| Lycium barbarum, Gou Qi Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 12 g, пропорция 4. |
| Считыватель микропланшетов | N/A | AMR-100 | Детекция абсорбции ELISA на 450 nm. |
| Мойка микропланшетов | N/A | APW-200 | Этап промывки планшетов ELISA. |
| Обратная транскриптаза MMLV | N/A | N/A | Фермент обратной транскрипции. |
| Нейтральный монтирующий клей | Sinopharm Group | N/A | Среда для заключения стекол, окрашенных гематоксилином и эозином. |
| Нормальный физиологический раствор | N/A | N/A | Растворитель для зондового введения в холостую контрольную группу, группу ложнооперированных животных и модельную группу. |
| Праймер Oligo(dT)18 | N/A | N/A | Используется для обратной транскрипции. |
| Пенициллин | N/A | N/A | Профилактика послеоперационных инфекций. Доза в источнике: 20 000 U/kg внутримышечно в течение 3 дней. |
| Скороварка | Xinfei | N/A | Указана в таблице приборов китайского оригинала. |
| Ингибитор протеаз | N/A | N/A | Добавляется при экстракции белков. |
| Буфер для лизиса белков | N/A | N/A | Экстракция белков из костной ткани для вестерн-блоттинга. |
| Мембрана PVDF | N/A | N/A | Мембрана для переноса при вестерн-блоттинге, активированная метанолом. |
| Прибор для qRT-PCR | N/A | N/A | Количественная ПЦР с обратной транскрипцией для EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP и GAPDH. |
| Набор ELISA для определения CTX-1 у крыс | Jiyinmei | JYM0026Ra | Сэндвич-ELISA для определения С-концевого телопептида коллагена 1 типа в сыворотке. Детекция на 450 nm. |
| Набор ELISA для определения P1NP у крыс | Jiyinmei | JYM0030Ra | Сэндвич-ELISA для определения N-концевого пропептида проколлагена 1 типа в сыворотке. Детекция на 450 nm. |
| Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang | Beijing Tongrentang | N/A | Компонент для питания Инь. Доза в составе полной формулы в источнике: 24 g, пропорция 8. |
| Первичные антитела к RhoA | Proteintech | N/A | Антитела для вестерн-блоттинга. Исходное разведение: 1:2000. Для JoVE требуются RRID и номер лота. |
| Пара праймеров для RhoA | N/A | ПЦР-продукт 177 bp | Прямой: GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Обратный: ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Терминология приведена к единому виду: с RHoA на RhoA. |
| Ингибитор РНказы | N/A | N/A | Включен в реакцию обратной транскрипции. |
| Вода, свободная от РНказ | N/A | N/A | Растворение РНК после высушивания. |
| Ротационный микротом | Leica | 2245 | Гистологическое секционирование. |
| Вторичные антитела для вестерн-блоттинга | N/A | N/A | Исходное разведение: 1:15000. Для JoVE требуются реактивность хозяина и RRID. |
| Обезжиренное молоко, 5% | N/A | N/A | Блокирующий реагент для вестерн-блоттинга, комнатная температура в течение 2 ч. |
| Аппарат для размазывания и подсушивания мазков | Jinhua Yidi | N/A | Подготовка стекол для гистологии. |
| Пентобарбитал натрия, 3% | N/A | N/A | Терминальная анестезия перед сбором крови из брюшной аорты в китайском исходном документе. Процедуру окончательного усыпления и метод подтверждения необходимо проверить. |
| Стандартный разбавитель образцов | Поставляется с набором ELISA, Jiyinmei | Компонент набора | Используется для последовательного разведения стандартов в процедуре ELISA. |
| Буфер TBST | N/A | N/A | Промывочный буфер для вестерн-блоттинга. |
| Термостатический инкубатор-шейкер | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | N/A | Лабораторная инкубация и перемешивание. |
| Реагент TRIzol | N/A | N/A | Экстракция РНК из 100 mg костной ткани. |
| Вертикальный микроскоп | Leica | DM1000 | Гистологическая визуализация при окрашивании гематоксилином и эозином с увеличением 200x. |
| Термостатический инкубатор с водяной рубашкой | N/A | GNP-9080 | Инкубация при проведении анализов. |
| Водорастворимый раствор эозина | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Гистологическое докрашивание. В исходной методике окрашивание эозином проводилось в течение 3 мин. |
| Система электрофореза для вестерн-блоттинга | N/A | N/A | Разделение белков. Электрофорез в источнике: изначально 80 V, затем 120 V. |
| Система визуализации вестерн-блоттинга | N/A | N/A | Визуализация хемилюминесцентных мембран. Для подачи требуются неотрезанные изображения мембран. |
| Система переноса для вестерн-блоттинга | N/A | N/A | Перенос белка на мембрану PVDF. Условия переноса в источнике: 400 mA, 90 мин, ледяная баня. |
| Ксилол | N/A | N/A | Обезжиривание и просветление тканей при гистологии. |
| Травяные компоненты пилюли Цзогуй (Zuogui) | Beijing Tongrentang | N/A | Состав из восьми трав: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, желатин из пластрона Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis и желатин из рога Cervus elaphus. |
Ссылки
- Compston JE, McClung MR, Leslie WD. Osteoporosis. Lancet. 2019;393(10169):364-376. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)32112-3
- Shen Y, Huang X, Wu J, et al. The global burden of osteoporosis, low bone mass, and its related fracture in 204 countries and territories, 1990-2019. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:882241. https://doi.org/10.3389/fendo.2022.882241
- Zhao C, Irie N, Takada Y, et al. Bidirectional ephrinB2-EphB4 signaling controls bone homeostasis. Cell Metab. 2006;4(2):111-121. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2006.05.012
- Wu Z, Li W, Jiang K, et al. Regulation of bone homeostasis: signaling pathways and therapeutic targets. MedComm (2020). 2024;5(8):e657. https://doi.org/10.1002/mco2.657
- Reid IR, Billington EO. Drug therapy for osteoporosis in older adults. Lancet. 2022;399(10329):1080-1092. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)02646-5
- Li J, Sun K, Qi B, et al. An evaluation of the effects and safety of Zuogui pill for treating osteoporosis: current evidence for an ancient Chinese herbal formula. Phytother Res. 2021;35(4):1754-1767. https://doi.org/10.1002/ptr.6908
- Shi T, Liu T, Kou Y, et al. The synergistic effect of Zuogui Pill and eldecalcitol on improving bone mass and osteogenesis in type 2 diabetic osteoporosis. Medicina (Kaunas). 2023;59(8):1414. https://doi.org/10.3390/medicina59081414
- Yang S, Zhang B, Wang YG, et al. Zuo Gui Wan promotes osteogenesis via PI3K/AKT signaling pathway: network pharmacology analysis and experimental validation. Curr Med Sci. 2023;43(5):1051-1060. https://doi.org/10.1007/s11596-023-2782-x
- Qiu J, Zhu Y, Xing J, Wang L, Zhang J, Yin H. Comparative pharmacokinetic study of 5 active ingredients after oral administration of Zuogui Pill in osteoporotic rats with different syndrome types. Int J Anal Chem. 2023;2023:1473878. https://doi.org/10.1155/2023/1473878
- Gong W, Zhang N, Cheng G, et al. Rehmannia glutinosa Libosch extracts prevent bone loss and architectural deterioration and enhance osteoblastic bone formation by regulating the IGF-1/PI3K/mTOR pathway in streptozotocin-induced diabetic rats. Int J Mol Sci. 2019;20(16):3964. https://doi.org/10.3390/ijms20163964
- Wang K, Kou Y, Rong X, Wei L, Li J, Liu H, Li M, Song H. ED-71 improves bone mass in ovariectomized rats by inhibiting osteoclastogenesis through EphrinB2-EphB4-RANKL/OPG axis. Drug Des Devel Ther. 2024;18:1515-1528. https://doi.org/10.2147/DDDT.S454116
- Percie du Sert N, Hurst V, Ahluwalia A, et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000410. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000410
- Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-661. https://doi.org/10.1096/fj.07-9574LSF
- Eastell R, Szulc P. Use of bone turnover markers in postmenopausal osteoporosis. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(11):908-923. https://doi.org/10.1016/S2213-8587(17)30184-5
- Yao ZY, Fan SY, Song ZF, Li ZC. Network pharmacology-based and molecular docking-based analysis of You-Gui-Yin for the treatment of osteonecrosis of the femoral head. Medicine (Baltimore). 2023;102(43):e35581. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000035581
- Wang J, Xu C, Zhang J, Bao Y, Tang Y, Lv X, Ma B, Wu X, Mao G. RhoA promotes osteoclastogenesis and regulates bone remodeling through mTOR-NFATc1 signaling. Mol Med. 2023;29(1):49. https://doi.org/10.1186/s10020-023-00638-1
- Noviana E, Indrayanto G, Rohman A. Advances in fingerprint analysis for standardization and quality control of herbal medicines. Front Pharmacol. 2022;13:853023. https://doi.org/10.3389/fphar.2022.853023
- Fischer V, Haffner-Luntzer M. Interaction between bone and immune cells: implications for postmenopausal osteoporosis. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:14-21. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2021.05.014
- Komori T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 2015;759:287-294. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2015.03.028
- Dempster DW, Compston JE, Drezner MK, et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2013;28(1):2-17. https://doi.org/10.1002/jbmr.1805