В данном исследовании представлен комплексный рабочий процесс визуализации, объединяющий стандартизированный сбор и обработку жидкости для бронхоальвеолярного лаважа, панель проточной цитометрии с семью маркерами, мультиплексный анализ цитокинов с 13 аналитами и единый конвейер анализа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Интегрированная визуализация рекрутирования нейтрофилов и профилирование воспалительных цитокинов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Жидкость для бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) является наиболее доступным матриксом для забора проб при изучении воспаления нижних дыхательных путей, однако традиционные анализы опираются на проточную цитометрию с использованием одного маркера в сочетании с иммуноферментным анализом (ELISA) для каждого отдельного аналита; такой подход ограничивает плотность получаемой информации и скрывает взаимосвязь между клетками и факторами. В данном исследовании представлен интегрированный рабочий процесс визуализации, сочетающий стандартизированный сбор и предварительную обработку с панелью для проточной цитометрии нейтрофилов и моноцитов по семи маркерам, мультиплексным анализом 13 цитокинов и унифицированным конвейером анализа на основе равномерного аппроксимированного проекционного отображения (UMAP), метакластеризации FlowSOM, иерархической кластеризации, сетей корреляции Спирмена и анализа главных компонентов (PCA).
Данный рабочий процесс был применен к одноцентровой проспективной когорте из 112 взрослых пациентов, перенесших бронхоскопию, которая включала 64 пациентов с микробиологически подтвержденной инфекцией легких и 48 лиц из контрольной группы без инфекции. Данные цитологического анализа и проточной цитометрии выявили выраженный сдвиг альвеолярного профиля от макрофагального к нейтрофильному при инфекции: процент нейтрофилов увеличился с медианы 3,2% до 68,4%, а абсолютная концентрация нейтрофилов возросла примерно в 50 раз. Мультиплексный профильный анализ выявил скоординированный трехмодульный цитокиновый ответ, при котором хемокиновый, провоспалительный и регуляторный модули были активированы; при этом CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α и G-CSF продемонстрировали наибольшую дискриминационную способность в качестве одиночных маркеров в исследуемой когорте (площадь под кривой [AUC] от 0,89 до 0,94). Интегративная визуализация с использованием PCA, корреляционной матрицы и сетевого графа выявила тесную связь оси «нейтрофилы — хемокины» на уровне участников, при этом количество нейтрофилов в БАЛЖ оказалось центральным узлом сети.
Данный рабочий процесс использует только материалы, регулярно получаемые в ходе клинически обоснованного БАЛ, не требует дополнительного объема образцов и предоставляет информативно насыщенную основу для анализа воспаления дыхательных путей при респираторных инфекциях. Это может быть реализовано в лабораториях специализированной медицинской помощи, оснащенных системами многопараметрической проточной цитометрии и платформами мультиплексного микросферного анализа, с возможностью применения в лонгитюдных исследованиях, анализах единичных клеток и оценке терапевтической эффективности. Более широкое внедрение отдельных аналитов в клиническую практику в качестве биомаркеров потребует проспективной валидации в независимых многоцентровых когортах.
Введение
Инфекционные смерти в результате инфекций нижних дыхательных путей остаются значительной причиной глобальной смертности, несмотря на достижения в стратегиях вакцинации и методах лечения; тем не менее, это особенно актуально для детского и пожилого населения1. Нейтрофилы являются основными клетками, регистрируемыми на ранних стадиях врожденного иммунного ответа в пораженной дыхательной системе, что жизненно важно для уничтожения вторгающегося патогена; однако неконтролируемое нейтрофильное воспаление приводит к разрушению альвеолярно-капиллярного барьера, окислительному повреждению тканей и развитию острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС)2,3. Нейтрофилы в воздушном пространстве легких также демонстрируют кинетику привлечения, особенности удерживания и эффекторное поведение, которые отличаются от других тканей, и эти различия влияют на то, разрешится ли инфекция или перейдет в тяжелую пневмонию4.
Жидкость для бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ) является важным источником информации об альвеолярном микроокружении и обеспечивает наиболее точное представление о клиническом иммунитете в данной области5. Хемокин CXCL8 играет ключевую роль в привлечении нейтрофилов в легкие через его рецепторы CXCR1 и CXCR2, наряду с другими хемокинами, включая CXCL1, CXCL2 и CXCL56. Цитокины IL-1β, IL-6 и TNF-α дополнительно усиливают этот процесс, в то время как IL-10 действует как противодействующий цитокин. Было показано, что их уровни в БАЛЖ коррелируют с тяжестью инфекций легких и развитием осложнений в легких вследствие бактериальной, вирусной и атипичной пневмонии7, а мультиплексные профили биомаркеров БАЛЖ внедряются для более ранней диагностики и дифференциации патогенов при инфекциях нижних дыхательных путей8.
Стандартное исследование БАЛЖ обычно не позволяет полностью охватить биологические механизмы, лежащие в основе теста. Количество клеток оценивают путем ручного дифференцирования клеток в образцах после цитоспинирования, в то время как растворимые медиаторы измеряют с помощью отдельных иммуноферментных анализов (ELISA) и представляют в виде столбчатых диаграмм. Хемокины, цитокины и каждый тип клеток оцениваются по отдельности, при этом между градиентом концентрации конкретного хемокина и популяциями клеток, на которые он влияет в образце, корреляция не устанавливается. Сочетание цитокиновых модулей, зависимостей «доза-ответ» хемокинов и нейтрофилов, а также подгрупп пациентов с их собственными воспалительными профилями часто упускается из виду в отсутствие многомерного анализа9.
Развитие вычислительных мощностей делает такой холистический подход все более реалистичным. Сочетание многопараметрической и спектральной проточной цитометрии с методами снижения размерности, такими как t-распределенное стохастическое вложение соседей (t-SNE) или равномерная аппроксимация и проекция многообразий (UMAP), позволяет переносить многомерные иммунные фенотипы в двухмерное пространство, при этом UMAP демонстрирует лучшую сохранность глобальной топологии и воспроизводимость применительно к цитометрическим данным10. Мультианалитные панели цитокинов с последующим иерархическим кластеризатором и построением корреляционных сетей помогают выявить сигнатуры, коррелирующие с тяжестью заболевания, которые невозможно определить с помощью анализа отдельных цитокинов11. Несмотря на прогресс в данной области, до сих пор не было разработано рабочего процесса, объединяющего эти методы для изучения рекрутирования нейтрофилов и цитокиновых сигнатур из одних и тех же образцов БАЛЖ при респираторных инфекциях. В данной работе описывается интегрированный рабочий процесс визуализации для исследования рекрутирования нейтрофилов с помощью цитологии и многопараметрической проточной цитометрии с последующим UMAP-анализом и анализом цитокиновых сигнатур методом мультиплексного иммуноанализа, иерархической кластеризацией, построением корреляционных матриц и анализом главных компонентов. Этот рабочий процесс позволяет создать интегрированную визуализацию, объединяющую клеточные и растворимые иммунные показатели дыхательных путей на одном графике с использованием образцов БАЛЖ, которые рутинно получают во время клинически обоснованной бронхоскопии при инфекциях нижних дыхательных путей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Популяция исследования и этика
Данное одноцентровое проспективное обсервационное исследование проводилось на базе многопрофильной учебной больницы в период с января 2026 года по апрель 2026 года. Протокол был одобрен под номером 2026HL-038, и перед началом любых процедур исследования от каждого участника было получено письменное информированное согласие.
Взрослые пациенты в возрасте от 18 до 75 лет, которым проводилась диагностическая гибкая бронхоскопия с бронхоальвеолярным лаважем (БАЛ) в рамках стандартного клинического обследования, набирались последовательно и распределялись в группу с инфекцией или в контрольную группу без инфекции на основании окончательных клинических и микробиологических диагнозов. Обзор интегрированного рабочего процесса визуализации, от набора пациентов до получения интегрированных визуальных результатов, представлен на рисунке 1.
Рисунок 1Обзор интегрированного рабочего процесса визуализации для профилирования привлечения нейтрофилов и ответов воспалительных цитокинов на основе БАЛЖ. Пять этапов кратко описывают (слева направо): перспективный набор участников в группу инфекции и контрольную группу с проведением бронхоскопии и БАЛ, предварительную обработку БАЖ с получением осадка клеток и супернатанта, параллельные измерения клеточных компонентов (цитология по Райту–Гимзе и многопараметрическая проточная цитометрия) и растворимых факторов (13-плексный иммуноанализ на основе магнитных микросфер), унифицированный конвейер визуализации (UMAP с метакластеризацией FlowSOM, иерархическая тепловая карта, анализ главных компонентов и сеть корреляции Спирмена), а также интегрированный визуальный результат. Сокращения: БАЛ — бронхоальвеолярный лаваж; БАЖ — жидкость БАЛ; UMAP — равномерное приближение и проекция многообразий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Критерии включения в группу инфекции были следующими: (1) пациенты с диагнозом внебольничной пневмонии (CAP), нозокомиальной пневмонии (HAP) или вентилятор-ассоциированной пневмонии (VAP) в соответствии с рекомендациями Инфекционного общества Америки (IDSA) и Американского торакального общества (ATS); (2) обнаружение одного или нескольких патогенов путем посева БАЛЖ с титром ≥104 колониеобразующих единиц (CFU)/мл, мультиплексной полимеразной цепной реакции (PCR) респираторных проб, метагеномного секвенирования нового поколения БАЛЖ или специфического анализа на антиген/антитела в парных образцах из дыхательных путей и сыворотки крови.
Критерии отбора для контрольной группы были следующими: (1) неинфекционные показания к бронхоскопии, включая оценку неопределенного узла в легком, аномальные результаты рентгенологического исследования, не указывающие на инфекцию, или обследование по поводу хронического кашля; (2) отсутствие острой инфекции легких, подтвержденное отрицательными результатами микробиологического тестирования и отсутствием каких-либо признаков воспаления или системной инфекции на момент проведения бронхоскопии; и (3) отсутствие приема антибиотиков в течение 30 дней до участия в исследовании. В качестве контроля привлекались пациенты, которым проводилась бронхоскопия по другим клиническим показаниям, а не здоровые добровольцы, что отражает популяцию, у которой в исследовательском центре обычно проводят БАЛ по клиническим показаниям.
Критерии исключения включали: (1) злокачественные новообразования и/или проведение цитоксической химиотерапии в течение предшествующих шести месяцев; (2) серопозитивность по ВИЧ; (3) трансплантация солидных органов или гемопоэтических стволовых клеток; (4) длительная иммуносупрессивная терапия с ежедневной эквивалентной дозой преднизолона > 0.3 mg/kg на протяжении более 3 недель; (5) беременность или лактация у женщин; (6) наличие в анамнезе геморрагического диатеза или любые противопоказания к гибкой бронхоскопии; (7) имеющиеся тяжелые хронические заболевания дыхательных путей (хроническая обструктивная болезнь легких [ХОБЛ] III/IV стадии по классификации Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD], идиопатический легочный фиброз, тяжелая персистирующая астма или клинически значимый бронхоэктаз); (8) активный туберкулез; (9) участие в другом интервенционном исследовании в течение последних 30 дней. БАЛ проводили во время первой бронхоскопии в течение 72 h с момента поступления при наличии инфекций, а у пациентов на искусственной вентиляции легких с инфекциями — в течение 48 h после интубации.
Расчет объема выборки был сосредоточен на основном клеточном показателе: количестве нейтрофилов в БАЛЖ в различных группах. С учетом ожидаемой величины эффекта в 0,6 SD между инфицированными и неинфицированными дыхательными путями и с учетом 15% допустимого выбывания участников, для обеспечения двустороннего α = 0,05 при статистической мощности 80% требовался минимальный объем выборки из 45 субъектов в группе. Из 156 подходящих кандидатов 27 не соответствовали критериям отбора (18 не соответствовали критериям включения, главным образом из-за невозможности идентифицировать патогенный агент, ответственный за заболевание, в установленный срок, или из-за несогласия с самой процедурой; 9 соответствовали критериям исключения, прежде всего из-за активного злокачественного новообразования или наличия в анамнезе химиотерапии, хронического применения кортикостероидов, тяжелого предшествующего хронического заболевания легких или геморрагического диатеза). Остальные 129 участников прошли бронхоскопию. Впоследствии 17 субъектов были исключены из исследования (7 — из-за недостаточного объема БАЛЖ < 40%; 4 — в связи с отзывом согласия во время госпитализации; и 6 — из-за переклассификации субъектов после окончательной микробиологической оценки: 4 кандидата в группу контроля, у которых по результатам посева была диагностирована скрытая инфекция, и 2 кандидата в группу инфекции, у которых после анализа посева не было обнаружено признаков инфекции). Итоговая группа участников исследования составила 12 человек: 64 с инфекцией и 48 без нее.
Сбор и предварительная обработка БАЛЖ
Бронхоскопию проводили опытные операторы в соответствии со стандартным протоколом учреждения, согласно опубликованным техническим рекомендациям по бронхоальвеолярному лаважу12. Лидокаин применяли местно, пациентам проводили умеренную внутривенную седацию, при этом подавали дополнительный кислород для поддержания сатурации кислорода (SpO₂) >92%. Гибкий бронхоскоп вводили и позиционировали в бронхопульмонарном сегменте с рентгенологическими отклонениями. В случаях, когда рентгенологические изменения были диффузными или нелокализуемыми, выбирали сегменты средней доли правого легкого или верхнего сегмента левого легкого (лингулярные сегменты). После каждого введения раствора проводили осторожную ручную аспирацию с отрицательным давлением < 10 mmHg. Вводили от трех до пяти порций стерильного физраствора при температуре 37 °C по 20–40 mL каждая, общим объемом 10–150 mL. Коэффициент восстановления оценивали как отношение полученного объема к введенному объему; для анализа принимались только образцы с выходом ≥40%.
Образцы, полученные при втором и последующих промываниях, объединяли для уменьшения бронхиального загрязнения и получения образца, обогащенного альвеолярными клетками. Объединенный бронхоальвеолярный лаважный жидкость (БАЛЖ) хранили на льду и обрабатывали в течение 2 ч после сбора, учитывая недавние данные об изменениях клеточного состава и дифференциального подсчета при длительном хранении и нагреве образцов БАЛЖ человека13. После фильтрации через стерильную нейлоновую сетку с размером пор 70 мкм для удаления слизи, выполненной путем простого механического пропускания без добавления муколитиков или антиагрегантов, таких как дитиотреитол (поскольку предварительные испытания показали, что этого достаточно для удаления слизистых сгустков без значимой потери целостности поверхностных эпитопов), жидкость центрифугировали при 400 × g в течение 10 мин при 4 °C. Супернатант сливали и разделяли на аликвоты в криопробирки с низкой белковой адсорбцией для анализа цитокинов, а клетки суспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) с 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 2 mM этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA), часть которых сохраняли для цитологического исследования и проточной цитометрии. Образцы цитокинов замораживали в жидком азоте, хранили при –80 °C и подвергали не более чем одному циклу замораживания-оттаивания перед использованием.
Цитология нейтрофилов и количественный анализ методом проточной цитометрии
Для цитопатологического исследования 100 µL клеточной суспензии БАЛ наносили на предметное стекло с помощью цитоцентрифуги (см. Таблицу материалов) при 30 × g в течение 5 мин, высушивали на воздухе и окрашивали по методу Райта-Гимзы. Дифференциальный подсчет клеток проводил технолог по гематологии, не владеющий информацией об анамнезе пациента; при этом подсчитывали не менее 40 клеток на одном стекле и рассчитывали процентное содержание макрофагов, лимфоцитов, нейтрофилов и эозинофилов. Процент нейтрофилов в БАЛ считали основным показателем цитопатологического анализа, поскольку современные данные свидетельствуют об их эффективности в дифференциации инфекционных и неинфекционных заболеваний легких у пациентов с легочными инфильтратами14.
Протокол количественного анализа методом проточной цитометрии был основан на недавно проведенной валидации протокола дифференцировки лейкоцитов жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) с использованием четырех цветов15 и включал дополнительные маркеры для идентификации нейтрофилов. В частности, примерно 5 × 105 клеток, выделенных из БАЛ, блокировали с помощью реагента для блокирования Fc-рецепторов человека (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 4 °C, а затем окрашивали в течение 20 мин при 4 °C антителами к CD45 (клон HI30), CD6b (клон G10F5), CD15 (клон HI98), CD16 (клон 3G8), CD1b (клон ICRF4), CD14 (клон M5E2) и HLA-DR (клон L243), а также с использованием фиксируемого красителя жизнеспособности (см. Таблицу материалов). Для лизиса эритроцитов использовали коммерческий раствор для лизиса эритроцитов (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при комнатной температуре. После лизиса эритроцитов клетки дважды промывали PBS с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки и ресуспендировали в буфере для проточной цитометрии, после чего анализировали на многоцветном проточном цитометре (см. Таблицу материалов). Компенсацию проводили с использованием компенсационных микросфер с одним красителем (см. Таблицу материалов); для каждой панели использовали пробирки с одним отсутствующим флуорохромом (FMO) и неокрашенные контроли.
Для каждого образца было зарегистрировано не менее 1 × 105 событий CD45⁺. Сначала на графике FSC-A/FSC-H выделяли синглеты, затем живые (viability dye⁻) CD45⁺ лейкоциты, после чего проводили исключение CD14⁺HLA-DR⁺ моноцитов-макрофагов для отбора гранулоцитов CD6b⁺ с высоким боковым светорассеянием. Затем в популяции гранулоцитов нейтрофилы определяли как события CD15⁺CD16⁺CD1b⁺. Этот первичный гейт для гранулоцитов CD6b⁺ проводили широко вокруг всех событий с высоким боковым светорассеянием, не ограничиваясь границей CD15⁺CD16⁺CD1b⁺, чтобы активированные нейтрофилы CD16-dim, CD1b-high и другие менее зрелые формы гранулоцитов оставались в общем автоматизированном подсчете нейтрофилов; более строгое определение CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ применялось только для характеристики подмножества зрелых нейтрофилов, представленного отдельно в последующем кластерном анализе. Количество нейтрофилов в БАЛЖ (cells/µL) оценивали на основе процента нейтрофилов и общего количества ядерных клеток, определенного с помощью автоматического гематологического анализатора (см. Таблицу материалов). Матрицы компенсации, стратегия гейтирования и отчеты по контролю качества отдельных образцов были заархивированы, а аналитики оставались слепыми по отношению к распределению участников по группам на протяжении всего процесса сбора и анализа данных.
Мультиплексный профильный анализ воспалительных цитокинов
Супернатанты БАЛФ размораживали один раз на влажном льду, после чего подвергали кратковременному вортексированию и осветлению путем центрифугирования при 10,0 × g в течение 5 мин при 4 °C непосредственно перед проведением анализа. Измерение 13 аналитов, разделенных на три функциональные категории, осуществляли с помощью мультиплексной иммуноаналитической платформы на основе микросфер с использованием специализированной панели магнитных бусин (см. Таблицу материалов). Провоспалительная группа включала IL-1β, IL-6, IL-17A и TNF-α; группа хемокинов включала CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 и CCL3/MIP-1α; регуляторная группа включала IL-10, IFN-γ, IL-1RA и G-CSF. Выбор аналитов основывался на данных о наиболее информативных показателях, обычно используемых в мультиплексном анализе цитокинов БАЛФ или сыворотки крови в исследованиях пневмонии/тяжелых респираторных инфекций7,1. Коэффициент разведения (1:2 в аналитическом буфере) был определен в ходе предварительного эксперимента на репрезентативной подгруппе как инфицированных, так и контрольных образцов, чтобы гарантировать попадание >90% результатов измерений в диапазон стандартной кривой.
Стандартные кривые определяли с помощью семиточечного серийного разведения рекомбинантных стандартов производителя; на каждом планшете их готовили в дубликатах, включая одну холостую лунку для вычитания фонового сигнала. Аппроксимация кривой выполнялась методом пятипараметрической логистической (5PL) регрессии с использованием проприетарного программного обеспечения прибора для сбора и анализа данных (см. Список материаловНижний предел количественного определения (НПКО) рассчитывали как наименьшее количество стандарта, обеспечивающее процент обратного восстановления в диапазоне от 80% до 120% и внутрисерийный коэффициент вариации (CV) ≤ 20%. Значения ниже НПКО заменяли значением НПКО/√2. Два объединенных образца жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) для контроля качества (один от репрезентативного инфицированного пациента и один от здорового субъекта) разделяли на аликвоты и добавляли на каждый планшет для мониторинга стабильности результатов в долгосрочной перспективе. Стандарты обеспечения качества основывались на рекомендациях по передовым методам, выработанных в ходе 12-летней многоцентровой программы оценки компетентности при проведении мультиплексного анализа на основе магнитных частиц.16включая требования к коэффициенту вариации (CV) внутри анализа ≤ 10% для дубликатных лунок, CV между планшетами ≤ 20% для контроля качества и минимальному количеству микросфер ≥ 50 на один аналит в лунке. Образцы на планшетах, не соответствующих вышеуказанным критериям, анализировали повторно. Анализ проводили одной серией в течение четырех недель с использованием одной лота набора, с рандомным чередованием инфицированных образцов и образцов контроля.
Конвейер анализа визуализации
Файлы стандартного формата проточной цитометрии (FCS) сначала анализировали с помощью коммерческого программного обеспечения для проточной цитометрии (см. Таблица материалов) для компенсации и выделения живых синглетов CD45⁺, после чего данные были экспортированы для объективного анализа в R v4.4. Для каждого образца было отобрано 10 0 событий CD45⁺ методом даунсэмплинга с последующей конкатенацией; интенсивность сигналов трансформировали с помощью функции arcsinh с кофактором 150. Снижение размерности и проекции UMAP выполняли с использованием пакета uwot при 15 ближайших соседях и минимальном расстоянии 0,1, а также параллельное вложение t-SNE с помощью пакета Rtsne при перплексии 30.10Кластеры фенотипов были определены с помощью FlowSOM со 100 узлами самоорганизующейся карты и далее разделены на 12–15 кластеров путем метакластеризации с использованием метода оптимизации, который недавно был валидирован для многомерных данных цитометрии.17Каждый кластер был аннотирован на основе медианной экспрессии маркеров линии и активации, а затем проверен путем сопоставления с результатами ручного гейтирования.
Для анализа данных мультиплексного определения цитокинов исходные значения сначала подвергали логарифмическому преобразованию log₁₀, а затем стандартизировали между аналитами с помощью z-масштабирования перед проведением дальнейшего анализа. Как аналиты, так и пациенты подвергались иерархической кластеризации с использованием евклидова расстояния и метода связывания Ward.D2; результаты были представлены в виде тепловой карты с кластеризацией по строкам и столбцам. Такой подход использовался для выявления коэкспрессируемых модулей цитокинов и классификации подгрупп пациентов в мультиплексных воспалительных когортах9. Матрицы корреляции для всех клеточных и растворимых биомаркеров были построены с использованием попарных ранговых корреляций Спирмена. Тепловые карты матриц корреляции были отображены вместе с сетью, в которой узлы соответствуют биомаркерам, а ребра указывают на корреляции, сохранившие значимость после коррекции на множественное тестирование методом Бенджамини — Хохберга (BH). Ширина ребер масштабировалась в соответствии с величиной коэффициента корреляции |ρ|, и ребра включались только при |ρ| ≥ 0.30 и p < 0.05 после коррекции. Анализ главных компонент (PCA) стандартизированной матрицы, содержащей данные по клеткам и цитокинам, выполнялся с помощью функции prcomp() с масштабированием единичной дисперсии. Участники были спроецированы на первые две главные компоненты с наложением групп инфекции и контроля. Последовательный даунсэмплинг и стандартизация всех анализов обеспечили сопоставимость показателей клеточных и растворимых биомаркеров на всех визуализациях.
Статистический анализ
Непрерывные переменные при отсутствии нормального распределения согласно тестам Шапиро-Уилка описывались с помощью медианы (межквартильный размах, МКР), в остальных случаях — среднего значения (стандартное отклонение, СО). Категориальные переменные описывались с помощью частот и долей. Сравнение групп проводили с использованием критерия Манна-Уитни U тест, когда непрерывные переменные имели ненормальное распределение, тест Уэлча t—тест использовался при нормальном распределении непрерывных переменных, а критерий хи-квадрат или точный критерий Фишера — в соответствующих случаях для категориальных переменных. Связи между непрерывными переменными оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Для учета частоты ложноположительных результатов (FDR) при мультиплексном анализе цитокинов и корреляционном анализе значения p были скорректированы с использованием метода Бенджамини–Хохберга с пороговым значением q < 0,05. Двусторонний p < Статистически значимым во всех основных анализах считался уровень p < 0,05. По возможности случаи с отсутствующими данными по отдельным переменным сохранялись и анализировались методом анализа полных случаев (complete-case analysis) для соответствующей переменной, в то время как для проведения анализа чувствительности применялся метод множественной импутации с использованием связанных уравнений (m = 20). Для отдельных цитокинов в рамках всей когорты исследования с помощью пакета pROC были построены рабочие характеристики приемника (ROC-кривые) и рассчитана соответствующая площадь под кривой (AUC); отдельная внешняя валидационная когорта не использовалась. В заранее определенных анализах чувствительности первичные межгрупповые сравнения повторялись после исключения участников, получавших антибиотики в течение 72 ч до бронхоскопии, а также после стратификации группы с инфекцией по статусу искусственной вентиляции легких и по подтипу пневмонии (внебольничная, нозокомиальная или вентилятор-ассоциированная). Анализ выполнялся в среде R v4.4 с использованием пакетов rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC и mice. Рисунки были созданы с помощью коммерческого программного обеспечения для построения научных графиков (см. Таблица материалов).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Популяция исследования и характеристики образцов
В итоговую когорту анализа вошли 12 субъектов, из которых 64 человека составили группу с инфекцией и 48 человек — контрольную группу без инфекции. Исходные демографические данные в обеих группах были схожими, в то время как лабораторные показатели, связанные с инфекцией, были выше в группе с инфекцией, как показано в Таблице 1. Инфекции были вызваны преимущественно грамотрицательными бактериями, основными бактер...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Надежность данного протокола зависит от ряда решений, принятых до и во время анализа. Установление нижней границы степени восстановления на уровне 40% и объединение второй и последующих аликвот были преднамеренными решениями, так как первая аликвота содержит более высокую концентрацию материалов дыхательных путей бронхов, в то время как степень восстановления систематически варьирует в зависимости от возраста, пола, истории курения и целевого бронха18. Блокирование Fc-рецепторов и титрование антит...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы искренне благодарим всех пациентов и добровольцев, принявших участие в данном исследовании, за их неоценимое сотрудничество. Мы выражаем признательность Комитету по этике за этическое одобрение (номер одобрения 2026HL-038) и нормативное руководство на протяжении всего процесса исследования.
Мы благодарим медицинский персонал отделения респираторной медицины, центра бронхоскопии и клинической лаборатории за помощь в сборе клинических образцов, обработке жидкости при бронхоальвеолярном лаваже и микробиологическом обнаружении. Мы также выражаем признательность за техническую поддержку центральной лаборатории больницы при проведении экспериментов по многомерной проточной цитометрии и мультиплексному профилированию цитокинов.
Данное исследование не получило никаких специальных грантов от финансирующих организаций из государственного, коммерческого или некоммерческого секторов.
Мы благодарим всех исследователей, техников и средний медицинский персонал, принимавших участие в этом проекте, за их вклад в скрининг пациентов, управление образцами, проведение экспериментов и систематизацию данных.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Антитело к CD11b человека, Brilliant Violet 421, клон ICRF44 | BioLegend | Кат. № 301323 | Маркер активации нейтрофилов; фиолетовый лазерный канал URL: https://www.biolegend.com |
| Антитела к CD14 человека, APC/Cyanine7, клон M5E2 | BioLegend | Кат. № 301820 | Маркер исключения моноцитов-макрофагов; красный лазерный канал Поскольку вы не предоставили исходный текст для перевода, пожалуйста, вставьте текст или предоставьте ссылку на контент JoVE, который необходимо перевести. Я готов приступить к работе, следуя всем вашим инструкциям по соблюдению академического стиля, научной точности и терминологического единства. https://www.biolegend.com |
| Антитело к CD15 человека, PE, клон HI98 | BioLegend | Кат. № 301906 | Маркер линии нейтрофилов; синий лазерный канал Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.biolegend.com |
| Антитело против CD16 человека, Brilliant Violet 510, клон 3G8 | BioLegend | Кат. № 302048 | Созревание нейтрофилов и маркер NK-клеток; фиолетовый лазерный канал Поскольку текст в поле URL отсутствует, пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.biolegend.com |
| Антитело к CD45 человека, PerCP, клон HI30 | BioLegend | Кат. № 304026 / RRID: AB_893338 | Панлейкоцитарный маркер; синий лазерный канал Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| Антитело к CD66b человека, FITC, клон G10F5 | BioLegend | Кат. № 305103 | Маркер гранулоцитов; синий лазерный канал Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.biolegend.com |
| Антитела к HLA-DR человека, PerCP/Cyanine5.5, клон L243 | BioLegend | Кат. № 307629 | Маркер антигенпрезентирующих клеток; синий лазерный канал Поскольку вы не предоставили исходный текст для перевода (поле URL пусто), пожалуйста, введите текст или предоставьте ссылку на контент, который необходимо перевести на русский язык. Я готов приступить к работе в соответствии с вашими инструкциями по соблюдению академического стиля и научной точности. https://www.biolegend.com |
| Автоматический гематологический анализатор (Sysmex XN-1000) | Sysmex Corporation | Прибор (модель XN-1000) | Используется для определения общего количества нуклеированных клеток с целью расчета абсолютного числа нейтрофилов Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://www.sysmex.com |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Кат. № A7906 | Используется в буфере для окрашивания при проточной цитометрии (0,5% масс./об. в PBS с 2 мМ ЭДТА) Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.sigmaaldrich.com/US/ru/product/sigma/a7906 |
| Пакет ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Проект Bioconductor | v2.20 (с открытым исходным кодом) | Используется для построения тепловых карт иерархической кластеризации данных мультиплексного анализа цитокинов Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Цитоцентрифуга (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Кат. № A78300003 | Используется для приготовления цитологических препаратов из клеточной суспензии БАЛЖ (бронхоальвеолярного лаважа) Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. Набор для выделения РНК (RNA Isolation Kit) |
| Раствор для лизиса эритроцитов (BD FACS Lysing Solution, 10-кратный концентрат) | BD Biosciences | Кат. № 349202 | Используется для лизиса эритроцитов после поверхностного окрашивания Поскольку вы не предоставили исходный текст для перевода, пожалуйста, вставьте текст, который необходимо перевести с английского на русский язык. Я выполню перевод в соответствии с вашими инструкциями, соблюдая академический стиль и научную терминологию. https://www.bdbiosciences.com |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 0,5 M, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Кат. № AM9260G | Используется в буфере для окрашивания при проточной цитометрии в концентрации 2 мМ Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. Набор для выделения РНК из тканей и клеток, с колонкой, 50 препарирований |
| Фиксируемый краситель для определения жизнеспособности (набор Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Кат. № 423105 | Исключение живых и мертвых клеток перед гейтированием; канал красного лазера Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.biolegend.com |
| Гибкий видеобронхоскоп | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Прибор (модель BF-1TQ290) | Используется для БАЛ при умеренной седации Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://www.olympus-global.com |
| Проточный цитометр, многоцветный (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Прибор (модель CytoFLEX LX, шестилазерная конфигурация) | Используется для сбора данных при применении панели из семи маркеров для проточной цитометрии нейтрофилов/моноцитов Поскольку в вашем запросе отсутствует исходный текст для перевода (поле URL пустое), пожалуйста, предоставьте текст или ссылку на материалы JoVE, которые необходимо перевести на русский язык. Я готов приступить к работе, соблюдая все указанные вами требования к академическому стилю, научной терминологии и точности перевода. https://www.beckman.com |
| Программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Используется для компенсации и ручного гейтирования FCS-файлов Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.flowjo.com |
| Пакет FlowSOM (R/Bioconductor) | Проект Bioconductor | v2.12 (с открытым исходным кодом) | Используется для кластеризации и метакластеризации данных проточной цитометрии с помощью самоорганизующихся карт Поскольку вы не предоставили текст для перевода после «URL:», пожалуйста, вставьте исходный английский текст, который необходимо перевести. Я выполню перевод в соответствии с вашими строгими инструкциями для JoVE. https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (программное обеспечение для статистического анализа и построения графиков) | Программное обеспечение GraphPad (Dotmatics) | v10 | Используется для создания итоговых рисунков Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.graphpad.com |
| Реагент для блокирования Fc-рецепторов человека (Human TruStain FcX) | BioLegend | Кат. № 422301 / RRID: AB_2818986 | Блокировка Fc-рецепторов перед окрашиванием антителами Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. Вы прислали только «URL:», но не указали саму ссылку или исходный текст. Как только вы предоставите материал, я переведу его в соответствии с вашими инструкциями. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| пакет igraph (R) | CRAN | v2.0 (с открытым исходным кодом) | Используется для построения и визуализации графа корреляционной сети Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Криопробирки с низкой сорбцией белков, 2,0 мл | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Кат. № 375418 | Используется для аликвот супернатанта БАЛЖ для анализа цитокинов Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Платформа для мультиплексного иммуноанализа на основе магнитных частиц Luminex (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Прибор (модель MAGPIX) | Используется для сбора данных мультиплексного анализа цитокинов Поскольку вы не предоставили исходный текст для перевода, пожалуйста, отправьте текст или ссылку на материал, который необходимо перевести с английского на русский язык. Я готов приступить к работе, строго соблюдая ваши инструкции по научной терминологии и академическому стилю. https://www.luminexcorp.com |
| Май-Грüраствор красителя по методу Ройнальда-Гимзы | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Кат. № GS500 | Используется для дифференциального подсчета клеток методом цитоспина Поскольку в вашем запросе отсутствует исходный текст для перевода, пожалуйста, предоставьте текст, который необходимо перевести с английского на русский язык. Я готов приступить к работе, соблюдая все ваши инструкции по научной терминологии, академическому стилю и точности перевода для материалов JoVE. https://www.sigmaaldrich.com/US/ru/product/sigma/gs500 |
| пакет mice (R) | CRAN | v3.16 (с открытым исходным кодом) | Используется для множественной импутации с помощью цепочек уравнений в анализе чувствительности Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. Вы указали только «URL:», но не привели саму ссылку или исходный текст. Как только вы отправите содержимое, я приступлю к профессиональному переводу на русский язык в соответствии с вашими инструкциями. https://cran.r-project.org/package=mice |
| Мультиплексная панель цитокинов/хемокинов на магнитных микросферах (13-плексная, индивидуальная; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Кат. № HCYTOMAG-60K | Специализированная панель для измерения 13 аналитов, описанных в разделе 2.4 Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. Вы отправили только «URL:», но не указали саму ссылку или текст. Как только вы предоставите контент, я переведу его в соответствии с вашими инструкциями для JoVE. https://www.merckmillipore.com |
| сетчатый нейлоновый фильтр для клеток, 70 µm | Corning (Falcon) | Кат. № 352350 | Используется для механической фильтрации БАЛЖ с целью удаления слизистых сгустков Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://www.corning.com |
| Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Кат. № 10010023 | Базовый буфер для ресуспендирования и окрашивания клеток URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| пакет pROC (R) | CRAN | v1.18 (с открытым исходным кодом) | Используется для построения ROC-кривых и расчета значений AUC Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (среда статистических вычислений) | R Core Team | v4.4 (с открытым исходным кодом) | Платформа для статистического анализа и визуализации Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.r-project.org |
| пакет rstatix (R) | CRAN | v0.7 (с открытым исходным кодом) | Используется для групповых сравнений и корреляционной статистики Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Пакет Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (с открытым исходным кодом) | Используется для вложений t-SNE Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Компенсационные бусины с одним красителем (компенсационные бусины UltraComp eBeads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Кат. № 01-2222-42 | Используется для одноцветных контролей компенсации Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. Вы отправили только «URL:» без самого контента. Как только вы пришлете текст, я переведу его в соответствии с вашими инструкциями. Набор для выделения РНК из тканей и клеток (RNA Pure), 50 реакций Набор RNA Pure предназначен для высокоэффективного выделения общей РНК из различных типов тканей и культур клеток. Данный метод обеспечивает получение высококачественной РНК, пригодной для последующего анализа с помощью ОТ-ПЦР (RT-PCR), северного блоттинга или синтеза кДНК. Особенности: - Высокая чистота и выход РНК. - Совместимость с широким спектром образцов. - Оптимизированный протокол для минимизации деградации РНК. Состав набора: - Раствор для лизиса. - Раствор для осаждения. - Растворы для промывки. - RNase-free вода. Условия хранения: 4°C. |
| Раствор хлорида натрия для инъекций, 0,9% (стерильный физиологический раствор) | Baxter International | Кат. № 2B1324 | Используется для введения препарата при БАЛ (100–150 мл, 20–аликоты по 40 мл при 37 °C) Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://www.baxter.com |
| пакет uwot (R) | CRAN | v0.2 (с открытым исходным кодом) | Используется для снижения размерности методом UMAP Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (программное обеспечение для сбора данных мультиплексного анализа и аппроксимации кривых) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Специализированное программное обеспечение прибора для аппроксимации стандартной кривой по модели 5PL Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. https://www.luminexcorp.com |
Ссылки
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.