Данный протокол объединяет многомерные транскриптомные данные с методами машинного обучения для идентификации генов, связанных со старением и митохондриями, при дилатационной кардиомиопатии с целью поиска биомаркеров и молекулярного субтипирования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Данный протокол объединяет многомерные транскриптомные данные с методами машинного обучения для идентификации генов, связанных со старением и митохондриями, при дилатационной кардиомиопатии с целью поиска биомаркеров и молекулярного субтипирования.
Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) характеризуется дилатацией левого желудочка и систолической дисфункцией, а также связана с митохондриальной дисфункцией и иммунно-воспалительной активацией. Однако молекулярные признаки, связанные со старением, и пути регуляции митохондрий при ДКМП остаются изученными не полностью. В данном исследовании были проанализированы шесть наборов данных объемного транскриптомного анализа и один набор данных секвенирования РНК единичных клеток из базы данных Gene Expression Omnibus. После нормализации данных, коррекции пакетного эффекта и аннотации типов клеток были выявлены гены-кандидаты, связанные со старением и митохондриями, с помощью анализа дифференциальной экспрессии, анализа сетей коэкспрессии генов с весовыми коэффициентами (WGCNA) и построения сетей белок-белковых взаимодействий. Отбор ключевых генов проводился далее с использованием регрессии LASSO, случайного леса (random forest) и метода рекурсивного исключения признаков на основе опорных векторов (SVM-RFE). Для характеристики иммунного микроокружения сердца при ДКМП были проведены анализы инфильтрации иммунных клеток, межклеточного взаимодействия и молекулярного субтипирования. В общей сложности с ДКМП были связаны 66 генов, связанных со старением, и 16 генов, связанных с митохондриями; они были преимущественно обогащены в путях сигнализации фактора, индуцируемого гипоксией-1, окислительного фосфорилирования и путях, связанных с синтазой оксида азота. Методы машинного обучения и анализ секвенирования РНК единичных клеток позволили определить SERPINE1, TGFB2, CYBB и TLR2 в качестве ключевых генов. CYBB и TLR2 высоко экспрессировались в моноцитах и макрофагах, тогда как SERPINE1 и TGFB2 преимущественно экспрессировались в стромальных клетках. Анализ иммунного ландшафта показал усиление активации провоспалительных макрофагов и изменение межклеточного взаимодействия в образцах с ДКМП. На основании экспрессии ключевых генов образцы с ДКМП были разделены на два молекулярных подтипа, связанных с сигнализацией фактора роста эндотелия сосудов и биосинтезом первичных желчных кислот соответственно. Данный протокол предоставляет комплексную основу для идентификации потенциальных биомаркеров и молекулярных подтипов при ДКМП.
Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) представляет собой заболевание миокарда, характеризующееся расширением левого желудочка и нарушением систолической функции. Это третья по частоте причина сердечной недостаточности и основное показание к трансплантации сердца во всем мире1. Согласно популяционным исследованиям, распространенность заболевания составляет примерно 1 случай на 250 взрослых, при этом более высокая частота наблюдается у мужчин, а значительная доля случаев обусловлена моногенными вариантами2. Эти данные свидетельствуют о том, что как генетическая предрасположенность, так и факторы окружающей среды способствуют возникновению и прогрессированию ДКМП.
Патогенез DCM включает взаимосвязанные процессы, в том числе воспалительную активацию, окислительный стресс, апоптоз кардиомиоцитов и нарушение профибротической сигнализации. Генетические полиморфизмы, связанные с воспалением, в том числе варианты промотора фактора некроза опухоли-α, были ассоциированы с предрасположенностью к вирусной форме DCM3. Повышенный окислительный стресс также связывают с гибелью кардиомиоцитов и дисфункцией левого желудочка при различных подтипах DCM у человека4. Кроме того, аберрантная активация сигнальных путей Wnt/β-catenin и кальциневрин/ядерный фактор активированных Т-клеток способствует гипертрофии миокарда и интерстициальному фиброзу, тем самым способствуя прогрессированию заболевания5,6. Митохондриальная дисфункция является еще одним важным компонентом DCM, поскольку кардиомиоциты имеют высокую потребность в энергии. Нарушение биогенеза митохондрий, гомеостаза кальция, митофагии и целостности митохондриальной ДНК может привести к нарушению окислительного фосфорилирования и способствовать прогрессирующей сердечной дисфункции7,8,9,10.
Несмотря на эти данные о механизмах, остаются важные пробелы в знаниях. В частности, временные и причинно-следственные связи между структурным ремоделированием митохондрий и биоэнергетической дисфункцией при инициации и прогрессировании DCM не были полностью определены11. Было исследовано несколько терапевтических стратегий. Терапия стволовыми клетками продемонстрировала регенеративный потенциал за счет паракринных, цитопротекторных и иммуномодулирующих эффектов, однако по-прежнему необходима оптимизация источников клеток, путей их доставки и выживаемости после трансплантации12. Подходы генной терапии, включая доставку на основе аденоассоциированных вирусов и редактирование генома с помощью коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами, также предлагают потенциальные стратегии прецизионного лечения. Тем не менее, ограничения, связанные с кардиальным тропизмом, иммуногенностью векторов и долгосрочной безопасностью, остаются нерешенными13.
Общедоступные транскриптомные наборы данных из таких репозиториев, как Gene Expression Omnibus (GEO), широко используются для поиска биомаркеров при DCM. Эти ресурсы обеспечивают доступ к многоцентровым клиническим когортам, поддерживают экономически эффективные и воспроизводимые исследования, а также позволяют повысить статистическую мощность за счет интеграции различных наборов данных14. Транскриптомное профилирование также позволяет проводить общегеномный скрининг генов-кандидатов, молекулярное субтипирование и анализ на уровне метаболических путей15. Однако общедоступные наборы данных имеют внутренние ограничения, включая технические батч-эффекты, клиническую и этиологическую неоднородность, ограниченные возможности для установления причинно-следственных связей, а также неполную лонгитюдную или прогностическую информацию16. Следовательно, результаты, полученные на основе общедоступных транскриптомных наборов данных, наиболее пригодны для формулирования гипотез и приоритизации биомаркеров-кандидатов и требуют валидации в независимых когортах и экспериментальных моделях.
Многие биоинформатические исследования DCM опираются преимущественно на анализ дифференциальной экспрессии, который может приводить к ложноположительным результатам и не позволяет полностью охарактеризовать сети коэкспрессии генов или клеточную гетерогенность в сердечной ткани. Чтобы устранить эти ограничения, в настоящем исследовании была применена интегрированная аналитическая стратегия, сочетающая взаимодополняющие методы. Общий транскриптомный анализ (bulk transcriptomic analysis) позволяет получить профили экспрессии на уровне ткани, подходящие для сравнения основной и контрольной групп. Взвешенный анализ сетей коэкспрессии генов (WGCNA) позволяет выявить модули генов, связанные с фенотипическими признаками, и дает возможность приоритизировать функционально связанные наборы генов, а не отдельные дифференциально экспрессируемые гены. Анализ сетей белок-белковых взаимодействий (PPI) выявляет высокосвязанные гены на основе топологии сети. Для поиска потенциальных биомаркеров в интегрированных наборах данных¹⁷ были использованы три алгоритма машинного обучения: регрессия LASSO (least absolute shrinkage and selection operator), случайный лес (random forest) и метод исключения признаков на основе опорных векторов (support vector machine-recursive feature elimination). Затем с помощью секвенирования РНК единичных клеток (scRNA-seq) были изучены паттерны экспрессии, специфичные для конкретных типов клеток, и сети межклеточного взаимодействия18.
Хотя митохондриальная дисфункция и связанные со старением молекулярные изменения по отдельности изучались при DCM, их совокупная связь с транскрипционными изменениями, связанными с заболеванием, остается недостаточно исследованной. В настоящем исследовании были интегрированы несколько наборов данных bulk-транскриптомики и scRNA-seq для выявления хаб-генов, связанных со старением и митохондриями, при DCM, характеристики иммунного микроокружения сердца и изучения молекулярных подтипов на основе выявленных генов. Данный интегрированный подход был использован для приоритизации потенциальных биомаркеров и создания основы для последующих механистических и валидационных исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все процедуры с животными были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике работы с лабораторными животными Второй аффилированной больницы Хэнаньского университета китайской медицины (номер одобрения HNSZYYYJS2023011150). Все процедуры проводились в соответствии с Руководством по этической экспертизе благополучия лабораторных животных (GB/T 35892-2018) и принципами 3R: заменой (Replacement), сокращением (Reduction) и совершенствованием (Refinement). Реагенты, базы данных, программное обеспечение и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.
1. Ресурсы данных и экспериментальные материалы
В качестве модельной группы использовали трансгенных самцов мышей линии CTNTR141W (класс SPF) со спонтанным фенотипом дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) и массой тела 25 ± 2 g. В качестве контрольной группы использовали самцов мышей линии C57BL/6J (класс SPF) того же возраста с массой тела 25 ± 2 g. В каждой группе было по 12 мышей. Все животные были получены из учреждений, имеющих действующие лицензии на разведение лабораторных животных, и содержались в условиях SPF-барьера при температуре 22 ± 2 °C и относительной влажности 40%–60% с 12-часовым циклом свет/темнота, при свободном доступе к стерильному корму и воде. После 1 недели акклиматизации всех мышей содержали в тех же условиях еще в течение 4 недель перед оценкой функции сердца и сбором образцов. В начале эксперимента возраст мышей составлял 6–8 недель. Мышей подвергали глубокой анестезии и эвтаназировали путем вывиха шейного позвонка.
Из базы данных Gene Expression Omnibus (GEO)19 были получены семь общедоступных транскриптомных наборов данных тканей миокарда левого желудочка пациентов с DCM. Эти наборы включали шесть наборов данных объемного транскриптома (bulk transcriptomics) и один набор данных секвенирования РНК единичных клеток (scRNA-seq) — GSE145154. В анализ были включены как CD45-положительные, так и CD45-отрицательные фракции. Обе фракции клеток, CD45-положительные и CD45-отрицательные, были объединены перед кластеризацией. Идентификатор образца использовался в качестве основной переменной пакета (batch variable) для интеграции с помощью Harmony. Были включены образцы левого желудочка нормы и левого желудочка с DCM из набора GSE145154, в частности GSM4307515, GSM4307516, GSM4307520 и GSM4307521. В данном исследовании использовались наборы данных GSE145154, GSE5406, GSE42955, GSE57338, GSE79962, GSE116250 и GSE141910. Все образцы, кроме DCM, были исключены; были оставлены только контрольные образцы (группа Control) и образцы с DCM (группа DCM). После контроля качества образцы не удалялись. Информация об included наборах данных GEO приведена ниже: GSE5406 содержал 102 образца (16 контрольных и 86 образцов DCM); GSE42955 содержал 17 образцов (5 контрольных и 12 образцов DCM); GSE57338 содержал 231 образец (136 контрольных и 95 образцов DCM); GSE79962 содержал 20 образцов (11 контрольных и 9 образцов DCM); GSE116250 содержал 51 образец (14 контрольных и 37 образцов DCM); и GSE141910 содержал 322 образца (161 контрольный и 161 образец DCM).
2. Предобработка данных объемного транскриптома
Матрицы экспрессии в сыром виде и файлы клинических аннотаций для шести наборов данных объемного транскриптома были загружены с помощью пакета GEOquery20. Для наборов данных микрочипов Affymetrix были получены исходные CEL-файлы, а для наборов данных RNA-seq — матрицы необработанных подсчетов. Коррекция фона, квантильная нормализация и расчет экспрессии для данных микрочипов выполнялись с использованием алгоритма робастного усреднения по массивам (RMA), реализованного в пакете affy21.
Данные подсчета RNA-seq были нормализованы методом усеченного среднего M-значений (trimmed mean of M-values) с использованием пакета edgeR22 и преобразованы в значения количества прочтений на миллион (counts per million) с логарифмическим преобразованием по основанию 2 (log₂). Идентификаторы зондов были заменены на официальные символы генов с использованием файлов аннотации конкретной платформы. В случаях, когда несколько зондов соответствовали одному гену, рассчитывалось среднее значение экспрессии.
Технические пакетные эффекты (batch effects) между наборами данных были устранены с помощью алгоритма ComBat из пакета sva23. Источник набора данных и платформа детекции были указаны в качестве факторов пакета. Для оценки эффективности удаления пакетных эффектов до и после коррекции был проведен анализ главных компонент.
3. Предобработка данных транскриптома отдельных клеток и аннотирование клеток
Матрица экспрессии генов из GSE145154 была импортирована в Seurat для создания объекта Seurat с использованием Seurat версии 524. Низкокачественные клетки были исключены с использованием следующих пороговых значений: от 200 до 6 000 детектированных генов на клетку, общее количество уникальных молекулярных идентификаторов более 500 и процент митохондриальных генов ниже 25%. Клетки, не соответствующие этим порогам контроля качества, были исключены как низкокачественные или разрушенные. Мы исключали низкокачественные клетки исключительно на основании описанных выше порогов контроля качества.
Логарифмическая нормализация была выполнена с помощью функции NormalizeData с коэффициентом масштабирования 10 000. С помощью функции FindVariableFeatures с методом vst были отобраны 3 000 наиболее вариабельных генов. Данные были масштабированы с помощью ScaleData, после чего для линейного снижения размерности был проведен анализ главных компонентов.
Эффекты батча были скорректированы с помощью алгоритма Harmony25 посредством функции RunHarmony, при этом в качестве группирующей переменной был указан идентификатор образца. Для кластеризации клеток с использованием функций FindNeighbors и FindClusters были использованы первые 15 главных компонент. Кластеризация проводилась с помощью алгоритма Leiden при разрешении 0,15. Нелинейное снижение размерности и визуализация были выполнены с помощью метода аппроксимации и проекции однообразного многообразия (UMAP).
Аннотирование типов клеток проводили с использованием канонических маркерных генов, а также с помощью автоматического аннотирования с использованием пакета SingleR26. Маркерные гены были следующими: B-клетки — IGKC, MS4A1 и CD79A; кардиомиоциты — TNNI3, MYL2 и ACTC1; эндотелиальные клетки — VWF, PECAM1 и EGFL7; макрофаги — C1QC, C1QB и C1QA; моноциты — S100A8, S100A9 и G0S2; натуральные киллеры — NKG7, GNLY и CCL5; гладкомышечные клетки — MYL9, TAGLN и ACTA2; стромальные клетки — FBLN1, LUM и DCN; и T-клетки — CD3E, CD3G и CD3D.
4. Анализ дифференциальной экспрессии и оценка обогащения наборов генов
Для сравнения экспрессии генов между группами с DCM и здоровым контролем была построена линейная модель с использованием пакета limma27. Гены со значением P < 0.05 и абсолютным изменением кратности (fold change) более 1,5, что соответствует абсолютному значению log₂ fold change более 0,58, были определены как статистически значимо дифференциально экспрессируемые.
Для расчета показателей обогащения наборов генов, связанных со старением и митохондриями, в каждом образце был проведен анализ обогащения наборов генов для одного образца (single-sample gene set enrichment analysis)28. Различия в показателях обогащения между группами с DCM и здоровым контролем оценивали с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона; статистически значимым считали значение P < 0.05.
На уровне отдельных клеток показатели старения и митохондриальных модулей были рассчитаны с помощью функции AddModuleScore в Seurat. Различия в показателях модулей между группами оценивали с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона.
Генные сигнатуры, связанные со старением, были извлечены из базы данных CellAge (https://genomics.senescence.info/cells/), а наборы генов, связанных с митохондриями, были получены из GeneCards (https://www.genecards.org/). Полные списки генов, использованные для оценки, представлены в Дополнительном файле 1.
5. Построение взвешенной сети коэкспрессии генов
Для построения сети были отобраны 5000 белок-кодирующих генов с наибольшей вариабельностью экспрессии в данных массового транскриптомного анализа. Функция pickSoftThreshold была использована для расчета индекса соответствия безмасштабной топологии при различных степенях мягкого порога. Оптимальный порог был определен как минимальная степень, обеспечивающая получение безмасштабной сети со значением R2 выше 0,9. Таким образом, для последующего сетевого анализа была принята степень мягкого порога β = 5.
С использованием функции blockwiseModules была построена знаковая взвешенная сеть коэкспрессии с минимальным размером модуля 30. Коэффициенты корреляции Пирсона рассчитывались между эйгенгеном каждого модуля и показателем обогащения, связанным со старением или митохондриями. Модули с абсолютным коэффициентом корреляции более 0,4 и P < 0,001 считались статистически значимо связанными модулями.
Гены в модулях со значимой взаимосвязью были сопоставлены с дифференциально экспрессируемыми генами для выявления генов-кандидатов старения, связанных с DCM, и генов-кандидатов митохондрий, связанных с DCM.
6. Анализ функционального обогащения
Анализ функционального обогащения, включая анализ генных онтологий (GO) и путей Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), был проведен для генов-кандидатов с использованием пакета clusterProfiler29. Обогащение GO охватывало три стандартные категории: биологический процесс, клеточный компонент и молекулярная функция.
Все анализы проводились с использованием аннотации для человека, коррекцией P-значения по методу ложноположительных результатов (FDR) и пороговым значением q-value 0,05. Размер наборов генов был ограничен диапазоном от 10 до 500 генов, а термины с FDR < 0,05 были определены как статистически значимые. Наконец, результаты анализа обогащения GO были визуализированы посредством для отображения данных использовали сгруппированные столбчатые диаграммы, а результаты анализа обогащения KEGG представляли в виде пузырьковых диаграмм.
7. Построение сети PPI и скрининг хаб-генов
Гены-кандидаты были введены в базу данных STRING версии 11.530 с выбором организма Homo sapiens и порогом достоверности взаимодействия, соответствующим комбинированному показателю более 0.7. Несвязанные узлы были скрыты, а данные о взаимодействиях экспортированы в формате значений, разделенных табуляцией.
Данные о взаимодействиях были импортированы в Cytoscape версии 3.9.1 для визуализации31. Топологические показатели узлов были рассчитаны с помощью плагина CytoHubba32 с использованием трех алгоритмов: Degree (степень), maximum neighborhood component (максимальный компонент окрестности) и maximal clique centrality (центральность максимальной клики).
Основные функциональные модули внутри сети были определены с помощью плагина MCODE33 со следующими параметрами по умолчанию: порог степени (degree cutoff) — 2; k-ядро (k-core) — 2; порог оценки узла (node score cutoff) — 0,2; максимальная глубина — 100. Гены, вошедшие в топ-10 по всем трем топологическим алгоритмам, были сопоставлены с генами в основной подсети MCODE для выявления итоговых хаб-генов белок-белкового взаимодействия.
8. Отбор основных генов на основе машинного обучения и построение диагностической модели
Для обеспечения воспроизводимости и сбалансированной репрезентативности интегрированный набор данных объемного транскриптомного анализа был случайным образом разделен на обучающую и валидационную выборки в соотношении 7:3 с использованием фиксированного случайного числа (seed = 123456). Разделение было стратифицировано по группе заболевания (DCM против контроля) для поддержания одинаковых пропорций классов в обеих выборках. Перед разделением пакетные эффекты (batch effects) из разных источников данных были скорректированы с помощью пакета sva, а интегрированные образцы рассматривались как единая когорта в процессе случайного распределения.
Для скрининга генов-кандидатов были применены три алгоритма машинного обучения. Сначала была выполнена логистическая регрессия LASSO посредством функция cv.glmnet в пакете glmnet34Была построена модель бинарной классификации с 5-кратной перекрестной проверкой, в качестве метрики оценки которой использовался показатель AUC. Гены с ненулевыми коэффициентами при значении lambda.min были отобраны в качестве генов-кандидатов.
Во-вторых, с помощью пакета randomForest35 была построена модель классификации случайного леса с 500 решающими деревьями. Количество переменных, выбираемых для каждого разделения, было установлено равным квадратному корню из общего количества признаков. Значимость генов количественно определяли на основе коэффициента Джини, и были отобраны 10 генов с самыми высокими показателями значимости.
В-третьих, анализ SVM-RFE был реализован с использованием функции rfe пакета caret36. Количество признаков было установлено в диапазоне от 1 до 10, а для обучения модели применялась 5-кратная перекрестная проверка. В конечном итоге был выбран поднабор генов с оптимальной точностью перекрестной проверки.
Гены, выявленные всеми тремя алгоритмами, были определены как окончательный набор основных генов, связанных со старением и митохондриями при DCM. Затем были построены диагностические модели с использованием 10 алгоритмов классификации: дерева решений, градиентного бустинга, бустированного обобщенного линейного моделирования, метода k-ближайших соседей, логистической регрессии, нейронной сети, метода частичных наименьших квадратов, случайного леса, метода опорных векторов и экстремального градиентного бустинга.
Кривые рабочих характеристик приемника (ROC-кривые) были построены с использованием пакета pROC37. Для оценки диагностической эффективности в обучающей и валидационной выборках были рассчитаны площадь под кривой (AUC), точность, чувствительность и специфичность.
Для расчета вклада каждого основного гена в прогнозы модели был проведен анализ SHapley Additive exPlanations38. Были построены сводные графики и водопадные графики для каждого образца. Окончательная диагностическая модель с площадью под кривой (AUC) более 0,8 в валидационном наборе считалась обладающей хорошей диагностической эффективностью.
9. Анализ межклеточных взаимодействий
Сети межклеточных взаимодействий в микроокружении сердца были реконструированы с помощью пакета CellChat39. Объект CellChat был создан с использованием базы данных CellChatDB.human. Дифференциально экспрессируемые лиганды и рецепторы были определены с помощью функции identifyOverExpressedGenes, а значимые пары взаимодействий были отобраны с помощью функции identifyOverExpressedInteractions.
Вероятности взаимодействия между типами клеток были рассчитаны с помощью функции computeCommunProb. Глобальная сеть взаимодействий на уровне типов клеток была агрегирована с помощью функции aggregateNet. Количество взаимодействий и интенсивность коммуникации между каждой парой типов клеток были количественно определены и визуализированы с помощью тепловых карт и столбчатых диаграмм.
10. Количественная оценка инфильтрации иммунных клеток
Показатели обогащения для 28 типов иммунных клеток были рассчитаны для каждого общего образца с использованием анализа обогащения наборов генов для одного образца28 и набора сигнатурных генов иммунных клеток40. Для сравнения показателей обогащения иммунных клеток между группами с DCM и здоровым контролем использовался критерий суммы рангов Уилкоксона. Значение P < 0,05 считалось статистически значимым.
Для оценки взаимосвязи между уровнями экспрессии основных генов и показателями обогащения иммунными клетками был проведен корреляционный анализ Пирсона. Все корреляции с P < 0.05 считались статистически значимыми.
11. Консенсусная кластеризация для молекулярного субтипирования
Неконтролируемая консенсусная кластеризация образцов DCM была выполнена с использованием профилей экспрессии основных генов посредством пакет ConsensusClusterPlus41Параметры кластеризации были установлены следующим образом: максимальное количество кластеров — 6, количество итераций ресемплирования — 1000, доля ресемплирования — 0,8. Для кластеризации был использован метод разбиения вокруг медиоидов (PAM) с евклидовым расстоянием; для обеспечения воспроизводимости результатов использовалось фиксированное случайное число (seed).
Оптимальное количество подтипов было определено на основании графика дельты площади (delta area plot) и показателей стабильности консенсусного кластера, в результате чего было установлено, что K = 2. Далее был проведен анализ главных компонент для подтверждения четкого разделения двух молекулярных подтипов.
Для расчета показателей обогащения путей KEGG для каждого отдельного образца был применен анализ вариации наборов генов (Gene set variation analysis)42. Для выявления дифференциальной активации путей между подтипами использовался пакет limma27, при этом статистически значимым считалось значение P менее 0,05.
12. Эхокардиографическая оценка сердечной функции
Мышей подвергли анестезии посредством внутрибрюшинно вводили 1% раствор пентобарбитала натрия (30 мг/кг), после чего животное фиксировали в положении на спине на термостатическом операционном столе. После удаления шерсти с грудной клетки на прекордиальную область равномерно наносили ультразвуковой контактный гель.
Эхокардиография в M-режиме под контролем двухмерного изображения проводилась на уровне папиллярных мышц левого желудочка с использованием ультразвуковой системы для мелких животных. Были зарегистрированы три последовательных стабильных сердечных цикла для измерения конечно-диастолического и конечно-систолического диаметров левого желудочка, фракции выброса и фракционного сокращения. Все эхокардиографические исследования проводились профессиональным специалистом по УЗИ в слепом режиме.
Из каждой группы было случайным образом отобрано по три мыши для проведения эхокардиографического исследования; в общей сложности эти 6 животных были впоследствии забиты для сбора тканей миокарда и проведения анализа ELISA. Остальные экспериментальные животные прошли дополнительные параллельные лабораторные исследования, данные которых не были включены в настоящее исследование.
13. Сбор тканей миокарда, экстракция белка и иммуноферментный анализ
После эхокардиографической оценки мышей усыпляли под глубоким наркозом. Ткани сердца быстро извлекали путем срединной торакотомии, и миокард левого желудочка препарировали на льду. Изолированные ткани тщательно промывали ледяным фосфатно-солевым буферным раствором для удаления остатков внутрисердечной крови. После удаления излишков жидкости стерильной фильтровальной бумагой образцы немедленно подвергали шоковой заморозке в жидком азоте и хранили при −80 °C для последующей экстракции белка, строго избегая повторных циклов замораживания-оттаивания.
Замороженные ткани миокарда взвешивали и на льду разрезали на фрагменты размером примерно 1 мм3. Ткани лизировали в ледяном буфере для лизиса RIPA, содержащем ингибиторы протеаз и фосфатаз, в стандартном соотношении 100 µL буфера на 10 mg ткани. Образцы полностью гомогенизировали механически на льду и инкубировали в течение 30 min до достижения полного лизиса клеток.
Лизаты центрифугировали при 12,000 × g в течение 15 мин при 4 °C. Полученные супернатанты собирали в пробирки, не содержащие ферментов, и определяли общую концентрацию белка с помощью набора для белкового анализа с бицинхониновой кислотой согласно протоколам производителя. Все образцы доводили до одинаковой концентрации белка с помощью буфера для лизиса.
Уровни экспрессии белков четырех хаб-генов в лизатах миокарда измеряли с помощью соответствующих наборов для иммуноферментного анализа (ELISA). Серийно разведенные стандарты и нормализованные лизаты тканей добавляли в двух повторах (100 µL на лунку) в предварительно покрытые микропланшеты. Планшеты инкубировали в течение 2 h при комнатной температуре и тщательно промывали промывочным буфером, входящим в состав набора.
В каждую лунку добавляли антитела, конъюгированные с ферментом, и инкубировали в течение 1 h при комнатной температуре, после чего проводили тщательную промывку. Затем добавляли раствор хромогенного субстрата и инкубировали планшеты в течение 20 min при комнатной температуре в темноте. Цветовой реакцию останавливали с помощью стоп-реагента, и значения оптической плотности измеряли при 450 nm (референсная длина волны: 570 nm) с использованием микропланшетного ридера с полным спектром сканирования.
14. Статистический анализ
Весь статистический анализ и визуализация данных были выполнены с использованием R версии 4.2.3. Для измерений концентрации каждого целевого гена (TGFB2, SERPINE1, CYBB, TLR2) методом ELISA сначала применялся тест Шапиро-Уилка для оценки нормальности распределения данных в группах Control и DCM по отдельности. Затем с помощью F-теста оценивалась гомогенность дисперсий между двумя группами. Метод межгруппового сравнения определялся в соответствии с результатами теста на гомогенность дисперсий: если дисперсии были однородными (P ≥ 0.05), для сравнения средних значений между группами использовался непарный t-критерий Стьюдента; если дисперсии были неоднородными (P < 0.05), для анализа применялся скорректированный t-критерий Уэлча. Все тесты были двусторонними, а порог статистической значимости был установлен на уровне P < 0.05. Данные были визуализированы в виде диаграмм размаха («ящиков с усами») с наложением отдельных точек данных. Значения P для всех тестов и тип использованного t-критерия были подробно указаны на каждом графике.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Предварительная обработка данных и анализ дифференциальной экспрессии
Все шесть наборов данных общего транскриптома прошли стандартизированную предварительную обработку и коррекцию эффекта серии перед последующим анализом. Данные микрочипов были нормализованы с использованием алгоритма робастного среднего по нескольким массивам (robust multi-array average), в то время как данные подсчетов РНК-секвенирования нормализовали методом усеченного среднего M-значений (trimmed mean of M-values). Для устранени...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Интегрированный многоуровневый рабочий процесс сочетал в себе метаанализ общих транскриптомных данных, построение взвешенной сети коэкспрессии генов, ансамблевое машинное обучение, валидацию на уровне отдельных клеток и верификацию на животных моделях in vivo. Четыре связанных со старением и митохондриями центральных гена CYBB, SERPINE1, TGFB2 и TLR2 были определены в качестве потенциальных диагностических биомаркеров дилатационной кардиомиопатии (ДКМ). Интеграция шести независимых транскриптомных наборов данных...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
Авторы выражают благодарность за предоставление общедоступных данных из базы данных Gene Expression Omnibus. Также выражается благодарность рецензентам и редакторам за их конструктивные замечания к рукописи. Данная работа была поддержана Провинциальным научно-исследовательским проектом департаментского уровня (грант № 2021JDZX2026) по теме «Механизм действия формулы Yiqi Huoxue в ослаблении атеросклеротического ремоделирования сосудов посредством KLF2-Nrf2-опосредованной воспалительной регуляции».
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ультразвуковой гель Aquasonic Clear | Parker Laboratories, Inc. | Mar-34 | Используется для эхокардиографической визуализации мелких животных. |
| Набор для определения содержания белка методом BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Детекция при 562 nm; диапазон 20–2 000 µg/mL; используется для количественного определения общего белка в лизатах сердца мыши. |
| База данных CellAge | Human Ageing Genomic Resources | https://genomics.senescence.info/cells/ | Источник генных сигнатур, связанных со старением. |
| CytoHubba, плагин для Cytoscape | Cytoscape App Store | Версия 0.1 | Используется для оценки топологии узлов в сетях белок-белковых взаимодействий. |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | Версия 3.9.1 | Используется для визуализации сетей белок-белковых взаимодействий. |
| Полноспектральный ридер микропланшетов | Thermo Fisher Scientific | Multiskan FC | Используется для измерения оптической плотности в анализах ELISA. |
| Gene Expression Omnibus | National Center for Biotechnology Information | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | Публичный репозиторий, используемый для получения транскриптомных наборов данных. |
| GeneCards | Weizmann Institute of Science | https://www.genecards.org/ | Источник наборов генов, связанных с митохондриями. |
| Коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз Halt, 100×, без ЭДТА | Thermo Fisher Scientific | 78441 | Хранить при 4 °C; добавлять в буфер RIPA в концентрации 10 µL/mL непосредственно перед использованием. |
| Жидкий азот | Местный поставщик лабораторных газов | Не применимо | Используется для мгновенного замораживания ткани миокарда. |
| Самцы мышей линии C57BL/6J (класс SPF), возраст 6–8 недель, вес 25 ± 2 g | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Не применимо | Лицензия на производство животных № SCXK (Jing) 2021-0006; использовались в качестве нормального контроля. |
| Самцы трансгенных мышей с DCM (линия CTNTR141W, класс SPF), возраст 6–8 недель, вес 25 ± 2 g | Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences | Не применимо | Лицензия на производство животных № SCXK (Jing) 2021-0065; использовались в качестве спонтанной модели DCM. |
| MCODE, плагин для Cytoscape | Cytoscape App Store | Версия 2.0.2 | Используется для идентификации основных функциональных подсетей в сетях белок-белковых взаимодействий. |
| Набор ELISA для определения CYBB у мышей | Biogradetech | A-QEK09250-96wells | Использовался в данном исследовании для измерения уровня CYBB в лизатах ткани миокарда мыши. |
| Набор ELISA для определения PAI-1 у мышей | EK-BIO | ML30970 | Использовался в данном исследовании для измерения уровня PAI-1 (белка, кодируемого геном SERPINE1) в лизатах ткани миокарда мыши. |
| Набор ELISA для определения TGF-β2 у мышей | ElaBoX | SEKM-0036 | Использовался в данном исследовании для измерения уровня TGF-β2 в лизатах ткани миокарда мыши. |
| Набор ELISA для определения TLR-2 у мышей | Solarbio | SEKM-0163 | Использовался в данном исследовании для измерения уровня TLR-2 в лизатах ткани миокарда мыши. |
| Фосфатно-солевой буфер, pH 7.4, без кальция и магния | Biological Industries | 02-024-1ACS | Стерильный 1× раствор; хранить при 4 °C; используется для промывки тканей и разведения. |
| Пакет R: caret | CRAN | Версия 6.0-94 | Используется для рекурсивного исключения признаков методом опорных векторов. |
| Пакет R: CellChat | Разработчики CellChat | Версия 1.6.1 | Используется для анализа межклеточного взаимодействия на основе данных секвенирования РНК единичных клеток. |
| Пакет R: clusterProfiler | Bioconductor | Версия 4.8.3 | Используется для анализа функционального обогащения. |
| Пакет R: ConsensusClusterPlus | Bioconductor | Версия 1.64.0 | Используется для неконтролируемой консенсусной кластеризации. |
| Пакет R: edgeR | Bioconductor | Версия 3.42.4 | Используется для нормализации данных секвенирования РНК методом усеченного среднего M-значений. |
| Пакет R: GEOquery | Bioconductor | Версия 2.68.0 | Используется для загрузки данных из Gene Expression Omnibus. |
| Пакет R: glmnet | CRAN | Версия 4.1-8 | Используется для логистической регрессии методом LASSO. |
| Пакет R: limma | Bioconductor | Версия 3.56.2 | Используется для анализа дифференциальной экспрессии и статистического моделирования. |
| Пакет R: pROC | CRAN | Версия 1.18.5 | Используется для анализа ROC-кривых. |
| Пакет R: randomForest | CRAN | Версия 4.7-1.2 | Используется для машинного обучения методом случайного леса. |
| Пакет R: Seurat | CRAN | Версия 5.0.1 | Используется для анализа данных секвенирования РНК единичных клеток. |
| Пакет R: SingleR | Bioconductor | Версия 2.2.0 | Используется для автоматической аннотации типов клеток. |
| Пакет R: sva | Bioconductor | Версия 3.48.0 | Используется для коррекции пакетного эффекта методом ComBat. |
| Охлаждаемая центрифуга | Sigma-Aldrich | SIGMA 3-K | Используется для центрифугирования лизатов ткани миокарда. |
| Буфер для лизиса и экстракции RIPA | Thermo Fisher Scientific | 89900 | Готовый к использованию 1× раствор; хранить при 4 °C; перед использованием дополняется ингибиторами протеаз и фосфатаз. |
| Система ультразвуковой визуализации для мелких животных | VINNO Technology Co., Ltd. | VINN06LAB | Используется для эхокардиографической оценки сердечной функции. |
| Пентобарбитал натрия | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 20040428 | Приготовлен в виде 1% раствора (10 mg/mL) в стерильном физрастворе; используется для внутрибрюшинной анестезии в дозе 30 mg/kg. |
| База данных STRING | STRING Consortium | Версия 11.5 | Используется для построения сетей белок-белковых взаимодействий. |
| Гомогенизатор тканей TGrinder H24 | TIANGEN | OSE-TH-01 | Используется для гомогенизации ткани миокарда мыши в буфере RIPA при скорости 6.0 m/s в течение 30–60 s в течение 2–3 циклов. |
| Термостатическая платформа для животных / подогреваемый операционный стол для мелких животных | Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd. | T-30350 | Используется для поддержания температуры тела мышей при 37 °C во время эхокардиографии; рабочий диапазон: от комнатной температуры до 50 °C. |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.