Методическая статья

Функциональная реконституция митохондриальных дыхательных суперкомплексов

72 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72243

⸱

21 августа 2026 г.

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем простой протокол реконституции функциональных митохондриальных дыхательных суперкомплексов в четко определенные протеолипосомы для коррелированного структурного и функционального анализа.

Аннотация

Митохондрии являются центральными узлами биоэнергетического метаболизма и основным источтом АТФ. Внутренняя мембрана митохондрий содержит систему окислительного фосфорилирования, которая включает комплексы электрон-транспортной цепи (CI, CII, CIII2, и CIV) и АТФ-синтазу (CV). У млекопитающих CI, CIII2, и CIV формируют высокоуровневые структуры, называемые суперкомплексами (СК), такие как СК I+III2+IV, SC I+III2и SC III2+IV. Хотя физиологические факторы, способствующие образованию суперкомплексов (СК), остаются неясными, было выдвинуто предположение, что формирование СК может увеличивать скорость переноса электронов между комплексами, снижать выработку активных форм кислорода или предотвращать неспецифическую агрегацию белков в плотно упакованной внутренней мембране митохондрий. Структурные и функциональные исследования респираторных СК в значительной степени опирались на комплексы, экстрагированные детергентами. Несмотря на то что эти исследования расширили наше понимание цепи переноса электронов, отсутствие герметичного мембранного бислоя ограничивает возможность изучения функциональных преимуществ сборки суперкомплексов. Однако последние достижения показали, что структурная характеристика мембранных белков возможна в реконструированных мембранных средах, близких к нативным, что обеспечивает более физиологический контекст для данных исследований. В данной работе мы представляем простой, быстрый и воспроизводимый протокол реконструирования респираторных СК в липосомы. Этот метод позволяет тестировать влияние различного липидного состава, концентрации белка и мембранного потенциала на функцию респираторных СК, предоставляя ценный инструмент для будущих механистических исследований.

Введение

Митохондрии играют центральную роль в дыхании эукариот. Внутренняя мембрана митохондрий (ВММ) содержит систему окислительного фосфорилирования, состоящую из комплексов электрон-транспортной цепи (CI–CIV) и АТФ-синтазы (CV)1. CI и CII переносят электроны от восстановленных субстратов на убихинон (CoQ), образуя убихинол (CoQH2), который передает электроны через CIII2 и с помощью цитохрома c на CIV, где кислород восстанавливается до воды. Перекачка протонов комплексами CI, CIII2 и CIV создает протонный движущий потенциал (ПДП), который используется CV для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата (P)1.

Помимо функционирования независимо, CI, CIII2 и CIV могут объединяться в суперкомплексы (СК) более высокого порядка с определенной стехиометрией, такие как SC I+III2+IV (также известный как респирасома), SC I+III2 и SC III2+IV2,3,4,5. Функциональные преимущества таких объединений остаются неясными6. Гипотезы об их функции варьируются от участия в сборке и канализации субстратов до представления в качестве побочного продукта высокой плотности белков во внутренней митохондриальной мембране (ВММ)3,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Недавние исследования показывают, что свойства мембраны, включая мембранное напряжение, вызванное гидрофобным несоответствием, белок-белковые и белок-липидные взаимодействия, способствуют формированию и стабильности СК16.

Структурные и функциональные исследования мембранных белков традиционно опирались на комплексы, солюбилизированные детергентами, которые разрушают нативную среду мембран и ограничивают изучение процессов, зависящих от мембранного потенциала и ионных градиентов. Напротив, последние достижения демонстрируют, что мембранные белки могут быть структурно охарактеризованы в реконструированных17,18,19 или нативных мембранах20,21,22,23, что значительно расширяет возможности изучения функциональных механизмов мембранных белков, зависящих от мембранного потенциала и ионных градиентов.

В данном протоколе описывается простой и воспроизводимый метод реконституции митохондриальных дыхательных суперкомплексов (СК) в определенные протеолипосомы. Полученная система представляет собой мощную платформу для исследования фундаментальных вопросов, касающихся формирования, стабильности и функции дыхательных СК в контролируемой мембранной среде, приближенной к нативной. Включив CoQ10 и цитохром c в процессе реконституции, мы демонстрируем, что реконструированные в протеолипосомах СК поддерживают потребление кислорода, зависящее от NADH, что указывает на сохранение функциональной активности комплексов внутри липидного бислоя. Далее мы показываем, что СК в протеолипосомах могут быть легко визуализированы с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), что позволяет установить прямую корреляцию между структурной организацией и биохимической активностью.

Хотя данный метод является надежным и легко воспроизводимым, успешная реконституция зависит от тщательной оптимизации липидного состава, концентрации детергента, соотношения белка и липида, а также от эффективной герметизации мембраны для сохранения стабильности и активности суперкомплекса.

Общая цель данного метода — обеспечить комплексный структурный и функциональный анализ респираторных суперкомплексов (SC) в определенных мембранных условиях. Этот подход устраняет ключевые недостатки систем на основе детергентов, восстанавливая SC в герметичном липидном бислое, который способен поддерживать мембранный потенциал и физиологически значимые белково-липидные взаимодействия. Кроме того, система позволяет точно контролировать липидный состав, кофакторы и содержание белка, что делает ее подходящей для систематического изучения влияния свойств мембраны на стабильность и активность SC. По сравнению с препаратами, солюбилизированными детергентами, или подходами in situ, данный метод обладает явным преимуществом, сочетая функциональные тесты, такие как потребление кислорода, стимулируемое NADH, со структурным анализом методом криоэлектронной микроскопии (cryo-EM), что позволяет устанавливать корреляции «структура-функция», которые трудно достичь с помощью других систем.

Протокол

Митохондриальные мембраны сердца свиньи были выделены из коммерчески приобретенной ткани сердца , полученной от животных, забитых для употребления в пищу. Живые животные специально для данного протокола не использовались. Было установлено, что использование этого материала не требует одобрения комитета по этике работы с животными, поскольку ткань была получена в качестве побочного продукта от животных, забитых для употребления в пищу.

1. Очистка митохондриального суперкомплекса SC I+III2/SC I+III2+IV из промытых мембран митохондрий сердца свиньи

  1. Разморозить 40 mg (4 mL) промытых митохондриальных мембран в виде аликвот по 10 mg/mL (промытые мембраны готовят согласно ранее описанному методу24,25).
  2. Развести мембраны в 4 mL буфера MX (30 mM HEPES, pH 7.7, 150 mM ацетата калия, 10% глицерина, 1 mM EDTA, 0.002% (w/v) фенилметилсульфонилфторида, 0.1% (w/v) CHAPS (3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфоната), 1 mM феррицианида калия). Добавить 8 mL 2% (w/v) раствора дигитонина в буфере MX (160 mg дигитонина в 8 mL; конечное соотношение 4:1 (mg дигитонина : mg общего белка мембран). Конечный объем составляет 16 mL.
  3. Гомогенизировать вручную в гомогенизаторе Dounce (50 проходов), стараясь не допустить образования пузырьков. Инкубировать (в режиме перемешивания/вращения) в течение 1 ч при 4 °C.
  4. Центрифугировать гомогенат при 16,000 × g и 4 °C в течение 30 min. Собрать супернадант.
  5. Сконцентрировать супернадант до 1 mL, используя центрифужный концентратор с порогом отсечения 100 kDa при 3000 × g и 4 °C. Концентрировать циклами по 10 min, тщательно перемешивая содержимое между центрифугированием, до достижения требуемого объема (образцы склонны к агрегации при отсутствии ресуспендирования между циклами центрифугирования из-за повышения локальной концентрации детергента у фильтра).
  6. Разделить сконцентрированный образец на четыре аликвоты по 250 µL. 
  7. Уравновешить колонку для эксклюзионной хроматографии (объем колонки: 24 mL) буфером для эксклюзионной хроматографии (буфер SEC; 30 mM HEPES pH 7.8, 150 mM ацетата калия, 1 mM EDTA, 0.005% гликозидного детергента), пропустив 48 mL (2 объема колонки).
  8. Настроить программу хроматографии для сбора фракций по 1 mL, начиная с объема элюции 6 mL и до достижения объема элюции 24 mL. Ввести аликвоту 250 µL (из этапа 1.6) на сорбент для эксклюзионной хроматографии объемом 24 mL. Использовать колонку, предварительно уравновешенную буфером для эксклюзионной хроматографии (из этапа 1.7). Собрать фракции из фракционера перед началом следующего цикла.
  9. Повторить этапы 1.7 и 1.8 для остальных сконцентрированных аликвот из этапа 1.6.
  10. Провести анализ 10 µL каждой фракции из циклов SEC, смешанных с 5 µL красителя для нанесения при синем нативном полиакриламидном электрофорезе (BN-PAGE), на градиентном геле 3%–12% акриламида, и выполнить in-gel анализ активности NADH/нитротетразол синего хлорида CI26  для проверки активности CI во фракциях. 
    ПРИМЕЧАНИЕ: Респираторные SC элюируются из сшитого агарозного геля для фильтрации объемом 24 mL при объеме элюции приблизительно 11.5 mL.
  11. Объединить фракции, демонстрирующие максимальную активность CI с высокой молекулярной массой в in-gel анализе активности CI. Сконцентрировать образец, как описано выше в пункте 1.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сконцентрированные SC в гликозидном детергенте глико-диосгенине (GDN) можно хранить с 30% (v/v) глицерином при конечной концентрации примерно 10 mg/mL в жидком N2. 40 mg промытого митохондриального комплекса дали 3.4 mg общего белка по результатам BCA-анализа.

2. Приготовление липидной смеси

ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицировано на основе ранее опубликованных протоколов27,28. Хлороформ токсичен, летуч и является предполагаемым канцерогеном. Работать с ним следует только в сертифицированном химическом вытяжном шкафу с использованием соответствующих СИЗ. Пентан легко воспламеняем. Держать вдали от источников возгорания. Работать с ним следует только в сертифицированном химическом вытяжном шкафу с использованием соответствующих СИЗ. Утилизируйте отходы органических растворителей в утвержденные контейнеры для галогенированных/негалогенированных растворителей в соответствии с правилами техники безопасности и охраны окружающей среды (EH&S) вашего учреждения.

  1. Работая в вытяжном шкафу, отдельно приготовьте стоковые растворы POPC (1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин), POPE (1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин) и CL (кардиолипин: 1,3-бис(sn-3’-фосфатидил)-sn-глицерол; из ткани сердца быка) в хлороформе в концентрации 25 mg/mL. 
  2. Приготовьте 10 mM раствор CoQ10 в хлороформе. Для получения 25 mg общей смеси липидов добавьте в стеклянную пробирку объемом 13 mL 0,4 mL (10 mg) POPC, 0,4 mL (10 mg) POPE, 0,2 mL (5 mg) CL и 50 µL 10 mM CoQ10 (итоговое содержание 500 nmol CoQ10 (20 nmol CoQ10/mg липида)) из стоковых растворов. Итоговое весовое соотношение POPC:POPE:CL составляет 2:2:1.
  3. Высушите смесь в потоке инертного газа (аргона или азота) для удаления хлороформа, осторожно вращая пробирку, чтобы липидная смесь образовала тонкий слой по стенкам пробирки. Сушите при постоянном потоке инертного газа в течение 10 min.
  4. Растворите высушенный липидный слой в 1 mL пентана и повторите шаг 2.3, чтобы способствовать удалению остаточного хлороформа.
  5. Выдержите пробирку с высушенными липидами в вакуумном эксикаторе при комнатной температуре в течение ночи для полного удаления растворителей. 
  6. Добавьте 5 mL буфера для протеолипосом (PLB; 10 mM MOPS pH 7.4, 150 mM KCl) для регидратации липидной смеси, плотно закройте пробирку, чтобы избежать утечки, и осторожно перемешайте на вортексе до полной сольватации липидов (когда высушенные липиды перестанут быть видны на стенках пробирки).
  7. Снимите заглушку, заполните пробирку инертным газом (аргоном или азотом), снова закройте ее и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 h. После 1 h инкубации разлейте липидную смесь в аликвоты по 300 µL и храните при −20 °C. 
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь POPC:POPE:кардиолипин (2:2:1) была выбрана на основе эмпирической оптимизации, а также потому, что PE и кардиолипин являются основными компонентами внутренней мембраны митохондрий; тем не менее, протокол можно легко адаптировать для тестирования альтернативных липидных составов.

3. Реконституция митохондриальных SC в липосомы

  1. Разморозьте аликвоты SC, хранящиеся в жидком азоте (Liquid N 2)  (шаг 1.12) на льду. Выполните замену буфера для удаления глицерина из образца, ресуспендировав образец в буфере для эксклюзионной хроматографии (SEC). Сконцентрируйте образец с помощью центрифужных фильтров с пределом отсечения 100 кДа при 3000 × г при 4 °В. Между циклами концентрирования (примерно каждые 5 мин) продолжайте проводить замену буфера, ресуспендируя образец в буфере для эксклюзионной хроматографии (SEC).
  2. Проверьте конечную концентрацию SC с помощью BCA-анализа (набора для определения содержания белка с использованием бицинхониновой кислоты).
  3. Разморозьте 300 µВозьмите аликвот липидной смеси, приготовленной на этапе 2.7, и пропустите её через экструдер, оснащенный поликарбонатной мембраной с порами 100 нм, в течение шести циклов при комнатной температуре (один цикл представляет собой перемещение липидной смеси из левого шприца в правый и обратно). После завершения циклов экструзии соберите полученные липосомы размером 100 нм из шприца, противоположного исходному. В качестве альтернативы липосомы можно получить методом соникации. 
  4. Добавьте 9 µмл 20% (масс./об.) раствора моющего средства (конечная концентрация 0,6% масс./об.) к 250 µЛ выдавленной липидной смеси в отдельную пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно протестировать различные детергенты. Для данных экспериментов наиболее эффективным оказался холат натрия — анионный детергент на основе желчных солей.
  5. Перемешайте путем инверсии и инкубируйте при 4°C °С в течение 30 мин. 
  6. Добавьте 120 µг (или более) митохондриальных SC и 3 µл 10 мМ цитохрома c (конечная концентрация 100 µМ) к смеси. Довести объем до 300 µL с PLB. Итоговое соотношение липидов и белков составляет примерно 10:1 (по массе). В качестве дополнительного контроля параллельно создайте пустые липосомы, добавив к смеси липидов и детергента буфер для ЭКХ (30 мМ HEPES, pH 7,8, 150 мМ ацетата калия, 1 мМ ЭДТА, 0,005% гликозидного детергента) вместо митохондриальных SC и цитохрома. c. 
  7. Перемешайте путем инверсии и инкубируйте при 4°C °инкубировать при температуре C в течение 30 мин. 
  8. Промойте предварительно упакованную спин-колонку для обессоливания, содержащую смолу G-25, буфером PLB четыре раза методом гравитационного потока. Затем промойте колонку путем центрифугирования при 1 000 × г в течение 2 мин.
  9. Добавьте образец протеолипосом в промытую предварительно заполненную десальтирующую спин-колонку с сорбентом G-25 и центрифугируйте колонку при 1000 × г при 4 °Промывайте в течение 2 мин для удаления детергента. Соберите элюат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Липосомы, полученные методом экструзии, имели более однородное распределение по размеру по сравнению с липосомами, полученными путем соникации. Не центрифугируйте предварительно заполненную обессоливающую спин-колонку дольше, чем рекомендует производитель, чтобы избежать загрязнения образца детергентом. Протеолипосомы хранили при 4 °С и обычно используется в течение 36 ч для минимизации возможной потери активности и сохранения целостности суперкомплексов.

4. Анализ флотации липидов29

  1. Приготовьте 27% и 7% (масс./об.) растворы сахарозы в PLB. Создайте ступенчатый градиент, последовательно наслоив 1,5 mL 27% сахарозы и 0,9 mL 7% сахарозы в центрифужную пробирку объемом 3,5 mL.
  2. Осторожно нанесите 300 µL протеолипосом (из шага 3.9), содержащих SC, на поверхность градиента сахарозы. Центрифугируйте градиенты при 100,000 × g в роторе с фиксированным углом в течение 2 ч при 4 °C.
  3. Аккуратно соберите (стараясь избегать перемешивания) девять фракций по 300 µL (или десять фракций по 270 µL) сверху вниз. Если образовался осадок, ресуспендируйте его в последней фракции и соберите как фракцию 9 или 10. Весь нереконструированный SC должен накопиться во фракции 9 или 10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ флотации помогает отделить реконструированные протеолипосомы от пустых липосом и нереконструированных белковых комплексов. Он используется для оптимизации процесса реконструкции.

5. Спектроскопический анализ активности КI по восстановлению феррицианида и анализ активности КI в геле

  1. Приготовьте необходимый объем реакционного буфера с феррицианидом (FRB; 20 mM Tris HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 0,1% масс./об. 3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфоната (CHAPS), 1 mM феррицианида калия).
  2. Отмерьте 990 µL реакционного буфера в кювету объемом 1 mL. Добавьте в кювету 5 µL образца (из каждой фракции градиента), затем добавьте в реакционную смесь 5 µL 20 mM NADH (конечная концентрация 100 µM). Загерметизируйте кювету прозрачной пленкой и перемешайте путем инверсии.
  3. С помощью спектрометра зарегистрируйте скорость снижения оптической плотности при 340 nm и 25 °C. Снижение поглощения при 340 nm указывает на окисление NADH. Повторите процедуру для всех фракций в трех повторностях. Для записи холостой пробы вместо образца используйте 5 µL PLB.
  4. Рассчитайте скорость окисления NADH после вычитания значения холостой пробы и постройте график суммарной активности каждой из фракций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы эксперимент можно проводить в 96-луночном планшете.
  5. Объедините фракции с максимальной суммарной активностью (избегайте использования фракций на дне пробирки, обладающих активностью, так как они соответствуют нереконструированному белку). Доведите общий объем объединенных фракций до 20 mL с помощью PLB для разбавления сахарозы.
  6. Центрифугируйте образцы при 150,000 × g и 4 °C в течение 1 ч в роторе с фиксированным углом. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 200 µL PLB.
  7. Смешайте 25 µL ресуспендированного осадка из предыдущего этапа с 25 µL 2% масс./об. дигитонина в PLB и инкубируйте (в режиме вращения) при 4 °C в течение 1 ч.
  8. Осадите неэкстрагированные белки центрифугированием при 16,000 × g в течение 20 мин. Соберите супернатант.
  9. Добавьте 10 µL красителя для нанесения на BN-PAGE к 30 µL супернатанта и нанесите на градиентный гель BN-PAGE 3%–12%. Проведите электрофорез в двух гелях для проведения анализов активности CI и CIV в геле26.
  10. Проводите электрофорез при 150 V в течение 30 мин, используя темный буфер для BN-PAGE (25 mM Tris, 0,192 g глицина, 200 mg Coomassie blue). Замените темный синий буфер на светло-синий буфер (25 mM Tris, pH 8.3, 0,192 g глицина, 20 mg Coomassie blue) и продолжайте электрофорез еще 2 ч при 200 V.
  11. После завершения электрофореза перенесите гели в подходящий контейнер и проведите анализы активности CI и CIV в геле26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для структурных и функциональных исследований комплексов, реконструированных в липосомах, используйте оставшиеся ресуспендированные протеолипосомы из этапа 5.6. После полной оптимизации реконструирования можно пропустить этапы 4 и 5 и использовать реконструированные протеолипосомы непосредственно из этапа 3.

6. Анализ тушения флуоресценции ACMA для измерения целостности мембран реконструированных протеолипосом29

  1. Приготовьте необходимый объем реакционного буфера для ACMA (9-амино-6-хлоро-2-метоксиакридина) (10 mM MOPS pH 7.4, 15 mM KCl, 4 µM ACMA, 0.5 mg/mL бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2 mM 2-меркаптоэтанола). 
  2. Внесите аликвоту 930 µL реакционного буфера в кювету объемом 1 mL. Добавьте в кювету 50 µL реконструированных протеолипосом, закройте кювету и перемешайте путем переворачивания. Инкубируйте в защищенном от света месте в течение 8 min.
  3. Установите следующие параметры спектрометра: длина волны возбуждения 410 nm, длина волны эмиссии 490 nm. 
  4. После инкубации снова перемешайте содержимое кюветы путем переворачивания и измеряйте флуоресценцию на спектрометре при комнатной температуре в течение 8 min.
  5. Добавьте в кювету 4 µL 20 µM валиномицина (конечная концентрация 80 nM), перемешайте путем переворачивания и проводите измерение в течение 8 min.
  6. Добавьте в кювету 6 µL 1 mM CCCP (карбонилцианид m-хлорфенилгидразона) (конечная концентрация 6 µM), перемешайте путем переворачивания и проводите измерение в течение 8 min.
  7. Для создания контроля с пустыми везикулами повторите шаги 6.2–6.6, заменив реконструированные протеолипосомы «пустыми липосомами». Пустые липосомы создаются теми же этапами, что и реконструированные протеолипосомы, но при реконструкции вместо добавления SC используется буфер для SEC (шаг 3.6).
  8. Повторите измерения в трех повторностях как для реконструированных протеолипосом, так и для пустых липосом, и постройте график зависимости их относительной флуоресценции от времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные для реконструированных протеолипосом или пустых липосом масштабируются по формуле (Fi − Fmin)/(Fmax−Fmin), где Fmax — начальное базовое значение флуоресценции данного образца, а Fmin — минимальное базовое значение данного образца после добавления CCCP.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: CCCP является токсичным разобщителем митохондриального окисления; работу с ним следует проводить в перчатках в вытяжном шкафу.

7. Респирометрические измерения потребления кислорода для оценки функции реконструированных SC30.

ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потребления кислорода измеряют с помощью системы кислородного электрода типа Кларка. Функциональный анализ реконструированных SCs проводят непосредственно на элюате из обессоливающей колонки (этап 3.9).

  1. Подготовьте систему с кислородным электродом в соответствии с инструкциями производителя и запустите программное обеспечение для управления прибором. Добавьте 2 mL ультрачистой воды в измерительную камеру.
  2. Установите скорость перемешивания таким образом, чтобы график концентрации кислорода оставался неизменным при дальнейшем увеличении скорости (начните с 10, увеличивайте с шагом 10). Удалите воду MQ и добавьте оксигенированную воду (воду MQ из флакона, подвергнутую интенсивному встряхиванию).
  3. Выберите Calibrate > Liquid-phase calibration > Air-saturated water и дождитесь стабилизации калибровки (скорость 0 nmol в мин). С помощью небольшого шпателя добавьте в реакционный сосуд несколько (4–6) кристаллов дитионита натрия для достижения нулевой концентрации кислорода в камере.
  4. Дождитесь выхода сигнала на плато, прежде чем продолжить. Сохраните калибровку и очистите реакционную камеру, промыв её 5 × 1 mL 70% этанола, 5 × 1 mL 0.1 mM EDTA, 5 × 1 mL воды MQ и 5 × 1 mL реакционного буфера для оксиграфии (ORB; 150 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 5 mM MgCl2, 5 mM KH2PO4, 0.02 mM EGTA, 0.5 mg/mL BSA).
  5. Добавьте 2 mL ORB, нажмите кнопку «start read» в программе и дождитесь стабилизации графика. При добавлении протеолипосом (образца) в реакционную камеру отметьте на графике в программе момент добавления образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка в образце протеолипосом оценивается по общему количеству белка, добавленного к липосомам. Наилучшие результаты были получены при соотношении белок:липид 1:12 и конечной концентрации белка 50 µg/mL в камере системы с кислородным электродом (2 mL). Точный выход протеолипосом не измерялся.
  6. После стабилизации показаний системы с кислородным электродом добавьте NADH в реакционную камеру и одновременно отметьте на графике в программе момент добавления NADH. Продолжайте запись в течение 5 min.
  7. Добавьте CCCP, отметьте добавление в программе и продолжайте запись в течение 5 min.
  8. Добавьте ингибитор (например, ингибитор CI (пиерицидин А) или ингибитор CIII2 (миксотиазол) или ингибитор CIV (NaN3)) и отметьте это на графике в программе, записывайте данные в течение 2 min, затем остановите запись. 
  9. Сохраните график и очистите реакционную камеру, промыв её 5 x 1 mL 70% этанола, 5 × 1 mL 0.1 mM EDTA, 7 × 1 mL воды MQ и 5 × 1 mL ORB перед проведением следующего измерения.
  10. Для коррекции данных с учетом фоновой скорости рассчитайте фоновую скорость, т. е. наклон кривой до добавления NADH, и линейно экстраполируйте эту скорость на весь период измерения, рассчитав ожидаемую фоновую [O2] для каждой временной точки. Затем вычтите экстраполированное значение фоновой [O2] из измеренного значения [O2] для каждой временной точки.
  11. Рассчитайте скорость потребления кислорода (OCR) как наклон графика измерений концентрации [O2] с поправкой на фон после добавления каждого реагента.
  12. Для расчета скоростей относительно OCR после добавления NADH для каждой отдельной кривой разделите каждую измеренную OCR (например, OCR после добавления NADH, CCCP и ингибитора соответственно) на OCR, измеренную после добавления NADH.     
    ПРИМЕЧАНИЕ: ОСТОРОЖНО: Дитионит натрия является сильным восстановителем и может бурно реагировать с окислителями или влагой. Работать в перчатках. Отходы, содержащие ингибиторы, утилизируйте как опасные химические отходы в соответствии с правилами учреждения.

8. Определение размера реконструированных липосом методом динамического рассеяния света

  1. Включите прибор для динамического рассеяния света (DLS) и подождите около 30 мин для стабилизации лазера.
  2. Запустите программное обеспечение для сбора данных и закройте все предыдущие файлы.
  3. Профильтруйте протеолипосомы (0,2 μm) для удаления твердых частиц.
  4. Перенесите 70 µL протеолипосом в чистую кювету, избегая появления отпечатков пальцев или пятен.
  5. Поместите кювету в прибор и плотно закройте крышку.
  6. Создайте новый файл и выберите Manual Measurement > Size (Ручное измерение > Размер).
  7. Установите температуру 25 °C и переведите индекс затухания (attenuation index) в автоматический режим.
  8. Задайте свойства диспергента (вязкость и показатель преломления; например, RI = 1,330 для воды/буфера).
  9. Настройте параметры сбора данных (автоматическая длительность, ~3 измерения, обработка General Purpose).
  10. Запустите измерение и контролируйте размер, индекс полидисперсности (PDI) и скорость счета (целевое значение ~100–500 kcps).
  11. Проанализируйте результаты: проверьте распределение по размерам (интенсивность/объем), PDI (допустимо <0,3) и качество автокорреляции (плавный спад, стабильная базовая линия); сохраните данные.

9. Подготовка и скрининг сеток для криоэлектронной микроскопии

  1. Используйте образец протеолипосом из этапа 5.11 (или этапа 3.9, если этапы 4 и 5 были пропущены) для подготовки сеток для ЭМ. При необходимости сконцентрируйте протеолипосомы, повторив этап 5.6 и resuspendedив их в меньшем объеме PLB.
  2. Подвергните медные сетки с отверстиями и углеродным покрытием (300 mesh) воздействию тлеющего разряда в течение 90 s при 20 mA в системе очистки с использованием воздуха.
  3. Настройте автоматическую систему плунжерного замораживания для заморозки при влажности 95% и температуре 15 °C со следующими параметрами: время промакивания (blot time) 10 s, сила промакивания (blot force) −8, время ожидания (wait time) 10 s и время слива (drain time) 0.
  4. Закрепите пинцет с обработанной тлеющим разрядом сеткой в системе плунжерного замораживания.
  5. Нанесите 4.0 µL образца протеолипосом на обработанную сетку в автоматическом плунжере.
  6. Инкубируйте сетки в течение 10 s перед промакиванием в течение 10 s и плунжерным замораживанием в жидком этане. Осторожно перенесите сетки в контейнер для сеток в камере с жидким N2, а затем в сосуд Дьюара для хранения в жидком N2.
  7. Загрузите замороженные сетки и проведите скрининг на просвечивающем электронном микроскопе с криогенным загрузчиком образцов. Использовался просвечивающий электронный микроскоп с детектором прямого электрона.
  8. Настройте микроскоп в соответствии с инструкциями производителя и проведите скрининг сеток на наличие реконструированных протеолипосом. Сохраните изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Жидкий этан легко воспламеняется и является криогенным веществом; работайте с ним, используя соответствующие СИЗ, вдали от источников возгорания во избежание пожара и холодовых ожогов. Жидкий азот является криогенным веществом и может вызвать серьезные холодовые ожоги и вытеснение кислорода. Работайте с ним, используя соответствующие криогенные СИЗ, и только в хорошо проветриваемых помещениях.

Результаты

Используя данный протокол, мы определили оптимальные условия реконституции митохондриальных суперкомплексов (СК), выделенных из митохондрий сердца свиньи (Рисунок 1A,B). Протокол ступенчатого градиента сахарозы эффективно отделяет реконструированные протеолипосомы от пустых везикул и не включенных в них белков, что позволяет проводить быстрое тестирование и оптимизацию условий. Репрезентативные результаты в Рисунок 2 покажите градиент с нанесенным образцом до и после центрифугирования. Кроме того, мы оптимизировали состав детергента, используемого для реконституции дыхательного СК в липосомы. Для реконституции СК по отдельности использовали четыре различных детергента: анионный желчный соль-детергент, CHAPS, дигитонин и гликозидный детергент. Общая активность CI в фракциях для каждого протестированного детергента измеряли с помощью анализа NADH-феррицианидного окислительно-восстановительного процесса (Рисунок 3A–D). При успешной реконституции максимальная активность КI наблюдалась в фракциях на границе раздела двух концентраций сахарозы (27% масс./об. сахарозы и 7% масс./об. сахарозы). Примечательно, что минимальная активность обнаруживается во фракции #10 для анионного желчного детергента и CHAPS, в то время как фракция #Значение 10 как для дигитонина, так и для гликозидного детергента указывает на значительную активность, что свидетельствует о том, что дигитонин и гликозидный детергент не обеспечивают эффективную реконституцию суперкомплексов в липосомы. Для всех последующих реконституций использовался анионный желчный соль-детергент.

Анализ активности CI и CIV в геле, проведенный на геле для голубого нативного полиакриламидного электрофореза протеолипосом POPC:POPE:CL (2:2:1), экстрагированных дигитонином, демонстрирует относительное количество SC и отдельных комплексов ETC после реконституции (Рисунок 4). Результаты показывают, что взаимодействие между CI и CIII2 в значительной степени сохраняется в протеолипосомах после повторной экстракции дигитонином и BN-PAGE. Хотя в полосе суперкомплекса присутствует некоторая активность CIV, также наблюдается сильный сигнал при более низкой молекулярной массе, что соответствует отдельному CIV и указывает на диссоциацию. Проницаемость реконструированных липосом была измерена с помощью анализа тушения флуоресценции ACMA, который показал, что протеолипосомы не были существенно проницаемы для протонов (Рисунок 5A,B). Размер реконструированных липосом был оценен с помощью DLS, что показало, что экструзия перед реконституцией приводит к итоговому распределению размеров протеолипосом 82.9 ± 0.8 nm в диаметре для пустых везикул и 10.6 ± 0.4 nm для реконструированных протеолипосом суперкомплексов RSPs (Рисунок 6). Потребление кислорода протеолипосомами использовалось для оценки функции SC, выявив четкое чувствительное к ингибиторам потребление кислорода, стимулируемое NADH (Рисунок 7A). Построение графиков OCR относительно OCR после добавления NADH напрямую сообщает о степени сопряжения внутри RSPs, т. е. OCR увеличивается примерно в 1.5 раза после добавления CCCP по сравнению с добавлением только NADH (Рисунок 7B). Просеянные сетки для крио-ЭМ позволили визуализировать SC в мембране протеолипосом, подтвердив успешную реконституцию (Рисунок 8A–I).

Процесс хроматографии, график УФ-поглощения, гель БН-ПААГ, очистка белков, результаты анализа.
Рисунок 1: Выделение и характеристика суперкомплексов из митохондрий сердца свиньи, солюбилизированных детергентом. (A) Репрезентативная хроматограмма очистки комплексов митохондриальных мембран свиньи, экстрагированных дигитонином, методом эксклюзионной хроматографии (SEC). (B) Электрофорез в нативных условиях с использованием Coomassie G-250 (BN-PAGE) фракций из A визуализировали с помощью окрашивания активности в геле с использованием CI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Центрифугирование в градиенте плотности, схема разделения протеолипосом; анализ слоев везикул и белков.
Рисунок 2Ступенчатые градиенты сахарозы с протеолипосомами. До центрифугирования (слева), после центрифугирования (справа) при 100 0 × g в течение 2 ч в ультрацентрифуге. Образец протеолипосом, нанесенный на градиент, разделяется на пустые везикулы, протеолипосомы и агрегированный белок в нижней части. Затем данный градиент фракционируют для дальнейшей характеризации согласно описанию. Приблизительный объем каждой фракции указан и отмечен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатая диаграмма, демонстрирующая активность фермента при использовании детергентов: холат натрия, CHAPS, GDN, дигитонин.
Рисунок 3: Флотационный анализ для оценки эффективности реконституции в различных детергентахАктивность НАДН-феррицианидредуктазы комплекса I в фракциях сахарного ступенчатого градиента после реконституции с (А) анионный желчнокислотный детергент, (Б) 3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат (CHAPS) (0,6% (м/об)), (С) дигитонин (0,6% масс./об.), (D) гликозидный детергент (GDN) (0,6% (масс./об.)). Фракция #10 получают путем ресуспендирования любого осадка в последней фракции. Активность во фракции #10 указывает на то, что белки не реконструировались. n = 3, планки погрешностей соответствуют SD = стандартному отклонению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема геля электрофореза, демонстрирующая результаты разделения белков; маркированные полосы указывают на типы белков.
Рисунок 4: Анализ активности в геле протеолипосом, экстрагированных дигитонином, методом BN-PAGE с градиентом 3%–12%. Анализ активности комплекса I (слева) и комплекса IV (справа) в геле. R = респирасома (К I+III2+IV), п/к1,3 (SC I+III2), IGA CI = (анализ активности CI в геле); IGA = анализ активности в геле CIV = (анализ активности CIV в геле). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту фигуру в увеличенном размере.

График тушения флуоресценции: пустые липосомы в сравнении с протеолипосомами, обработка валиномицином и CCCP.
Рисунок 5Метод гашения флуоресценции ACMA для определения проницаемости для протонов в реконструированных протеолипосомахС помощью pH-чувствительного красителя (ACMA) внутреннее значение pH реконструированных протеолипосом (голубой цвет) сравнивали с пустыми липосомами (оранжевый цвет) после последовательного добавления валиномицина и CCCP. Для сравнения представлены репрезентативные кривые флуоресценции ACMA, полученные из различных препаратов протеолипосом. (A) Реконструированные липосомы с поврежденной мембраной (протекающие). (B) Реконструированные липосомы с интактной мембраной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

График распределения размеров для сравнения протеолипосом и пустых липосом; анализ зависимости объема от размера.
Рисунок 6Динамическое рассеяние света при измерении пустых липосом и реконструированных протеолипосом SC. Представлены средние распределения размеров по объему экструдированных пустых липосом (оранжевый цвет) и протеолипосом, реконструированных с помощью SC (голубой цвет). Измерения проводились в трех технических повторностях. Пустые липосомы имеют средний гидродинамический диаметр 82,9 ± 0,8 нм, в то время как RSPs имеют средний гидродинамический диаметр 10,6 ± 0,4 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Клеточное дыхание, график потребления кислорода и гистограмма с анализом воздействия NADH, CCCP и пиерицидина А.
Рисунок 7: Анализ потребления кислорода для оценки сопряжения реконструированных синтез-комплексов в липосомахПотребление кислорода измеряли для оценки дыхательной активности и сопряжения комплексов электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) после их реконструирования в липосомы, полученные методом экструзии. (А) Репрезентативная кривая записи с кислородного электрода с поправкой на фоновые значения, демонстрирующая изменения концентрации кислорода после последовательного добавления NADH для запуска дыхания, опосредованного комплексом I (CI), CCCP для устранения протонного градиента и измерения максимальной скорости несвязанного потребления кислорода (OCR), пиерицидина А для ингибирования CI и антимицина А для ингибирования CIII2, или NaN3 (Азид) для ингибирования CIV. (B) Количественное определение скорости потребления кислорода (OCR) в указанных условиях с поправкой согласно шагу 7.10. Для каждой кривой представлены точки данных относительно OCR после добавления NADH, а также среднее значение ± SD (планки погрешностей). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту фигуру в большем размере.

Криоэлектронный анализ процесса формирования липидных везикул; стрелками отмечены структуры везикул; масштабная линейка 10–50 нм.
Рисунок 8: Визуализация реконструированных SC в мембранах протеолипосом методом криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). (A–C) Репрезентативные электронные микрофотографии просеянных сеток, демонстрирующие реконструированные синтетические каналы (SC), ассоциированные с мембранами протеолипосом. Реконструированные SC отмечены желтыми стрелками. Масштабные отрезки = 50 нм. (D–I) Репрезентативные частицы SC при большем увеличении на мембранах протеолипосом. Масштабные отрезки = 10 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту фигуру в увеличенном размере.

Обсуждение

Представлен простой и воспроизводимый метод реконституции митохондриальных дыхательных суперкомплексов (SC) в определенные протеолипосомы, позволяющий контролируемо исследовать их структуру и функцию. Несколько этапов данного протокола имеют критическое значение для успешной реконституции. По нашим данным, липосомы, полученные методом экструзии, имеют более однородное распределение по размеру (оцененное с помощью динамического рассеяния света), чем липосомы, полученные путем соникации. Эффективное удаление детергента с использованием предварительно заполненной обессоливающей спин-колонки необходимо для обеспечения герметизации мембраны и правильного встраивания SC в липидный бислой; неполное удаление может привести к образованию «протекающих» или нестабильных протеолипосом. Оптимизация липидного состава, соотношения белка и липида, а также выбор детергента одинаково важны, так как эти параметры сильно влияют на эффективность реконституции и стабильность SC. Метод флотации в градиенте сахарозы полезен для первоначальной оптимизации; однако после установления условий предпочтительнее использовать протеолипосомы непосредственно после обессоливающей спин-колонки для последующего структурного и функционального анализа, чтобы избежать потери образца и его разрушения при фракционировании в градиенте. Объем фракции, необходимый для наблюдения активности, варьируется от препарата к препарату. Отрегулируйте объем добавляемой в реакционную смесь фракции для разных препаратов. Ориентация дыхательного SC в мембране протеолипосомы может существенно влиять на результаты измерений дыхания. Процедура реконституции не была оптимизирована для обеспечения единой топологии; следовательно, хотя ожидается смешанная популяция ориентаций, тесты на доступность феррицианида к CI указывают на выраженное преобладание периферических плеч CI, обращенных наружу.

Ориентация реконструированных суперкомплексов была оценена экспериментально, а активность CI по феррицианиду измерялась в присутствии и в отсутствие детергента. В интактных RSP извне добавленный NADH может взаимодействовать только с молекулами CI, периферическое плечо которых обращено к внешней среде, тогда как пермеабилизация детергентом обеспечивает доступ NADH ко всем комплексам. Таким образом, данный анализ позволяет оценить долю функционально доступных периферических плеч CI, обращенных к внешней среде, а не дает полное структурное определение топологии протеолипосом. Сравнение активности, измеренной в этих условиях, показало, что 83,1% ± 0,04% респирасом (SC) были ориентированы периферическим плечом CI наружу, что свидетельствует о значительной направленной ориентации в процессе реконституции.

Для повышения воспроизводимости и стабильности можно использовать несколько модификаций и стратегий устранения проблем. Анализы активности в геле для CI и CIV, проведенные на объединенных фракциях, экстрагированных дигитонином из сахарозных градиентов, демонстрируют полосы для SC, что указывает на то, что SC не диссоциирует полностью в процессе реконституции. Однако полоса SC более выражена на геле активности CI по сравнению с гелем активности CIV, что свидетельствует о том, что CIV может частично диссоциировать от CI и CIII2 после реконституции (Рисунок 4). Регулировка липидного состава может повысить стабильность SC. Частичная диссоциация CIV также может быть следствием выбора детергента или быстрого удаления детергента во время реконституции, что может дестабилизировать более слабые белок-белковые взаимодействия внутри суперкомплекса. Дальнейшая оптимизация условий обмена детергентов может улучшить удержание CIV. Кроме того, минимизация механического стресса, исключение ненужных этапов очистки и осторожное обращение с образцами могут помочь сохранить целостность протеолипосом. Для функциональных анализов критически важно обеспечить полную герметизацию протеолипосом, так как проницаемость мембраны препятствует сопряжению с трансмембранным протонным градиентом. При подготовке сеток для крио-ЭМ важно использовать сетки с непрерывным углеродным покрытием, так как было показано, что это улучшает распределение частиц в отверстиях сетки19.

Несмотря на свои преимущества, данный подход имеет определенные ограничения. Протеолипосомы не полностью воспроизводят композиционную и динамическую сложность нативной внутренней мембраны митохондрий, а частичная диссоциация компонентов SC, в особенности CIV, по-прежнему остается проблемой. На функциональные показатели также может влиять неполное сопряжение или неоднородность эффективности реконституции. Тем не менее, по сравнению с системами, солюбилизированными детергентами, этот метод сохраняет белково-липидные взаимодействия и поддерживает мембранную среду, близкую к нативной, обеспечивая при этом более высокий уровень экспериментального контроля, чем подходы in situ. Таким образом, он представляет собой ценную платформу для систематического исследования того, как липидный состав и свойства мембраны регулируют стабильность и активность SC.

Понимание этих взаимосвязей особенно важно, поскольку нарушение организации дыхательных суперкомплексов implicated в широком спектре митохондриальных и метаболических расстройств31,32,33,34,35,36,37,38,39,40. Дефекты сборки комплексов ЭТЦ, синтеза кардиолипина или ремоделирования липидов, наблюдаемые при таких заболеваниях, как синдром Лея41,42,43,44,45,46,47, синдром Барта48,49,50,51,52,53,54 и синдром Сенгерса48, могут дестабилизировать суперкомплексы, нарушать перенос электронов, снижать выработку ATP и увеличивать генерацию активных форм кислорода. Эти биоэнергетические дефекты непропорционально затрагивают ткани с высоким энергопотреблением, такие как сердце, скелетные мышцы и головной мозг, что приводит к развитию таких фенотипов, как кардиомиопатия, непереносимость физических нагрузок и нейродегенерация36,37,38. Напротив, появляющиеся данные свидетельствуют о том, что образование суперкомплексов может выполнять компенсаторную и защитную функции в условиях стресса, стабилизируя комплексы ЭТЦ и ограничивая патологическую продукцию АФК55,56. Описанная здесь платформа реконструированных протеолипосом представляет собой контролируемую систему для прямого изучения того, как связанное с заболеванием ремоделирование липидов, мутации или фармакологические вмешательства изменяют сборку и функцию суперкомплексов, что позволяет проводить механистические исследования митохондриальной дисфункции и разрабатывать будущие терапевтические стратегии.

Низкая скорость потребления кислорода может быть следствием плочного встраивания суперкомплексов, частичной диссоциации CIV, остатков детергента, недостатка CoQ10 или цитохрома c, деградации NADH или низкой концентрации белка в камере оксиграфа. Подтвердите реконституцию с помощью анализа флотации или BN-PAGE, проверьте целостность мембран путем гашения флуоресценции ACMA, приготовьте свежий раствор NADH и оптимизируйте соотношение белка и липидов, концентрацию кофакторов, удаление детергента и концентрацию образца. Протекание протеолипосом может быть вызвано неполным удалением детергента, избыточной концентрацией детергента, грубым обращением, повторными циклами замораживания-оттаивания или повреждением липидов. Если в анализе с ACMA наблюдается утечка протонов, повторите удаление детергента, используя свежеуравновешенную обессоливающую колонку, избегайте чрезмерного центрифугирования колонки, приготовьте свежие липосомы, минимизируйте механическое воздействие и используйте протеолипосомы сразу после реконституции. Агрегация на этапах концентрирования может происходить из-за высокой локальной концентрации белка или детергента у мембраны концентратора. Концентрируйте образцы короткими (10 min) циклами центрифугирования, аккуратно ресуспендируйте образец между циклами, избегайте избыточного концентрирования, храните образцы при 4 °C и удаляйте видимые агрегаты путем низкоскоростного осветления перед дальнейшим использованием. Нестабильное поведение при флотации может отражать вариабельность размера липосом, неполное удаление детергента, агрегацию, неправильное наслоение сахарозы или нарушение градиента при загрузке образца или сборе фракций. Приготовьте свежие растворы сахарозы, наслоите градиенты медленно, не смешивая границы разделов, используйте однородно экструдированные липосомы, поддерживайте постоянные условия центрифугирования и аккуратно собирайте фракции сверху вниз. Неравномерное распределение частиц при крио-ЭМ может быть вызвано низкой концентрацией протеолипосом, агрегацией, преимущественной адсорбцией на углероде, плохим смачиванием сетки, слишком толстым слоем льда или избыточным промакиванием. Оптимизируйте концентрацию протеолипосом, удаляйте агрегаты перед подготовкой сетки, отрегулируйте условия тлеющего разряда, протестируйте время и силу промакивания, подберите подходящий тип сеток или углеродных подложек и по возможности используйте свежеприготовленные образцы.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Скрининг сеток проводился в центре BioEM при Калифорнийском университете в Дейвисе (UC Davis). Мы благодарим доктора Фэй Го за помощь в проведении скрининга. Работа была профинансирована NIGMS при NIH в рамках гранта R35GM137929 (JAL).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (POPC)Avanti Research860320
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (POPE)Avanti Research850757
1,3-бис(sn-3-’-фосфатидил)-sn-глицерин (кардиолипин, из ткани сердца быка)Avanti Research840012
2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота — HEPESSigma-AldrichH23830
3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS)Sigma-AldrichM12545
3,3′-Диаминобензидин ---- DABBSigma-AldrichD4293
Карбонилцианид м-хлорфенилгидразон ---- CCCPSigma-AldrichC2759
CHAPSSigma-Aldrich220201
ХлороформSigma-Aldrich650948
Коэнзим Q10Sigma-AldrichC9538
Цитохром c из сердца лошадиSigma-AldrichC2506
ДигитонинSigma-Aldrich300410
этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N′,N′-тетрауксусная кислота --- ЭГТАSigma-AldrichE3889
Этилендиаминтетрауксусная кислота — ЭДТАSigma-AldrichE6758
ГлицеринSigma-AldrichG7893
Глико-диосгенинAnatraceGDN101детергент
лаурилмальтозонеопентилгликоль ---- LMNGSigma-AldrichNG310
Хлорид магнияSigma-AldrichM8266
МиксотиазолSigma-AldrichT5580
NADH, динатриевая сольSigma-Aldrich481913
Нитротетразолиум синий хлоридSigma-AldrichN6876
Пиерицидин АSigma-Aldrich96861
Ацетат калияSigma-AldrichP5708
Хлорид калияSigma-AldrichP3911
Феррицианид калияSigma-Aldrich702587
Дигидрофосфат калия ---- KH2PO4Sigma-AldrichP0662
Азид натрияSigma-AldrichS2002
Гидрат холата натрияSigma-AldrichC1254
Хлорид натрияSigma-AldrichS9888
Дитионит натрияSigma-Aldrich71699
СахарозаSigma-AldrichS9378
ТРИСSigma-AldrichT1503
ACMA (9-амино-6-хлоро-2-метоксиакридин)Sigma-AldrichSML4162
Оборудование и наборы
Amicon® Ультрацентрифужный фильтр, ППО 100 кДа, 0,5 млMilliporeUFC5100
Amicon® Ультрацентрифужный фильтр, ППО 100 кДа, 15 млMilliporeUFC9100
Ультрацентрифуга Beckman Optima TLXBeckman Coulter
гель для BN-PAGEгель для голубого нативного полиакриламидного электрофореза
Ультрацентрифуга Beckman Optima XEBeckman Coulter
Система очистки тлеющим разрядомсистема очистки тлеющим разрядом
Крио-ПЭМ Glacios 2 с детектором Gatan K3Thermo Fisher Scientificтрансмиссионный электронный микроскоп
набор гомогенизаторов для тканей Dounce KIMBLESigma-AldrichD9188
Автоматический поршень Leica GP2Leica
Микроцентрифуга 16Beckman CoulterA46474
Хроматографическая система NGC Discover 10Bio-Rad7880009
Oxygraph+система кислородного электрода
Обессоливающая колонка PD-10Cytiva28918007спин-колонка для эксклюзионной хроматографии
Набор для определения концентрации белка Pierce BCA Protein assay kitThermo Fisher Scientific23225набор для определения концентрации белка методом бицинхониновой кислоты
Ультразвуковой гомогенизатор Q-125Q-sonicaQ125-110
Колонка с Sephadex G-25 Mпредзаполненная центрифужная колонка для обессоливания с смолой G-25
Микропланшетный ридер SpectraMax M2Molecular Devices
Superose 6 increase 10/300 GLCytiva29091596сшитый агарозный гель-фильтрационный сорбент
TLA-100.3 Комплект с ротором с фиксированным угломBeckman Coulter349490
Фиксированный угловой ротор Type 50.2 Ti из титанаBeckman Coulter337901
вода Milli-Q (MQ)сверхчистая вода
Malvern Zetasizer ZS, динамическое рассеяние света (ДРС)Malvern Pananalytical
Система Oxygraph+ от HansatechHansatech Instruments
Система очистки тлеющим разрядом PELCO easiGlowTED PELLA, INC
Система Vitrobot Mark IVThermo Fisher Scientificкриозамораживатель с погружением
Медные сетки Quantifoil R 1.2/1.3 300 mesh с углеродным слоем 2 нмTED PELLA, INC668-300-Cu-100с перфорированным углеродным покрытием
мини-экструдер AvantiAvanti Lipids610000

Ссылки

  1. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 1961;191:144-8.
  2. Dudkina NV, Kudryashev M, Stahlberg H, Boekema EJ. Interaction of complexes I, III, and IV within the bovine respirasome by single particle cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:15196-200.
  3. Althoff T, Mills DJ, Popot JL, Kühlbrandt W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 2011;30:4652-64.
  4. Schäfer E, Dencher NA, Vonck J, Parcej DN. Three-dimensional structure of the respiratory chain supercomplex I1III2IV1 from bovine heart mitochondria. Biochemistry. 2007;46:12579-85.
  5. Schägger H, Pfeiffer K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 2000;19:1777-83.
  6. Milenkovic D, Blaza JN, Larsson NG, Hirst J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metab. 2017;25:765-76.
  7. Berndtsson J, et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Rep. 2020;21. doi:10.15252/embr.202051015.
  8. Moe A, Di Trani J, Rubinstein JL, Brzezinski P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118. doi:10.1073/pnas.2021157118.
  9. Blaza JN, et al. Kinetic evidence against partitioning of the ubiquinone pool and the catalytic relevance of respiratory-chain supercomplexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:15735-40.
  10. Diaz F, Enríquez JA, Moraes CT. Cells lacking Rieske iron-sulfur protein have a reactive oxygen species-associated decrease in respiratory complexes I and IV. Mol Cell Biol. 2012;32:415-29.
  11. Maranzana E, et al. Mitochondrial respiratory supercomplex association limits production of reactive oxygen species from complex I. Antioxid Redox Signal. 2013;19:1469-80.
  12. Schägger H, et al. Significance of respirasomes for the assembly/stability of human respiratory chain complex I. J Biol Chem. 2004;279:36349-53.
  13. Acín-Pérez R, et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Mol Cell. 2004;13:805-15.
  14. Letts JA, Sazanov LA. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nat Struct Mol Biol. 2017;24:800-8.
  15. Protasoni M, et al. Respiratory supercomplexes act as a platform for complex III-mediated maturation of human mitochondrial complexes I and IV. EMBO J. 2020;39. doi:10.15252/embj.2019102817.
  16. Pöverlein MC, Jussupow A, Kim H, Kaila VRI. Protein-induced membrane strain drives supercomplex formation. eLife. 2024;13. doi:10.7554/eLife.102104.1.
  17. Mandala VS, MacKinnon R. Voltage-sensor movements in the Eag Kv channel under an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119. doi:10.1073/pnas.2214151119.
  18. Falzone ME, MacKinnon R. Gβγ activates PIP2 hydrolysis by recruiting and orienting PLCβ on the membrane surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120. doi:10.1073/pnas.2301121120.
  19. Grba DN, et al. Molecular mechanism of the ischemia-induced regulatory switch in mammalian complex I. Science. 2024;384:1247-53.
  20. Tao X, Zhao C, MacKinnon R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120. doi:10.1073/pnas.2302325120.
  21. Zheng W, Chai P, Zhu J, Zhang K. High-resolution in situ structures of mammalian respiratory supercomplexes. Nature. 2024;631:232-9.
  22. Nakano A, et al. Structures of respiratory supercomplexes and ATP synthase oligomers in mammalian mitochondrial inner membrane. Nat Commun. 2026;17:4075. doi:10.1038/s41467-026-70578-x.
  23. Coupland CE, et al. High-resolution electron cryomicroscopy of V-ATPase in native synaptic vesicles. Science. 2024;385:168-74.
  24. Letts JA, Fiedorczuk K, Sazanov LA. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 2016;537:644-8.
  25. Letts JA, et al. Structures of respiratory supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Mol Cell. 2019;75:1131-46.e6.
  26. Jha P, Wang X, Auwerx J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Curr Protoc Mouse Biol. 2016;6:1-14.
  27. Biner O, Fedor JG, Yin Z, Hirst J. Bottom-up construction of a minimal system for cellular respiration and energy regeneration. ACS Synth Biol. 2020;9:1450-9.
  28. Wright JJ, et al. Reverse electron transfer by respiratory complex I catalyzed in a modular proteoliposome system. J Am Chem Soc. 2022;144:6791-801.
  29. Lee SY, Letts JA, MacKinnon R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 2009;387:1055-60.
  30. Caldeira D de AF, Oliveira DF de, Cavalcanti-de-Albuquerque JP, Nascimento JHM, Zin WA, et al. Isolation of mitochondria from fresh mice lung tissue. Front Physiol. 2021;12:748261. doi:10.3389/fphys.2021.748261.
  31. Shi H, et al. Global burden of ischaemic heart disease from 2022 to 2050: projections of incidence, prevalence, deaths, and disability-adjusted life years. Eur Heart J Qual Care Clin Outcomes. 2025;11:355-66.
  32. Rahman S. Mitochondrial disease in children. J Intern Med. 2020;287:609-33.
  33. Pérez-Albert P, et al. Mitochondrial disease in children: the nephrologist’s perspective. JIMD Rep. 2018;42:61-70.
  34. Gorman GS, et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Ann Neurol. 2015;77:753-9.
  35. Pitceathly RDS, Rahman S. Mitochondrial DNA-related diseases associated with single large-scale deletions and point mutations. In: Gasparre G, Porcelli AM, editors. The Human Mitochondrial Genome: From Basic Biology to Disease. London: Academic Press; 2020. p. 353-74.
  36. Morán M, et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction: implications in neurodegeneration. Free Radic Biol Med. 2012;53:595-609.
  37. Chinnery PF. Primary mitochondrial disorders overview. In: Adam MP, Feldman J, Mirzaa GM, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, et al., editors. GeneReviews®. Seattle: University of Washington, Seattle; 1993–2026. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1224/
  38. Ellis CE, et al. Mitochondrial lipid abnormality and electron transport chain impairment in mice lacking α-synuclein. Mol Cell Biol. 2005;25:10190-201.
  39. Hekimi S, Wang Y, Noë A. Mitochondrial ROS and the effectors of the intrinsic apoptotic pathway in aging cells: the discerning killers. Front Genet. 2016;7:161. doi:10.3389/fgene.2016.00161.
  40. Chouchani ET, et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 2014;515:431-5.
  41. Van de Wal MAE, et al. Ndufs4 knockout mouse models of Leigh syndrome: pathophysiology and intervention. Brain. 2022;145:45-63.
  42. Hoefs SJG, et al. NDUFA10 mutations cause complex I deficiency in a patient with Leigh disease. Eur J Hum Genet. 2011;19:270-4.
  43. Ostergaard E, et al. Respiratory chain complex I deficiency due to NDUFA12 mutations as a new cause of Leigh syndrome. J Med Genet. 2011;48:737-40.
  44. Marin SE, et al. Leigh syndrome associated with mitochondrial complex I deficiency due to novel mutations in NDUFV1 and NDUFS2. Gene. 2013;516:162-7.
  45. Adjobo-Hermans MJW, et al. NDUFS4 deletion triggers loss of NDUFA12 in Ndufs4−/− mice and Leigh syndrome patients: a stabilizing role for NDUFAF2. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2020;1861:148213. doi:10.1016/j.bbabio.2020.148213.
  46. Leshinsky-Silver E, et al. NDUFS4 mutations cause Leigh syndrome with predominant brainstem involvement. Mol Genet Metab. 2009;97:185-9.
  47. Piekutowska-Abramczuk D, et al. NDUFB8 mutations cause mitochondrial complex I deficiency in individuals with Leigh-like encephalomyopathy. Am J Hum Genet. 2018;102:460-7.
  48. Bertero E, Kutschka I, Maack C, Dudek J. Cardiolipin remodeling in Barth syndrome and other hereditary cardiomyopathies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2020;1866:165803. doi:10.1016/j.bbadis.2020.165803.
  49. Xu Y, et al. Loss of protein association causes cardiolipin degradation in Barth syndrome. Nat Chem Biol. 2016;12:641-7.
  50. McKenzie M, Lazarou M, Thorburn DR, Ryan MT. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth syndrome patients. J Mol Biol. 2006;361:462-9.
  51. Acehan D, Xu Y, Stokes DL, Schlame M. Comparison of lymphoblast mitochondria from normal subjects and patients with Barth syndrome using electron microscopic tomography. Lab Invest. 2007;87:40-8.
  52. Dudek J, et al. Cardiolipin deficiency affects respiratory chain function and organization in an induced pluripotent stem cell model of Barth syndrome. Stem Cell Res. 2013;11:806-19.
  53. Hagen TM, et al. Acetyl-L-carnitine fed to old rats partially restores mitochondrial function and ambulatory activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:9562-6.
  54. Schlame M, et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. J Am Coll Cardiol. 2003;42:1994-9.
  55. Ayala-Hernandez MG, et al. Respiratory complex III2 assembles complex I via toxic intermediate in mitochondrial disease. bioRxiv. 2025:doi:10.1101/2025.06.17.660237.
  56. Liang C, et al. Formation of I2+III2 supercomplex rescues respiratory chain defects. Cell Metab. 2025;37:441-59.e11.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BiochemistryMitochondriaSupercomplexesReconstitutionProteoliposomesRespirationMetabolism
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи