Исследовательская статья
Используя биоинформатику, машинное обучение и qPCR-валидацию, в этом исследовании были выявлены пять кандидатных биомаркеров, связанных с SUMOилированием и дисфункцией митохондрий при сердечной недостаточности. Эти результаты улучшают понимание механизмов сердечной недостаточности и указывают на возможные направления для будущих диагностических исследований.
Сердечная недостаточность (ГФ) представляет собой устойчивую клиническую проблему. Хотя SUMOилирование и функция митохондрий жизненно важны для здоровья кардиомиоцитов, их совокупное влияние на ВЧ остаётся недостижимым. Два набора данных, связанных с HF, были загружены из GEO. Перекрывающиеся гены были получены из всех генов тренировочного набора — генов, связанных с SUMO, и генов, связанных с митохондриями. Для выявления диагностических ключевых генов применялись три алгоритма машинного обучения. Впоследствии были построены и оценены диагностические модели на основе этих генов. Кроме того, иммунная микросреда у HF и здоровых контролей оценивалась с помощью CIBERSORT, MCP-counter и ssGSEA. Были проанализированы различия в иммунной инфильтрации между HF и здоровыми контролями. Были проведены прогнозирование препаратов и молекулярное докингование для выявления потенциальных кандидатов, нацеленных на эти гены. Наконец, qPCR была использована для валидации уровней экспрессии генов в клинических образцах. Было выявлено всего 113 распространённых генов с заметным обогащением в регуляции митохондрий. Пять ключевых генов, а именно NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 и FKBP4, были идентифицированы тремя алгоритмами машинного обучения. Функциональные анализы связали эти гены с иммунным ответом, обработкой РНК и регуляцией клеточного цикла. Кроме того, профилирование иммунной инфильтрации показало, что инфильтрация нейтрофилов способствует нарушению иммунных ответов в HF. Молекулярное докирование показало, что маломолекулярный препарат IMX-942 обладает благоприятной связывающей аффинностью со SQSTM1 (-5,8 ккал/моль). qPCR-валидация поддержала результаты биоинформатики. NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 и FKBP4 были идентифицированы как ключевые гены, связывающие SUMOилирование и функцию митохондрий в HF. Эти результаты дают новые знания о патофизиологии ВЧ и могут способствовать разработке новых диагностических и терапевтических стратегий.
Сердечная недостаточность (СН), терминальная стадия различных сердечно-сосудистых заболеваний, характеризуется нарушением сердечной функции, которая не удовлетворяет метаболические потребностиорганизма 1. Это изнуряющее состояние представляет серьёзную угрозу для здоровья пациентов, приводя к снижению качества жизни и повышенному уровнюсмертности 2. Современные диагностические методы для ВЧ в основном включают обнаружение биохимическихмаркеров 3,4, эхокардиографию и радиологическуювизуализацию 5. Хотя доступные методы лечения включают фармакологические препараты, вмешательства на основе приборов и хирургические процедуры, клинические результаты остаютсянеудовлетворительными 6. Ограничения, такие как побочные реакции на лекарства, ограниченная применимость устройств, иммунное отторжение и другие осложнения, часто препятствуют терапевтическойэффективности 7,8,9,10,11. Поэтому существует острая необходимость прояснить основные механизмы ГФ, выявить ранние и точные диагностические биомаркеры и разработать более эффективные и безопасные терапевтические стратегии.
Малые убиквитин-модификаторы (SUMO) ковалентно конъюгируются с лизиновыми остатками субстратных белков динамическим и обратимым процессом, регулируя структуру и функцию субстратныхбелков 12. Сумоилирование, критическая посттрансляционная модификация, служит ключевым регулятором различных клеточныхпроцессов 13,14. Митохондрии, как энергетический и метаболический центр клеток, критически участвуют в патогенезе HF. В патологическом процессе HF значительно способствует прогрессии митохондрийдисфункция АТФ, взрыв реактивных форм кислорода (ROS) и дисбаланс гомеостаза Ca2+. Примечательно, что новые данные указывают на возможное взаимодействие между SUMOilation и функцией митохондрий. Митохондриальный стресс может запускать пути, связанные с SUMOилированием, тогда как белки SUMO и их специфические протеазы необходимы для поддержания митохондриальногогомеостаза 19,20,21. Недавние исследования дополнительно подчеркнули важность контроля качества митохондрий и динамики митохондрий при сердечно-сосудистых заболеваниях и прогрессированииHF 22,23. Однако синергетический эффект SUMOилирования и регуляции митохондрий на развитие HF остаётся неясным, особенно на генном уровне.
В этом исследовании мы систематически изучали гены на пересечении SUMOilation и митохондриальной дисфункции в HF — двух ключевых биологических процессах, которые индивидуально зачастаны в HF, но пока не интегрированы в полной степени. Перекрывающиеся гены были выявлены путём пересекающихся генов, связанных с HF, генов, связанных с SUMOilation, и генов, связанных с митохондриями. Ключевые гены затем были скринингованы с помощью алгоритмов машинного обучения и использованы для построения диагностической модели. Дополнительно были проведены анализы функционального обогащения и иммунной инфильтрации для изучения их потенциальных биологических ролей в ГФ. Этот интегрированный подход может обеспечить систематическую основу для изучения перекрёстного взаимодействия между SUMOilation и дисфункцией митохондрий при HF.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией, а протокол был утверждён Этическим комитетом Третьей больницы Хэбэйского медицинского университета (W2025-065-1) в ноябре 2024 года. Было получено информированное согласие от всех участников исследования.
Источник данных и предварительная обработка
Были получены данные РНК-секвенации, связанные с HF, включая два набора микрочипов из Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Были выбраны два периферических набора данных по микрочипу крови: GSE59867 (34 образца HF и 30 контрольных) использовался в качестве обучающего набора данных; GSE57338 (177 HF-образцов и 136 контрольных) использовался в качестве валидационного набора данных. Клиническая информация, доступная для GSE57338, включая возраст, пол и состояние заболевания, была получена из GEO и суммирована в дополнительной таблице 1. Кроме того, из базы данных dbPTM (https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php) (Дополнительная таблица 2) было получено всего 3 893 гена, связанных с SUMOilation (SRG), а также 2 030 генов, связанных с митохондриями (MRG), на основе предыдущегоисследования 24 (Дополнительная таблица 3). Далее пакет R GEOquery (v 2.72.0)25 использовался для загрузки наборов данных из базы данных GEO, извлечения матрицы выражений и получения образцовой информации о фенотипе. Аннотация выполнялась путём отображения файла аннотации и сопоставления идентификаторов генов. Недействительные идентификаторы генов были удалены, а наиболее выраженные зонды остались.
Ключевой отбор генов с помощью машинного обучения
Для отбора генов, связанных с HF, SUMOilation и митохондриями, использовался многоступенчатый подход. Во-первых, общие гены между обучающим набором данных, SRG и MRG были выявлены с помощью анализа пересечения. Потенциальная функция общих генов была определена с помощью анализа обогащения генов (Gene Ontology Ontology (GO) и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) с использованием пакета R ClusterProfiler (v 4.12.6)26. Затем были применены три подхода машинного обучения — регрессия LASSO, XGBoost и случайный лес (RF) — для дальнейшей фильтрации генов. В регрессии LASSO оптимальный параметр регуляризации λ выбирался с помощью перекрёстной валидации для выявления генетических признаков с наибольшей прогностической ценностью. Гены с ненулевой коэффициентом были отобраны для последующего анализа. Затем алгоритмы XGBoost и RF использовались для расчёта показателей важности признаков и скрининга топ-20 генов.
Построение и оценка диагностических моделей
Диагностическая модель была построена с использованием логистической регрессии на основе GSE59867 набора данных. Затем модель применялась для прогнозирования состояния заболевания и расчёта вероятностных оценок. Для проверки модели из GSE57338 набора данных извлекали те же ключевые гены, нормализовали для соответствия обучающему набору данных и использовали для внешнего прогнозирования. Производительность модели оценивалась с помощью кривых рабочей характеристики приёмника (ROC), матрицы путаницы, кривой калибровки и анализа кривой принятия решения (DCA).
Анализ обогащения множества генов (GSEA) и субклеточная локализация
Для выявления коррелированных генов каждого ключевого гена использовался корреляционный анализ Спирмана. Анализ GSEA проводился с использованием пакета R ClusterProfiler (версия 4.12.6) на родственных генах ключевых генов. Тем временем, чтобы определить точную субклеточную локализацию ключевых генов внутри клетки, их субклеточная локализация была определена с помощью базы данных GeneCards (https://www.genecards.org/).
Ассоциация ген-заболеваний и прогнозирование лекарств
Для оценки клинической значимости выявленных ключевых генов были проведены систематические анализы ассоциаций заболеваний и взаимодействия лекарств. Ассоциации заболеваний и генов были изучены с помощью Сравнительной токсикогеномной базы данных (CTD; https://ctdbase.org/), результаты ранжированы как по результатам вывода, так и по референсным количеству (в топ-10 зарегистрированных ассоциациях). Данные о взаимодействии генов и лекарственных средств для ключевых генов были получены из базы данных Drug-Gene Interaction (DGIdb), а лекарства исключались на основе оценки взаимодействия < 0,5. Впоследствии мы скачали 3D-структуры белков, соответствующих ключевым генам, из базы данных PDB (https://www.rcsb.org/) и молекулярные структуры потенциальных лекарств из PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Далее был проведён анализ молекулярного стыкинга с использованиемCB-Dock2 27 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php) для расчёта показателей связывания потенциальных препаратов и белков. Меньшая свободная энергия связывания указывает на более стабильное взаимодействие, что говорит о том, что соединение может иметь больший потенциал таргетинга.
Анализ иммунной инфильтрации
Инфильтрация иммунных клеток оценивалась с помощью трёх комплементарных методов: Microenvironment Cell Populations-counter (MCP-counter)28, идентификация типа клеток путём оценки относительных подмножеств РНК-транскриптов (CIBERSORT)29 и анализ обогащения с одним образцом (ssGSEA)30. Анализ MCP-счетчика и CIBERSORT проводился с использованием R-пакета IOBR (v 0.99.0)31. MCP-счетчик использовался для оценки численности иммунных и стромальных клеток, а CIBERSORT — для количественной оценки относительных пропорций 22 типов иммунных клеток. ssGSEA проводился с использованием пакета GSVA (v1.52.3)32 для оценки обогащения иммунных подтипов на уровне образца.
Построение конкурирующей регуляторной сети эндогенных РНК (цеРНК)
Для изучения потенциальных регуляторных ролей miRNA–lncРНК, связанных с ранее выявленными ключевыми генами, была создана регуляторная сеть ceRNA. Пакет R multiMiR (v 1.26.0)33 использовался для прогнозирования потенциальных взаимодействий микроРНК (miRNA)–mRNA для ключевых генов, интегрируя данные из PITA (https://omictools.com/pita-tool/) и базы данных miRDB (https://mirdb.org/). Были отобраны пары miRNA–mRNA с высокой уверенностью и стабильностью. Впоследствии взаимодействия lncRNA и miRNA были извлечены из базы данных StarBase (https://rnasysu.com/encori/) и отфильтрованы по взаимодействиям, поддерживаемым ≥ 10 экспериментами CLIP-seq, и классифицированы как lincRNA. Сеть ceRNA была построена путём интеграции взаимодействий lncRNA-miRNA-mRNA.
qPCR-валидация
Для подтверждения экспрессии ключевых генов были собраны образцы крови пациентов с HF и здоровых контрольных групп из клинической когорты (n = 6 на группу) в Третьей больнице Медицинского университета Хэбэя (W2025-065-1) по утверждённым протоколам и информированному согласию. Общая РНК была выделена с помощью реагента TRIzol в сочетании с хлороформом и изопропанолом. После извлечения РНК растворялась в воде, обработанной DEPC, а её концентрация и чистота оценивались с помощью спектрофотометра NanoDrop. Для транскрипционного анализа РНК была обратно транскрипирована в кДНК с помощью быстрой смеси синтеза кДНК первой цепи для RT (с использованием dsDNase). Впоследствии было проведено количественное ПЦР с использованием Fast Taq qPCR SYBR Green Mix. Конкретные последовательности грунтов подробно описаны в Таблице материалов. Относительные уровни экспрессии генов рассчитывались с помощью метода 2-ΔΔCT с соответствующей нормализацией.
Статистический анализ
Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения R и GraphPad Prism. Статистические сравнения между двумя независимыми группами проводились либо с помощью t-теста Студента, либо теста Mann-Whitney U, в зависимости от распределения данных. p-значение менее 0,05 считалось статистической значимостью.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Идентификация и функциональное обогащение пересекающихся генов
Для выявления генов, участвующих в SUMOилировании и функции митохондрий в HF, впервые был проведён контроль качества на обучающем наборе GSE59867 (Дополнительный рисунок 1A). Был проведён трёхсторонний анализ пересечения между всеми генами в учебном наборе, SRG и MRG, выявил 113 перекрывающихся генов (рисунок 1A). Для изучения потенциа...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
HF, прогрессирующая и терминальная стадия различных сердечно-сосудистых заболеваний, характеризуется высокосложными и многофакторными патофизиологическимимеханизмами 17,34. Хотя и SUMOilation, и митохондриальная дисфункция индивидуально связаны с HF, их потенциальные синергетические роли остаются недостаточно изученными, особенно на генном уровне. В настоящем исследовании мы выявили пять ключевых генов — NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQST...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта работа была поддержана Медицинским научно-исследовательским проектом Хэбэя (номер гранта: 20250084).
У авторов нет конфликта интересов, которые нужно объявлять.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Заменитель хлороформа | Servicebio | G3014-02 | qPCR реагент |
| Очищенная от DEPC вода | Biosharp | BL510A | qPCR реагент |
| Быстрый набор для синтеза первой цепи cDNA для обратной транскрипции (с dsDNase) | Albatross Biology | 500-101 | qPCR реагент |
| Fast Taq qPCR SYBR Green набор | Albatross Biology | 500-102 | qPCR реагент |
| Праймеры FKBP4 | Tsingke | N/A | Forward: 5’-GAAGGCGTGCTGAAGGTCAT-3’ Reverse: 5’-TGCCATCTAATAGCCAGCCAG-3’ |
| Изопропанол | Hushi | 80109218 | qPCR реагент |
| Праймеры MYEF2 | Tsingke | N/A | Forward: 5’-CAGCTCCAATGGCGTTAAAATG-3’ Reverse: 5’-TGGCCTTCTTACTTCCTGTAGAT-3’ |
| Спектрофотометр NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000C | qPCR реагент |
| Праймеры NFKB1 | Tsingke | N/A | Forward: 5’-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3’ Reverse: 5’-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’ |
| Праймеры NSUN2 | Tsingke | N/A | Forward: 5’-GAACTTGCCTGGCACACAAAT-3’ Reverse: 5’-TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA-3’ |
| Праймеры SQSTM1 | Tsingke | N/A | Forward: 5’-GCACCCCAATGTGATCTGC-3’ Reverse: 5’-CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG-3’ |
| TRIzol реагент | Vazyme | R401-01 | qPCR реагент |
| Праймеры β-актина | Tsingke | N/A | Forward: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’ Reverse: 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’ |
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение