MiR-93-5p напрямую воздействует на Toll-подобный рецептор 4 (TLR4) при пневмонии, вызванной Mycoplasma pneumoniae (MPP), у детей. Его пониженная экспрессия может способствовать прогрессированию заболевания и сопутствующему повреждению пищеварительной системы. Эти результаты позволяют предположить, что miR-93-5p может служить потенциальным диагностическим биомаркером MPP и MPP с повреждением пищеварительной системы.
Исследовательская статья
Оценка роли miR-93-5p у детей, инфицированных Mycoplasma pneumoniae с повреждением пищеварительной системы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
MiR-93-5p был вовлечен в модуляцию острого повреждения легких, однако его роль и диагностическая ценность при пневмонии, вызванной Mycoplasma pneumoniae (MPP) у детей с поражением пищеварительной системы, остаются неясными. В данном исследовании оценивалась роль miR-93-5p как потенциального диагностического биомаркера MPP и сопутствующих осложнений со стороны пищеварительной системы у детей. Клинические образцы были собраны у детей-пациентов с MPP и в группе здорового контроля. Экспрессия miR-93-5p была количественно определена с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией. Для создания клеточной модели MPP использовались клетки A549, инфицированные Mycoplasma pneumoniae (MP), с целью оценки изменений жизнеспособности клеток и уровней провоспалительных цитокинов. Таргетирование Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) с помощью miR-93-5p оценивали с помощью люциферазного репортерного анализа. Диагностическая эффективность оценивалась с использованием анализа кривой рабочих характеристик приемника (ROC-кривой). Уровни miR-93-5p были значительно снижены у пациентов с MPP по сравнению со здоровым контролем (P < 0.001) и еще более низкими у пациентов с MPP с поражением пищеварительной системы по сравнению с пациентами с изолированной MPP. Инфекция MP снижала жизнеспособность клеток и повышала уровни IL-6 и TNF-α, тогда как гиперэкспрессия miR-93-5p ослабляла эти эффекты. Экспрессия TLR4 повышалась после инфицирования MP и отрицательно регулировалась miR-93-5p. Клинически поражение пищеварительной системы у пациентов с MPP ассоциировалось с более низкими уровнями miR-93-5p. Анализ ROC-кривых показал высокую диагностическую эффективность при дифференциации пациентов с MPP от здорового контроля, а также пациентов с MPP с поражением пищеварительной системы от пациентов с изолированной MPP. MiR-93-5p напрямую таргетирует TLR4 при педиатрической MPP, и его даунрегуляция может способствовать прогрессированию заболевания и сопутствующему поражению пищеварительной системы. Эти результаты позволяют предположить, что miR-93-5p может служить потенциальным диагностическим биомаркером MPP и MPP с поражением пищеварительной системы.
Введение
Mycoplasma pneumoniae (MP) является основным патогеном, вызывающим пневмонию у детей1, что часто приводит к значительной респираторной заболеваемости во всем мире. Хотя MP вызывает преимущественно легочную инфекцию, она также может приводить к внелегочным осложнениям, затрагивающим несколько систем органов2. При инфекции, вызванной M. pneumoniae, наиболее часто регистрируемыми желудочно-кишечными симптомами являются тошнота, рвота, диарея и боли в животе3. Ряд желудочно-кишечных состояний и проявлений также были идентифицированы как часть внелегочных заболеваний, связанных с M. pneumoniae (MPEPDs)2. Педиатрические пациенты с пневмонией, вызванной M. pneumoniae (MPP), осложненной поражением пищеварительной системы, создают клинические трудности, которые могут усугубить тяжесть заболевания и осложнить лечение4. Новые данные указывают на взаимодействие между легочной инфекцией и кишечной дисфункцией, что может лежать в основе этой взаимосвязи5,6. Дисрегуляция иммунных ответов при инфекции MP также может быть связана с поражением пищеварительной системы7.
Несмотря на достижения в методах диагностики8, раннее и точное выявление MPP остается сложной задачей из-за перекрывающихся клинических проявлений с другими респираторными инфекциями и вариабельности внелегочных поражений9. Легкие и кишечник являются ключевыми компонентами общей слизистой иммунной системы, и эти органы могут влиять на функции друг друга, что проявляется в виде кишечных расстройств при заболеваниях легких и взаимных эффектов — явление, известное как ось «легкие-кишечник»10. Более того, педиатрический сестринский уход сосредоточен преимущественно на купировании респираторных симптомов11, в то время как желудочно-кишечные проявления могут недооцениваться или приписываться побочным эффектам лечения. Этот пробел подчеркивает необходимость комплексной оценки, объединяющей исследование легких и желудочно-кишечного тракта для оптимизации поддерживающих сестринских вмешательств12. Недавние молекулярные исследования выявили регуляторы путей воспалительной сигнализации, участвующие как в патологии легких, так и в воспалении кишечника при MPP12,13.
MiR-93-5p вовлечен в патогенез острого повреждения легких, при этом снижение его экспрессии коррелирует с нарушением функции легких и усилением воспалительных реакций14,15. На основании этих данных была выдвинута гипотеза, что уровень miR-93-5p аналогичным образом снижен в сыворотке крови детей с MPP. Биоинформатический анализ с использованием базы данных TargetScan выявил Toll-подобный рецептор 4 (TLR4) в качестве потенциальной прямой мишени miR-93-5p. Было сообщено, что TLR4 играет важную роль в модуляции оси «легкие-кишечник»16,17, и поэтому он был рассмотрен как потенциально связанный с желудочно-кишечными осложнениями при MPP. Соответственно, в данном исследовании изучалась роль miR-93-5p у детей с MPP, осложненным повреждением пищеварительной системы.
Протокол
Данное исследование было рассмотрено и одобрено комитетом по этике при аффилированной больнице Янчжоуского университета (номер одобрения 2023-YKL01-(16); 17 января 2023 г.). У каждого участника были взяты образцы периферической венозной крови для проведения соответствующих лабораторных анализов. Перед началом участия было получено информированное согласие от законных опекунов всех участников. Реактивы, оборудование и инструменты, использованные в данном протоколе, перечислены в таблице материалов.
1. Сбор клинических образцов
В период с февраля 2023 по декабрь 2024 года в аффилированной больнице Янчжоуского университета было зарегистрировано в общей сложности 108 детей в возрасте от 2 до 14 лет. Всем 108 детям был поставлен диагноз MPP, подтвержденный данными визуализации грудной клетки и результатами полимеразной цепной реакции (ПЦР) на ДНК MP в мазках из носоглотки. ДНК MP в носоглоточных мазках определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени с таргетированием специфичного для MP гена адгезина P1.
Пациенты были разделены по статусу заболевания на две группы: MPP без DSI (n = 60) и MPP с DSI (n = 48). DSI определялся по наличию как минимум одного желудочно-кишечного симптома, включая диарею (≥3 жидких или водянистых стулов в день в течение >24 ч), тошноту, рвоту или постоянную боль в животе с симптомом раздражения брюшины или без него, сопровождаемую как минимум одним отклонением лабораторных показателей и/или подтверждением данными визуализации органов брюшной полости. Отклонения лабораторных показателей включали повышенный уровень сывороточных трансаминаз, амилазы или липазы и/или повышение маркеров кишечной проницаемости, таких как D-лактат и эндотоксин. Подтверждающие данные визуализации органов брюшной полости включали утолщение стенки кишечника, увеличение мезентериальных лимфатических узлов или перитонеальный выпот, выявленные при ультразвуковом исследовании или компьютерной томографии. Кроме того, в качестве контроля выступили 60 здоровых детей, проходивших плановое обследование.
- Критерии включения
Пациенты с желудочно-кишечными симптомами в сочетании с лабораторными или инструментальными отклонениями были включены в группу DSI. - Критерии исключения
Критерии исключения включали вирусную или бактериальную пневмонию, туберкулез, наличие в анамнезе аллергии на исследуемые препараты, иммунные нарушения, недостаточное питание, дисфункцию почек, пороки развития желудочно-кишечного тракта и предшествующую антибиотикотерапию до госпитализации.
2. Культивирование клеток и модель MPP
Mycoplasma pneumoniae стандартный штамм ATCC 15531 культивировали в бульоне PPLO. Эпителиальные клетки альвеол человека линии A549 культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, в увлажненных условиях при 37 °C и 5% CO₂.
Для создания модели MPP in vitro клетки A549 заражали суспензиями M. pneumoniae с множественностью заражения (MOI) 1:10018. После заражения несвязанные бактерии удаляли путем замены культуральной среды. Эффективность заражения подтверждали с помощью qPCR-детекции ДНК MP в супернатантах культур после заражения.
3. Конструирование плазмид и трансфекция
Мимики miR-93-5p, плазмиды для гиперэкспрессии TLR4 (oe-TLR4) и соответствующие им отрицательные контроли были синтезированы коммерческим способом. Трансфекцию клеток A549, инфицированных MP, проводили с использованием липидного реагента для трансфекции. Эффективность трансфекции оценивали через 48 ч после трансфекции с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР).
4. Анализ методом RT-qPCR
Общую РНК экстрагировали из клеток A549, собранных по окончании экспериментов. Клетки лизировали и гомогенизировали с использованием фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Очистку общей РНК проводили с помощью реагента для экстракции РНК на основе фенола. Для обратной транскрипции miR-93-5p использовали набор для обратной транскрипции, тогда как комплементарную ДНК для анализа мРНК синтезировали с помощью имеющегося в продаже реагента для обратной транскрипции. Анализ RT-qPCR проводили с использованием химии SYBR Green.
5. МТТ-тест
Трансфицированные клетки A549 из каждой экспериментальной группы собирали и высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2 × 103 клеток на лунку. Затем в каждую лунку добавляли 20 µL реагента метилтиазолия бромида дифенилтетразолия (MTT). После дополнительной инкубации в течение 2 ч при 37 °C супернатанты осторожно удаляли. Образовавшиеся в результате метаболической активности клеток кристаллы формазана растворяли согласно инструкции к анализу. Жизнеспособность клеток определяли косвенно путем измерения оптической плотности (OD) при 490 nm с помощью микропланшетного ридера.
6. Иммуноферментный анализ
Для измерения уровней интерлейкина-6 (IL-6) и фактора некроза опухоли-α (TNF-α) использовали коммерческие наборы для иммуноферментного анализа (ELISA). Анализы проводили в соответствии с инструкциями производителя. Измерения выполняли в трех повторностях в двух независимых экспериментальных репликатах для обеспечения точности и воспроизводимости.
7. Репортерный анализ с использованием двойной люциферазы
Сайты связывания MiR-93-5p в пределах 3′-нетранслируемой области (UTR) TLR4 были предсказаны с помощью базы данных TargetScan. Фрагменты, содержащие последовательности дикого типа (WT) или мутантные (MUT) последовательности, были клонированы в люциферазный репортерный вектор. Клетки A549 подвергали котрансфекции 500 ng конструкции WT или MUT совместно с мимиками miR-93-5p или контролем с использованием липидного реагента для трансфекции. Через 48 h активность люциферазы измеряли с помощью двухлюциферазного репортерного анализа. Активность люциферазы светлячка нормализовали по активности люциферазы Renilla для учета эффективности трансфекции.
8. Вестерн-блоттинг
Для вестерн-блоттинга клеточные лизаты смешивали с буфером для нанесения и центрифугировали при 10,000 × g в течение 3 мин. Супернатанты подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, после чего белки переносили на поливинилиденфторидные мембраны. Мембраны блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH) и ингибитору каппа B альфа (IκBα) в разведении 1:1000 в трис-солевом буфере с добавлением Tween 20 и 5% BSA. После трехкратной промывки мембраны инкубировали с конъюгированным с HRP козьим антителом против IgG кролика (1:500) в течение 1 ч при комнатной температуре. После дополнительных промывок белковые полосы визуализировали с помощью усиленного хемилюминесцентного субстрата и фиксировали с помощью системы хемилюминесцентного имиджинга. Интенсивность полос целевых белков и GAPDH количественно определяли по данным трех независимых экспериментов с использованием программного обеспечения для анализа изображений.
9. Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения для статистического анализа. Нормальность распределения данных измерений оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка. Данные с нормальным распределением представлены как среднее значение ± стандартное отклонение; их сравнение проводили с использованием t-критерия для независимых выборок (для двух групп) или однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) (для нескольких групп). Если ANOVA указывал на наличие значимого общего различия, для попарных сравнений использовали апостериорный критерий Тьюки. Данные с ненормальным распределением анализировали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Категориальные переменные выражали в виде абсолютных значений и процентов и сравнивали с помощью критерия хи-квадрат. Анализ ROC-кривых (рабочей характеристики приемника) использовали для оценки диагностического потенциала miR-93-5p в прогнозировании MPP или MPP с DSI. Для выявления прогностических факторов, связанных с MPP с DSI, проводили многофакторную логистическую регрессию. В модель включали следующие переменные: возраст, пол, продолжительность лихорадки, длительность применения антибиотиков и экспрессию miR-93-5p, разделенную по медиане. Двустороннее значение P <0.05 считали статистически значимым.
Результаты
Снижение уровня MiR-93-5p при педиатрическом MPP
Для изучения потенциала miR-93-5p в качестве биомаркера при педиатрическом MPP была проведена оценка его диагностической эффективности. Как показано на Рисунке 1A, экспрессия miR-93-5p была значительно снижена у детей с MPP по сравнению со здоровым контролем. Демографические и гематологические характеристики двух групп обобщены в Таблице 1. Статистически значимых различий в распределении по возрасту или полу между группами не наблюдалось (P > 0.05). Однако количество лейкоцитов (WBC) в периферической крови, процент нейтрофилов (Net%) и уровень С-реактивного белка (CRP) были значительно повышены в группе MPP по сравнению со здоровым контролем (P < 0.001).
Для дальнейшей оценки диагностической эффективности miR-93-5p при дифференциации пациентов с MPP и здоровых детей был проведен анализ рабочей характеристики приемника (ROC-кривой) (Рисунок 1B). Площадь под кривой (AUC) составила 0,9009 [95% доверительный интервал (ДИ): 0,8537–0,9482] при чувствительности 80,56% и специфичности 88,33%. Эти результаты указывают на то, что снижение уровней miR-93-5p в сыворотке крови ассоциировано с MPP у детей.
Влияние miR-93-5p на клеточные модели MPP
Для оценки влияния miR-93-5p в клеточной модели MPP была проведена серия экспериментов in vitro. По сравнению с контрольными клетками, в клеточной модели MPP экспрессия miR-93-5p была снижена (Рисунок 2A). Инфицирование MP также было связано со снижением жизнеспособности клеток A549 (Рисунок 2B). Кроме того, уровни провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-α в модели MPP были повышены по сравнению с контролем (Рисунок 2C).
Для дальнейшей оценки функционального эффекта miR-93-5p в клетках A549, инфицированных MP, была создана модель гиперэкспрессии miR-93-5p (Рисунок 2D). Гиперэкспрессия miR-93-5p значительно повышала жизнеспособность клеток по сравнению с моделью MPP без гиперэкспрессии miR-93-5p (Рисунок 2E). В соответствии с этими данными, повышение экспрессии miR-93-5p сопровождалось снижением выработки IL-6 и TNF-α (Рисунок 2F). Эти результаты указывают на то, что снижение экспрессии miR-93-5p было связано с уменьшением жизнеспособности клеток и усилением воспалительных реакций при инфекции MP, в то время как гиперэкспрессия miR-93-5p нивелировала эти изменения.
MiR-93-5p мишенью является TLR4
Для выяснения регуляторной взаимосвязи между miR-93-5p и TLR4 был проведен биоинформатический анализ, в результате которого в 3′-нетранслируемой области (UTR) мРНК TLR4 был выявлен предполагаемый сайт связывания miR-93-5p (Рисунок 3A). В модели клеток MP экспрессия TLR4 была повышена по сравнению с контролем (Рисунок 3B). Предполагаемое взаимодействие было впоследствии оценено с помощью люциферазного репортерного анализа. Ко-трансфекция мимиками miR-93-5p приводила к снижению люциферазной активности конструкции дикого типа, что указывает на специфическое связывание с предсказанным сайтом (Рисунок 3C).
Оверэкспрессия miR-93-5p в клетках, инфицированных MP, снижала экспрессию TLR4 по сравнению с инфицированным контролем без обработки мимиком (Рисунок 3D). Для дальнейшего изучения нижележащих эффектов, связанных с модуляцией TLR4, были созданы модели клеток A549 с оверэкспрессией TLR4 (Рисунок 3E). Вестерн-блот-анализ показал повышение уровней IκBα после оверэкспрессии TLR4 (Рисунок 3F).
Оверэкспрессия TLR4 заметно снизила жизнеспособность клеток после инфицирования MP по сравнению с контрольными клетками, тогда как одновременная оверэкспрессия miR-93-5p нивелировала это снижение (Рисунок 3G). Измерение уровней воспалительных цитокинов дополнительно показало, что оверэкспрессия TLR4 повышает уровни провоспалительных медиаторов, в то время как оверэкспрессия miR-93-5p ослабляет эти изменения даже в присутствии оверэкспрессии TLR4 (Рисунок 3H). Эти результаты указывают на то, что miR-93-5p негативно регулирует экспрессию TLR4 и ослабляет клеточные изменения, связанные с инфицированием MP.
Диагностическая ценность miR-93-5p при MPP и MPP с DSI
В предыдущих отчетах описывалось участие TLR4 в тканях легких и толстой кишки16. В связи с этим была проведена клиническая оценка потенциальной связи между miR-93-5p и повреждением пищеварительной системы при MPP. Как показано на рисунке 4A, экспрессия miR-93-5p была снижена в группе MPP+DSI по сравнению с группой MPP.
Демографические и гематологические характеристики обобщены в Таблице 2. Между группами не было выявлено значимых различий по возрасту или полу. Однако продолжительность лихорадки и прием антибиотиков были значительно больше у пациентов с сопутствующими DSI (P < 0.05).
Диагностическая значимость miR-93-5p для дифференциации случаев MPP с DSI от случаев без DSI была оценена с помощью ROC-анализа. Значение AUC составило 0,7866 (95% CI: 0,6889–0,8843) (Рисунок 4B), при чувствительности 85,71% и специфичности 57,45%.
Многофакторный логистический регрессионный анализ выявил, что низкий уровень экспрессии miR-93-5p, продолжительная лихорадка и длительное применение антибиотиков являются факторами, связанными с поражением пищеварительной системы при инфекции MP (Таблица 3; P < 0.05).
Рисунок 1: Экспрессия и диагностическая значимость miR-93-5p в группе здорового контроля (n = 60) и у пациентов с MPP (n = 108). (A) Экспрессия miR-93-5p была снижена у пациентов с MPP. (B) ROC-анализ экспрессии miR-93-5p. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Функциональные эффекты miR-93-5p в модели клеток, инфицированных MP. (A) Экспрессия miR-93-5p была снижена в модели с инфекцией MP. (B) Жизнеспособность клеток была снижена в модели с инфекцией MP. (C) Уровни TNF-α и IL-6 были повышены в модели с инфекцией MP. (D) Эффективность трансфекции мимика miR-93-5p. (E) Жизнеспособность клеток повысилась после гиперэкспрессии miR-93-5p. (F) Уровни TNF-α и IL-6 снизились после гиперэкспрессии miR-93-5p. n = 3. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: MiR-93-5p напрямую воздействует на TLR4. (A) Предполагаемый сайт связывания между miR-93-5p и TLR4. (B) Экспрессия TLR4 в модели, инфицированной MP. (C) Двойной люциферазный репортерный анализ. (D) Негативная регуляция TLR4 посредством miR-93-5p. (E) Эффективность оверэкспрессии TLR4. (F) Вестерн-блот-анализ IκBα. (G) Жизнеспособность клеток. (H) Уровни TNF-α и IL-6. n = 3. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Экспрессия и диагностическая значимость miR-93-5p у пациентов с MPP (n = 60) и пациентов с MPP с DSI (n = 48). (A) Экспрессия miR-93-5p в группе MPP+DSI. (B) ROC-анализ miR-93-5p. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Переменная | Здоровые добровольцы (n = 60) | MPP (n = 108) | P |
| возраст (лет) | 6.81± 3.14 | 7.12 ± 3.55 | 0.559 |
| пол (мужской/женский) | 28/32 | 49/59 | 0.872 |
| Лейкоциты (× 109/л) | 7.27 ± 0.89 | 9.86 ± 1.36 | <0.001 |
| СРБ (мг/л) | 2.35 ± 0.17 | 11.53 ± 2.01 | <0.001 |
| Чистый % | 42.55 ± 5.62 | 56.51 ± 15.40 | <0.001 |
Таблица 1: Сравнение демографических характеристик и рутинных показателей крови у здоровых добровольцев группы контроля и пациентов с МПП.В этой таблице обобщены демографические характеристики и рутинные гематологические параметры здоровых добровольцев группы контроля и пациентов с МПП, включая возраст, пол, число лейкоцитов (WBC), процент нейтрофилов, процент эозинофилов, процент базофилов и уровень СРБ. Представлены межгрупповые сравнения и соответствующие значения P.
| Переменная | MPP (n = 60) | MPP+DSI (n = 48) | P |
| возраст (лет) | 6.88 ± 3.87 | 7.42 ± 3.11 | 0.441 |
| пол (мужчины/женщины) | 31/29 | 28/20 | 0.494 |
| Лейкоциты ( × 10⁹/L) | 8.9 ± 0.89 | 11.05 ± 0.76 | <0.001 |
| СРБ (mg/L) | 10.94 ± 1.62 | 12.27 ± 2.22 | <0.001 |
| % нейтрофилов | 55.87 ± 14.75 | 57.32 ± 16.29 | 0.629 |
| Продолжительность лихорадки (дней) | 4.60 ± 1.83 | 7.26 ± 1.04 | <0.001 |
| Время применения антибиотиков (дней) | 4.65 ± 1.147 | 6.29 ± 0.771 | <0.001 |
Таблица 2: Сравнение демографических характеристик и рутинных показателей крови у пациентов с MPP и пациентов с MPP+DSI. В данной таблице приведено сравнение демографических характеристик, рутинных гематологических параметров и соответствующих клинических признаков у пациентов только с MPP и у пациентов с MPP, осложненным DSI. Представлены межгрупповые сравнения и соответствующие значения P.
| Переменная | ОШ | 95% ДИ | Значение P | |
| нижняя | верхняя | |||
| miR-93-5p (низкий уровень против высокого) | 6.702 | 1.487 | 30.211 | 0.013 |
| возраст | 1.126 | 0.286 | 4.437 | 0.866 |
| пол | 1.071 | 0.27 | 4.248 | 0.923 |
| Продолжительность лихорадки | 73.416 | 15.018 | 358.895 | <0.001 |
| Время применения антибиотиков | 7.921 | 1.877 | 33.421 | 0.005 |
Таблица 3: Логистический регрессионный анализ детей с MP-инфекцией, осложненной поражением пищеварительной системы. В данной таблице представлены результаты логистического регрессионного анализа факторов, связанных с поражением пищеварительной системы у детей с MP-инфекцией. Анализ включает ОШ, 95% ДИ и значение P для каждой переменной.
Сокращения: Baso%, процент базофилов; CI, доверительный интервал; CRP, С-реактивный белок; DSI, повреждение пищеварительной системы; Eos%, процент эозинофилов; IκBα, ингибитор каппа B альфа; IL-6, интерлейкин-6; MP, Mycoplasma pneumoniae; MPP, пневмония, вызванная Mycoplasma pneumoniae; NC, отрицательный контроль; Net%, процент нейтрофилов; oe-TLR4, гиперэкспрессия TLR4; OR, отношение шансов; ROC, рабочая характеристика приемника; TLR4, Toll-подобный рецептор 4; TNF-α, фактор некроза опухоли-α; WBC, количество лейкоцитов.
ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Исходные числовые данные, на которых основаны рисунки и таблицы, представлены в Дополнительной таблице 1.
Дополнительная таблица 1: Исходные числовые данные для рисунков и таблиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
Несмотря на то, что MP считается прежде всего легочным патогеном, инфекция MP может вызывать различные внелегочные осложнения, затрагивающие несколько систем органов помимо легких19,20. Появляющиеся данные свидетельствуют о взаимодействии вдоль оси «легкие-кишечник», при котором воспалительные медиаторы, высвобождаемые при патологии легких, нарушают баланс кишечной флоры21 и функцию кишечника22. Это двустороннее взаимодействие подчеркивает важность комплексного обследования пациентов, охватывающего как респираторные симптомы, так и состояние желудочно-кишечного тракта. В связи с этим циркулирующие сывороточные биомаркеры привлекают все больше внимания как минимально инвазивные инструменты, обладающие потенциальной диагностической или прогностической ценностью23,24. MiRNAs стали перспективными кандидатами благодаря своей стабильности и роли в регуляции связанных с воспалением сигнальных путей, участвующих в патогенезе MP25,26,27. В данном исследовании систематически изучалась роль и клиническая значимость miR-93-5p при детской MPP, особенно при осложнении поражением пищеварительной системы. Уровни miR-93-5p были снижены у детей с MPP по сравнению со здоровым контролем и еще более низкими оказались у пациентов с поражением пищеварительной системы. Эти результаты указывают на потенциальную роль дисрегуляции miR-93-5p в патологии легких и на ее возможность использования в качестве биомаркера внелегочных проявлений.
МикроРНК продемонстрировали диагностическую значимость при тяжелой пневмонии, показав многообещающие значения чувствительности, специфичности и общей точности диагностики28,29. Клинически у детей с MPP, осложненной DSI, наблюдались более длительная лихорадка и более продолжительный курс антибиотикотерапии по сравнению с пациентами без пищеварительных осложнений. В многофакторном логистическом регрессионном анализе более низкие уровни miR-93-5p, наряду с указанными клиническими параметрами, были независимо связаны с поражением пищеварительной системы. Кроме того, анализ ROC-кривых показал высокую диагностическую эффективность сывороточного miR-93-5p при дифференциации пациентов с MPP с DSI от пациентов без DSI. Таким образом, определение уровня miR-93-5p может иметь дополнительную ценность для раннего выявления и стратификации рисков при микоплазменной инфекции у детей.
Что касается диагностической эффективности циркулирующей miR-93-5p по сравнению с рутинными клиническими маркерами воспаления, полученные данные свидетельствуют о том, что miR-93-5p может иметь дополнительную ценность, а не заменять традиционные показатели. СРБ и прокальцитонин (PCT) остаются широко используемыми биомаркерами в клинической практике для оценки степени тяжести инфекции и подбора антибиотикотерапии, при этом метаанализы показывают, что PCT обладает несколько более высокой диагностической точностью по сравнению с СРБ при бактериальной пневмонии30. Однако эти белки острой фазы в значительной степени неспецифичны, поскольку они реагируют на различные воспалительные стимулы и не могут достоверно отличить инфекцию, вызванную MP, от других респираторных патогенов или специфически отразить риск внелегочных осложнений. Напротив, miR-93-5p, как регуляторная молекула, связанная с сигнализацией TLR4/ядерного фактора каппа B (NF-κB), может предоставлять иную патофизиологическую информацию, дополняющую традиционные маркеры. Было отмечено, что корреляция между miR-93-5p и СРБ относительно слабая (r Пирсона = 0,2698), что позволяет предположить, что miR-93-5p может отражать иной аспект воспалительного ответа, чем системная реакция острой фазы.
Появляющиеся данные, полученные на моделях животных, продемонстрировали, что инфекция Mycoplasma pneumoniae может вызывать не только патологию дыхательных путей, но и повреждение пищеварительной системы через ось «легкие-кишечник», опосредованную кишечной флорой31. У мышей, инфицированных MP, наблюдались патологические повреждения как в легких, так и в толстой кишке, наряду с изменениями состава микробиоты кишечника, включая снижение численности полезных бактерий, таких как Corynebacterium glutamicum, и увеличение численности потенциальных патогенов, таких как Lachnospiraceae NK4A136 group и Escherichia-Shigella, что сопровождалось повышенным уровнем липополисахаридов (LPS) в содержимом толстой кишки и в крови32. Также сообщалось, что байкалин уменьшает воспаление легких и регулирует кишечную флору у мышей с MPP через путь TLR4/NF-κB, что подтверждает участие этого сигнального каскада во взаимодействии между легкими и кишечником33. Эти результаты согласуются с возможным участием сигналинга NF-κB в оси miR-93-5p/TLR4, исследуемой в данной работе.
На механистическом уровне было установлено, что TLR4, ключевой медиатор врожденного иммунитета, связанный с провоспалительными реакциями34,35,36,37, экспрессировался более интенсивно при инфекции MP. Повышенная экспрессия TLR4 сопровождалась увеличением уровней провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-α, а также снижением жизнеспособности эпителиальных клеток. Оверэкспрессия miR-93-5p подавляла экспрессию TLR4, ослабляла высвобождение воспалительных цитокинов и улучшала выживаемость клеток в условиях инфекции. Таким образом, снижение уровня miR-93-5p у пациентов с MPP, особенно при наличии повреждений пищеварительной системы, может быть связано с усилением воспалительной сигнализации, опосредованной TLR4, и более выраженным системным воспалительным ответом. Полученные данные не позволяют подтвердить активацию нижележащего пути NF-κB, так как анализ фосфорилированных IκBα и p65 не проводился.
Следует признать несколько ограничений данного исследования. Во-первых, это было одноцентровое исследование с относительно небольшим размером выборки, особенно для подгруппы DSI, что может ограничить статистическую мощность и обобщаемость результатов. Для подтверждения этих данных и установления надежных клинических пороговых значений необходима внешняя валидация в более крупных многоцентровых когортах. Во-вторых, хотя IκBα была обнаружена методом вестерн-блоттинга, комплексная валидация других нижележащих компонентов пути TLR4/NF-κB, включая MyD88, p-IκBα и p65, не проводилась. Подтверждение экспрессии этих сигнальных компонентов на уровне белка усилило бы механистическую интерпретацию. В-третьих, обсервационный дизайн не позволяет делать причинно-следственные выводы; необходимы эксперименты по потере и усилению функции, включая использование мимиков или ингибиторов miRNA in vitro или in vivo, чтобы определить, вносит ли miR-93-5p прямой вклад в повреждение пищеварительной системы, связанное с MPP. В-четвертых, эксперименты in vitro проводились на клетках легочного эпителия A549. Хотя эта модель подходит для оценки противовоспалительного действия miR-93-5p в контексте легких, она не может напрямую моделировать патологию желудочно-кишечного тракта. Предполагаемая связь между сигнализацией miR-93-5p/TLR4 в легких и проявлениями со стороны пищеварительной системы, потенциально опосредованная осью «легкие-кишечник», требует прямой валидации на моделях кишечного эпителия, таких как клетки Caco-2, и на животных моделях инфекции MP in vivo. Наконец, технические сложности, связанные с детекцией miRNA, включая стабильность РНК и стратегии нормализации, остаются препятствиями для рутинного клинического внедрения. Несмотря на эти ограничения, полученные результаты создают основу для будущих механистических исследований и масштабных работ по валидации.
В заключение, повышение экспрессии miR-93-5p ослабляло вызванное MP воспаление в эпителиальных клетках легких за счет подавления TLR4. С клинической точки зрения, снижение уровней циркулирующей miR-93-5p было связано с повреждением пищеварительной системы у детей с MPP, что указывает на потенциальную полезность данного маркера в качестве дополнительного биомаркера для выявления пациентов с риском развития желудочно-кишечных осложнений.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Отсутствует.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Клетки эпителия альвеол человека A549 | ATCC, USA | Cat# CCL-185; RRID: CVCL_0023 | Линия клеток эпителия альвеол человека, используемая для модели MPP in vitro |
| Антитела к GAPDH | Hangzhou XianZhi Biological Technology, China | Cat# AB-P-R001; RRID: AB_3096355 | Первичные антитела, используемые для детекции GAPDH в качестве контроля нагрузки при вестерн-блоттинге |
| Антитела к IκBα | Beyotime, China | Cat# AG2741; RRID: AB_3731391 | Первичные антитела, используемые для детекции IκBα методом вестерн-блоттинга |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | Solarbio, China | Cat# A8012 | Блокирующий реагент, используемый при вестерн-блоттинге |
| Центрифуга | Thermo Fisher Scientific, USA | Multifuge X4 Pro; Cat# 75016066; RRID: SCR_020726 | Центрифуга, используемая при культивировании клеток и подготовке проб |
| Система хемилюминесцентной визуализации | Tanon, China | 5200Multi; RRID: SCR_027114 | Система визуализации, используемая для регистрации хемилюминесцентных сигналов вестерн-блоттинга |
| Система двухлюциферазного репортерного анализа (Dual-Luciferase Reporter Assay System) | Promega, USA | Cat# E1910 | Используется для измерения активности люциферазы светлячка и Renilla |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gibco, USA | Cat# A5256701 | Сывороточная добавка к среде для культивирования клеток |
| Козьи антитела против IgG кролика, конъюгированные с HRP | Cell Signaling Technology, USA | Cat# 7074; RRID: AB_2099233 | Вторичные антитела, конъюгированные с HRP, используемые при вестерн-блоттинге |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 10.1.2; URL: https://www.graphpad.com | Программное обеспечение, используемое для статистического анализа и графического представления данных |
| Набор ИФА (ELISA) для интерлейкина-6 (IL-6) | Elabscience, China | Cat# E-EL-H6156; RRID: AB_3665145 | Набор ИФА, используемый для количественного определения IL-6 |
| Реагент для трансфекции Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | Реагент на основе липидов, используемый для трансфекции клеток A549 |
| Считыватель микропланшетов | Tecan, Switzerland | Infinite M Plex; RRID: SCR_026522 | Считыватель микропланшетов, используемый для измерения оптической плотности при 490 nm |
| Мимики miR-93-5p | Ribobio, China | Cat# miR10000093-1-5 | Синтетические мимики miR-93-5p, используемые для гиперэкспрессии miR-93-5p |
| Отрицательный контроль miR-93-5p | Ribobio, China | Cat# miR1N0000001-1-5 | Отрицательный контроль для трансфекции мимиков miR-93-5p |
| Набор для МТТ-анализа пролиферации и цитотоксичности клеток | Beyotime, China | Cat# C0009S | Используется для оценки жизнеспособности клеток |
| Стандартный штамм Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531 | ATCC, USA | Cat# 15531 | Стандартный штамм M. pneumoniae, используемый для создания модели инфекции |
| Репортерный вектор pGL3-Basic Luciferase | Promega, USA | Cat# E1751 | Репортерный вектор, используемый для двухлюциферазного репортерного анализа |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Solarbio, China | Cat# IP9212 | Буфер, используемый для промывки клеток и подготовки проб |
| Субстрат Pierce ECL для вестерн-блоттинга | Thermo Scientific, USA | Cat# 32209 | Хемилюминесцентный субстрат, используемый для детекции при вестерн-блоттинге |
| Среда для плевропневмоподобных организмов (PPLO) | BD, USA | Cat# 255420 | Культуральная среда, используемая для M. pneumoniae |
| Поливинилиденфторидная (PVDF) мембрана | Bio-Rad | Cat# 1620177 | Мембрана, используемая для переноса белков при вестерн-блоттинге |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR036A | Мастер-микс для обратной транскрипции, используемый для синтеза кДНК |
| Набор реагентов PrimeScript RT | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR037A | Набор реагентов, используемый для обратной транскрипции |
| Система ПЦР в реальном времени | Applied Biosystems, USA | QuantStudio 3 Real-Time PCR System; RRID: SCR_020238 | Прибор для ПЦР в реальном времени, используемый для анализа qPCR |
| Среда RPMI-1640 | Gibco, USA | Cat# 11875135 | Среда для культивирования клеток A549 |
| SPSS | IBM | Version 27.0; RRID: SCR_016479 | Программное обеспечение, используемое для статистического анализа |
| Отрицательный контроль гиперэкспрессии TLR4 | Ribobio, China | NA | Отрицательный контроль для экспериментов по гиперэкспрессии TLR4 |
| Плазмида для гиперэкспрессии TLR4 (oe-TLR4) | Ribobio, China | NA | Плазмида, используемая для гиперэкспрессии TLR4 |
| Реагент TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 15596026 | Реагент, используемый для экстракции тотальной РНК |
| Набор ИФА (ELISA) для фактора некроза опухоли-α (TNF-α) | Elabscience, China | Cat# E-EL-H0109; RRID: AB_3665144 | Набор ИФА, используемый для количественного определения TNF-α |
| Universal SYBR qPCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japan | Cat# BL697A | Мастер-микс, используемый для количественной ПЦР |
| Система гель-электрофореза для вестерн-блоттинга | Bio-Rad, USA | Mini-PROTEAN Tetra Cell; Cat# 1658004 | Система электрофореза, используемая для разделения белков |
Ссылки
- Yan C et al. Current status of Mycoplasma pneumoniae. infection in China. World Journal of Pediatrics. 2024;20(1):1-4.
- Poddighe D. Extra-pulmonary diseases related to Mycoplasma pneumoniae. in children: recent insights into the pathogenesis. Current Opinion in Rheumatology. 2018;30(4). doi:10.1097/BOR.0000000000000494.
- Schildgen O et al. Clinical manifestations in infants and children with Mycoplasma pneumoniae. infection. PLOS ONE. 2018;13(4). doi:10.1371/journal.pone.0195288.
- Li X et al. Intestinal necrosis due to nonocclusive mesenteric ischemia in a child with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia: a case report. BMC Infectious Diseases. 2025;25(1):1049.
- Ran B, Yang Z, Li M. METTL3-mediated miR-4534 maturation promotes IVDD progression by targeting the Sirt6-mediated Nrf2/HO-1 pathway. 2024;21(6):2795-2813.
- Du B et al. The lung-gut crosstalk in respiratory and inflammatory bowel disease. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2023;13. doi:10.3389/fcimb.2023.1218565.
- Jiang Y et al. Intestinal bacteria flora changes in patients with Mycoplasma pneumoniae pneumonia. with or without wheezing. Scientific Reports. 2022;12(1):5683.
- Lin L-J et al. The diagnostic value of serological studies in pediatric patients with acute Mycoplasma pneumoniae. infection. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2020;53(2):351-356.
- Cui J et al. Integrated microfluidic cartridge for rapid and colorimetric detection of Mycoplasma pneumoniae. Microchimica Acta. 2025;192(9):559.
- Wang X, Starodubtseva MN, Kapron CM, et al. Cadmium, von Willebrand factor and vascular aging. NPJ Aging. 2023;9(1):11.
- Chen J. Efficacy of the PDCA cyclic care model in improving lung function and speed of recovery in children with Mycoplasma pneumonia. American Journal of Translational Research. 2025;17(3):1792-1802.
- Li Y et al. Clinical significance of serum miR-98-5p in children with Mycoplasma pneumoniae. infection complicated with digestive system damage. Immunobiology. 2025;230(4):153101.
- Zhang Y, Wu ZM. LINC02605 involved in paediatric pneumonia complicated with diarrhoea via miR-539-5p/CXCL1 axis. European Journal of Clinical Investigation. 2024;54(9). doi:10.1111/eci.14234.
- Gao H et al. Knockdown of lncRNA MEG3 protects against sepsis-induced acute lung injury in mice through miR-93-5p-dependent inhibition of NF-κB signaling pathway. Pathology - Research and Practice. 2022;239:154142.
- Gao H et al. MicroRNA-93 contributes to the suppression of lung inflammatory responses in LPS-induced acute lung injury in mice via the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Int J Mol Med. 2020;46(2):561-570.
- Wedgwood S et al. Intestinal dysbiosis and the developing lung: the role of Toll-like receptor 4 in the gut-lung axis. Frontiers in Immunology. 2020;11. doi:10.3389/fimmu.2020.00357.
- Zou N et al. Transcutaneous auricular vagus nerve stimulation as a novel therapy connecting the central and peripheral systems: a review. Int J Surg. 2024;110(8):4993-5006.
- Chen Y et al. Combination of azithromycin and methylprednisolone alleviates Mycoplasma pneumoniae.-induced pneumonia by regulating miR-499a-5p/STAT3 axis. Exp Ther Med. 2022;24(3):578.
- Poddighe D. Mycoplasma pneumoniae.-related extra-pulmonary diseases and antimicrobial therapy. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2020;53(1):188-189.
- Meyer Sauteur PM, Ramien ML, Theiler M. Mycoplasma pneumoniae.: extrapulmonary manifestations in children with focus on mucocutaneous disease. The Pediatric Infectious Disease Journal. 9900. doi:10.1097/INF.0000000000004946.
- Liu C et al. Mast cells participate in regulation of lung-gut axis during Staphylococcus aureus pneumonia. Cell Proliferation. 2019;52(2).
- Guo J et al. People are an organic unity: gut-lung axis and pneumonia. Heliyon. 2024;10(6).
- Fan F et al. Clinical characteristics and serum inflammatory markers of community-acquired mycoplasma pneumonia in children. The Clinical Respiratory Journal. 2023;17(7):607-617.
- Ding L, Jiang Y. Biomarkers associated with the diagnosis and prognosis of Mycoplasma pneumoniae. pneumonia in children: a review. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2025;15. doi:10.3389/fcimb.2025.1552144.
- Peng W et al. Comparative analysis of the efficacy and safety of different methods for injecting polidocanol in the treatment of venous malformations. Phlebology. 2024;39(9):629-635.
- Wang J et al. Peripheral blood microR-146a and microR-29c expression in children with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia and its clinical value. Italian Journal of Pediatrics. 2023;49(1):119.
- Chu C et al. High expression of miR-222-3p in children with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia. Italian Journal of Pediatrics. 2019;45(1):163.
- Powell BH, Witwer KW, Meffert MK. Cellular miRNAs and viruses: trends in miRNA sequestering and target de-repression. J Virol. 2025;99(7).
- Gan T, Yu J, He J. miRNA, lncRNA and circRNA: targeted molecules with therapeutic promises in Mycoplasma pneumoniae. infection. Arch Microbiol. 2023;205(8):293.
- Im PK et al. Hyperuricemia, gout and the associated comorbidities in China: findings from a prospective study of 0.5 million adults. The Lancet Regional Health – Western Pacific. 2025;58. doi:10.1016/j.lanwpc.2025.101572.
- Hu J et al. Insight into the pathogenic mechanism of Mycoplasma pneumoniae. Curr Microbiol. 2022;80(1):14.
- Li B et al. Cecropin AD ameliorates pneumonia and intestinal injury in mice with Mycoplasma pneumoniae. by mediating gut microbiota. BMC Vet Res. 2025;21(1):39.
- Song D et al. The mechanism of baicalin in improving pulmonary inflammatory response and injury and regulating intestinal flora in Mycoplasma pneumoniae pneumoni.a mice. Cellular Signalling. 2025;126:111530.
- Coutinho-Wolino KS et al. Bioactive compounds modulating Toll-like 4 receptor (TLR4)-mediated inflammation: pathways involved and future perspectives. Nutrition Research. 2022;107:96-116.
- Thorburn AN et al. TLR2, TLR4 and MyD88 mediate allergic airway disease (AAD) and Streptococcus pneumoniae-induced suppression of AAD. PLOS ONE. 2016;11(6).
- Tang J et al. Effect of gut microbiota on LPS-induced acute lung injury by regulating the TLR4/NF-kB signaling pathway. International Immunopharmacology. 2021;91:107272.
- Jia H et al. Pulmonary epithelial TLR4 activation leads to lung injury in neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 2016;197(3):859-871.