Добровольный сбор образцов фекалий, совместимых с групповым содержанием, у мышей с использованием индивидуальной системы клеток

Краткое содержание

Этот протокол описывает индивидуальную систему клеток для добровольного, благоприятного, одновременного и индивидуального сбора образцов фекалий из мышей, содержащихся в группах.

Аннотация

Для надёжного измерения метаболитов кортикостерона в кале необходимы образцы фекалий, которые можно отнести к отдельным животным и собрать в определённое временное окно. Это сложно для групповых мышей, где объединённые образцы домашних клеток не позволяют индивидуальное распределение, а временное разделение может мешать благополучию животных и результатам исследования. Цель этого протокола — представить простую, недорогую систему клеток, позволяющую добровольно, одновременно и индивидуально собирать образцы фекалий из мышей, содержащихся в группе. Система состоит из проволочной поликарбонатной клетки, соединённой с тремя отдельными коробками для сбора. После привычки и тренировки мыши добровольно заходят в коробки, чтобы получить небольшую пищевую награду. Двери можно закрыть без преследования, обращения или принудительного перемещения. Фекальные гранулы собираются из каждой коробки отдельно, что позволяет назначить образцы отдельным животным при сохранении социального содержания вне периода отбора. Этот протокол поддерживает неинвазивный продольный отбор проб и подходит для изучения метаболитов кортикостерона или других биомаркеров калов. Конструкцию легко изготовить из стандартного материала клетки и акрилового стекла, она может быть разобрана для очистки и позволяет параллельно отбирать несколько клеток. Снижая нарушения, связанные с обращением, и улучшая стандартизацию окна отбора проб, метод обеспечивает практическое совершенствование эндокринного мониторинга у мышей, содержащихся в группах.

Введение

Одной из главных проблем при оценке концентрации кортикостерона в плазме является то, что сама процедура отбора проб может вызвать острое повышение уровня кортикостерона, тем самым запутывая измерение и потенциально влияя на интерпретацию результатов^{исследования 1,2,3}. Измерение каловых метаболитов кортикостерона (FCM) является неинвазивной альтернативой, поскольку концентрации FCM отражают циркулирующие уровни глюкокортикоидов за несколько часов до отбора пробы, в зависимости от вида, штамма, пола и времени прохождения^{кишечника 4,5}. Однако надёжный анализ FCM у мышей, содержащихся в групповых помещениях, остаётся сложным. Объединённые образцы фекалий, собранные в домашней клетке, не могут быть отнесены к отдельным животным и могут демонстрировать высокую вариабельность из-за межиндивидуальных различий в секреции глюкокортикоидов и неопределённости точного окна отбора проб. Длительное разделение животных может мешать целям исследования, тогда как краткосрочное разделение для индивидуального сбора образцов требует трудоёмки, ограничивает пропускную способность и может вызвать^{стресс 2}.

Для возможности индивидуального сбора образцов фекалий из групповых мышей с минимальным обращением была разработана специально изготовленная клетка для сбора фекалий (рисунок 1A-E). Конструкция была адаптирована из ранее описанной клетки для сбора фекалий для колючих^{мышей 6} и модифицирована для использования с лабораторными мышами. Система состоит из стандартной поликарбонатной клетки типа III, соединённой с тремя отдельными коробками, к которым животные могут добровольно подойти и закрыть с помощью раздвижных дверей. Такая схема позволяет собирать образцы фекалий с отдельных мышей без прямого обращения в период отбора проб и одновременно отбирать образцы нескольких животных. Таким образом, клетка обеспечивает практический подход к неинвазивному, индивидуально приписываемому ФКМ-образу у мышей, содержащихся в группе.

Следующий протокол описывает систему отбора образцов фекалий, которая позволяет собирать и идентифицировать образцы фекалий отдельных мышей при сохранении среды группового содержания, используя специально изготовленные клетки для бесконтактного отбора образцов фекалий.

Протокол

Перед проведением исследования был проконсультирован ответственный комитет по этике животных Медицинского университета Вены, который сообщил, что формальная лицензия на проведение экспериментов на животных не требуется; Поэтому одобрения или номер протокола отсутствуют. В исследовании использовались только устоявшиеся практики разведения и выращивания, а также неинвазивный сбор образцов фекалий. Инвазивные процедуры не проводились. В соответствии с Директивой 2010/63/EU, ожидаемая нагрузка на животных была оценена как ниже порога боли, страданий, страданий или длительного вреда, эквивалентного или выше, чем та, что вызвана введением иглы в соответствии с надлежащей ветеринарной практикой. Все животные содержались и содержались в соответствии с институциональными стандартами благополучия животных.

1. Строительство клеток (см. список материалов)

1. Вырежьте детали 1-4 из 5 мм плексигласа/акрила по шаблонам, показаным на рисунке 2A-C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблоны с точными размерами могут быть напечатаны в формате DIN A3 (Дополнительный рисунок 1 и Дополнительный рисунок 2).
2. Отрежьте дно поликарбонатной клетки типа II (PTII), как показано на рисунке 2D. Эта часть позже станет верхней крышкой коробок для сбора фекалий.
3. Просверлите отверстия и прорези в бывшем дне клетки PTII, как показано на рисунке 2D.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точные размеры приведены на дополнительном рисунке 3.
4. Просверлите отверстия в передней и короткой сторонах клетки PTIII, как показано на рисунке 2E.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точные размеры приведены на дополнительной рисунке 4.
5. Используйте часть 2 как шаблон, чтобы отметить соответствующие отверстия для сверления на короткой стороне клетки PTIII и на длинной стороне клетки PTII.
6. Просверлите отмеченные отверстия и прикрепите клетку PTIII, каркас PTII и часть 2 с помощью резьбовых винтов, как показано на рисунке 2F.
7. Вставьте часть 1 как дно клетки PTII. Разместите части 4a и 4b так, чтобы они удерживали первую часть на месте, и разделите пробную клетку на отдельные коробки. Используйте пистолет для горячего клея, чтобы закрепить их на месте.
8. Вставьте нижние выступы частей 4a и 4b в прорези части 1. Эти выступы образуют ножки коробок для сбора.
9. Продвиньте верхние выступы частей 4a и 4b через верхнюю крышку, бывшую днище клетки PTII, чтобы удержать её на месте.
10. Протягивайте деревянные палочки или стержни через отверстия в выступах, используя один стержень сверху и два снизу, чтобы стабилизировать и закрепить конструкцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Деревянные материалы должны использоваться в виварии только если они одноразовые, так как они не подлежат чистке. Если это не так, следует использовать стержни другого состава.
11. Закройте оставшиеся зазоры или мелкие неточности с помощью пистолета для горячего клея. Используйте части 3a, 3b и 3c (рисунок 2B) как раздвижные двери между домашней клеткой и коробками для сбора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что для животных не остаются острые края, остатки клея или выступающие материалы. Компоненты из акрилового стекла/плексигласа, использованные в этом прототипе, не подходят для стерилизации паровым автоклавом. Поэтому, если система используется в SPF-объектах, требующих стерилизованного материала, связанного с клетками, следует либо использовать одобренную институционально неавтоклавную процедуру дезинфекции, либо акриловые компоненты заменить на автоклаварный материал при сохранении тех же размеров.

2. Подготовка и содержание животных

1. Получите необходимое количество мышей соответствующего штамма для исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные данные были получены от 30 восьминедельных мышей C57BL/6J, включая 20 самок и 10 самцов. Мыши были свободны от специфических патогенов по стандартам FELASA и были получены в Charles River Laboratories, Зульцфельд, Германия.
2. Домашние животные в обычных условиях в адаптированных поликарбонатных клетках типа III, максимум три взрослых мыши в каждой клетке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования отдельные самцы содержались в стандартных поликарбонатных клетках типа II.
3. Поддерживайте относительную влажность в комнате для животных при 22 ± 2 °C и влажности 55 ± 10% в рамках 12-часового цикла свет/темнота с включением света в 6:00 утра.
4. Обеспечьте стандартную поддерживающую диету и воду ad libitum.
5. Добавьте постельное бельё из осины, бумажный туалетный рулон, красный прозрачный пластиковый домик и бумажные полотенца в качестве материала для гнездования в каждую клетку.
6. Идентифицируйте мышей в первую очередь по естественным отметинам на хвосте. Временно наносите отметки на животных с похожими отметинами на хвосте во время взвешивания, если это необходимо.

3. Привыкание и дрессировка животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Готовая клетка состоит из домашней клетки PTIII, соединённой с отбором проб с тремя отдельными коробками для сбора проб, PTII. Домашние клетки могут использоваться как обычные: с подстилкой, обогащением клетки, проволочной крышкой без внешних крепежей, а также с питанием и водой. Систему можно разобрать для стирки, и она может использоваться только в течение недель отбора проб. В течение недель без отбора проб животных можно содержать в стандартных клетках PTIII.

1. Поместите животных в систему клеток как минимум за две недели до первой запланированной пробной сессии.
2. Привыкните животных к коробкам для сбора, убрав раздвижные двери на одну ночь, чтобы они могли свободно исследовать коробки.
3. Проведите три тренировки перед первой сессией отбора проб. Проводить тренировки при тех же условиях освещения и в то же время суток, планируя последующий отбор проб, желательно при красном свете вскоре после начала тёмной фазы.
4. Нанесите небольшое количество бонуса, например фундуковый крем, арахисовое масло, солодовую пасту или подобную вкусную пищу, на стену напротив входа в каждый ящик для сбора.
5. В первый день тренировки оставьте двери открытыми и позвольте животным самостоятельно открыть и съесть награду.
6. Во второй день тренировки дождитесь, пока животное зайдёт в коробку и не начнёт лизать награду. Аккуратно закройте раздвижную дверь за животным и отпустите её через 10 минут.
7. В третий день обучения повторяйте процедуру и постепенно увеличивайте время пребывания животных в контейнерах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тренировки должны быть спокойными и последовательными. Избегайте погони за животными в коробки, так как это может увеличить стресс и уменьшить добровольное участие в последующих сессиях проб.

4. Сбор образцов фекалий

1. Время сбора образцов
   1. Планируйте время отбора проб в зависимости от биологического вопроса и ожидаемой задержки между выделением кортикостерона из плазмы и фекального кортикостерона. У мышей метаболиты фекального кортикостерона обычно отражают циркулирующие уровни глюкокортикоидов примерно за 8–10 часов до отбора пробы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если точный срок критически важен, проведите пилотное исследование для определения времени выделения FCM в конкретном штамме, полу и используемых экспериментальных условиях. Этот пилот можно совмещать с тренировками.
   2. Планируйте отбор проб в период высокого выброса кал. Выборка обычно наиболее эффективна в начале тёмной и активной фазы.
   3. Проводите все сеансы отбора проб в одно и то же время суток на протяжении всего исследования, чтобы уменьшить вариации, вызванные суточным ритмом уровней FCM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, события, происходящие утром около 10:00, хорошо отражаются при запланировании проб между 18:00 и 20:00, в зависимости от светового графика в комнате для животных.
2. Процедура отбора проб и практические советы
   1. Отмечайте животных индивидуально, прежде чем пробовать. Используйте отметки на ушах или отдельные отметки на хвосте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отметки на носках и цветовые коды внутри коробок могут быть трудноразличимы при красном свете.
   2. Подготовьте коробки для сбора во время фазы освещения, нанеся награду на заднюю стенку каждой коробки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка коробок в течение дня улучшает видимость для экспериментатора и позволяет животным почувствовать запах награды перед пробой.
   3. В запланированное время отбора проб откройте коробки для сбора и дождитесь, пока животные войдут добровольно.
   4. Когда мышь вошла в коробку для сбора, аккуратно закройте раздвижную дверь за ней.
   5. После того как все животные попадут в коробку, запишите личность и положение каждой мыши в подготовленный лист выборки.
   6. Если за одну сессию отобрано более 10 клеток, привлекайте второго экспериментатора для поддержки идентификации животных, обращения с дверями и документации.
   7. Храните животных в коробках для сбора в течение запланированного периода отбора проб, обычно от 30 минут до 2 часов, в зависимости от ожидаемого количества фекалий и дизайна исследования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исключать образцы, если индивидуальность не может быть определена с уверенностью, если фекальные гранулы загрязнены мочой, подстилкой или фекалиями другого животного, если длительность отбора пробы существенно отклоняется от запланированного временного окна или если количество фекального материала недостаточно для анализа FCM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 50 мг — наш стандартный протокол, и это количество использовалось во всех валидациях и всех других статьях^{5, 7 и 8}. Обычно его легко получить.
   8. В конце периода отбора проб откройте раздвижные двери и позвольте мышам вернуться в домашнюю клетку.
   9. Закройте ящики сразу после ухода мышей, чтобы предотвратить повторное проникновение и перекрёстное загрязнение образцов.
   10. Удалите фекальные гранулы из каждой коробки с помощью длинных щипцов и переместите их в индивидуально маркированные трубки.
   11. Храните образцы при -20 °C до дальнейшей подготовки анализа FCM.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если коробки надёжно закрыты и не могут быть возвращены мышами, сбор фекальных гранул можно отложить до следующей световой фазы. Однако это следует делать последовательно в рамках исследования.
   12. Держите животных в домашней клетке (PTIII) до следующей смены клетки. Затем их можно разобрать и постирать в обычной стиральной машине для клетки.

Результаты

Метаболиты кортикостерона в кале (FCM) были успешно количественно измерены из образцов, собранных в специально изготовленных клетках для отбора образцов фекалий в лонгитюдном исследовании, сравнивающем мышей с постоянной и периодической разведкой. Репрезентативный анализ FCM включал 30 животных: постоянно разведённую группу, n = 15 животных в 5 клетках; периодически разводимая группа n = 10 животных в 5 клетках, при этом 5 самцов содержатся в одиночном содержании, за исключением трёх случаев размножения, где их содержали вместе с самками. Образцы собирались в 19 раз в две недели в дни смены клетки, а также по выходным. Среднее время до входа большинства животных в коробку составляло 7,5 минуты (SD = 3,07), при этом большинство животных составляли в среднем 27,6 (SD = 1,44) мышей по 30 мышей. Все мыши вошли в коробку после среднего 11,69 минуты (SD = 3,29). Средняя продолжительность содержания у всех мышей составляла 24,56 мин (SD = 15,51), а время от входа первой мыши в коробку до начала выпуска составляло 43,14 мин (SD = 8,51). Средняя продолжительность выпуска составляла 14,86 мин (SD = 22,82), а средняя продолжительность всей процедуры — 68,00 мин (SD = 11,87). Из 19 проб (3 пробных + 16 обычных), ожидая 480 образцов, два образца отсутствовали, потому что мыши не испражнялись во время содержания, три образца не удалось собрать, потому что мыши были либо сильно беременны, либо вскоре после рождения, а 5 мышам требовалась мягкая поддержка для входа. Средний вес образцов, взятых из первых трёх проб, составил 51,16 мг (SD = 25,39). Из всех собранных образцов (475) 473 удалось проанализировать и получить результаты.

Отдельные животные считались биологическими репликатами. Повторные образцы фекалий, собранные у одних и тех же животных в течение восьминедельного исследования, рассматривались как продольные повторные измерения, а не как независимые биологические реплики. Анализ проводился с использованием линейной модели смешанных эффектов с полом, группой размножения, днём отбора пробы и количеством мышей в клетке как фиксированными эффектами, а клетка — случайным перехватом. В модель были включены взаимодействия между полом, группой разведения и днём отбора проб. Количество мышей в клетке было включено как дополнительный фиксированный эффект, но не тестировалось с точки зрения взаимодействия, поскольку эта переменная частично сочеталась с экспериментальным дизайном, особенно у периодически разводившихся самцов.

Модель показала чёткое влияние пола на концентрацию ФКМ (рисунок 3A-D). У самок концентрация FCM выше, чем у самцов, в условиях размножения и в дни отбора проб, оценка = 28,30, SE = 2,58, t = 10,98, P < 0,0001. Пост-хок сравнения подтвердили эту половую разницу как внутри групп размножения, так и в оба дня отбора. У животных, выведенных на постоянной основе, у самок концентрация FCM выше, чем у самцов по воскресеньям — оценка = 53,41, SE = 8,28, P < 0,0001, а по средам оценка = 55,27, SE = 8,37, P < 0,0001. Такая же тенденция наблюдалась у животных с перерывами в воскресенье: оценка = 58,04, SE = 12,00, P < 0,0001, а по средам оценка = 59,68, SE = 9,88, P < 0,0001.

Модель также показала значительный основной эффект группы разведения: оценка = 11,59, SE = 4,65, t = 2,49, P = 0,0227. Однако сравнения, скорректированные по Тьюки, не выявили значимых различий между постоянными и периодически разведёнными животными внутри отдельных комбинаций пола и дня. У самок постоянные и периодически размножаемые животные по воскресеньям существенно не различались: оценка = 24,51, SE = 12,20, P = 0,2085, или по средам оценка = 17,31, SE = 12,20, P = 0,4950. Аналогично, у самцов по воскресеньям не было выявлено значимой разницы в группах размножения: оценка = 29,14, SE = 14,00, P = 0,1708, или по средам оценка = 21,72, SE = 13,30, P = 0,3682. Значимый основной эффект группы разведения следует интерпретировать как общий эффект на уровне модели, тогда как более специфические пост-хок сравнения с Тьюки в день пола и выборки не выявили устойчивого различия по парам.

Отсутствие значительной разницы в группах размножения у самцов особенно важно, поскольку самцов по воскресеньям всегда держали по одному дому. Таким образом, воскресное сравнение у самцов показывает, что сам метод отбора проб не увеличивает концентрацию FCM, по крайней мере у самцов мышей. Клетки для отбора пробы фекалий также использовались в другом исследовании, в котором сравнивались FCM у мышей с загрязнёнными укладками и^{контрольными группами 9}.

Рисунок 1: Обзор индивидуально изготовленной клетки для отбора пробы фекалий. Клетка позволяет собирать образцы фекалий с отдельных мышей, содержащихся в групповой клетке, без прямого обращения во время отбора проб. (A) Полностью собранная клетка, состоящая из домашней клетки и прикреплённой клетки для отбора пробы фекалий. (B) Боковой вид прикреплённой клетки для отбора проб. (C) Вид сверху, показывающий три отдельных входа в отдельные коробки для сбора. (D) Вид изнутри домашней клетки к входам в пробные коробки. (E) Открыт клетка для отбора проб, обеспечив доступ к коробкам для удаления и очистки фекалий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Строительный план и сборка клетки для отбора проб фекалий. (A-C) Акриловые стеклянные детали используются для строительства пола, боковых стен, раздвижных дверей и разделителей клетки для отбора проб. (D) Модификация поликарбонатной клетки типа II путём удаления дна и просверления отверстий и прорезей для крышки коробки для сбора. (E) Модификация поликарбонатной клетки типа III путём просверления трёх входных отверстий на передней стороне. (F) Схематический боковой вид собранной клетки, показывающий поликарбонатную домашнюю клетку типа III, соединённую с модифицированной поликарбонатной клеткай типа II, а также расположение частей 1, 2 и 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Репрезентативные данные FCM, полученные после сбора образца фекалий в специально изготовленной клетке. Метаболиты кортикостерона (FCM) были измерены в образцах фекалий, собранных индивидуально у групповых мышей с использованием специально изготовленной клетки для отбора пробы фекалий. Значения отображаются в восьми еженедельных точках отбора проб для мышей с постоянной и периодической разведкой. Образцы собирались либо в дни смены клеток, либо по выходным. Точки и соединяющие линии представляют групповые средние значения в каждой точке времени. Полоски ошибок и затемнения лент указывают среднее ± стандартное отклонение (SD). (A) Самки, взятые в дни смены клетки. (B) Самки, взятые в выходные. (C) Самцы, взятые в дни смены клетки. (D) Самцы, взятые по выходным. Рисунок иллюстрирует, что метод обеспечивал измеримые концентрации FCM во всех группах и временных точках. У самок обычно была более высокая концентрация FCM, чем самцы, тогда как различия между группами размножения были менее заметными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Шаблоны для акриловых стеклянных компонентов 1-3. Шаблоны для вырезания частей 1, 2 и 3a-c из 5 мм акрилового стекла/плексигласа для изготовления клетки для отбора пробы фекалий. Часть 1 служит нижней вставкой модифицированной поликарбонатной клетки типа II. Часть 2 используется для соединения поликарбонатной клетки типа III с поликарбонатной клетки типа II и для маркировки соответствующих отверстий для бурения. Части 3a-c образуют внутренние разделители/структурные элементы системы сбора. Белые круглые отметки обозначают воздушные отверстия, а мелкие — отверстия для винтов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Шаблоны для акриловых стеклянных компонентов 4a и 4b . Шаблоны для резки частей 4a и 4b из 5 мм акрилового стекла/плексигласа. Эти детали вставляются в Часть 1, чтобы удержать нижний вставку на месте и разделить клетку для отбора проб на отдельные ящики для сбора фекалий. Нижние выступы образуют ножки коробок для сбора, тогда как верхние проходят через верхнюю крышку и закрепляются деревянными стержнями или палочками для еды для стабилизации конструкции. Белые круги обозначают отверстия для стержней или воздушных отверстий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Модификация поликарбонатной клетки типа II. Схематический шаблон для модификации поликарбонатной клетки типа II. Нижняя часть клетки отрезана, как указано, и позже используется как верхняя крышка коробок для сбора фекалий. Отверстия и прорези просверлены в удаленной нижней части для установки и фиксации частей 4a и 4b. Отверстия для винтов используются для крепления поликарбонатной клетки типа II, поликарбонатной клетки типа III и части 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Модификация фасада поликарбонатной клетки типа III. Схематический шаблон для сверления передней стороны поликарбонатной клетки типа III. В короткой стороне клетки просверлены три круглых отверстия, чтобы обеспечить доступ между домашней клеткой и клеткой для отбора пробы фекалий. Дополнительные отверстия для винтов используются для крепления к части 2 и поликарбонатной клетки типа II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Этот протокол описывает простую систему клеток для сбора индивидуально распределяемых образцов фекалий у групповых мышей. Главное преимущество метода заключается в сочетании индивидуальной атрибуции образцов с поддержанием ключевых аспектов социального жилья, особенно визуального и обонятельного контакта с соседями по клетке. Это важно, поскольку групповое содержание часто требуется для благополучия животных и может быть частью экспериментального^{дизайна 10}. В отличие от объединённого отбора проб в домашних клетках, система позволяет присваивать значения FCM отдельным животным, при этом избегая длительного индивидуального содержания до или во время сбора образцов.

Широко используемые методы сбора образцов кал у лабораторных мышей включают объединённый отбор образцов в домашних клетках, временное содержание отдельных людей в чистых клетках, метаболические клетки и прямой сбор после обращения или переноса. Объединённые образцы из домашних клеток легко достать, они неинвазивны, недорогие и совместимы с параллельным отбором проб из многих клеток, но они не допускают индивидуального приписывания животных, содержащихся в группе. Временное индивидуальное содержание или перемещение в чистые клетки позволяет назначить индивидуальные образцы, но удаляет животных из их социальной группы и может вызвать острый стресс из-за обращения, новизны или социальной изоляции. Это особенно актуально для анализа FCM, поскольку показатели, связанные с кортикостероном, чувствительны к стрессу, вызванному самой процедурой отбора^{проб 11}. Метаболические клетки обеспечивают контролируемый сбор образцов и позволяют отделять фекалии и мочу, но требуют специализированного оборудования, менее совместимы с рутинным содержанием и обычно требуют индивидуального содержания. Сбор на основе прямого обращения также может предоставить индивидуальные образцы, но требует повторного обращения или манипуляции животными, что может повлиять на показания, связанные со стрессом.

По сравнению с существующими подходами, нынешняя система была разработана как совместимое с групповым содержанием усовершенствование для повторного, неинвазивного, индивидуального отбора пробы кал. После привычки и тренировки мыши добровольно заходят в коробки для проб в ответ на небольшое вознаграждение в виде пищи. Таким образом, образцы можно собирать без погони, обращения или принудительного переноса в отдельную клетку. Систему не следует интерпретировать как доказанную как способную улучшать благосостояние или снижать стресс в строго экспериментальном смысле, поскольку прямые показатели благосостояния не были включены в настоящее исследование. Однако он был разработан для снижения степени социальной изоляции во время сбора выборки и, следовательно, может быть менее разрушительным по сравнению с традиционными методами индивидуального собра. Кроме того, можно параллельно брать несколько животных и несколько клеток, что помогает стандартизировать окно отбора проб, что важно, поскольку концентрации FCM зависят от циркадного ритма и отражают секрецию глюкокортикоидов за несколько часов до отбора^{проб 5,12}.

Репрезентативные результаты показывают, что система подходит для сбора образцов фекалий, которые можно анализировать на концентрации FCM. Измеримые концентрации FCM были получены по группам и временным точкам, и метод выявил ожидаемую явную разницу в полах с более высокой концентрацией FCM у женщин, чем у самцов. Исследование также включало внутреннее сравнение с традиционным одиночным жильём у мужчин. По воскресеньям самцов из группы с интервальным размножением брали по одному дому, тогда как постоянно размножаемых самцов отбирали с помощью недавно разработанной системы сбора. Концентрации FCM существенно не различались между этими группами по воскресеньям. Это говорит о том, что добровольный вход в пробную клетку и кратковременное пребывание в коробке не значительно увеличивали концентрацию FCM по сравнению с традиционным сбором в одном корпусе. Тем не менее, это сравнение ограничивалось мужчинами и не было предназначено как специализированное исследование эквивалентности или проверки кроссоверов. Поэтому дальнейшие исследования должны сравнивать систему с устоявшимися подходами индивидуального содержания или метаболической клетки в сбалансированных экспериментальных условиях и включать поведенческие показатели острого стресса во время отбора проб.

Помимо оценки метаболитов кортикостерона в кале, система может быть полезна и для других задач, требующих краткосрочного сбора отдельных образцов фекалий. Возможные применения включают паразитологические исследования, анализ микробиоты, исследования пищеварения или другие анализы фекаленных биомаркеров. С небольшими техническими изменениями систему можно также адаптировать для сбора мочи, например, установив перфорированный пол и подходящий лоток для сбора под животным. Для таких случаев возможность поддержания близости к соседям по клетке во время сбора образцов может быть преимуществом по сравнению с традиционными индивидуальными или метаболическими подходами в клетке. Однако пригодность системы должна быть подтверждена для каждого конкретного типа образца и для дальнейшего анализа, особенно когда загрязнение, объём образца, время сбора или условия хранения критически важны.

В целом, животные должны привыкать к коробкам до первой сессии отбора, отдельные метки должны быть хорошо видны при используемом освещении, а отбор проб должен проводиться в одно и то же время суток на протяжении всего исследования. Образцы следует исключать, если индивидуальная идентичность неопределённа, если гранулы загрязнены, если длительность отбора пробы существенно отличается от запланированного временного окна или если фекального материала недостаточно для анализа¹³. На применимость системы отбора проб могут влиять несколько практических факторов, включая иерархии доминирования, агрессивные взаимодействия, вариабельность мотивации к еде, различия в штаммах и снижение подвижности или изменённое поведение у животных с ожирением, пожилыми, беременными, послеродовыми или другими нарушениями. Однако в нынешней когорте успех добровольного участия и выборки был высоким. Из 480 ожидаемых обычных образцов два отсутствовали, потому что мыши не испражнялись во время содержания под стражей, а три не удалось собрать, потому что животные были либо очень беременны, либо вскоре после родов. Таким образом, было собрано 475 образцов, из которых 473 дали анализируемые результаты. Эти данные показывают, что отказ входить в коробки и не получать образцы были редкостью в условиях, использованных в данном исследовании. Тем не менее, дополнительные корректировки привычки или протокола могут потребоваться для других штамм, крупных групп или животных с изменённой подвижностью, состоянием тела, состоянием здоровья или социальным поведением. Дополнительные ограничения заключаются в том, что метод требует обучения и в настоящее время предназначен для небольших групп по три мыши, а также что акриловые стеклянные/плексигласные компоненты не поддаются паровому автоклавированию.

Клетка недорогая, легко изготавливается из стандартного материала и акрилового стекла, и не требует электронных компонентов. Его конструкция позволяет разбирать, чистить и интегрировать их в регулярные процедуры смены клеток, что делает его подходящим для многократного продольного отбора проб. В целом, система представляет собой практичный, совместимый с групповым содержанием подход для неинвазивного, индивидуально назначаемого отбора экскрементов у мышей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сверло 5 мм	Craftomat	22380487	Диаметр 5 мм; Количество 1
Сверла 60 мм	Bosch	32064647	Диаметр 60 мм; Количество 1
Сверла 7 мм	Craftomat	22380520	Диаметр 7 мм; Количество 1
Сверлоносовой станок	Makita	25730054	Стандартный ручной или настольный сверлоносовой станок; Количество 1
Термоклей	Einhell	29051207	Для сборки клетки; Количество 1
Термопаяльные палочки	Einhell	29049664	Совместимы с термоклеем; Количество 5-10
Клетка Макролон	Animalab	31200129	Стандартная клетка типа II; Количество 1
Клетка Макролон	Animalab	31200256	Стандартная клетка типа III; Количество 1
Плексиглас / акриловое стекло	Bauhaus	29122352	Примерно 0,25 м² итого; толщина 5 мм; Количество  2 листа DIN A3
Пилка или фрезерное устройство	Scheppach	32079641	Маленькая ленточная пила, трапецеидальная пила или фрезерное устройство CNC; Количество 1
Резьбовые винты	Profi Depot	10807533	20 мм × 3 мм; Количество 4
Деревянные палочки / прутья	Ikea	903.429.71	Круглые деревянные прутья; Количество 3