Методическая статья

Платформа для непрерывного культивирования эндотелиальных клеток в условиях физиологического потока при симулированной микрогравитации

29 просмотров

⸱

11 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, San José State University, 2Department of Mechanical Engineering, San José State University

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол проектирования, сборки и эксплуатации безпузырькового микрофлюидного устройства с замкнутым контуром для культивирования эндотелиальных клеток в условиях физиологического потока при имитации микрогравитации.

Аннотация

Микрофизиологические системы (МФС) представляют собой ценные in vitro модели, воссоздающие структуру и функцию тканей человека. В частности, системы «ткань-на-чипе» или «орган-на-чипе», использующие микрофлюидные технологии, воспроизводят механическую и биохимическую среду in vivo, обеспечивая при этом мониторинг роста и развития клеток в режиме реального времени. Такие системы могут быть особенно полезны для исследований в условиях космических полетов, поскольку их можно отправить в космос, например на Международную космическую станцию (МКС), для изучения влияния космических путешествий на организм человека. Основным препятствием для успешного функционирования микрофизиологических систем (МФС) является образование пузырьков газа, которое может быть особенно выраженным в условиях микрогравитации. В данной работе описываются конструкция, сборка и эксплуатация микрофизиологической системы культивирования клеток для использования в условиях симулированной микрогравитации (например, при работе на устройстве случайного позиционирования или клиностате). Было показано, что включение в гидравлический контур независимой от ориентации ловушки для пузырьков является высокоэффективным методом удаления пузырьков воздуха в условиях микрогравитации и позволяет осуществлять долгосрочное культивирование эндотелиальных клеток. Эта замкнутая, независимая от ориентации микрофлюидная система может быть использована для работы тканевых чипов или систем «орган-на-чипе» без образования пузырьков для имитации комбинированного воздействия микрогравитации и потока, а также для развертывания в космических миссиях.

Введение

В настоящее время, благодаря изучаемым механизмам, стало хорошо известно, что механические силы играют критическую роль в функционировании клеток и в поддержании тонкого баланса между здоровьем и болезнью1. Среди всех стрессовых факторов окружающей среды гравитационная сила уникальна, и в подавляющем большинстве биомедицинских исследований она справедливо считается постоянным, неизменным вектором. Однако космический полет создает уникальную среду микрогравитации, в которой поведение организмов может отличаться от земного. Эксперименты в условиях космического полета с участием животных и людей демонстрируют значительные физиологические изменения, что подчеркивает роль гравитации в клеточном и организменном гомеостазе2.

В последнее время НАСА и другие частные агентства проявили значительный интерес к разработке тканевых чипов (или органов-на-чипе) для использования в космических миссиях3. Тканевые чипы предназначены для имитации архитектуры in vivo, что позволяет с высокой точностью моделировать физиологическое и механистическое воздействие микрогравитации и космической радиации4. Благодаря использованию клеток донора тканевые чипы могут также применяться для исследования чувствительности астронавтов к микрогравитации и космической радиации, а также для разработки профилактических мер5. За последние пять лет с помощью тканевых чипов были смоделированы и запущены на МКС несколько систем органов, включая мозг, печень, кишечник, кровеносные сосуды, сердце, почки и легкие6. In vivo органы в разной степени перфузируются сосудистой сетью, что определяет их физиологию — например, печень сильно васкуляризирована, в то время как хрящ в гораздо меньшей степени. Следовательно, для точного воспроизведения функций органов in vitro важным аспектом при разработке систем органов-на-чипе является обеспечение тока жидкости через ткани и клетки.

Микрофлюидика используется для перфузии клеток и тканей в системах «орган на чипе»7,8. Надлежащий уровень потока жидкости не только обеспечивает транспорт питательных веществ в систему и удаление продуктов обмена из нее, но и поддерживает физиологическое напряжение сдвига, воздействующее на клетки. Однако при малых размерах пузырьки воздуха создают постоянную проблему на границах фаз, что приводит к неточным измерениям, повреждениям и закупоркам9. Для решения этой проблемы использовались ловушки для пузырьков с активным (например, вакуумное дегазирование или внешние поля, такие как акустические или термические) и пассивным (например, полупроницаемая мембрана, основанная на свойствах поверхности) дизайном10,1. Тем не менее, такие конструкции микрофлюидных дегазаторов усложняют изготовление устройств, нарушают целостность образцов и приводят к засорению и прорывам барьера. Эти проблемы обостряются в космосе, где нуклеация и образование пузырьков выражены гораздо сильнее, а стратегии борьбы с пузырьками, эффективные на Земле, становятся в значительной степени неэффективными12. Наземные аналоги микрогравитации могут быть созданы с помощью таких устройств, как сосуд с вращающейся стенкой (RWV) или машина случайного позиционирования (RPM)13,14. Примечательно, что в RPM вектор гравитации постоянно переориентируется, тем самым практически обнуляя средневременной результирующий гравитационный стимул, воздействующий на образец. Недавно мы сообщили о разработке, изготовлении и применении независимой от ориентации ловушки для пузырьков для перфузионного культивирования эндотелиальных клеток в условиях симулированной микрогравитации с использованием RPM15. В данной статье мы описываем пошаговую сборку и работу замкнутой системы перфузии с использованием независимой от ориентации ловушки для пузырьков и демонстрируем ее применимость для культивирования эндотелиальных клеток пупочной вены человека в качестве модели непрерывного культивирования клеток в условиях симулированной микрогравитации.

Система с замкнутым контуром состоит из микроконтроллера с драйвером двигателя для управления микронасосом с регулируемой частотой и напряжением, датчика потока жидкости, ловушки для пузырьков15 и микрофлюидного канала, содержащего адгезивные эндотелиальные клетки. Подробное описание отдельных компонентов приведено в таблице материалов. В приведенных ниже протоколах описаны сборка электроники системы (этап 1), сборка гидравлической части (этап 2), стерилизация и заполнение системы (этапы 3 и 4), интеграция микрофлюидной клеточной культуры (этап 4), сборка микронасосов и контроллера (этап 5), а также сборка всей системы в корпусе (этап 6). Система потока с замкнутым контуром была установлена на RPM для имитации микрогравитации с использованием специально изготовленного корпуса (этап 7).

Протокол

1. Электроника системы

  1. Подключите драйвер насоса к микроконтроллеру в соответствующих разъемах с маркировкой «mp-Highdriver4». 
  2. Подключите один кабель насоса в указанном месте к боковой стороне драйвера насоса с маркировкой «CH1 CH2». 
  3. Подключите один микронасос к одному из портов кабеля насоса. Убедитесь, что белый соединительный порт осторожно отодвинут от цветных проводов для полной вставки микронасоса. После того как микронасос будет полностью вставлен в соединительный порт, аккуратно прижмите белый соединительный порт обратно к цветным проводам, чтобы зафиксировать микронасос на месте.
  4. Используйте кабель macro-to-mini-USB для подключения платы Nano к компьютеру, на котором установлено приложение микроконтроллера.
  5. Прикрепите два резьбовых штуцерных адаптера к концам одного датчика потока жидкости. Используйте датчик потока жидкости для мониторинга и записи данных о скорости потока жидкости. Собранная система показана на Рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все компоненты, указанные в Разделе 1, подлежат замене только при необходимости, например, при их повреждении или начале ухудшения рабочих характеристик.

2. Соединения гидравлической системы

  1. При заполнении системы наполните полость независимой от ориентации ловушки пузырьков экспериментальной рабочей жидкостью примерно до 80% от максимального объема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Такой уровень заполнения обеспечивает более высокую степень улавливания пузырьков, при этом входной и выходной порты остаются погруженными в рабочую жидкость. Независимая от ориентации ловушка пузырьков имеет два боковых порта рядом с ее центром, которые служат прямыми соединениями с замкнутой системой потока, и совместимый с Luer верхний порт, позволяющий дополнительно заполнить полость при его открытии. Перед началом эксперимента крайне важно, чтобы верхний порт независимой от ориентации ловушки пузырьков был полностью герметизирован с помощью тефлоновой ленты и заглушки Luer для обеспечения полной замкнутости системы.
  2. Отрежьте четыре отрезка ПВХ-трубки длиной 10 cm (вн. д. 1.59 mm × внеш. д. 3.18 mm) для соединения всех компонентов контура потока. 
  3. Подсоедините один отрезок ПВХ-трубки к выходу микронасоса (стрелка указывает направление потока от входа к выходу). Используйте один черный нейлоновый круглый проставочный шайбу 3 mm (вн. д. 3.2 mm), надетую на ПВХ-трубку, чтобы надежно закрепить трубку на микронасосе. Подсоедините другой конец ПВХ-трубки к любому из боковых портов независимой от ориентации ловушки пузырьков. 
  4. Используйте второй отрезок ПВХ-трубки, чтобы соединить другой боковой порт независимой от ориентации ловушки пузырьков с адаптером входного штуцера датчика потока жидкости (стрелка указывает направление потока от входа к выходу). 
  5. Используйте третий отрезок ПВХ-трубки, чтобы соединить адаптер выходного штуцера датчика потока жидкости (т. е. сторону, в которую указывает стрелка) с одним Г-образным коннектором Luer. 
  6. Подсоедините последний отрезок ПВХ-трубки к входу того же микронасоса (стрелка указывает направление потока от входа к выходу). Используйте одну черную нейлоновую круглую проставочную шайбу 3 mm (вн. д. 3.2 mm), надетую на ПВХ-трубку, чтобы надежно закрепить трубку на микронасосе. Подсоедините другой конец ПВХ-трубки к одному Г-образному коннектору Luer.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все трубки следует заменять перед каждым экспериментом.

3. Экспериментальная подготовка и стерилизация системы

  1. Подготовьте бокс биологической безопасности для процесса стерилизации, чтобы обеспечить полную стерильность и безопасность клеточной культуры. 
  2. Подготовьте одну самостоящую центрифужную пробирку объемом 50 mL с 70% этанолом и одну самостоящую центрифужную пробирку объемом 50 mL со стерильной водой для клеточных культур.
  3. Поместите микроконтроллер в небольшой пластиковый пакет, оставив кабель насоса (Pump Cable) и микронасос снаружи. Загерметизируйте пластиковый пакет с помощью стяжки, чтобы защитить электронные компоненты. 
  4. Используйте распылитель с 70% этанолом и бумажные полотенца для стерилизации внешних поверхностей всех компонентов контура потока и всех вспомогательных экспериментальных материалов. НЕ используйте распылитель с 70% этанолом на электрических разъемах. Помещайте каждый компонент и материал в бокс биологической безопасности сразу после протирания 70% этанолом. 
  5. Подключите мобильную компьютерную станцию к микроконтроллеру с помощью кабеля macro-to-mini-USB и откройте компьютерное приложение микроконтроллера, чтобы установить частоту и напряжение двух микронасосов на 10 Hz и 240 V соответственно. Держите микронасос выключенным.
  6. Погрузите угловой разъем Luer, подключенный к микронасосу, непосредственно в самостоящую центрифужную пробирку объемом 50 mL с 70% этанолом. Подсоедините шприц объемом 12 mL с соединителем Luer «ма-ма» к другому угловому разъему Luer в том же контуре потока. 
  7. Вручную пережмите участок ПВХ-трубки, соединяющей микронасос и угловой разъем Luer, и убедитесь, что верхний порт независимого от ориентации ловушки пузырьков герметизирован тефлоновой лентой и заглушкой Luer. Другой рукой оттяните поршень шприца объемом 12 mL примерно на 5 mL, чтобы создать в системе достаточный вакуум. 
  8. Включите микронасос и отпустите зажим, установленный на предыдущем этапе. Пропустите 5 mL 70% этанола в шприц для обеспечения тщательной стерилизации системы. 
  9. Откройте верхний порт независимого от ориентации ловушки пузырьков, чтобы она заполнилась 70% этанолом. Когда независимая от ориентации ловушка пузырьков заполнится 70% этанолом примерно на 80%, выключите насос и полностью герметизируйте верхний порт тефлоновой лентой и заглушкой Luer. Осторожно встряхните независимую от ориентации ловушку пузырьков, чтобы убедиться в полной стерильности внутренней поверхности. 
  10. Извлеките угловой разъем Luer из центрифужной пробирки с 70% этанолом и включите микронасос, чтобы опорожнить систему. Как только весь 70% этанол будет втянут в шприц объемом 12 mL, отсоедините независимую от ориентации ловушку пузырьков от системы, снимите заглушку Luer и слейте содержимое ловушки пузырьков непосредственно в контейнер для отходов, чтобы удалить 70% этанол. 
  11. Повторите шаги 3.6–3.10, используя самостоятельную центрифужную пробирку объемом 50 mL со стерильной водой для клеточных культур вместо 70% этанола, и пропустите 15 mL стерильной воды для клеточных культур через каждый контур потока.

4. Подготовка системы и интеграция микрофлюидного клеточного канала

  1. После завершения стерилизации оставьте систему в шкафу биологической безопасности для вакуумного заполнения рабочей жидкостью. 
  2. Погрузите угловой коннектор Luer, подключенный к микронасосу, непосредственно в пластиковый контейнер (приблизительные размеры 80 mm × 50 mm × 25 mm), заполненный 30 mL среды для культивирования клеток. Подключите шприц объемом 12 mL к другому угловому коннектору Luer в том же контуре потока с помощью соединителя Luer «мама-ма». 
  3. Указательным пальцем и большим пальцем левой руки пережмите участок трубки PVC Tygon, соединяющий микронасос и угловой коннектор Luer, и правой рукой оттяните поршень шприца объемом 12 mL примерно на 5 mL, чтобы создать достаточный вакуум во всей системе. Убедитесь, что верхний порт независимого от ориентации ловушки для пузырьков герметизирован тефлоновой лентой и заглушкой Luer. 
  4. Включите микронасос и отпустите зажим, установленный на предыдущем этапе. Дайте 5 mL среды для культивирования клеток пройти в шприц для обеспечения тщательного заполнения системы.
  5. Откройте верхний порт независимой от ориентации ловушки для пузырьков, чтобы она заполнилась средой для культивирования клеток. Когда ловушка для пузырьков заполнится средой примерно на 80%, выключите насос и полностью герметизируйте верхний порт тефлоновой лентой и заглушкой Luer.
  6. Поместите микрофлюидный канал с культивируемыми клетками непосредственно в пластиковый контейнер размером 80 mm × 50 mm × 25 mm и поместите магнитный перемешиватель в центр микроканала с клетками, чтобы он не всплывал. Долейте в пластиковый контейнер среду для культивирования клеток до полного погружения всего предметного стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные клетки культивировали в ibidi µ-Slide VI0.4 до достижения 80% конфлюэнтности с использованием стандартных протоколов перед интеграцией в контур потока16.
  7. Удерживая угловые коннекторы Luer одного контура потока погруженными в среду для культивирования клеток, включите микронасос этого контура. Осторожно подсоедините угловые коннекторы Luer к одному из микроканалов, следя за тем, чтобы в точках соединения не образовывались пузырьки воздуха. После этого выключите микронасос.

5. Корпус для микроконтроллера и микронасосов (опционально)

  1. Используйте два винта M3 × 8 из нержавеющей стали, две шайбы M3 из нержавеющей стали и две гайки M3 из нержавеющей стали, чтобы закрепить изготовленное на заказ крепление поперечины на изготовленной на заказ нижней монтажной пластине. 
  2. Используйте четыре винта M3 × 12 из нержавеющей стали, четыре шайбы M3 из нержавеющей стали и четыре гайки M3 из нержавеющей стали, чтобы закрепить дно поликарбонатного корпуса на изготовленной на заказ нижней монтажной пластине. Используйте восемь нейлоновых шайб M3 (по две на каждый винт M3 × 12), чтобы оставить небольшой зазор между дном корпуса и нижней монтажной пластиной. 
  3. Используйте четыре винта M3, четыре нейлоновых шестигранных разъемных стойки M3 (па-ма) и четыре гайки M3 из нержавеющей стали, чтобы закрепить микроконтроллер на изготовленной на заказ внутренней монтажной пластине из акрила. Расположите нейлоновые шестигранные стойки между нижней частью микроконтроллера и акриловой монтажной пластиной.  
  4. Используйте два винта M3 × 8 из нержавеющей стали, две шайбы M3 из нержавеющей стали и две гайки M3 из нержавеющей стали, чтобы закрепить изготовленный на заказ держатель микронасосов в верхней части акриловой внутренней монтажной пластины. 
  5. Поместите микронасосы в изготовленный на заказ держатель так, чтобы стрелка на микронасосах была направлена в сторону драйвера насоса. 
  6. Используйте четыре винта M3 × 8 с полукруглой головкой из нержавеющей стали и четыре шайбы M3 из нержавеющей стали, чтобы закрепить внутреннюю акриловую монтажную пластину внутри поликарбонатного корпуса. 
  7. Вставьте четыре резиновых уплотнительных кольца в одну сторону поликарбонатного корпуса, где расположены четыре последовательных отверстия. Повторите процедуру для противоположной стороны с четырьмя последовательными отверстиями. 
  8. С помощью принтера этикеток пронумеруйте уплотнительные кольца от 1 до 4 слева направо с обеих сторон поликарбонатного корпуса.
  9. Установите два уплотнительных кольца O-Ring вокруг резьбовой части кабеля mini-USB (па-ма). После этого вставьте разъем «ма» кабеля mini-USB (па-ма) в отверстие в поликарбонатном корпусе с той же стороны, куда указывают стрелки на микронасосах. Закрепите разъем «ма» кабеля mini-USB (па-ма), установив еще одно кольцо O-Ring вокруг резьбовой части с внешней стороны поликарбонатного корпуса. 
  10. Загерметизируйте оставшееся отверстие в боковой части поликарбонатного корпуса универсальной клейкой лентой. Собранная система показана на Рисунке 2. 

6. Монтажная пластина верхней панели (опционально)

  1. Используйте четыре винта из нержавеющей стали M2 × 8 и четыре гайки из нержавеющей стали M2, чтобы закрепить два зажима для монтажа датчиков потока на изготовленной на заказ акриловой монтажной пластине верхней панели. 
  2. Используйте четыре винта из нержавеющей стали M3 × 12 и четыре гайки из нержавеющей стали M3, чтобы закрепить два изготовленных на заказ независимых от ориентации держателей ловушек для пузырьков на изготовленной на заказ акриловой монтажной пластине верхней панели. 
  3. С помощью плоскогубцев разрежьте стальную резьбовую шпильку M4 на четыре части длиной примерно 10 mm. Используйте эти четыре части в качестве четырех вертикальных стоек для закрепления монтажной пластины верхней панели над поликарбонатным кожухом. 
  4. С помощью ножниц вырежьте четыре отрезка полиуретановой трубки (вн. диам. 6.35 mm) длиной по 40 mm. Проденьте части стальной резьбовой шпильки M4 сквозь эти отрезки трубок, чтобы обеспечить достаточный зазор между монтажной пластиной верхней панели и крышкой поликарбонатного кожуха. 
  5. Расположив изготовленные на заказ независимые от ориентации держатели ловушек для пузырьков и монтажные зажимы сверху, проденьте одну из четырех частей резьбовой шпильки M4 наполовину через каждый угол изготовленной на заказ акриловой монтажной пластины верхней панели. Сверху на каждом отрезке резьбовой шпильки закрепите одну баранную гайку M4, одну гайку M4 и одну шайбу. 
  6. Проденьте каждый отрезок резьбовой шпильки M4 через одну круглую черную нейлоновую проставку 6 mm (внутр. диам. 3.2 mm) и один отрезок полиуретановой трубки длиной 40 mm. В конце закрепите одну баранную гайку M4 в нижней части каждой резьбовой шпильки M4. Расположите компоненты в следующем порядке: стальная баранная гайка M4, гайка из нержавеющей стали M4, шайба из нержавеющей стали M4, монтажная пластина верхней панели, черная нейлоновая круглая проставка, полиуретановая трубка и еще одна стальная баранная гайка M4. 
  7. С помощью универсальной клейкой ленты склейте две акриловые заготовки размером 75 mm × 25 mm друг с другом лицевыми сторонами так, чтобы длины акриловых пластин были параллельны друг другу. 
  8. С помощью ножниц вырежьте один отрезок двухстороннего вспененного скотча (шириной 25 mm × толщиной 1.6 mm) длиной 75 mm. Приклейте одну сторону двухстороннего вспененного скотча длиной 75 mm к акриловой заготовке размером 75 mm × 25 mm так, чтобы длина вспененного скотча и длина акриловой заготовки были параллельны друг другу. 
  9. Используйте эту акриловую заготовку с вспененным скотчем в качестве прокладки, которая располагается поверх коленчатых Luer-коннекторов микрослайда, чтобы предотвратить их ослабление во время экспериментов по имитации микрогравитации. Закрепите прокладку из акриловой заготовки со вспененным скотчем и микрослайд вместе с помощью изготовленного на заказ держателя для микрослайдов.

7. Установка на машину случайного позиционирования (RPM)

  1. С помощью двустороннего вспененного скотча закрепите все компоненты системы потока на монтажной пластине RPM. Избегайте наклеивания скотча непосредственно под микроканалами для культивирования клеток, чтобы обеспечить газообмен клеток во время эксперимента. Убедитесь, что микрослайд закреплен в центре монтажной пластины, чтобы во время эксперимента он находился на осях вращения RPM. 
  2. Вставьте монтажную пластину в верхний слот U-образной рамы RPM и закрепите её на раме с помощью винта и шайбы, входящих в комплект RPM. 
  3. Используйте заранее правильно распаянный разъем-переходник DB15 для прямого подключения компьютерной станции к RPM, которая затем будет подключена к микроконтроллеру и датчикам потока жидкости с помощью второго заранее распаянного разъема-переходника DB15. 
    ПРИМЕЧАНИЕ: Токосъемное кольцо RPM соединяет два разъема DB15, фактически связывая компьютерную станцию с микроконтроллером и датчиком потока.
  4. Подключите кабели питания к микроконтроллеру и датчику потока, и закрепите свободные участки кабелей пластиковыми стяжками. Кабели должны быть плотно закреплены, но убедитесь, что электрические соединения не подвергаются натяжению. Собранная система показана на Рисунке 3. 

8. Сбор данных проточной цитометрии

  1. Запустите программное обеспечение датчика потока на компьютерной станции для мониторинга скорости потока. 
  2. Используйте компьютерное приложение микроконтроллера для регулировки напряжения насоса до тех пор, пока датчик потока не зафиксирует требуемую скорость потока.
  3. После установки скорости потока начните регистрацию данных о потоке в течение 24 h.

Результаты

Перед сбором результатов по гидродинамике или клеточным культурам, как описано ниже, следует проверять целостность системы на каждом основном контрольном этапе протокола в процессе сборки и заполнения (прайминга). Электронные соединения можно легко проверить, подключив микроконтроллер и датчик потока жидкости к компьютеру и установив связь с каждым компонентом через соответствующее прикладное программное обеспечение. Соединения трубок на зажимных фитингах считаются достаточными, когда трубка задвинута за зажим; любой жидкостный компонент, имеющий любое количество трещин, следует немедленно заменить. Заполнение системы должно привести к созданию контура потока, который является не только стерильным, но и визуально свободным от пузырьков; удалите любые видимые пузырьки, осторожно постукивая по месту их расположения.

После завершения настройки экспериментальной установки систему потока следует запустить и контролировать в течение 1 h перед началом 24 h периода тестирования, чтобы убедиться в отсутствии утечек в системе и отсутствии пузырьков воздуха на выходе из ловушки для пузырьков. Кроме того, если система потока работает в условиях симулированной микрогравитации, аппарат для симуляции микрогравитации должен свободно вращаться после установки системы потока; это можно проверить, просто вращая аппарат вручную, а также путем наблюдения за работой аппарата по программе симуляции микрогравитации в течение 1 h перед началом 24 h периода тестирования.

Характеристики системы перфузии с замкнутым контуром

Данные с датчиков потока, зарегистрированные в течение 24 ч, представлены на рисунке 4. На рисунке сравнивается скорость потока при нормальной гравитации в течение 24 ч в контуре потока с использованием и без использования независимой от ориентации ловушки для пузырьков. Пузырьки воздуха представлены в виде высокоинтенсивных всплесков. Непрерывные всплески, наблюдаемые в контуре без ловушки для пузырьков, исчезают после установки в контур независимой от ориентации ловушки для пузырьков. Это сравнение демонстрирует не только необходимость использования ловушки для пузырьков, но и стабильную эффективность независимой от ориентации ловушки для пузырьков.

Культивирование эндотелиальных клеток в условиях потока

Для полной оценки жизнеспособности системы потока без пузырьков воздуха был проведен 24-часовой эксперимент в условиях микрогравитации с культурами эндотелиальных клеток с использованием ловушки для пузырьков и без нее. По окончании эксперимента систему разобрали, стараясь не допустить высыхания клеток. Сразу после этого клетки фиксировали 4% формальдегидом и окрашивали фаллоидином CF594 для визуализации актина и Hoechst 33342 для ядер согласно стандартным протоколам иммуноокрашивания15. Визуализацию клеток проводили с помощью конфокальной микроскопии (Zeiss LSM 700). На рисунке 5 представлены репрезентативные изображения клеток для каждого режима потока. Изображения показывают, что ловушки для пузырьков (рисунок 5B) полностью восстанавливают жизнеспособность и рост клеток, тогда как в канале без ловушки для пузырьков клетки отслаиваются (рисунок 5A). Ориентацию ядер на изображениях в случае с использованием ловушки для пузырьков можно количественно оценить с помощью ImageJ, так как при ее отсутствии клеток не наблюдалось15.

Схема микрофлюидной системы с микронасосами, датчиком потока, трубками контура жидкости и ловушкой для пузырьков в эксперименте.
Рисунок 1. Компоненты системы потока с замкнутым контуром. Жидкость, выходящая из микронасоса, сначала попадает в ловушку для пузырьков для их фильтрации, затем проходит через датчик для регистрации данных о потоке, прежде чем поступить в микрофлюидный чип. Система рассчитана на одновременную работу двух контуров потока, здесь показан только один полный контур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Схема микрофлюидного чипа; включает корпус микронасоса, датчик потока, ловушку для пузырьков и компоненты рамы.
Рисунок 2. Узлы системы потока для установки на аппарате случайного позиционирования (RPM). Микронасосы и электроника защищены корпусом. После подготовки (т. е. заполнения жидкостью) верхняя панель закрепляется на корпусе с помощью резьбовых шпилек, при этом микрофлюидный чип располагается по центру между ними. Датчики потока и ловушки для пузырьков установлены на верхней панели. Корпус электроники прикреплен к монтажной пластине с перекладиной для фиксации на RPM. Показаны два независимых контура потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема установки для электрофореза для разделения белков, лабораторное оборудование для электрофоретического анализа.
Рисунок 3. Собранная перфузионная система, установленная на машине случайного позиционирования (RPM). Вся перфузионная система закреплена путем привинчивания поперечины монтажной пластины к RPM. Кабели питания электроники организованы путем обмотки вокруг центральной периферии, что обеспечивает размещение всей сборки в пределах ограничений полезного пространства платформы RPM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Графики анализа скорости потока, данные эксперимента, установка A против B, время (h) против скорости потока (mL/min).
Рисунок 4. Сравнение репрезентативных графиков скорости потока. Сравнение графиков скорости потока между (A>) контуром потока без независимого от ориентации пузырькового уловителя и (B>) контуром потока с независимым от ориентации пузырьковым уловителем. Данный эксперимент проводился в условиях нормальной гравитации (т. е. без вращения) с датчиком потока, установленным непосредственно перед микрослайдом в обоих контурах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Микрофотографии анализа жизнеспособности клеток, демонстрирующие разницу в плотности клеток; красное и синее окрашивание.
Рисунок 5. Репрезентативные изображения эндотелиальных клеток, культивируемых в условиях потока с использованием и без использования независимой от ориентации ловушки для пузырьков. (A) Поток без ловушки для пузырьков, демонстрирующий низкую адгезию клеток; (B) Поток с ловушкой для пузырьков, демонстрирующий высокую адгезию клеток. Актин показан красным цветом, ядра — синим. Масштабная линейка = 200 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Была разработана микрофлюидная система с замкнутым контуром, независимая от ориентации в пространстве и способная функционировать в условиях отсутствия гравитации; показано, что данная система пригодна для культивирования эндотелиальных клеток в условиях физиологического потока. Основными компонентами системы являются микроконтроллер, микронасос, датчик потока жидкости, микрослайд для культивирования клеток и специально разработанная, напечатанная на 3D-принтере ловушка для пузырьков, независимая от ориентации.

Ловушки для пузырьков, используемые в данной работе, изготовлены из стереолитографической смолы15, которая обычно обладает низкой цитосовместимостью при использовании без предварительного вымывания неполимеризованных мономеров, даже в случае смол биомедицинского класса17,18. Таким образом, перед внедрением ловушки для пузырьков в систему важно оценить, может ли химический выщелачиваемый состав материала изготовленной на заказ ловушки снизить жизнеспособность клеток.

Помимо выбора цитосовместимых материалов, наиболее критическими этапами протоколов настройки эксперимента являются герметизация ловушки для пузырьков, погружение микрослайда для заполнения системы (прайминга) и организация кабелей при использовании аппарата для симуляции микрогравитации. После того как будет убеждено, что заполненная жидкостью система не содержит пузырьков, верхний порт ловушки для пузырьков необходимо герметично закрыть тефлоновой лентой и люэровским пробкой (Luer plug) для предотвращения утечек. Из-за присущей слоям стереолитографической печати шероховатости поверхности при индивидуальном изготовлении одной только люэровской пробки недостаточно для обеспечения качественной герметизации. Погружение микрослайда в резервуар с культуральной средой оказалось наиболее эффективным методом обеспечения полного удаления пузырьков при прайминге, особенно в месте соединения Г-образного коннектора с микрослайдом. Другие опробованные методы прайминга, такие как включение трехходовых кранов в контур потока, приводили к сохранению значительного количества пузырьков после заполнения, которые было почти невозможно удалить, не отсоединив Г-образный коннектор от микрослайда. Наконец, неупорядоченные электронные кабели могут препятствовать работе аппарата для симуляции микрогравитации, вызывая его непреднамеренную остановку. Даже после закрепления всех кабелей и проверки свободного вращения аппарата перед началом эксперимента, за системой и аппаратом следует наблюдать каждые 3–4 часа бодрствования, чтобы минимизировать риск остановки.

Данная система может быть адаптирована для более сложных клеточных культур или трехмерных (3D) тканевых чипов и может стать ценным инструментом для совершенствования моделей in vitro с целью изучения механизмов заболеваний, поддержки разработки лекарственных препаратов, оценки воздействия стрессоров космического полета и подготовки контрмер. Например, созданные инженерные тканевые платформы, отправленные на МКС, использовались для изучения влияния микрогравитации и радиационного воздействия5, а экстремальные условия микрогравитации применялись для имитации фенотипов старения или создания крупных многоклеточных сфероидов для исследования рака19. Во всех таких случаях независимый от ориентации пузырьковый ловушка и система потока могут быть использованы либо для изучения влияния напряжения сдвига, либо для настройки массопереноса с целью достижения желаемых результатов.

По сравнению с другими подходами к культивированию клеток, представленная здесь система обладает двумя ключевыми преимуществами: (1) обеспечением непрерывного потока по замкнутому контуру и (2) компактностью и автономностью. Некоторые методы культивирования клеток основаны на использовании статических флаконов или лунок, в которых отсутствует физиологически имитирующее напряжение сдвига жидкости. Некоторые коммерческие системы (например, ibidi Pump System, Грэфелфинг, Германия) позволяют достичь непрерывного однонаправленного потока за счет переключателей перекрестных клапанов между чередующимися шприцами. Однако работа такого аппарата обычно требует отдельной системы управления актуаторами с интерфейсом компьютера, что делает его ни компактным, ни автономным. Кроме того, интеграция надежной ловушки для пузырьков, описанной в данной работе, облегчает проведение длительных экспериментов без постоянного присутствия оператора.

Одной из потенциальных модификаций системы в будущих итерациях является микронасос, в частности, для изучения влияния более высокого напряжения сдвига на эндотелиальные клетки. Микронасосы, использованные при получении репрезентативных данных, были способны создавать напряжение сдвига только до 7.5 dyn/cm2, в то время как эндотелиальные клетки in vivo обычно подвергаются воздействию напряжения сдвига, которое почти в три раза выше20. Потенциальные области применения данной системы в будущем, помимо непрерывного культивирования клеток в условиях симулированной микрогравитации, включают другие портативные приложения, требующие непрерывной рециркуляции жидкости. К таким возможностям относятся скрининг лекарственных средств, анализы на загрязнение или токсичность, испытания на коррозию, жидкостное охлаждение электроники и экологический мониторинг загрязняющих веществ.

Раскрытие информации

Всенаправленная пузырьковая ловушка защищена патентной заявкой US 18634723. Дополнительных конфликтов интересов нет.

Благодарности

Данная работа была поддержана грантом NASA по космической биологии № 80NSSC21K0272.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% этанолFisher ScientificA4094 Используется для приготовления 70% раствора этанола для стерилизации системы (минимально необходимый объем — 35 мл)
черный нейлоновый круглый проставочный кольцо 6 мм, наружный диаметр 7 мм, внутренний диаметр 3,2 ммExqutooZH-050Фиксирует верхний кронштейн к корпусу (минимум 4 шт.)
Акриловая пластина, 75 мм в длину x 25 мм в ширинуPolymersanACRCSФиксирует Г-образные переходники Люера на предметном стекле с микроканалами (минимум 1 шт.)
Кабель USB 2.0 с разъемами A-male и mini-BUgreen Group Limited10355Для подключения компьютера к микроконтроллеру (минимум 1 шт.)
Газоловушка(Специальный заказ)Для предотвращения попадания пузырьков воздуха в микрослайд (минимум 1 шт.)
Держатель для ловушки пузырьковПользовательскийДержатель, напечатанный на 3D-принтере, для фиксации газоловушки (минимум 2 шт.)
Вода для культур клетокFisher ScientificMT2505CIИспользуется для вымывания всех остатков этанола после стерилизации (необходимый минимальный объем — 30 мл)
Крепление контроллера, насоса и корпуса (внутреннее крепление)Индивидуальный заказМонтажная панель внутри корпуса (минимум 1 шт.)
Крепление на поперечинуСпециальныйКрепежная перекладина, прикрепленная к монтажной пластине корпуса (минимум 1 шт.)
Разветвители DB15 с разъемами «папа» и «ма»ANMBESTANMBEST_MDDB15Для подключения компьютера к устройству случайного позиционирования, а затем к микроконтроллеру (минимум 1 шт.)
Угловой коннектор «Люэр — штуцер»ibidi10802Соединяет микрослайд с контуром потока (минимум 2 шт.)
Двусторонний вспененный скотч3M4026Для прижима Г-образных люэр-адаптеров на микрофлюидном стекле (минимум 1 шт.)
Корпус (60 мм x 140 мм x 140 мм)Хэммонд154Q2GYCLСлужит корпусом для микроконтроллера и микронасосов (минимум 1 шт.)
Крепление корпуса (нижнее крепление)Специальный заказМонтажная пластина под корпусом (минимум 1 шт.)
Соединитель Люэра «самка-самка»БоаоБоао-Шприцы-WAD2354Используется для соединения шприца с Г-образным коннектором Люэра при подготовке линий подачи среды для культивирования клеток (минимум 1 шт.)
среда для культивирования клеток Gibco RPMI 1640Thermo Fisher11875093Используется для культивирования эндотелиальных клеток (минимально необходимый объем — 50 мл)
Люверсы, 9/16" диаметр отверстия и 1/8" толщина, 1/8" ИдентификаторMcMaster-Carr9307K863Для вывода трубок из корпуса и ввода в него (минимум 8 шт.)
адаптер-фитинг IDEX P-646, 1/16" переходник с штуцером на резьбу 1/4-28IDEXP-646Подключите датчик потока к контуру потока (необходимо минимум 2)
Датчик расхода жидкостиSensirionSLF3-130FДля сбора данных проточной цитофлуориметрии (минимум 1)
Зажим для крепления датчика потока жидкостиSensirionМонтажный зажим SLF3xкрепление SLF3x (минимум 2 шт.)
Шприц с люэровским замком (12 мл)McKesson414624Для вакуумного заполнения (минимум 1 шт.)
Заглушка ЛюэраCole-ParmerUX-5010-3Для герметизации пузырьковых ловушек, не зависящих от ориентации (минимум 1 шт.)
Гайка М2 из нержавеющей сталиVIGRUEB07PJQC7T6Крепление датчиков потока жидкости к верхнему основанию (требуется минимум 4 шт.)
M2×винты из нержавеющей стали (8 шт.)VIGRUEB07PJQC7T6Крепление датчиков потока жидкости к верхнему основанию (требуется минимум 4 шт.)
нейлоновая шестигранная стойка-дистанцер M3 с внешним и внутренним резьбовым концомМейджуболB0GC6GN9S7Закрепление mp-Multiboard на внутреннем креплении (минимум 4 шт.)
нейлоновая шайба M3Сутемрибор7,81573E+1Закрепите корпус к нижнему креплению (требуется минимум 16 шт.)
гайка М3 из нержавеющей сталиVIGRUEB07PJQC7T6Крепление корпуса к нижнему основанию, поперечной перекладины к нижнему основанию, держателя насоса к внутреннему креплению (минимум 16 шт.)
шайба M3 из нержавеющей сталиVIGRUEB07PJQC7T6Крепит перекладину к нижнему креплению, корпус к нижнему и внутреннему креплениям, внутреннее крепление к держателю насоса (минимум 12 шт.)
M3×винт с полукруглой головкой из нержавеющей стали, 12VIGRUEB07PJQC7T6Крепит корпус к нижнему основанию (требуется минимум 4 шт.)
M3×винт с внутренним шестигранником из нержавеющей стали 12FgruhFG01-3Фиксирует держатель ловушки для пузырьков на креплении верхней палубы (минимум 2 шт.)
M3×винт с полукруглой головкой под крестообразный шлиц Phillips, 6 шт.МейджуболB0GC6GN9S7Фиксация mp-Multiboard к внутреннему креплению (требуется минимум 4 шт.)
M3×винты из нержавеющей стали (8 шт.)VIGRUEB07PJQC7T6Фиксация поперечной перекладины к нижнему креплению, корпуса к внутреннему креплению, держателя насоса к внутреннему креплению (минимум 8 шт.)
гайка M4 из нержавеющей сталиVIGRUEB07PJQC7T6Фиксирует верхнее крепление к корпусу (минимум 4 шт.)
Шайба M4 из нержавеющей сталиVIGRUEB07PJQC7T6Фиксирует верхнее крепление к корпусу (требуется минимум 4 шт.)
Резьбовая шпилька из стали M4-0,7ArwnnkloAR01Разрезать на отрезки длиной примерно 6 дюймов (необходимо минимум 4 штуки)
Кабель mini USB «папа — мама»PlinkwirekbPCM-0725-LДля подключения компьютера к микроконтроллеру (минимум 1 шт.)
Переходник mini USB с штекера на гнездо, Г-образныйUCEC4326453558Для подключения компьютера к микроконтроллеру (опционально) (минимум 1 шт.)
Держатель микроканаловСпециальный заказДержатель, напечатанный на 3D-принтере, для центрирования микроканала (минимум 1 шт.)
Микроканальный предметный слайд, µ-слайд VI 0.4ibidi80606Для клеточных анализов в условиях потока (минимум 1 шт.)
МикронасосБартельсMP6-HYBДля создания потока (минимум 1 шт.)
Держатель микронасосаСпециальный заказМонтажное крепление для фиксации микронасоса (минимум 1 шт.)
mp-Multiboard с mp-Highdriver4БартельсBM-E-05Для управления настройками частоты и напряжения микронасосов (минимум 1 шт.)
Кабель насоса mp-pumpБартельсBM-A-05Используется для электрического соединения mp-Multiboard с микронасосами (минимум 1 шт.)
Нейлоновый круглый проставочный кольцо, наружный диаметр 7 мм, внутренний диаметр 3,2 ммХарфингтон2037015Для закрепления трубок в микронасосе (минимум 2 шт.)
Уплотнительное кольцоZDBB7,17327E+1Фиксирует кабель mini USB («па» — «ма») на корпусе (опционально)  (Минимум 3)
Пластиковый контейнерHerdusaПЛАСТИКОВЫЙ КОНТЕЙНЕР HDS10Используется в качестве открытого резервуара для среды культивирования клеток (минимум 1 шт.)
Полиуретановая трубка, 1/8" вн. диам., 1/4" оптическая плотностьПАРКЕР95U-4-062-BLU-010Фиксация верхнего крепления к корпусу (минимально необходимое расстояние 1,6 см)
Машина случайного позиционированияAIRBUSУстановка случайного позиционирования 2.0 (минимум 1 шт.)
USB-кабель SCC1SensirionSCC1-USB 2MПодключение датчиков потока жидкости к компьютеру (минимум один)
Самостоятельно стоящая центрифужная пробиркаPEKYBIOB0C13GZVD6Используются для хранения воды для культур клеток/70% этанола (минимум 2 шт.)
Разделитель, алюминиевый, наружный диаметр 8 мм, длина 20 ммMcMaster-Carr9469A062Минимальная потребность 4
Трубка Tygon ПВХ 1/16" ID x 1/8" ОП (оптическая плотность)Saint-GobainB-4-3Соединяет все компоненты контура потока (минимальная необходимая длина — 40 см)
Крепление верхней панелиСпециальный заказМонтажная пластина, подключенная к датчикам потока жидкости и ловушке для пузырьков (минимум 1 шт.)
Барашковая гайка, M4 x 0,7 мм, оцинкованная стальСиптенкS-TH-DLM-02Фиксирует верхний монтажный элемент к корпусу (требуется минимум 4 шт.)
Стяжка-хомутПожалуйста, предоставьте текст для перевода.7,32073E+1Фиксация кабелей при монтаже системы к RPM (требуется минимум 4 шт.)

Ссылки

  1. Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
  2. Krittanawong C, et al. Human health during space travel: state-of-the-art review. Cells. 2023;12(1):40.
  3. Parafati M, et al. Human skeletal muscle tissue chip autonomous payload reveals changes in fiber type and metabolic gene expression due to spaceflight. NPJ Microgravity. 2023;9:77.
  4. Mair DB, Tsui JH, Higashi T, Kim D. Spaceflight-induced contractile and mitochondrial dysfunction in an automated heart-on-a-chip platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(40):e2404644121.
  5. Kim S, et al. Skeletal muscle-on-a-chip in microgravity as a platform for regeneration modeling and drug screening. Stem Cell Rep. 2024;19(8):1061-1073.
  6. Mu X, et al. Small tissue chips with big opportunities for space medicine. Life Sci Space Res (Amst). 2022;35:150-157.
  7. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23:467-491.
  8. Kong JS, Kim J, Jang J, Cho D. Advances and applications of organ-on-a-chip technology. Cell Rep Methods. 2026;6(3):101361.
  9. He X, et al. How to prevent bubbles in microfluidic channels. Langmuir. 2021;37(6):2187-2194.
  10. Gao Y, Wu M, Lin Y, Xu J. Trapping and control of bubbles in various microfluidic applications. Lab Chip. 2020;20(24):4512-4527.
  11. Yang M, et al. Emergence of debubblers in microfluidics: A critical review. Biomicrofluidics. 2022;16(3):031503.
  12. Zhang Q, et al. Bubble nucleation and growth on microstructured surfaces under microgravity. NPJ Microgravity. 2024;10:13.
  13. Radtke AL, Herbst-Kralovetz MM. Culturing and applications of rotating wall vessel bioreactor derived 3D epithelial cell models. J Vis Exp. 2012;(62):e3868.
  14. Wadhwa A, Bruun L, Petersen JCG, Petersen LG. Guidelines for use of the random positioning machine as a reduced-gravity analog. Sci Rep. 2026;16:10012.
  15. Vegunta B, et al. Orientation-independent bubble trap with internal partition for robust operation of microfluidic systems. Lab Chip. 2025;25(14):3423-3429.
  16. Evani SJ, et al. Monocytes mediate metastatic breast tumor cell adhesion to endothelium under flow. FASEB J. 2013;27(8):3017-3029.
  17. Musgrove HB, Catterton MA, Pompano RR. Applied tutorial for the design and fabrication of biomicrofluidic devices by resin 3D printing. Anal Chim Acta. 2022;1209:339742.
  18. Nam N, Hwangbo N, Jin G, Shim J, Kim J. Effects of heat-treatment methods on cytocompatibility and mechanical properties of dental products 3D-printed using photopolymerized resin. J Prosthodont Res. 2023;67(1):121-131.
  19. Shelhamer M, et al. Selected discoveries from human research in space that are relevant to human health on Earth. NPJ Microgravity. 2020;6:5.
  20. Fisher AB, Chien S, Barakat AI, Nerem RM. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2001;281(3):L529-L533.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.