В данном исследовании представлен комплексный рабочий процесс визуализации, объединяющий стандартизированный сбор и обработку жидкости для бронхоальвеолярного лаважа, панель проточной цитометрии с семью маркерами, мультиплексный анализ цитокинов с 13 аналитами и единый конвейер анализа.
Исследовательская статья
Интегрированная визуализация рекрутирования нейтрофилов и профилирование воспалительных цитокинов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Жидкость для бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) является наиболее доступным матриксом для забора проб при изучении воспаления нижних дыхательных путей, однако традиционные анализы опираются на проточную цитометрию с использованием одного маркера в сочетании с иммуноферментным анализом (ELISA) для каждого отдельного аналита; такой подход ограничивает плотность получаемой информации и скрывает взаимосвязь между клетками и факторами. В данном исследовании представлен интегрированный рабочий процесс визуализации, сочетающий стандартизированный сбор и предварительную обработку с панелью для проточной цитометрии нейтрофилов и моноцитов по семи маркерам, мультиплексным анализом 13 цитокинов и унифицированным конвейером анализа на основе равномерного аппроксимированного проекционного отображения (UMAP), метакластеризации FlowSOM, иерархической кластеризации, сетей корреляции Спирмена и анализа главных компонентов (PCA).
Данный рабочий процесс был применен к одноцентровой проспективной когорте из 112 взрослых пациентов, перенесших бронхоскопию, которая включала 64 пациентов с микробиологически подтвержденной инфекцией легких и 48 лиц из контрольной группы без инфекции. Данные цитологического анализа и проточной цитометрии выявили выраженный сдвиг альвеолярного профиля от макрофагального к нейтрофильному при инфекции: процент нейтрофилов увеличился с медианы 3,2% до 68,4%, а абсолютная концентрация нейтрофилов возросла примерно в 50 раз. Мультиплексный профильный анализ выявил скоординированный трехмодульный цитокиновый ответ, при котором хемокиновый, провоспалительный и регуляторный модули были активированы; при этом CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α и G-CSF продемонстрировали наибольшую дискриминационную способность в качестве одиночных маркеров в исследуемой когорте (площадь под кривой [AUC] от 0,89 до 0,94). Интегративная визуализация с использованием PCA, корреляционной матрицы и сетевого графа выявила тесную связь оси «нейтрофилы — хемокины» на уровне участников, при этом количество нейтрофилов в БАЛЖ оказалось центральным узлом сети.
Данный рабочий процесс использует только материалы, регулярно получаемые в ходе клинически обоснованного БАЛ, не требует дополнительного объема образцов и предоставляет информативно насыщенную основу для анализа воспаления дыхательных путей при респираторных инфекциях. Это может быть реализовано в лабораториях специализированной медицинской помощи, оснащенных системами многопараметрической проточной цитометрии и платформами мультиплексного микросферного анализа, с возможностью применения в лонгитюдных исследованиях, анализах единичных клеток и оценке терапевтической эффективности. Более широкое внедрение отдельных аналитов в клиническую практику в качестве биомаркеров потребует проспективной валидации в независимых многоцентровых когортах.
Введение
Инфекционные смерти в результате инфекций нижних дыхательных путей остаются значительной причиной глобальной смертности, несмотря на достижения в стратегиях вакцинации и методах лечения; тем не менее, это особенно актуально для детского и пожилого населения1. Нейтрофилы являются основными клетками, регистрируемыми на ранних стадиях врожденного иммунного ответа в пораженной дыхательной системе, что жизненно важно для уничтожения вторгающегося патогена; однако неконтролируемое нейтрофильное воспаление приводит к разрушению альвеолярно-капиллярного барьера, окислительному повреждению тканей и развитию острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС)2,3. Нейтрофилы в воздушном пространстве легких также демонстрируют кинетику привлечения, особенности удерживания и эффекторное поведение, которые отличаются от других тканей, и эти различия влияют на то, разрешится ли инфекция или перейдет в тяжелую пневмонию4.
Жидкость для бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ) является важным источником информации об альвеолярном микроокружении и обеспечивает наиболее точное представление о клиническом иммунитете в данной области5. Хемокин CXCL8 играет ключевую роль в привлечении нейтрофилов в легкие через его рецепторы CXCR1 и CXCR2, наряду с другими хемокинами, включая CXCL1, CXCL2 и CXCL56. Цитокины IL-1β, IL-6 и TNF-α дополнительно усиливают этот процесс, в то время как IL-10 действует как противодействующий цитокин. Было показано, что их уровни в БАЛЖ коррелируют с тяжестью инфекций легких и развитием осложнений в легких вследствие бактериальной, вирусной и атипичной пневмонии7, а мультиплексные профили биомаркеров БАЛЖ внедряются для более ранней диагностики и дифференциации патогенов при инфекциях нижних дыхательных путей8.
Стандартное исследование БАЛЖ обычно не позволяет полностью охватить биологические механизмы, лежащие в основе теста. Количество клеток оценивают путем ручного дифференцирования клеток в образцах после цитоспинирования, в то время как растворимые медиаторы измеряют с помощью отдельных иммуноферментных анализов (ELISA) и представляют в виде столбчатых диаграмм. Хемокины, цитокины и каждый тип клеток оцениваются по отдельности, при этом между градиентом концентрации конкретного хемокина и популяциями клеток, на которые он влияет в образце, корреляция не устанавливается. Сочетание цитокиновых модулей, зависимостей «доза-ответ» хемокинов и нейтрофилов, а также подгрупп пациентов с их собственными воспалительными профилями часто упускается из виду в отсутствие многомерного анализа9.
Развитие вычислительных мощностей делает такой холистический подход все более реалистичным. Сочетание многопараметрической и спектральной проточной цитометрии с методами снижения размерности, такими как t-распределенное стохастическое вложение соседей (t-SNE) или равномерная аппроксимация и проекция многообразий (UMAP), позволяет переносить многомерные иммунные фенотипы в двухмерное пространство, при этом UMAP демонстрирует лучшую сохранность глобальной топологии и воспроизводимость применительно к цитометрическим данным10. Мультианалитные панели цитокинов с последующим иерархическим кластеризатором и построением корреляционных сетей помогают выявить сигнатуры, коррелирующие с тяжестью заболевания, которые невозможно определить с помощью анализа отдельных цитокинов11. Несмотря на прогресс в данной области, до сих пор не было разработано рабочего процесса, объединяющего эти методы для изучения рекрутирования нейтрофилов и цитокиновых сигнатур из одних и тех же образцов БАЛЖ при респираторных инфекциях. В данной работе описывается интегрированный рабочий процесс визуализации для исследования рекрутирования нейтрофилов с помощью цитологии и многопараметрической проточной цитометрии с последующим UMAP-анализом и анализом цитокиновых сигнатур методом мультиплексного иммуноанализа, иерархической кластеризацией, построением корреляционных матриц и анализом главных компонентов. Этот рабочий процесс позволяет создать интегрированную визуализацию, объединяющую клеточные и растворимые иммунные показатели дыхательных путей на одном графике с использованием образцов БАЛЖ, которые рутинно получают во время клинически обоснованной бронхоскопии при инфекциях нижних дыхательных путей.
Протокол
Популяция исследования и этика
Данное одноцентровое проспективное обсервационное исследование проводилось на базе многопрофильной учебной больницы в период с января 2026 года по апрель 2026 года. Протокол был одобрен под номером 2026HL-038, и перед началом любых процедур исследования от каждого участника было получено письменное информированное согласие.
Взрослые пациенты в возрасте от 18 до 75 лет, которым проводилась диагностическая гибкая бронхоскопия с бронхоальвеолярным лаважем (БАЛ) в рамках стандартного клинического обследования, набирались последовательно и распределялись в группу с инфекцией или в контрольную группу без инфекции на основании окончательных клинических и микробиологических диагнозов. Обзор интегрированного рабочего процесса визуализации, от набора пациентов до получения интегрированных визуальных результатов, представлен на рисунке 1.
Рисунок 1Обзор интегрированного рабочего процесса визуализации для профилирования привлечения нейтрофилов и ответов воспалительных цитокинов на основе БАЛЖ. Пять этапов кратко описывают (слева направо): перспективный набор участников в группу инфекции и контрольную группу с проведением бронхоскопии и БАЛ, предварительную обработку БАЖ с получением осадка клеток и супернатанта, параллельные измерения клеточных компонентов (цитология по Райту–Гимзе и многопараметрическая проточная цитометрия) и растворимых факторов (13-плексный иммуноанализ на основе магнитных микросфер), унифицированный конвейер визуализации (UMAP с метакластеризацией FlowSOM, иерархическая тепловая карта, анализ главных компонентов и сеть корреляции Спирмена), а также интегрированный визуальный результат. Сокращения: БАЛ — бронхоальвеолярный лаваж; БАЖ — жидкость БАЛ; UMAP — равномерное приближение и проекция многообразий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Критерии включения в группу инфекции были следующими: (1) пациенты с диагнозом внебольничной пневмонии (CAP), нозокомиальной пневмонии (HAP) или вентилятор-ассоциированной пневмонии (VAP) в соответствии с рекомендациями Инфекционного общества Америки (IDSA) и Американского торакального общества (ATS); (2) обнаружение одного или нескольких патогенов путем посева БАЛЖ с титром ≥104 колониеобразующих единиц (CFU)/мл, мультиплексной полимеразной цепной реакции (PCR) респираторных проб, метагеномного секвенирования нового поколения БАЛЖ или специфического анализа на антиген/антитела в парных образцах из дыхательных путей и сыворотки крови.
Критерии отбора для контрольной группы были следующими: (1) неинфекционные показания к бронхоскопии, включая оценку неопределенного узла в легком, аномальные результаты рентгенологического исследования, не указывающие на инфекцию, или обследование по поводу хронического кашля; (2) отсутствие острой инфекции легких, подтвержденное отрицательными результатами микробиологического тестирования и отсутствием каких-либо признаков воспаления или системной инфекции на момент проведения бронхоскопии; и (3) отсутствие приема антибиотиков в течение 30 дней до участия в исследовании. В качестве контроля привлекались пациенты, которым проводилась бронхоскопия по другим клиническим показаниям, а не здоровые добровольцы, что отражает популяцию, у которой в исследовательском центре обычно проводят БАЛ по клиническим показаниям.
Критерии исключения включали: (1) злокачественные новообразования и/или проведение цитоксической химиотерапии в течение предшествующих шести месяцев; (2) серопозитивность по ВИЧ; (3) трансплантация солидных органов или гемопоэтических стволовых клеток; (4) длительная иммуносупрессивная терапия с ежедневной эквивалентной дозой преднизолона > 0.3 mg/kg на протяжении более 3 недель; (5) беременность или лактация у женщин; (6) наличие в анамнезе геморрагического диатеза или любые противопоказания к гибкой бронхоскопии; (7) имеющиеся тяжелые хронические заболевания дыхательных путей (хроническая обструктивная болезнь легких [ХОБЛ] III/IV стадии по классификации Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD], идиопатический легочный фиброз, тяжелая персистирующая астма или клинически значимый бронхоэктаз); (8) активный туберкулез; (9) участие в другом интервенционном исследовании в течение последних 30 дней. БАЛ проводили во время первой бронхоскопии в течение 72 h с момента поступления при наличии инфекций, а у пациентов на искусственной вентиляции легких с инфекциями — в течение 48 h после интубации.
Расчет объема выборки был сосредоточен на основном клеточном показателе: количестве нейтрофилов в БАЛЖ в различных группах. С учетом ожидаемой величины эффекта в 0,6 SD между инфицированными и неинфицированными дыхательными путями и с учетом 15% допустимого выбывания участников, для обеспечения двустороннего α = 0,05 при статистической мощности 80% требовался минимальный объем выборки из 45 субъектов в группе. Из 156 подходящих кандидатов 27 не соответствовали критериям отбора (18 не соответствовали критериям включения, главным образом из-за невозможности идентифицировать патогенный агент, ответственный за заболевание, в установленный срок, или из-за несогласия с самой процедурой; 9 соответствовали критериям исключения, прежде всего из-за активного злокачественного новообразования или наличия в анамнезе химиотерапии, хронического применения кортикостероидов, тяжелого предшествующего хронического заболевания легких или геморрагического диатеза). Остальные 129 участников прошли бронхоскопию. Впоследствии 17 субъектов были исключены из исследования (7 — из-за недостаточного объема БАЛЖ < 40%; 4 — в связи с отзывом согласия во время госпитализации; и 6 — из-за переклассификации субъектов после окончательной микробиологической оценки: 4 кандидата в группу контроля, у которых по результатам посева была диагностирована скрытая инфекция, и 2 кандидата в группу инфекции, у которых после анализа посева не было обнаружено признаков инфекции). Итоговая группа участников исследования составила 12 человек: 64 с инфекцией и 48 без нее.
Сбор и предварительная обработка БАЛЖ
Бронхоскопию проводили опытные операторы в соответствии со стандартным протоколом учреждения, согласно опубликованным техническим рекомендациям по бронхоальвеолярному лаважу12. Лидокаин применяли местно, пациентам проводили умеренную внутривенную седацию, при этом подавали дополнительный кислород для поддержания сатурации кислорода (SpO₂) >92%. Гибкий бронхоскоп вводили и позиционировали в бронхопульмонарном сегменте с рентгенологическими отклонениями. В случаях, когда рентгенологические изменения были диффузными или нелокализуемыми, выбирали сегменты средней доли правого легкого или верхнего сегмента левого легкого (лингулярные сегменты). После каждого введения раствора проводили осторожную ручную аспирацию с отрицательным давлением < 10 mmHg. Вводили от трех до пяти порций стерильного физраствора при температуре 37 °C по 20–40 mL каждая, общим объемом 10–150 mL. Коэффициент восстановления оценивали как отношение полученного объема к введенному объему; для анализа принимались только образцы с выходом ≥40%.
Образцы, полученные при втором и последующих промываниях, объединяли для уменьшения бронхиального загрязнения и получения образца, обогащенного альвеолярными клетками. Объединенный бронхоальвеолярный лаважный жидкость (БАЛЖ) хранили на льду и обрабатывали в течение 2 ч после сбора, учитывая недавние данные об изменениях клеточного состава и дифференциального подсчета при длительном хранении и нагреве образцов БАЛЖ человека13. После фильтрации через стерильную нейлоновую сетку с размером пор 70 мкм для удаления слизи, выполненной путем простого механического пропускания без добавления муколитиков или антиагрегантов, таких как дитиотреитол (поскольку предварительные испытания показали, что этого достаточно для удаления слизистых сгустков без значимой потери целостности поверхностных эпитопов), жидкость центрифугировали при 400 × g в течение 10 мин при 4 °C. Супернатант сливали и разделяли на аликвоты в криопробирки с низкой белковой адсорбцией для анализа цитокинов, а клетки суспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) с 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 2 mM этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA), часть которых сохраняли для цитологического исследования и проточной цитометрии. Образцы цитокинов замораживали в жидком азоте, хранили при –80 °C и подвергали не более чем одному циклу замораживания-оттаивания перед использованием.
Цитология нейтрофилов и количественный анализ методом проточной цитометрии
Для цитопатологического исследования 100 µL клеточной суспензии БАЛ наносили на предметное стекло с помощью цитоцентрифуги (см. Таблицу материалов) при 30 × g в течение 5 мин, высушивали на воздухе и окрашивали по методу Райта-Гимзы. Дифференциальный подсчет клеток проводил технолог по гематологии, не владеющий информацией об анамнезе пациента; при этом подсчитывали не менее 40 клеток на одном стекле и рассчитывали процентное содержание макрофагов, лимфоцитов, нейтрофилов и эозинофилов. Процент нейтрофилов в БАЛ считали основным показателем цитопатологического анализа, поскольку современные данные свидетельствуют об их эффективности в дифференциации инфекционных и неинфекционных заболеваний легких у пациентов с легочными инфильтратами14.
Протокол количественного анализа методом проточной цитометрии был основан на недавно проведенной валидации протокола дифференцировки лейкоцитов жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) с использованием четырех цветов15 и включал дополнительные маркеры для идентификации нейтрофилов. В частности, примерно 5 × 105 клеток, выделенных из БАЛ, блокировали с помощью реагента для блокирования Fc-рецепторов человека (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 4 °C, а затем окрашивали в течение 20 мин при 4 °C антителами к CD45 (клон HI30), CD6b (клон G10F5), CD15 (клон HI98), CD16 (клон 3G8), CD1b (клон ICRF4), CD14 (клон M5E2) и HLA-DR (клон L243), а также с использованием фиксируемого красителя жизнеспособности (см. Таблицу материалов). Для лизиса эритроцитов использовали коммерческий раствор для лизиса эритроцитов (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при комнатной температуре. После лизиса эритроцитов клетки дважды промывали PBS с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки и ресуспендировали в буфере для проточной цитометрии, после чего анализировали на многоцветном проточном цитометре (см. Таблицу материалов). Компенсацию проводили с использованием компенсационных микросфер с одним красителем (см. Таблицу материалов); для каждой панели использовали пробирки с одним отсутствующим флуорохромом (FMO) и неокрашенные контроли.
Для каждого образца было зарегистрировано не менее 1 × 105 событий CD45⁺. Сначала на графике FSC-A/FSC-H выделяли синглеты, затем живые (viability dye⁻) CD45⁺ лейкоциты, после чего проводили исключение CD14⁺HLA-DR⁺ моноцитов-макрофагов для отбора гранулоцитов CD6b⁺ с высоким боковым светорассеянием. Затем в популяции гранулоцитов нейтрофилы определяли как события CD15⁺CD16⁺CD1b⁺. Этот первичный гейт для гранулоцитов CD6b⁺ проводили широко вокруг всех событий с высоким боковым светорассеянием, не ограничиваясь границей CD15⁺CD16⁺CD1b⁺, чтобы активированные нейтрофилы CD16-dim, CD1b-high и другие менее зрелые формы гранулоцитов оставались в общем автоматизированном подсчете нейтрофилов; более строгое определение CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ применялось только для характеристики подмножества зрелых нейтрофилов, представленного отдельно в последующем кластерном анализе. Количество нейтрофилов в БАЛЖ (cells/µL) оценивали на основе процента нейтрофилов и общего количества ядерных клеток, определенного с помощью автоматического гематологического анализатора (см. Таблицу материалов). Матрицы компенсации, стратегия гейтирования и отчеты по контролю качества отдельных образцов были заархивированы, а аналитики оставались слепыми по отношению к распределению участников по группам на протяжении всего процесса сбора и анализа данных.
Мультиплексный профильный анализ воспалительных цитокинов
Супернатанты БАЛФ размораживали один раз на влажном льду, после чего подвергали кратковременному вортексированию и осветлению путем центрифугирования при 10,0 × g в течение 5 мин при 4 °C непосредственно перед проведением анализа. Измерение 13 аналитов, разделенных на три функциональные категории, осуществляли с помощью мультиплексной иммуноаналитической платформы на основе микросфер с использованием специализированной панели магнитных бусин (см. Таблицу материалов). Провоспалительная группа включала IL-1β, IL-6, IL-17A и TNF-α; группа хемокинов включала CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 и CCL3/MIP-1α; регуляторная группа включала IL-10, IFN-γ, IL-1RA и G-CSF. Выбор аналитов основывался на данных о наиболее информативных показателях, обычно используемых в мультиплексном анализе цитокинов БАЛФ или сыворотки крови в исследованиях пневмонии/тяжелых респираторных инфекций7,1. Коэффициент разведения (1:2 в аналитическом буфере) был определен в ходе предварительного эксперимента на репрезентативной подгруппе как инфицированных, так и контрольных образцов, чтобы гарантировать попадание >90% результатов измерений в диапазон стандартной кривой.
Стандартные кривые определяли с помощью семиточечного серийного разведения рекомбинантных стандартов производителя; на каждом планшете их готовили в дубликатах, включая одну холостую лунку для вычитания фонового сигнала. Аппроксимация кривой выполнялась методом пятипараметрической логистической (5PL) регрессии с использованием проприетарного программного обеспечения прибора для сбора и анализа данных (см. Список материаловНижний предел количественного определения (НПКО) рассчитывали как наименьшее количество стандарта, обеспечивающее процент обратного восстановления в диапазоне от 80% до 120% и внутрисерийный коэффициент вариации (CV) ≤ 20%. Значения ниже НПКО заменяли значением НПКО/√2. Два объединенных образца жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) для контроля качества (один от репрезентативного инфицированного пациента и один от здорового субъекта) разделяли на аликвоты и добавляли на каждый планшет для мониторинга стабильности результатов в долгосрочной перспективе. Стандарты обеспечения качества основывались на рекомендациях по передовым методам, выработанных в ходе 12-летней многоцентровой программы оценки компетентности при проведении мультиплексного анализа на основе магнитных частиц.16включая требования к коэффициенту вариации (CV) внутри анализа ≤ 10% для дубликатных лунок, CV между планшетами ≤ 20% для контроля качества и минимальному количеству микросфер ≥ 50 на один аналит в лунке. Образцы на планшетах, не соответствующих вышеуказанным критериям, анализировали повторно. Анализ проводили одной серией в течение четырех недель с использованием одной лота набора, с рандомным чередованием инфицированных образцов и образцов контроля.
Конвейер анализа визуализации
Файлы стандартного формата проточной цитометрии (FCS) сначала анализировали с помощью коммерческого программного обеспечения для проточной цитометрии (см. Таблица материалов) для компенсации и выделения живых синглетов CD45⁺, после чего данные были экспортированы для объективного анализа в R v4.4. Для каждого образца было отобрано 10 0 событий CD45⁺ методом даунсэмплинга с последующей конкатенацией; интенсивность сигналов трансформировали с помощью функции arcsinh с кофактором 150. Снижение размерности и проекции UMAP выполняли с использованием пакета uwot при 15 ближайших соседях и минимальном расстоянии 0,1, а также параллельное вложение t-SNE с помощью пакета Rtsne при перплексии 30.10Кластеры фенотипов были определены с помощью FlowSOM со 100 узлами самоорганизующейся карты и далее разделены на 12–15 кластеров путем метакластеризации с использованием метода оптимизации, который недавно был валидирован для многомерных данных цитометрии.17Каждый кластер был аннотирован на основе медианной экспрессии маркеров линии и активации, а затем проверен путем сопоставления с результатами ручного гейтирования.
Для анализа данных мультиплексного определения цитокинов исходные значения сначала подвергали логарифмическому преобразованию log₁₀, а затем стандартизировали между аналитами с помощью z-масштабирования перед проведением дальнейшего анализа. Как аналиты, так и пациенты подвергались иерархической кластеризации с использованием евклидова расстояния и метода связывания Ward.D2; результаты были представлены в виде тепловой карты с кластеризацией по строкам и столбцам. Такой подход использовался для выявления коэкспрессируемых модулей цитокинов и классификации подгрупп пациентов в мультиплексных воспалительных когортах9. Матрицы корреляции для всех клеточных и растворимых биомаркеров были построены с использованием попарных ранговых корреляций Спирмена. Тепловые карты матриц корреляции были отображены вместе с сетью, в которой узлы соответствуют биомаркерам, а ребра указывают на корреляции, сохранившие значимость после коррекции на множественное тестирование методом Бенджамини — Хохберга (BH). Ширина ребер масштабировалась в соответствии с величиной коэффициента корреляции |ρ|, и ребра включались только при |ρ| ≥ 0.30 и p < 0.05 после коррекции. Анализ главных компонент (PCA) стандартизированной матрицы, содержащей данные по клеткам и цитокинам, выполнялся с помощью функции prcomp() с масштабированием единичной дисперсии. Участники были спроецированы на первые две главные компоненты с наложением групп инфекции и контроля. Последовательный даунсэмплинг и стандартизация всех анализов обеспечили сопоставимость показателей клеточных и растворимых биомаркеров на всех визуализациях.
Статистический анализ
Непрерывные переменные при отсутствии нормального распределения согласно тестам Шапиро-Уилка описывались с помощью медианы (межквартильный размах, МКР), в остальных случаях — среднего значения (стандартное отклонение, СО). Категориальные переменные описывались с помощью частот и долей. Сравнение групп проводили с использованием критерия Манна-Уитни U тест, когда непрерывные переменные имели ненормальное распределение, тест Уэлча t—тест использовался при нормальном распределении непрерывных переменных, а критерий хи-квадрат или точный критерий Фишера — в соответствующих случаях для категориальных переменных. Связи между непрерывными переменными оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Для учета частоты ложноположительных результатов (FDR) при мультиплексном анализе цитокинов и корреляционном анализе значения p были скорректированы с использованием метода Бенджамини–Хохберга с пороговым значением q < 0,05. Двусторонний p < Статистически значимым во всех основных анализах считался уровень p < 0,05. По возможности случаи с отсутствующими данными по отдельным переменным сохранялись и анализировались методом анализа полных случаев (complete-case analysis) для соответствующей переменной, в то время как для проведения анализа чувствительности применялся метод множественной импутации с использованием связанных уравнений (m = 20). Для отдельных цитокинов в рамках всей когорты исследования с помощью пакета pROC были построены рабочие характеристики приемника (ROC-кривые) и рассчитана соответствующая площадь под кривой (AUC); отдельная внешняя валидационная когорта не использовалась. В заранее определенных анализах чувствительности первичные межгрупповые сравнения повторялись после исключения участников, получавших антибиотики в течение 72 ч до бронхоскопии, а также после стратификации группы с инфекцией по статусу искусственной вентиляции легких и по подтипу пневмонии (внебольничная, нозокомиальная или вентилятор-ассоциированная). Анализ выполнялся в среде R v4.4 с использованием пакетов rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC и mice. Рисунки были созданы с помощью коммерческого программного обеспечения для построения научных графиков (см. Таблица материалов).
Результаты
Популяция исследования и характеристики образцов
В итоговую когорту анализа вошли 12 субъектов, из которых 64 человека составили группу с инфекцией и 48 человек — контрольную группу без инфекции. Исходные демографические данные в обеих группах были схожими, в то время как лабораторные показатели, связанные с инфекцией, были выше в группе с инфекцией, как показано в Таблице 1. Инфекции были вызваны преимущественно грамотрицательными бактериями, основными бактериальными патогенами которых являлись Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii. Другими патогенами были Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, атипичные агенты, вирусы и смешанные инфекции.
Показатели извлечения БАЛЖ соответствовали заранее установленному порогу ≥40% для всех сохраненных образцов, при этом в группе инфекции показатели были несколько ниже по сравнению с контрольной группой (медиана 48,3% против 53,3%, p = 0,03), что согласуется с усилением воспаления дыхательных путей и застойными явлениями в слизистой оболочке инфицированных дыхательных путей. Поскольку извлеченный объем также различался между группами (58 mL против 64 mL, p = 0,04), все представленные концентрации цитокинов могут быть подвержены незначительной межгрупповой разнице в факторе разведения; заранее определенный анализ чувствительности, ограниченный образцами с коэффициентом извлечения ≥50% (n = 42 в группе инфекции, n = 34 в контрольной группе), подтвердил направление и величину каждого межгруппового сравнения (наибольшее изменение величины эффекта < 8%), что указывает на маловероятность влияния ошибки разведения на наблюдаемые различия. Время между сбором и обработкой составило 65 min для группы инфекции и 62 min для контрольной группы, что укладывается в 2-часовое окно. Критерии контроля качества (К) на уровне образцов свидетельствовали о высокой достоверности результатов. Дифференциальный подсчет цитологических показателей был получен на основе подсчета ≥40 клеток во всех 112/12 образцах (10%). Данные проточной цитометрии соответствовали заранее установленному критерию ≥1 × 105 событий CD45⁺ во всех 112/12 образцах (10%), при этом медиана жизнеспособности живых клеток составила 89,4% (IQR 85,6–92,8%). Все мультиплексные планшеты для анализа цитокинов соответствовали критериям КК после одного повторного запуска. Для всех 13 аналитов внутрисерийный коэффициент вариации (CV) составил 4,7% (2,1–9,3%, все <10%), межпланшетный CV пулированных образцов КК составил 1,2% (6,8–18,4%, все <20%), а медианное количество микросфер составило 78 событий/аналит/лунка (53–142, все ≥ 50).
| Переменная | Инфицирование (n = 64) | Контрольная группа (n = 48) | значение p |
| Возраст, лет, медиана [МКР] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| Мужчины, n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| ИМТ, кг/м²2, медиана [МР] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.66 |
| Анамнез курения, n (%) | 0.52 | ||
| Никогда | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| Прежний | 22 (34.4) | 16 (33.3) | |
| Текущий | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| Артериальная гипертензия, n (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| Сахарный диабет, n (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| Ишемическая болезнь сердца, n (%) | 11 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| Хроническая болезнь почек, n (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| Показание к бронхоскопии, n (%) | — | ||
| Внебольничная пневмония | 35 (54.7) | — | |
| Госпитальная пневмония | 19 (29.7) | — | |
| Вентилятор-ассоциированная пневмония | 10 (15.6) | — | |
| Неопределенный легочный узел | — | 23 (47.9) | |
| Стойкое рентгенологическое отклонение | — | 15 (31.3) | |
| Оценка хронического кашля | — | 10 (20.8) | |
| Возбудитель, n (%) | — | ||
| Грамотрицательные бактерии | 28 (43.8) | ||
| Грамположительные бактерии | 16 (25.0) | ||
| Атипичные патогены | 7 (10.9) | ||
| Респираторные вирусы | 8 (12.5) | ||
| Смешанная инфекция | 5 (7.8) | ||
| ИВЛ при проведении БАЛ, n (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| Прием антибиотиков в течение 72 ч до БАЛ, n (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.001 |
| Введенный объем, мл, медиана [МКИ] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| Восстановленный объем, мл, медиана [МКИ] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0.04 |
| Коэффициент восстановления БАЛЖ, %, медиана [МКР] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| Время обработки, мин, медиана [МР] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.55 |
| Лейкоциты крови, × 10⁹/л, медиана [МР] | 11.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| Нейтрофилы крови, %, медиана [МКР] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.001 |
| С-реактивный белок, мг/л, медиана [МР] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| Прокальцитонин, нг/мл, медиана [МКР] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.001 |
Таблица 1: Демографические, клинические характеристики и параметры обработки БАЛЖ когорты исследования. Сравниваются исходные демографические характеристики, сопутствующие заболевания, показания к бронхоскопии, возбудители инфекции, параметры процедуры и показатели лабораторных анализов периферической крови у 64 участников группы с инфекцией и 48 участников контрольной группы без инфекции. Непрерывные переменные представлены в виде медианы [межквартильный размах] и сравнивались с помощью U -критерия Манна–Уитни; категориальные переменные представлены как n (%) и сравнивались с помощью критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера, где это применимо. Сокращения: БАЛ = бронхоальвеолярный лаваж; БАЛЖ = бронхоальвеолярный лаважный жидкость; ИМТ = индекс массы тела; IQR = межквартильный размах; WBC = количество лейкоцитов.
Визуализация рекрутирования нейтрофилов в БАЛЖ
Как показано на Рисунке 2, у инфицированных субъектов наблюдался отчетливый сдвиг соотношения популяций от преобладания макрофагов к преобладанию нейтрофилов. Препараты, полученные с помощью цитоцентрифугирования, были окрашены по методу Райта — Гимзы; окрашивание выявило явное различие между двумя группами: в контрольной группе преобладали альвеолярные макрофаги, присутствовали некоторые лимфоциты и несколько нейтрофилов, в то время как в инфицированной группе доминировали нейтрофилы с частым наличием внутриклеточных бактерий, дегенерированными ядрами и токсической грануляцией. Для подтверждения различий использовался дифференциальный подсчет не менее 40 клеток, в результате чего доля нейтрофилов увеличилась с медианного значения 3.2% (IQR: 1.8–5.6%) в контрольной группе до 68.4% (IQR: 49.2–82.5%) в инфицированной группе (p < 0.01), тогда как доля альвеолярных макрофагов снизилась с 8.2% (IQR: 82.4–92.5%) до 2.6% (IQR: 12.3–38.5%) (p < 0.01). Процент лимфоцитов был схожим в обеих группах (7.4% [4.8–1.3%] против 6.5% [3.4–1.2%], p = 0.42).
Анализ гейтирования и снижение размерности подтвердили и дополнили данные о клеточных фенотипах, полученные с помощью микроскопии. После исключения клеточного дебриса, дуплетов и мертвых клеток доля CD45⁺CD6b⁺ гранулоцитов составила в медиане 65,8% (IQR: 46,2–79,4%) от всех CD45⁺ лейкоцитов в группе инфекции по сравнению с 4,1% (IQR: 2,3–6,8%) в контрольной группе (p < 0.01). В популяции гранулоцитов зрелые нейтрофилы CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ составили 92,4% (IQR: 87,5–95,8%) всех гранулоцитов в группе инфекции против 8,6% (IQR: 82,3–93,5%) в контрольной группе, что указывает на то, что пул привлеченных нейтрофилов состоял преимущественно из зрелых, полностью дифференцированных клеток, а не из ранних предшественников. Проекции UMAP и t-SNE на основе матрицы поверхностных белков с arcsinh-преобразованием показали почти идентичные топологии, в которых случаи инфекции занимали выраженный «остров» зрелых нейтрофилов CD15⁺CD16⁺CD1b⁺, который был слабо заселен в контрольных образцах, тогда как «остров» HLA-DR⁺CD14⁺ альвеолярных макрофагов демонстрировал противоположную картину: плотное заселение в контроле и редкое в группе инфекции. Мета-кластеризация с помощью FlowSOM выявила 13 субпопуляций, среди которых наибольшее межгрупповое расширение продемонстрировали субпопуляция зрелых нейтрофилов (38,4% [2,6–56,2%] против 2,8% [1,5–4,6%], p < 0.001) и кластер активированных CD16-dim CD1b-high нейтрофилов (2,6% [1,4–32,5%] против 0,4% [0,1–1,2%], p < 0.001).
Что касается абсолютного числа нейтрофилов, в группе инфекции наблюдалось примерно 50-кратное увеличение количества нейтрофилов в БАЛЖ по сравнению с контрольной группой. Общее количество ядерных клеток на µL БАЛЖ увеличилось со 156 cells/µL (IQR 8–232) в контрольной группе до 384 cells/µL (IQR 180–712) в группе инфекции (p < 0.01), а число нейтрофилов возросло с 5 cells/µL (IQR 2–13) в контрольной группе до 262 cells/µL (IQR 89–578) в группе инфекции (p < 0.01). Попарные различия в процентном содержании и абсолютном количестве нейтрофилов между группами оставались высокозначимыми после поправки Бенджамини–Хохберга (BH) (q < 0.01).
Рисунок 2Визуализация привлечения нейтрофилов в БАЛЖ. Репрезентативные поля цитоспинов, окрашенных по методу Райта — Гимзы, полученные от контрольного участника и инфицированного участника, иллюстрируют сдвиг клеточного профиля БАЛЖ от преобладания макрофагов к преобладанию нейтрофилов. Четырехэтапная стратегия гейтирования при проточной цитометрии (синглеты FSC → живые CD45⁺ лейкоциты → CD6b⁺ гранулоциты после исключения CD14⁺HLA-DR⁺ → CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ зрелые нейтрофилы), UMAP-проекция данных проточной цитометрии с arcsinh-преобразованием и наложением 13 метакластеров FlowSOM, расцвеченных по биологической аннотации, а также диаграммы размаха процента нейтрофилов в БАЛЖ и абсолютной концентрации нейтрофилов (клеток/µL, логарифмическая шкала) представлены рядом для прямого сравнения клеточных фенотипов, выявленных в группах инфекции и контроля. Сокращения: BALF = бронхоальвеолярный лаважный fluid (БАЛЖ); FSC = прямое светорассеяние; UMAP = униформное аппроксимирование и проекция многообразия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту фигуру в увеличенном размере.
Визуализация профилей воспалительных цитокинов в БАЛЖ
Характер скоординированных ответов по нескольким цитокиновым осям позволил отличить группу инфекции от контрольной группы; при этом цитокины были разделены на три стабильных функциональных модуля, как показано на Рисунке 3. Кластеризация логарифмически трансформированных (log₁₀) и нормализованных концентраций цитокинов с использованием метода Ward.D2 позволила построить четкую дендрограмму образцов, разделяющую их на две группы, где образцы с инфекцией и контроли располагались на противоположных концах дендрограммы; при этом было отмечено всего семь ошибочно классифицированных участников (шесть контролей сгруппировались с образцами инфекции, в основном это были случаи хронического кашля с легким нейтрофильным воспалением дыхательных путей, и один образец инфекции сгруппировался с контролями, что соответствовало ранней атипичной пневмонии). Дендрограмма аналитов определила три цитокиновых кластера. Хемокиновый кластер, включающий CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 и CCL3, продемонстрировал наибольшее кратное изменение между группой инфекции и контрольной группой, а также самую высокую внутримодульную корреляцию. Провоспалительный кластер, содержащий IL-1β, IL-6, IL-17A и TNF-α, показал аналогичное однонаправленное повышение уровней, хотя и несколько менее выраженное. Регуляторный кластер, включающий IL-10, IL-1RA, IFN-γ и G-CSF, также был повышен в образцах с инфекцией, что указывает на то, что ответ не был чисто провоспалительным, а параллельно задействовал контррегуляторные и противовирусные механизмы.
Медианы (МКИ) всех исследованных аналитов были выше в группе инфекции по сравнению с контрольной группой, и скорректированное значение p было меньше 0,01 для всех 13 аналитов после поправки на ложноположительные результаты по методу Бенджамини — Хохберга (BH-FDR). Среди аналитов CXCL8/IL-8 имел самую высокую концентрацию и наибольшее кратное изменение (с 68 [32–142] pg/mL в контрольной группе до 2 485 [842–6 520] pg/mL в группе инфекции, что соответствует примерно 36-кратному увеличению). Аналогичная тенденция наблюдалась для CXCL1/GRO-α с примерно 21-кратным увеличением (78 [36–148] против 1 672 [524–3 890] pg/mL). Для IL-1β наблюдалось примерно 13-кратное увеличение (5,8 [2,6–1,4] против 78 [29–184] pg/mL). IL-6, IL-1RA и G-CSF увеличились в 13–16 раз (16,4 [7,8–30,5] против 248 [82–612] pg/mL; 12 [48–258] против 1 748 [658–3 964] pg/mL; 24 [10–52] против 384 [125–912] pg/mL соответственно). Другие, менее выраженные увеличения наблюдались для TNF-α (~8 раз), CXCL10/IP-10 (~9 раз), CCL2/MCP-1 (~8 раз), CCL3/MIP-1α (~10 раз), IL-10 (~10 раз), IFN-γ (~6 раз) и IL-17A (~4 раза).
Анализ ROC-кривых внутри когорты позволил определить, что IL-8 (AUC 0.94), IL-1β (AUC 0.92), IL-6 (AUC 0.91), CXCL1 (AUC 0.91) и G-CSF (AUC 0.89) являются аналитами с наиболее выраженной дискриминационной способностью одиночных маркеров между группой инфекции и контрольной группой; данные значения AUC обобщают показатели дискриминации внутри исследуемой когорты при отсутствии отдельного внешнего валидационного набора. Анализ чувствительности с применением множественной импутации с помощью цепочечных уравнений (m = 20) дал оценки в пределах 5% от медиан для полных случаев по каждому аналиту и не изменил ранговый порядок величин эффекта.
Для оценки влияния предшествующей антибиотикотерапии и подтипа пневмонии на наблюдаемые различия в уровнях цитокинов использовались заранее определенные анализы чувствительности. При повторном проведении основных сравнений групп после исключения 41 участника из группы инфекции (64,1%), получавших антибиотики в течение 72 ч до БАЛ, все 13 аналитов оставались значимо более высокими в оставшихся 23 случаях инфекции, чем в контрольной группе, после коррекции BH-FDR (скорректированный p < 0.01 для пяти ведущих дискриминаторов), при этом точечные оценки были несколько выше, а не ниже медиан всей когорты (например, CXCL8/IL-8 2 860 [980–7 10] pg/mL и IL-1β 92 [34–210] pg/mL), что согласуется с частичным подавлением цитокинов дыхательных путей из-за применения антибиотиков перед БАЛ. Стратификация группы инфекции по подтипу пневмонии показала одинаковый порядок ранжирования хемокинов и провоспалительных цитокинов для внебольничной пневмонии (n = 35), нозокомиальной пневмонии (n = 19) и вентилятор-ассоциированной пневмонии (n = 10), при этом в подгруппе вентилятор-ассоциированной пневмонии наблюдались самые высокие медианные уровни CXCL8, CXCL1, IL-6 и G-CSF; факт проведения искусственной вентиляции легких не изменил направление какого-либо из межгрупповых сравнений.
Рисунок 3Визуализация профилей воспалительных цитокинов в БАЛЖ. Тепловая карта иерархической кластеризации log₁₀-преобразованных и z-стандартизированных концентраций 13 измеренных аналитов для всех 112 участников; цветные аннотационные полосы над тепловой картой указывают принадлежность к группе (контрольная группа, инфекция), подтип пневмонии (внебольничная, госпитальная или вентилятор-ассоциированная пневмония) и категорию возбудителя (грамотрицательная, грамположительная, атипичная, вирусная или смешанная инфекция). Диаграммы размаха для наиболее значимых дифференциально экспрессируемых цитокинов (CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF и TNF-α; шкала log₁₀, пг/мл) для сравнения групп инфекции и контроля. *** p < 0,01 после коррекции ложноположительных результатов по методу Бенджамини–Хохберга. Сокращения: BALF = бронхоальвеолярный лаваж; BH = Бенджамини–Хохберг; CAP = внебольничная пневмония; HAP = госпитальная пневмония; VAP = вентилятор-ассоциированная пневмония. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Совместная визуализация рекрутирования нейтрофилов и профилей цитокинов
Сопоставление клеточных и растворимых компонентов выявило сильную биологическую связь между привлечением нейтрофилов и системой хемокинов, как показано на Рисунке 4. Двумерное представление было получено с помощью анализа главных компонентов (PCA) стандартизированной матрицы клеток и цитокинов, где PC1 составил 51,1% общей дисперсии, а PC2 — еще 12,7%, что в сумме дает 63,8%. PC1 отделил группу с инфекцией от контрольной группы и характеризовался высокими положительными нагрузками на нейтрофилы БАЛЖ, CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β и G-CSF, а также высокими отрицательными нагрузками на макрофаги. PC2 разделил траекторию с высоким содержанием хемокинов (высокие положительные нагрузки на CXCL8 и CXCL1) и траекторию с преобладанием регуляторных факторов (положительные нагрузки на IL-10, IL-1RA и IFN-γ), таким образом, что внутри группы с инфекцией участники имели тенденцию разделяться по степени тяжести, причем случаи вентилятор-ассоциированной пневмонии у пациентов на искусственной вентиляции легких попадали в квадрант с высоким уровнем хемокинов.
Попарные корреляции рангов Спирмена между 17 клеточными и растворимыми признаками выявили сильную положительную корреляцию между количеством нейтрофилов в БАЛЖ и общим хемокиновым каскадом (CXCL8 ρ = 0.78; CXCL1 ρ = 0.74; CCL3 ρ = 0.69; CCL2 ρ = 0.61; CXCL10 ρ = 0.54; все скорректированные p < 0.01). Второй уровень значимых корреляций был обнаружен между количеством нейтрофилов и провоспалительным каскадом (G-CSF ρ = 0.65; IL-1β ρ = 0.62; IL-6 ρ = 0.58; TNF-α ρ = 0.51), за которым следовали умеренные положительные корреляции с регуляторным каскадом (IL-10 ρ = 0.45; IL-1RA ρ = 0.48). Процент макрофагов продемонстрировал зеркальную отрицательную корреляцию аналогичной силы как с хемокиновым, так и с провоспалительным каскадами. Внутрикаскадные корреляции были существенно сильнее, чем межкаскадные (медиана |ρ| внутри каскада = 0.68 против медианы |ρ| между каскадами = 0.33), что подтверждает концепцию общих вышестоящих регуляторных путей, контролирующих хемокиновый, провоспалительный и регуляторный каскады.
Сеть корреляций отобразила эту взаимосвязь на графе, в котором нейтрофилы БАЛ были наиболее центральным узлом; при этом все 13 ребер, ведущих к цитокинам, сохранили значимость после поправки Бенджамини-Хохберга (BH) на множественное тестирование. Из 136 возможных попарных связей между 17 признаками 9 соответствовали совместному критерию |ρ| ≥ 0.30 и скорректированному по BH p < 0.05 и были сохранены. Граф сети корреляций продемонстрировал четкую трехблочную модульную архитектуру, которая повторяла кластеры, полученные в результате иерархической кластеризации: самые плотные и сильные связи наблюдались между модулем хемокинов и количеством и процентом нейтрофилов в БАЛ; связи средней интенсивности связывали провоспалительный модуль как с нейтрофилами, так и с модулем хемокинов, а слабые связи из регуляторного модуля соединяли блоки хемокинов и провоспалительных факторов. Узел процента макрофагов располагался напротив блока нейтрофилов и хемокинов и был связан с ним веером ребер с отрицательным весом. В совокупности PCA, корреляционная матрица и сетевой граф выявили согласованную закономерность, при которой инфильтрация нейтрофилов в БАЛ и ответ хемокинов сильно связаны на уровне каждого отдельного участника, а провоспалительные и регуляторные пути служат четко определенными, но взаимосвязанными модулями вокруг этой оси нейтрофилов и хемокинов.
Рисунок 4Сопряженная визуализация привлечения нейтрофилов и профилей воспалительных цитокинов. Биплот анализа главных компонентов стандартизированной матрицы клеточных показателей и цитокинов с цветовым выделением групп участников, тепловая карта корреляции Спирмена и сетевой граф всех 17 клеточных и растворимых признаков (размер узлов соответствует степени узла, масштаб ребер определяется значением |ρ|, фильтрация проведена с применением поправки Бенджамини-Хохберга) p < 0,05 и |ρ| ≥ 0,30), что указывает на наличие центрального узла «нейтрофилы — хемокины». Сокращения: BH = метод Бенджамини — Хохберга; PC = главная компонента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Обезличенный набор данных на уровне участников и код анализа на языке R, использованные в данном исследовании, представлены в виде Дополнительной таблицы S1 и Дополнительного файла 1. Другие данные, подтверждающие результаты этого исследования, могут быть предоставлены автором, ответственным за переписку, по обоснованному запросу.
Дополнительная таблица S1: Набор данных БАЛЖ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 1: ZIP-архив с кодами для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
Надежность данного протокола зависит от ряда решений, принятых до и во время анализа. Установление нижней границы степени восстановления на уровне 40% и объединение второй и последующих аликвот были преднамеренными решениями, так как первая аликвота содержит более высокую концентрацию материалов дыхательных путей бронхов, в то время как степень восстановления систематически варьирует в зависимости от возраста, пола, истории курения и целевого бронха18. Блокирование Fc-рецепторов и титрование антител против отдельных клонов для обеспечения правильных границ гейтирования между зрелыми CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ нейтрофилами и CD14⁺HLA-DR⁺ альвеолярными макрофагами (доминирующими клетками в образце БАЛЖ с наиболее высоким уровнем неспецифического окрашивания и фоновой автофлуоресценции) имеют жизненно важное значение для поддержания согласованности между двумя группами19,20. Ограничение по количеству циклов замораживания-размораживания и 2-часовой временной интервал для мультиплексного анализа также не являются случайными. Данные по БАЛЖ человека показали значительное снижение процента нейтрофилов в период от 6 до 24 ч даже при хранении при 4 °C, в то время как процент макрофагов и лимфоцитов оставался стабильным13. Параметры алгоритмов t-SNE и UMAP, а также параметры сетки FlowSOM из 100 узлов и 12–15 метакластеров были определены до анализа групп, чтобы предотвратить подстройку параметров post hoc, что является одной из известных причин невоспроизводимости протоколов цитометрии16. Сведения об операторах и идентификаторы планшетов/запусков могут быть сохранены для каждого клеточного события с целью применения методов коррекции пакетного эффекта в будущих крупномасштабных анализах21.
Существует несколько распространенных сценариев неудач, которые не требуют внесения изменений в протокол. Низкий выход (<40%) обычно обусловлен неправильным позиционированием клина или чрезмерным всасыванием; эту проблему следует устранить, скорректировав положение бронхоскопа и снизив интенсивность всасывания до <100 mmHg перед аспирацией следующей аликвоты. Избыточную аутофлуоресценцию альвеолярных макрофагов, являющуюся основным мешающим фактором при анализе клеток легких методом проточной цитометрии, можно минимизировать, включая в каждую серию контроли из неокрашенных клеток легких и четко определяя гейт макрофагов по высокому боковому рассеянию, а не полагаясь исключительно на красители жизнеспособности19. Мультиплексные панели часто подвержены влиянию низкого количества микросфер и аномально высоких значений. Выполнение предварительной кривой разведений для подмножества инфицированных и контрольных образцов перед выбором разведения 1:2 позволяет избежать насыщения сигнала CXCL8, CXCL1 и G-CSF, которые для образцов при пневмонии находятся в верхней части стандартной кривой вследствие ранее обнаруженного матричного эффекта в образцах БАЛЖ22. Протокол может быть дополнительно скорректирован в зависимости от особенностей когорты. Если образцы преимущественно содержат один тип патогена, сокращение основной панели до хемокинов и провоспалительных медиаторов позволит сохранить достаточную статистическую мощность. В случае смешанной популяции, содержащей бактерии, вирусы и атипичные патогены, будет полезно измерить также регуляторные медиаторы, так как недавно было доказано существование специфического для патогена паттерна в альвеолярных нейтрофилах и макрофагах23, а комбинация про- и регуляторных цитокинов в БАЛЖ, как было показано, отражает тяжесть течения внебольничной пневмонии24.
Вклад данного рабочего процесса заключается не в отдельном наблюдении за притоком нейтрофилов или повышением уровня хемокинов и провоспалительных цитокинов при респираторной инфекции, что подробно описано в литературе, а в сочетании панели проточной цитометрии для нейтрофилов и моноцитов из семи маркеров и мультиплексного иммуноанализа из 13 аналитов в рамках общего конвейера визуализации, применяемого к одному и тому же образцу БАЛЖ. Внедрение панели из семи маркеров, нацеленной на нейтрофилы и моноциты, вместе с мультиплексным иммуноанализом из 13 аналитов позволяет зафиксировать фенотипическую и цитокиновую сложность; без этого анализ потребовал бы проведения нескольких независимых тестов с гораздо большим объемом БАЛЖ, чем можно получить при стандартной бронхоскопии. Первый метод хорошо согласуется с предыдущими работами, показывающими, что многоцветная проточная цитометрия столь же надежна, как и ручная микроскопия, для идентификации типов клеток в образцах БАЛЖ15, в то время как критерии приемлемости для второго метода отражают передовой опыт признанной многоцентровой программы оценки компетенций по мультиплексному анализу на основе микросфер16. В частности, комбинированная тепловая карта, сетевой график и PCA, построенные с использованием идентичных стандартизированных входных данных, выявляют взаимосвязи между типами клеток и связанными с ними факторами, которые ранее можно было только косвенно предположить, суммируя независимые столбчатые диаграммы. Это важно, поскольку хемокины CXCL8, CCL2 и CCL3, обнаруживаемые в БАЛЖ, совместно работают для привлечения нейтрофилов и моноцитов из общего циркуляторного русла, и их совместная структура несет информацию, которую невозможно извлечь из независимых показателей отдельных аналитов9,10. БАЛЖ уже рутинно получают в клинических целях, и дополнительный объем не требуется, поэтому данный рабочий процесс может быть позиционирован как трансляционное дополнение к существующим услугам бронхоскопии, а не как отдельная диагностическая процедура.
Практическое время выполнения всего рабочего процесса, включающего транспортировку образцов, окрашивание, регистрацию данных методом проточной цитометрии, инкубацию и считывание мультиплексного анализа, а также последующий вычислительный конвейер, составляет порядка 24 h в условиях исследовательской лаборатории. Таким образом, данный рабочий процесс позиционируется как инструмент глубокого фенотипирования для механистической характеристики и мониторинга ответа на лечение, а не как экспресс-метод прикроватной сортировки для принятия критических по времени решений, таких как немедленное различие между вентилятор-ассоциированной пневмонией и стерильным острым респираторным дистресс-синдромом, при которых стандартом медицинской помощи остаются более быстрые микробиологические анализы и тесты на единичные биомаркеры.
Необходимо упомянуть о нескольких ограничениях. БАЛЖ собирается из дыхательных путей и отражает непосредственные поверхностные взаимодействия в воздушном пространстве, однако он не содержит клеток, расположенных в альвеолярной стенке и перегородках, где локализуется множество активированных макрофагов и резидентных лимфоцитов ткани. Следовательно, между иммунным статусом воздушного пространства и паренхимы нет однозначного соответствия, что согласуется с ранее опубликованными данными25. Мультиплексное определение на основе микросфер подвержено перекрестной реактивности антител, а также матриксным эффектам, которые особенно выражены в среде БАЛЖ, содержащей муцин и сурфактант, по сравнению с сывороткой крови; кроме того, процесс разведения эпителиальной выстилающей жидкости физиологическим раствором невозможно компенсировать с помощью каких-либо эндогенных маркеров, таких как мочевина, что согласуется с недавно опубликованными критическими обзорами26. Объем полученного промывного содержимого был в среднем на 6 mL ниже в группе инфекции, чем в контрольной группе, поэтому сообщаемые здесь абсолютные концентрации подвержены небольшой разнице в коэффициенте разведения между группами, и эндогенный маркер разведения не применялся. Предварительный прием антибиотиков 41 из 64 участников группы инфекции (64,1%) может привести к снижению концентрации цитокинов в дыхательных путях и затруднить выделение патогена. Важно отметить, что протокол представляет собой лишь «мгновенный снимок» в одной временной точке во время клинически показанной бронхоскопии, что исключает анализ кинетики привлечения нейтрофилов, максимальной секреции хемокинов и их разрешения у отдельных пациентов. Значения AUC для одного аналита были получены из той же когорты, которая использовалась для идентификации биомаркеров, при отсутствии независимой валидационной когорты, и должны интерпретироваться как показатели дискриминации внутри когорты, а не как внешне валидированная диагностическая эффективность; внедрение любого порогового значения для одного маркера в клиническую практику потребует проспективной валидации в независимой многоцентровой когорте. Заранее определенные анализы чувствительности, ограниченные образцами с более высоким выходом, участниками, не получавшими антибиотиков, а также стратифицированные по статусу искусственной вентиляции легких и по подтипу пневмонии (внебольничная, нозокомиальная или вентилятор-ассоциированная), не изменили направление межгрупповых сравнений.
В будущем эти ограничения можно будет устранить, добавив секвенирование РНК отдельных клеток или CITE-seq к тем же осадкам БАЛЖ, которые использовались для количественного определения белков и клеток; данные методы были успешно применены в крупных когортах пациентов с бактериальной пневмонией и педиатрической пневмонией, вызванной Mycoplasma pneumoniae, для выявления подмножеств альвеолярных нейтрофилов и макрофагов, которые невозможно различить с помощью традиционной проточной цитометрии27,28. Дополнение информации, полученной при анализе воздушных пространств, данными масс-цитометрии изображений или пространственной транскриптомики соответствующих биопсий или даже материалов аутопсии позволило бы контекстуализировать эти данные29. Связывание лонгитюдного отбора проб БАЛЖ с оценкой действия антагонистов CXCR1/CXCR2 и блокады рецепторов IL-6, которые продемонстрировали преимущество в выживаемости или необходимости органосистемной поддержки при тяжелой пневмонии и остром респираторном дистресс-синдроме (ОРДС), также позволило бы протестировать ось «нейтрофилы-хемокины», выдвинутую на передний план в данном рабочем процессе, в качестве средства принятия терапевтических решений30,31.
В заключение, в данной работе описывается комплексный рабочий процесс визуализации, состоящий из стандартизированных процедур сбора и подготовки БАЛЖ, панели проточной цитометрии с семью маркерами для количественного определения состава нейтрофилов и моноцитов, мультиплексного анализа цитокинов для измерения 13 цитокинов, а также общей платформы визуализации, включающей UMAP, иерархическую кластеризацию, корреляционную сеть и PCA-анализ. При применении этого рабочего процесса к проспективной когорте из 112 взрослых пациентов, которым была показана бронхоскопия по клиническим показаниям, анализ выявил резкий переход в составе иммунных клеток альвеол от макрофагов к нейтрофилам у пациентов с инфекцией, обнаружил трехмодульную структуру цитокинового ответа и выявил сильно связанную ось нейтрофил–хемокин, которая не прослеживается при использовании измерений по одному маркеру. Данная процедура опирается исключительно на материал, собранный в ходе клинической диагностики, не требует дополнительного объема образца и может быть реализована в лабораториях третичного звена, оснащенных оборудованием для многопараметрической проточной цитометрии и мультиплексного анализа на основе микросфер. Более широкое внедрение и любое использование отдельных аналитов в качестве диагностических биомаркеров потребуют проспективной валидации в независимых многоцентровых когортах. Таким образом, исследование представляет воспроизводимую и насыщенную данными методологию для характеристики воспаления дыхательных путей при респираторных инфекциях и создает основу для ее дальнейшего развития в лонгитюдных исследованиях, одноклеточном и пространственном анализе, а также для терапевтической оценки иммуномодуляции, направленной на ось нейтрофил–хемокин.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы искренне благодарим всех пациентов и добровольцев, принявших участие в данном исследовании, за их неоценимое сотрудничество. Мы выражаем признательность Комитету по этике за этическое одобрение (номер одобрения 2026HL-038) и нормативное руководство на протяжении всего процесса исследования.
Мы благодарим медицинский персонал отделения респираторной медицины, центра бронхоскопии и клинической лаборатории за помощь в сборе клинических образцов, обработке жидкости при бронхоальвеолярном лаваже и микробиологическом обнаружении. Мы также выражаем признательность за техническую поддержку центральной лаборатории больницы при проведении экспериментов по многомерной проточной цитометрии и мультиплексному профилированию цитокинов.
Данное исследование не получило никаких специальных грантов от финансирующих организаций из государственного, коммерческого или некоммерческого секторов.
Мы благодарим всех исследователей, техников и средний медицинский персонал, принимавших участие в этом проекте, за их вклад в скрининг пациентов, управление образцами, проведение экспериментов и систематизацию данных.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Антитело к CD11b человека, Brilliant Violet 421, клон ICRF44 | BioLegend | Кат. № 301323 | Маркер активации нейтрофилов; фиолетовый лазерный канал URL: https://www.biolegend.com |
| Антитела к CD14 человека, APC/Cyanine7, клон M5E2 | BioLegend | Кат. № 301820 | Маркер исключения моноцитов-макрофагов; красный лазерный канал Поскольку вы не предоставили исходный текст для перевода, пожалуйста, вставьте текст или предоставьте ссылку на контент JoVE, который необходимо перевести. Я готов приступить к работе, следуя всем вашим инструкциям по соблюдению академического стиля, научной точности и терминологического единства. https://www.biolegend.com |
| Антитело к CD15 человека, PE, клон HI98 | BioLegend | Кат. № 301906 | Маркер линии нейтрофилов; синий лазерный канал Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.biolegend.com |
| Антитело против CD16 человека, Brilliant Violet 510, клон 3G8 | BioLegend | Кат. № 302048 | Созревание нейтрофилов и маркер NK-клеток; фиолетовый лазерный канал Поскольку текст в поле URL отсутствует, пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.biolegend.com |
| Антитело к CD45 человека, PerCP, клон HI30 | BioLegend | Кат. № 304026 / RRID: AB_893338 | Панлейкоцитарный маркер; синий лазерный канал Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Антитело к CD66b человека, FITC, клон G10F5 | BioLegend | Кат. № 305103 | Маркер гранулоцитов; синий лазерный канал Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.biolegend.com |
| Антитела к HLA-DR человека, PerCP/Cyanine5.5, клон L243 | BioLegend | Кат. № 307629 | Маркер антигенпрезентирующих клеток; синий лазерный канал Поскольку вы не предоставили исходный текст для перевода (поле URL пусто), пожалуйста, введите текст или предоставьте ссылку на контент, который необходимо перевести на русский язык. Я готов приступить к работе в соответствии с вашими инструкциями по соблюдению академического стиля и научной точности. https://www.biolegend.com |
| Автоматический гематологический анализатор (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | Прибор (модель XN-1000) | Используется для определения общего количества нуклеированных клеток с целью расчета абсолютного числа нейтрофилов Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://www.sysmex.com |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Кат. № A7906 | Используется в буфере для окрашивания при проточной цитометрии (0,5% масс./об. в PBS с 2 мМ ЭДТА) Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.sigmaaldrich.com/US/ru/product/sigma/a7906 |
| Пакет ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Проект Bioconductor | v2.20 (с открытым исходным кодом) | Используется для построения тепловых карт иерархической кластеризации данных мультиплексного анализа цитокинов Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Цитоцентрифуга (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Кат. № A78300003 | Используется для приготовления цитологических препаратов из клеточной суспензии БАЛЖ (бронхоальвеолярного лаважа) Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. Набор для выделения РНК (RNA Isolation Kit) |
| Раствор для лизиса эритроцитов (BD FACS Lysing Solution, 10-кратный концентрат) | BD Biosciences | Кат. № 349202 | Используется для лизиса эритроцитов после поверхностного окрашивания Поскольку вы не предоставили исходный текст для перевода, пожалуйста, вставьте текст, который необходимо перевести с английского на русский язык. Я выполню перевод в соответствии с вашими инструкциями, соблюдая академический стиль и научную терминологию. https://www.bdbiosciences.com |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 0,5 M, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Кат. № AM9260G | Используется в буфере для окрашивания при проточной цитометрии в концентрации 2 мМ Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. Набор для выделения РНК из тканей и клеток, с колонкой, 50 препарирований |
| Фиксируемый краситель для определения жизнеспособности (набор Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Кат. № 423105 | Исключение живых и мертвых клеток перед гейтированием; канал красного лазера Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.biolegend.com |
| Гибкий видеобронхоскоп | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Прибор (модель BF-1TQ290) | Используется для БАЛ при умеренной седации Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://www.olympus-global.com |
| Проточный цитометр, многоцветный (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Прибор (модель CytoFLEX LX, шестилазерная конфигурация) | Используется для сбора данных при применении панели из семи маркеров для проточной цитометрии нейтрофилов/моноцитов Поскольку в вашем запросе отсутствует исходный текст для перевода (поле URL пустое), пожалуйста, предоставьте текст или ссылку на материалы JoVE, которые необходимо перевести на русский язык. Я готов приступить к работе, соблюдая все указанные вами требования к академическому стилю, научной терминологии и точности перевода. https://www.beckman.com |
| Программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Используется для компенсации и ручного гейтирования FCS-файлов Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.flowjo.com |
| Пакет FlowSOM (R/Bioconductor) | Проект Bioconductor | v2.12 (с открытым исходным кодом) | Используется для кластеризации и метакластеризации данных проточной цитометрии с помощью самоорганизующихся карт Поскольку вы не предоставили текст для перевода после «URL:», пожалуйста, вставьте исходный английский текст, который необходимо перевести. Я выполню перевод в соответствии с вашими строгими инструкциями для JoVE. https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (программное обеспечение для статистического анализа и построения графиков) | Программное обеспечение GraphPad (Dotmatics) | v10 | Используется для создания итоговых рисунков Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.graphpad.com |
| Реагент для блокирования Fc-рецепторов человека (Human TruStain FcX) | BioLegend | Кат. № 422301 / RRID: AB_2818986 | Блокировка Fc-рецепторов перед окрашиванием антителами Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. Вы прислали только «URL:», но не указали саму ссылку или исходный текст. Как только вы предоставите материал, я переведу его в соответствии с вашими инструкциями. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| пакет igraph (R) | CRAN | v2.0 (с открытым исходным кодом) | Используется для построения и визуализации графа корреляционной сети Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Криопробирки с низкой сорбцией белков, 2,0 мл | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Кат. № 375418 | Используется для аликвот супернатанта БАЛЖ для анализа цитокинов Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Платформа для мультиплексного иммуноанализа на основе магнитных частиц Luminex (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Прибор (модель MAGPIX) | Используется для сбора данных мультиплексного анализа цитокинов Поскольку вы не предоставили исходный текст для перевода, пожалуйста, отправьте текст или ссылку на материал, который необходимо перевести с английского на русский язык. Я готов приступить к работе, строго соблюдая ваши инструкции по научной терминологии и академическому стилю. https://www.luminexcorp.com |
| Май-Грüраствор красителя по методу Ройнальда-Гимзы | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Кат. № GS500 | Используется для дифференциального подсчета клеток методом цитоспина Поскольку в вашем запросе отсутствует исходный текст для перевода, пожалуйста, предоставьте текст, который необходимо перевести с английского на русский язык. Я готов приступить к работе, соблюдая все ваши инструкции по научной терминологии, академическому стилю и точности перевода для материалов JoVE. https://www.sigmaaldrich.com/US/ru/product/sigma/gs500 |
| пакет mice (R) | CRAN | v3.16 (с открытым исходным кодом) | Используется для множественной импутации с помощью цепочек уравнений в анализе чувствительности Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. Вы указали только «URL:», но не привели саму ссылку или исходный текст. Как только вы отправите содержимое, я приступлю к профессиональному переводу на русский язык в соответствии с вашими инструкциями. https://cran.r-project.org/package=mice |
| Мультиплексная панель цитокинов/хемокинов на магнитных микросферах (13-плексная, индивидуальная; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Кат. № HCYTOMAG-60K | Специализированная панель для измерения 13 аналитов, описанных в разделе 2.4 Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. Вы отправили только «URL:», но не указали саму ссылку или текст. Как только вы предоставите контент, я переведу его в соответствии с вашими инструкциями для JoVE. https://www.merckmillipore.com |
| сетчатый нейлоновый фильтр для клеток, 70 µm | Corning (Falcon) | Кат. № 352350 | Используется для механической фильтрации БАЛЖ с целью удаления слизистых сгустков Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://www.corning.com |
| Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Кат. № 10010023 | Базовый буфер для ресуспендирования и окрашивания клеток URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| пакет pROC (R) | CRAN | v1.18 (с открытым исходным кодом) | Используется для построения ROC-кривых и расчета значений AUC Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (среда статистических вычислений) | R Core Team | v4.4 (с открытым исходным кодом) | Платформа для статистического анализа и визуализации Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.r-project.org |
| пакет rstatix (R) | CRAN | v0.7 (с открытым исходным кодом) | Используется для групповых сравнений и корреляционной статистики Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Пакет Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (с открытым исходным кодом) | Используется для вложений t-SNE Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Компенсационные бусины с одним красителем (компенсационные бусины UltraComp eBeads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Кат. № 01-2222-42 | Используется для одноцветных контролей компенсации Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. Вы отправили только «URL:» без самого контента. Как только вы пришлете текст, я переведу его в соответствии с вашими инструкциями. Набор для выделения РНК из тканей и клеток (RNA Pure), 50 реакций Набор RNA Pure предназначен для высокоэффективного выделения общей РНК из различных типов тканей и культур клеток. Данный метод обеспечивает получение высококачественной РНК, пригодной для последующего анализа с помощью ОТ-ПЦР (RT-PCR), северного блоттинга или синтеза кДНК. Особенности: - Высокая чистота и выход РНК. - Совместимость с широким спектром образцов. - Оптимизированный протокол для минимизации деградации РНК. Состав набора: - Раствор для лизиса. - Раствор для осаждения. - Растворы для промывки. - RNase-free вода. Условия хранения: 4°C. |
| Раствор хлорида натрия для инъекций, 0,9% (стерильный физиологический раствор) | Baxter International | Кат. № 2B1324 | Используется для введения препарата при БАЛ (100–150 мл, 20–аликоты по 40 мл при 37 °C) Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://www.baxter.com |
| пакет uwot (R) | CRAN | v0.2 (с открытым исходным кодом) | Используется для снижения размерности методом UMAP Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (программное обеспечение для сбора данных мультиплексного анализа и аппроксимации кривых) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Специализированное программное обеспечение прибора для аппроксимации стандартной кривой по модели 5PL Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://www.luminexcorp.com |
Ссылки
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.