Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптическая система для оценки механики предсердий и желудочков сердца мыши при перфузии по методу Лангендорфа

77 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 августа 2026 г.

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается процедура извлечения и каннюляции сердца мыши, а также подготовка и настройка системы ретроградной перфузии по Лангендорфу. Экспериментальная установка сопряжена с оптической системой высокого разрешения, предназначенной для оценки механических реакций предсердий и желудочков при сохранении их естественной динамики.

Аннотация

Сердце мыши служит широко используемой моделью в сердечно-сосудистых исследованиях благодаря достижениям в области инженерных технологий. Однако оценка сократимости предсердий и желудочков остается сложной задачей из-за малого размера сердца мыши. В данной работе представлена новая методика оценки сократимости и частоты сердечных сокращений в интактном изолированном сердце. Использование сердца мыши с перфузией по Лангендорфу в сочетании с оптической системой высокого разрешения позволяет оценивать сократимость предсердий и желудочков. Экспериментальная установка решает проблемы, связанные с малым размером сердца и высокой скоростью сокращений, обеспечивая при этом получение сигналов высокого разрешения. Синхронизация между частотой стимуляции и частотой сердечных сокращений в диапазоне от 420 до 660 ударов в минуту (bpm) соответствовала результатам, полученным ауксотоническим методом. Кроме того, измерения укорочения желудочков и динамических сигналов предсердий позволяют определить предсердно-желудочковую сократимость. Данный метод подходит для оценки сократимости и частоты сердечных сокращений в интактном изолированном сердце без фармакологического или системного воздействия. Эти результаты демонстрируют, что оптическая система позволяет измерять ответы по укорочению желудочков и предсердий.

Введение

Физиология сердца предоставляет множество возможностей для открытий; такие ключевые процессы, как водитель активность сердца и электромеханическое сопряжение, являются центральными постулатами, которые постоянно изучаются1. Хотя влияние биологического шума на сократимость сердца2 и водительную активность остается недостаточно изученным1, новые методы оптической визуализации позволили представить новые парадигмы3,4.

Две экспериментальные методики с использованием системы Лангендорфа внесли неоценимый вклад в измерение функции сердца. Первая — метод изоволюметрического сокращения, при котором сигнал регистрируется с помощью небольшого баллона, введенного в левый желудочек5,6,7. Вторая — метод ауксотонической записи, при котором сигнал получают, пришивая один конец нити к верхушке сердца, а другой — к механическому регистрирующему устройству для измерения ауксотонических сокращений вдоль оси сердца2,8. Тем не менее, оценка сократимости предсердий и желудочков сердца мыши затруднена из-за его малого размера. Кроме того, подготовка требует определенной осторожности, так как сердце подвержено повреждениям9,10,11,12,13.

Оптическая система для оценки механической динамики сердец мышей обладает несколькими новыми характеристиками и преимуществами. Во-первых, данный метод подходит для оценки сократимости и частоты сердечных сокращений в интактном изолированном сердце в отсутствие фармакологических или системных воздействий. Протокол также может быть эффективно использован в экспериментах по оценке ишемически-реперфузионного повреждения при изучении методов лечения, основанных на фармакологическом воздействии, регенерации клеток или кислородной терапии.

В данной работе мы представляем протокол записи биофизических параметров сократительной функции сердца мыши с использованием оптической системы высокого разрешения. Этот метод позволяет оценивать сократительную способность и частоту сердечных сокращений в интактном изолированном сердце. Кроме того, он позволяет проводить оценку сократимости предсердий и желудочков. Препарат сердца мыши по методу Лангендорфа включает усовершенствование в виде небольшой модификации, позволяющей минимизировать потерю температуры перфузата и двигательные артефакты, не подавляя при этом сокращения мышц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с животными проводились в соответствии с Федеральными правилами содержания и использования лабораторных животных и были одобрены Комитетом по уходу за животными CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Мексика). В данном исследовании использовались самцы мышей линии C57BL/6J весом 28–34 g и возрастом 8–14 недель. Все материалы и оборудование, используемые в протоколе, перечислены в Таблице материалов. В Дополнительных файлах 1–11 представлены вспомогательные схемы, руководства по программному обеспечению, программы анализа, данные стимуляции и прикладные файлы для данного протокола.

1. Приготовление стоковых растворов

  1. Заранее приготовьте два основных раствора и храните их в холодильнике при 4 °C: (1) Раствор I, 1 L (в деионизированной воде; в г/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) и (2) Раствор II, 0,1 L (в деионизированной воде; в г/L: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы можно использовать в течение 30 дней после приготовления. Хранить при 4 °C.

2. Подключение и очистка системы Лангендорфа

  1. Подсоедините резервуар (1), термостат резервуара (2), перфузионный насос (3), змеевик (4), рециркулятор змеевика (5), систему мониторинга (6) и дренажную систему (8), как показано на Рисунке 1A.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соединение между системой мониторинга и дренажной системой более подробно показано в Дополнительном файле 1.
  2. Заполните систему Лангендорфа 1 L деионизированной воды при 50 °C, затем запустите перфузионный и дренажный насосы (Дополнительный файл 1, дренажная система). Примерно через 20–30 min слейте жидкость из системы, после чего перейдите к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в отсутствии утечек или падения давления в системе. Если это произойдет, не продолжайте эксперимент.
  3. Заполните систему 1 L 1% уксусной кислоты (растворенной в деионизированной воде), выключите перфузионный и дренажный насосы и подождите 60 min, затем включите насосы, чтобы удалить жидкость.
  4. Повторите шаг 2.2 дважды.
  5. Заполните систему 70% этанолом (растворенным в деионизированной воде), чтобы предотвратить адгезию компонентов раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионную систему Лангендорфа необходимо очищать каждые десять экспериментов или ежемесячно. Протокол очистки перед экспериментом описан в разделе 4, а протокол очистки после эксперимента подробно изложен в разделе 8.

3. Приготовление раствора Тайрода во время эксперимента

  1. Приготовьте 1 L раствора со следующим составом (в мМ): 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-глюкозы, 10 HEPES; доведите pH до 7,35 ± 0,05 с помощью NaOH.
    1. Смешайте 100 mL Стока I с 700 mL деионизированной воды при постоянном перемешивании, затем нагрейте раствор до 37 °C; обеспечьте оксигенацию раствора, подключив баллон с O2 к аэратору, как показано на Рисунке 1A (1).
    2. Добавьте 3,6 mL Стока II и 96,4 mL деионизированной воды для получения концентрации 1,8 mM CaCl2(2H2O), затем добавьте NaOH для доведения pH до 7,35 ± 0,05.
    3. Доведите объем деионизированной водой до 1 L для получения раствора Тайрода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сохранить 100 mL раствора в холодильнике при 4 °C; этот объем потребуется позже на этапе 6.

4. Подготовка системы Лангендорфа

ПРИМЕЧАНИЕ: Если в день проведения эксперимента система Лангендорфа не заполнена этанолом, приступать к процедуре не рекомендуется; вместо этого повторите раздел 2.

  1. Включите перфузионный и дренажный насосы. Установите скорость потока перфузионного насоса на 3 mL/min, а дренажного — на 10 mL/min. Осушите систему.
  2. Заполните систему 1 L деионизированной воды при 37 °C, затем слейте воду.
  3. Заполните систему раствором Тайрода, приготовленным на этапе 3, и поддерживайте раствор при физиологической температуре и постоянной оксигенации.
  4. Включите термостаты резервуара и серпентинный рециркулятор. Установите температуру резервуара (Рисунок 1A (2)) на 38 °C для поддержания раствора в физиологических условиях. Установите температуру серпентина (Рисунок 1A (5)) на 40 °C. Это компенсирует потерю температуры раствора в системе Лангендорфа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если температура раствора Тайрода на выходе из системы не является физиологической (37 ± 0.5 °C), отрегулируйте температуру серпентинного рециркулятора. Не рекомендуется переходить к этапу 6 до тех пор, пока температура не стабилизируется на соответствующем значении.
  5. Включите монитор давления (Дополнительный файл 1, система мониторинга) и откалибруйте его в диапазоне 0–200 mmHg. Для калибровки системы можно использовать приложение для мониторинга и стимуляции (Дополнительный файл 3 и Дополнительный файл 11).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо убедиться в отсутствии потерь давления и пузырьков воздуха в системе. Если в системе присутствуют пузырьки, временно перекройте нижний выход серпентина и откройте верхний клапан; это приведет к заполнению колонки, что позволит пузырькам выйти наружу. Не рекомендуется продолжать эксперимент до подтверждения выполнения этого условия.

5. Оптическая система14

  1. Соберите КМОП-камеру (Рисунок 1A, 10), регулируемый объектив камеры (LC) и систему освещения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система освещения состоит из двух светодиодов (Рисунок 1A, 9), две плоско-выпуклые линзы освещения (LI), блок управления освещением (Рисунок 1A, 11), карту сбора данных (Дополнительный файл 1, систему мониторинга), а также спроектированные с помощью 3D-моделирования опорные элементы (Дополнительный файл 1).
  2. Поместите контрольный объект объемом приблизительно 1000 мм³3 на расстоянии 100–200 мм от объектива камеры (центр Рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объект должен быть расположен в позиции сердца в системе Лангендорфа. Данное положение показано на Рисунок 1B, конкретно в центре изображения, в месте падения световых лучей.
  3. Запустите программное обеспечение для захвата изображений, затем установите в настройках камеры субдискретизацию 4x (4 пикселя = 1 субпиксель). Задайте область интереса (ROI) размером 200 x 200 субпикселей (Дополнительный файл 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При данной конфигурации возможно достижение временного разрешения 750 кадров в секунду (к/с).
  4. Включите систему освещения (Дополнительный файл 1), отрегулируйте световые лучи так, чтобы они были сфокусированы на контрольном объекте, и обеспечьте однородность освещения (Рисунок 1B).
  5. Отрегулируйте интенсивность освещения контрольного объекта, чтобы избежать переэкспонирования изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение должно выглядеть следующим образом Рисунок 2A (или Рисунок 1C, ПК-контроллер). Блики на поверхности объекта (сердца) должны быть максимально минимизированы без потери четкости его контура. Этого можно добиться путем регулировки мощности освещения или сокращения времени экспозиции в настройках камеры.
  6. Сфокусируйте объектив камеры так, чтобы получить четкое изображение контрольного объекта (Рисунок 1C, управляющий ПК). Убедитесь, что эталонный объект занимает 80% поля зрения (Рисунок 2A) для получения шкалы пересчета приблизительно 61 µm на субпиксель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая система автоматически активирует систему освещения, когда камера переведена в режим получения изображения (Рисунок 1A и Дополнительный файл 2). Рекомендуется переводить камеру в режим ожидания, чтобы система освещения оставалась выключенной и активировалась только в периоды сбора экспериментальных данных во избежание перегрева.

6. Хирургические процедуры и канюляция

  1. Гепаринизация и анестезия
    1. Приготовьте анестезирующую смесь, содержащую тилетамин-золазепам (40 mg/kg массы тела мыши) и ксилазин (10 mg/kg массы тела мыши), затем разведите ее физиологическим раствором до объема 200 µL.
    2. Введите анестезирующую смесь внутрибрюшинно, используя иглу 27 G. Дождитесь наступления глубокой анестезии у мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в отсутствии рефлекторного ответа на раздражение конечностей или хвоста (обычно достаточно 10 min).
    3. Введите 200 UI нефракционированного гепарина внутрибрюшинно с помощью иглы 27 G и подождите примерно 5 min перед продолжением эксперимента.
  2. Извлечение и каннюляция
    1. Положите мышь на спину, удалите шерсть и кожу в области грудной клетки с помощью хирургических ножниц.
    2. Сделайте разрез брюшной стенки ниже диафрагмы, стараясь сохранить ее целостность.
    3. Выполните поперечный разрез диафрагмы и быстро проведите двустороннюю восходящую торакотомию через ребра, затем удалите реберную стенку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить сердце. Если в ходе процедуры сердце было задето или повреждено, рекомендуется прекратить эксперимент.
    4. Аккуратно зажмите верхние структуры сердца с помощью тонкого пинцета: дугу аорты и прилегающие сосуды. Плавно приподнимите их, чтобы сделать разрез снизу вверх, и извлеките сердце и легкие вместе.
    5. Быстро перенесите сердце в чашку Петри, содержащую 50 mL раствора Тайрода при 4 °C, для первичной промывки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С момента разреза диафрагмы у животного начнется дыхательная недостаточность; с этого момента остается 60 s для выполнения этапов 6.2.3–6.2.6. Превышение этого временного лимита может вызвать ишемическое повреждение.
    6. С помощью стереоскопического микроскопа и тонких ножниц удалите легкие и излишки жировой ткани, чтобы обнажить дугу аорты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При очистке тканей следите за тем, чтобы не повредить дугу аорты. Если аорта будет перерезана ниже плечеголовной артерии, каннюляция будет затруднена, что может привести к утечкам под давлением.
    7. Перенесите сердце в специально изготовленное основание для каннюляции, содержащее 50 mL буфера Тайрода при 4 °C, и вставьте конец аорты в каннюлю, изготовленную из иглы 20 G (Supplementary File 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить аортальный клапан. При повреждении клапана сердце отекает, и коронарная циркуляция не будет осуществляться должным образом.
    8. Завяжите два узла каннюляции, используя шелковый шовный материал 4/0: первый — в углублении дистальнее кончика каннюли, второй — перед плечеголовным стволом (Supplementary File 1).
    9. Медленно введите раствор Тайрода с помощью шприца объемом 1 mL, заполненного буфером комнатной температуры. Убедитесь, что ткани коронарного русла просветлились, что подтверждает правильность каннюляции.
    10. Удалите жировую ткань, чтобы обеспечить доступ к желудочкам и предсердиям.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время каннюляции не должно превышать 5 min для сохранения жизнеспособности сердца.
    11. Перенесите сердце в систему Лангенордфа и дайте ему стабилизироваться в течение 30 min.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце помещают в центр системы (Figure 1A,B), подвешивая его вертикально. При подвешивании сердца будьте предельно осторожны, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха. В случае их появления давление поднимется выше 140 mmHg, сердце начнет отекать и станет нежизнеспособным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка по Лангенордфу считается завершенной, когда сердце демонстрирует механически стабильный ответ, естественную частоту колебаний примерно 360 ударов в минуту (BPM) и перфузионное давление от 60 до 110 mmHg.

7. Протокол задания темпа и видеозапись

  1. Жизнеспособность сердца
    1. Убедитесь, что коронарное давление находится в диапазоне 60–110 mmHg при использовании перфузионного насоса с потоком 3 mL/min. Если давление коронарной перфузии упадет ниже 60 mmHg, немного увеличьте скорость потока насоса (низкое давление приведет к тому, что сердце станет бледным и дряблым). Напротив, если давление превысит 110 mmHg, немного уменьшите скорость потока насоса (избыточное давление вызовет отек тканей и прогрессирующий рост давления до наступления остановки сердца).}
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное поддержание перфузионного давления вне вышеупомянутого оптимального диапазона приведет к необратимому нарушению жизнеспособности сердца.
    2. Расположите сердце фронтально так, чтобы в камере был получен полный фронтальный вид. Отрегулируйте положение так, чтобы в поле зрения камеры были видны оба предсердия (Рисунок 2A).
    3. Осторожно поместите платиновые электроды поверхностно на верхнюю часть правого предсердия в области узла синоатриального водителя ритма. Используйте изображение с камеры в качестве ориентира, чтобы ввести электроды в поле зрения. Расположите электрод так, чтобы он не перекрывал правое предсердие. Наблюдая за изображением с камеры в реальном времени, медленно продвигайте электрод до контакта с тканью предсердия, стараясь не оказывать избыточного давления (которое привело бы к сплющиванию правого предсердия на изображении).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном выполнении вид с камеры будет соответствовать Рисунку 2A.
    4. Запустите приложение для мониторинга и стимуляции (Дополнительный файл 11) и включите карту сбора данных (Рисунок 1A (6)). Установите значения параметров стимула: амплитуда 2 V, частота 420, 540 и 720 импульсов в минуту (PPM) с прямоугольным импульсом длительностью 7 ms (вставка на Рисунке 2A).
    5. Проведите стимуляцию для проверки жизнеспособности, начиная с самой низкой частоты, используя длительность стимуляции 20 s с последующим периодом восстановления (временем покоя) 20 s между событиями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените жизнеспособность сердца с помощью мониторинга через камеру. Если орган физиологически функционален, будет наблюдаться синхронизация между приложенным стимулом и сердечным ответом, сопровождаемая надлежащей координацией между камерами сердца. Напротив, отсутствие жизнеспособности будет проявляться потерей координации камер или исключительно наличием изолированных сокращений предсердий.
    6. Закройте дверцу камеры, так как эксперимент чувствителен к комнатном освещению и температурным колебаниям (Рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дверца камеры должна оставаться закрытой в течение всего времени проведения эксперимента. Контролируйте жизнеспособность сердца с помощью камеры и измерения перфузионного давления.
  2. Регистрация данных
    1. Примените протокол стимуляции, который состоит из последовательностей прямоугольных импульсов длительностью 30 s, за которыми следует 30 s без сигнала. Установите значения параметров стимула для каждой серии стимуляции: амплитуда 2 V, длительность импульса 7 ms и частота в диапазоне от 360 до 720 PPM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол стимуляции начинается с 360 PPM и увеличивается на 60 PPM в каждой временной точке (вставка на Рисунке 2A).
    2. Непрерывно записывайте видео динамики фронтального вида сердца в формате .avi с помощью программного обеспечения для захвата изображения с камеры (Дополнительный файл 2). Сделайте видеозапись длительностью 20 s для каждой серии стимуляции. Записывайте 20-секундный сегмент, начиная через 5 s после начала стимуляции. Репрезентативная необработанная запись представлена в Дополнительном видео 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютер одновременно записывает примененную серию стимуляции (.xls, Дополнительный файл 9) к каждому записанному видео (.avi), генерируемых приложением для мониторинга и стимуляции и программным обеспечением для захвата изображения с камеры соответственно (Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3).
    3. Подтвердите жизнеспособность сердца, сравнив первое видео, записанное до начала протокола стимуляции, со вторым видео, записанным после применения протокола (Рисунок 2B).

8. Очистка системы перфузии Лангендорфа после завершения эксперимента

  1. Извлеките стимулятор и платиновые электроды ЭКГ. Извлеките сердце из системы и слейте все остатки раствора Тайрода.
  2. Выключите оптическую систему и закройте клапан O2.
  3. Промойте систему 1 L деионизированной воды при 37 °C и слейте жидкость из системы.
  4. Повторите шаги 2.4 и 2.5.
  5. Выключите все системы и оборудование.

9. Обработка видео

  1. Начните с импорта каждого видео в расчетное программное обеспечение и применения функции нормализации видео15.
  2. Выберите область интереса (ROI), включающую область сердца. Выполните сегментацию изображения для удаления фонового шума, электродов и канюли (Дополнительный файл 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по правильному выбору области изображения для удаления приведены в Дополнительном файле 10.
  3. Проведите анализ глобальной механической динамики (Дополнительный файл 5). Примеры вариабельности и сигналов приведены на Дополнительном рисунке S1, Дополнительном рисунке S2 и Дополнительном рисунке S3.
    1. Примените морфологические операторы к каждому кадру видео для обнаружения периметра сердца, затем примените алгоритм заполнения кадра для генерации маски15.
    2. Подсчитайте количество пикселей в сегментированной области в каждом кадре, затем нормализуйте это значение по общему количеству пикселей в изображении для получения динамического сигнала (вставка на Рисунке 2B и Дополнительном рисунке S3).
    3. Примените к полученному сигналу двунаправленный фильтр Баттерворта 5-го порядка в диапазоне от 3 до 100 Hz для подавления высокочастотного шума и артефактов капельного перфузионного полива15.
    4. Нормализуйте сигналы во всех видео, используя записанные максимальные и минимальные значения.
    5. Определите частоту сердечных сокращений, рассчитав интервал между двумя значениями максимальной амплитуды (IAA (s)) для каждого динамического и стимульного сигнала.
    6. Рассчитайте частоту в BPM по следующей формуле:
      Уравнение для расчета частоты, показывающее, что частота сердечных сокращений в BPM равна 60, деленному на IAA.
    7. Постройте карты Пуанкаре на основе данных IAA для иллюстрации вариабельности за короткие и длительные периоды16,17,18 (Дополнительный рисунок S1 и Дополнительный рисунок S2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию см. в Дополнительном файле 10.
  4. Проведите сегментарный анализ механической динамики желудочков (Дополнительный файл 6).
    1. Выполните бинаризацию изображения. Используйте морфологические операторы для разграничения области желудочков, приведя её к эллиптической геометрии без ущерба для ROI15.
    2. Впишите минимальный эллипс в область желудочков в каждом кадре. Извлеките координаты набора дистальных точек в кадре. Используйте набор из 10–20 точек в каждом экстремуме вдоль оси Y (Рисунок 3A). Репрезентативный результат оценки эллипса представлен в Дополнительном видео 2.
    3. Рассчитайте укорочение желудочков как среднее расстояние между экстремальными точками вдоль оси Y в каждом видео19.
    4. Примените к полученному сигналу двунаправленный фильтр Баттерворта 5-го порядка в диапазоне от 3 до 100 Hz для подавления высокочастотного шума и артефактов капельного перфузионного полива15.
    5. Нормализуйте сигнал укорочения желудочков относительно всех видео, полученных для каждого режима стимуляции, и рассчитайте частоту сердечных сокращений и задержку, как в этапах 9.3.5–9.3.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получены такие параметры, как длительность желудочкового цикла (DVE), длительность релаксации (DVW), межжелудочковый интервал (IVV) и амплитуда сокращения желудочков (VA) (Рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию см. в Дополнительном файле 10.
  5. Проведите сегментарный анализ механической динамики предсердий (Дополнительный файл 7).
    1. Используйте две области ROI для разграничения предсердий (Рисунок 3C).
    2. Анализируйте каждое предсердие индивидуально.
      1. Используйте морфологические операторы для очерчивания предсердий, корректируя их без ущерба для ROI15. Используйте алгоритм повышения контрастности для очерчивания каждого предсердия20,21.
      2. Выполните бинаризацию изображения и количественно определите число пикселей, отличных от нуля, в каждом кадре, чтобы получить динамический сигнал предсердий.
      3. Примените к полученным сигналам двунаправленный фильтр Баттерворта 5-го порядка в диапазоне от 3 до 100 Hz для подавления высокочастотного шума и артефактов капельного перфузионного полива15.
      4. Рассчитайте среднее значение двух сигналов предсердий (Рисунок 3D).
    3. Нормализуйте сигнал укорочения предсердий относительно всех видео, полученных для каждого режима стимуляции, и рассчитайте частоту сердечных сокращений и задержку, как в этапах 9.3.5–9.3.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получены такие параметры, как длительность предсердного цикла (DAE), межпредсердный интервал (IAT) и амплитуда сокращения предсердий (AA) (Рисунок 3D). Более подробную информацию см. в Дополнительном файле 10.
  6. Проведите электромеханический анализ13,22 (Дополнительный файл 8).
    1. Сравните данные стимуляции с сигналами предсердий и желудочков (Рисунок 3D).
    2. Рассчитайте время распространения импульса в проводящей системе сердца, определив задержку между событиями в предсердиях и желудочках (AVD), приняв приложенный стимул за точку отсчета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эксперименты по изучению механической функции сердца проводятся с использованием аппарата Лангендорфа, как показано на рисунке 1A (вверху). Системы мониторинга и оптики позволяют осуществлять видеозапись при срабатывании управления освещением, как показано на рисунке 1A (внизу). На рисунке 1C представлен внешний вид термостатического шкафа, предназначенного для изоляции сердца от внешних температурн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сердце мыши очень чувствительно к температурным колебаниям2,9,10,11,22. В данном эксперименте перфузируемое сердце располагали вертикально. Мы внесли небольшое изменение в метод перфузии по Лангендорфу, чтобы минимизировать потерю температуры перфузата и артефакты движения. В змеевик был добавлен рециркуляционный насос для поддержания температуры перфузата на ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана грантом Секретариата по науке, гуманитарным наукам, технологиям и инновациям (SECIHTI) № LN-2025-C-23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц 1 mLBD Plastipak302485Хирургическая процедура
Игла 20 GNIPROAH-2032Аортальная канюля
Регулируемая линза 25 mm с увеличением 8x-100xGenericN/AОбъектив камеры оптической системы; упоминается как регулируемый объектив камеры
Игла 27 GBD PrecisionGlide302358Хирургическая процедура
Опорные детали, разработанные в 3DCINVESTAVN/AСпециально разработанные 3D-опорные детали
Шелковая шовная нить 4-0AMERICAN SUTURETGSN0901Аортальная канюля
Блок питания 40-ASTERENPRL-25Блок питания для светодиодов
Аэрационный каменьN/AN/AОксигенация раствора Тайрода
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306Раствор Тайрода
D-глюкозаJ.T. Baker1916-01Раствор Тайрода
Дренажный насосCINVESTAVN/AСпециальный дренажный насос; упоминается как дренажный насос
Плоско-выпуклая линза F = 25.4 mmTHORLABSLA1951-AЛинза освещения оптической системы; упоминается как плоско-выпуклая линза освещения
Ледяная уксусная кислотаSigma-Aldrich695092Очистка системы Лангендорфа
ГепаринPiSA060M91Антикоагулянт
HEPESSigma-AldrichH3375Раствор Тайрода
Мощные светодиодыLuminiusCBT-90-G-L11-C12Светодиодный источник света
Система освещенияCINVESTAVN/AСпециальная система освещения; упоминается как система освещения
KClCTR SCIENTIFICCTR02196Раствор Тайрода
Программное обеспечение LabVIEW версия 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/AПО для работы приложения мониторинга и стимуляции; упоминается как приложение для мониторинга и стимуляции
Программное обеспечение MATLABThe MathWorksN/AВычислительное ПО для программ нормализации, сегментации и анализа видео; упоминается как вычислительное ПО
Медицинский кислородGRUPO INFRAN/AОксигенация раствора Тайрода
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104Раствор Тайрода
Мини-насос с переменным потокомCONTROL COMPANY3385Перфузионный насос
Хирургический набор для мышейKent ScientificINSMOUSEKITХирургическая процедура
NaClSigma-AldrichS5886Раствор Тайрода
NaH2PO4DEQDEQF290400250Раствор Тайрода
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108Регулировка pH
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01Карта сбора данных
Платиновые электроды, диам. 0.25 mmSigma-Aldrich349402Электроды для электрической стимуляции
Блок питания (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30AБлок питания рециркулятора
Монитор давленияCINVESTAVN/AСпециальный монитор давления; упоминается как монитор давления
Датчик давленияLA BOUVETB17295Монитор давления системы Лангендорфа
Чистый этиловый спиртSigma-Aldrich493511Этанол для очистки системы
Рециркуляционный термостат (LXC)PolyScienceL113A0412Рециркулятор резервуара
ФизрастворPiSA1118480.9% раствор хлорида натрия (NaCl)
Змеевиковый термостатCINVESTAVN/AСпециальный змеевиковый рециркулятор/термостат
СтереомикроскопN/AN/AХирургическая процедура
Освещение стереомикроскопаN/AN/AХирургическая процедура
Программное обеспечение uEye CockpitIDS Imaging Development System GmBHN/AПО для захвата изображений с камеры; упоминается как ПО для захвата изображений с камеры
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624Высокоскоростная CMOS-камера; упоминается как CMOS-камера
КсилазинPiSA4001211Анестетик
Zoletil 100Virbac83048907Тилетамин-золепаземовый анестетик; упоминается как смесь анестетиков

Ссылки

  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сердце в перфузионной системе Лангендорфамодель сердца мышиоптическая оценкасократимость предсердийсократимость желудочковизмерение частоты сердечных сокращенийвизуализация высокого разрешенияукорочение желудочковдинамика предсердиймеханика сердца

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.