Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиная модель повреждения легких, ассоциированного с коронавирусной инфекцией 2019 года, индуцированного коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2 и липополисахаридом

109 просмотров

⸱

11 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Sichuan Center for Disease Control and Prevention

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается модель повреждения легких у мышей, ассоциированного с коронавирусной инфекцией 2019 года, индуцированного комбинированным интраназальным введением коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 и липополисахарида. Эта модель позволяет исследовать легочные воспалительные реакции, нарушение ответов интерферона I типа и возможные терапевтические вмешательства.

Аннотация

Несмотря на повсеместное внедрение вакцинации и противовирусной терапии, инфекция SARS-CoV-2 продолжает вызывать значительную заболеваемость и смертность среди уязвимых групп населения, что подчеркивает настоятельную необходимость в надежных экспериментальных моделях для исследования патогенеза COVID-19, выяснения механизмов действия лекарственных препаратов и оценки потенциальных терапевтических стратегий. Инфекция SARS-CoV-2 может вызвать тяжелое повреждение легких, характеризующееся избыточным воспалительным ответом и нарушением противовирусного иммунитета, опосредованного интерфероном I типа (IFN-I); однако современные модели на животных в ограниченной степени воспроизводят нарушения иммунно-воспалительных реакций, связанных с COVID-19. Для воспроизведения ключевых иммунопатологических особенностей COVID-19 была разработана модель повреждения легких у мышей, индуцированного SARS-CoV-2 и LPS. Данная модель вызывает выраженные патологические изменения в тканях легких, включая инфильтрацию воспалительными клетками, разрушение структуры альвеол и повышенную экспрессию провоспалительных цитокинов, что сопровождается нарушением ответов IFN-I. В этом исследовании приведено детальное описание процедур, использованных для создания мышиной модели повреждения легких, индуцированного SARS-CoV-2 и LPS, а также представлена систематическая характеристика модели на основе анализа гистопатологических изменений легких, вирусной нагрузки, уровня воспалительных цитокинов и IFN-I. Эта модель представляет собой экспериментальную платформу для изучения иммунно-воспалительных механизмов, лежащих в основе повреждения легких при COVID-19, и процессов восстановления легочной ткани, а также служит базой для оценки терапевтических стратегий, направленных на облегчение иммунно-воспалительной дисрегуляции и способствование восстановлению функции легких.

Введение

С момента своего появления в конце 2019 года вирус SARS-CoV-2 стал серьезным вызовом для мирового здравоохранения, а продолжающаяся эволюция вируса по-прежнему создает сложности для существующих вакцин и терапевтических стратегий1,2,3. Поэтому дальнейшее изучение повреждения легких, связанного с COVID-19, необходимо для выяснения механизмов заболевания и совершенствования терапевтических стратегий.

Инфекция SARS-CoV-2 может вызвать тяжелое поражение легких и даже привести к развитию острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) и синдрома полиорганной недостаточности4,5. Растущий объем данных свидетельствует о том, что патогенез поражения легких, ассоциированного с COVID-19, крайне сложен, а его ключевым признаком является дисрегуляция иммунного и воспалительного ответов6,7,8,9. С одной стороны, инфекция SARS-CoV-2 может индуцировать чрезмерный воспалительный ответ, приводящий к массивному выбросу провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-1β (IL-1β) и фактор некроза опухоли-α (TNF-α), что запускает так называемый «цитокиновый шторм»10,11, который считается основным фактором поражения легких и прогрессирования заболевания. С другой стороны, на ранней стадии инфекции SARS-CoV-2 может подавлять ответ IFN-I хозяина посредством множества механизмов, что приводит к нарушению опосредованного IFN-I противовирусного иммунитета12,13,14. Соответственно, отсроченный интерфероновый ответ в сочетании с повышенным уровнем провоспалительных цитокинов считается характерным признаком COVID-196,15.

В настоящее время доступные модели COVID-19 на животных в значительной степени опираются на трансгенных мышей hACE2, адаптированные к мышам вирусные штаммы или другие виды, такие как хорьки и нечеловеческие приматы16,17. Однако традиционные модели инфекции SARS-CoV-2 у мышей часто не позволяют полностью воспроизвести гипервоспалительные признаки COVID-1918,19,20. LPS, агонист TLR4, индуцирует выраженные воспалительные ответы и широко используется в моделях острого повреждения легких21. Таким образом, описанная в данном исследовании модель, индуцированная SARS-CoV-2 и LPS, предназначена для исследований, сосредоточенных на повреждении легких, связанном с COVID-19, в частности, на механизмах, лежащих в основе избыточной воспалительной активации и нарушенных противовирусных иммунных ответов. По сравнению с моделями только с SARS-CoV-2, этот подход подчеркивает иммунно-воспалительные особенности, сохраняя при этом контекст вирусной инфекции. Данная модель обладает значительным потенциалом для изучения иммунно-воспалительных механизмов, а не для моделирования передачи вируса или полного естественного течения инфекции SARS-CoV-2.

В данном протоколе описывается процедура создания мышиной модели повреждения легких, ассоциированного с COVID-19, индуцированного SARS-CoV-2 и LPS. Учитывая ограниченность существующих моделей в воспроизведении иммунно-воспалительной дисрегуляции, характерной для COVID-19, данный подход представляет собой практическую платформу для изучения механизмов заболевания и оценки потенциальных терапевтических стратегий. Модель была систематически оценена с помощью гистопатологии легких, определения вирусной нагрузки, анализа воспалительных цитокинов и ответов IFN-I.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В данном исследовании была создана модель повреждения легких, ассоциированного с COVID-19, у мышей посредством интраназального введения SARS-CoV-2 и LPS, что представляет собой стабильную и экономически выгодную альтернативу трансгенным моделям мышей. Экспериментальный протокол был одобрен Центром по контролю и профилактике заболеваний провинции Сычуань и получил одобрение комитета по этике работы с животными [Sichuan CDC (Animal Ethics) Approval No. 005 (2025)]. Все процедуры проводились в строгом соответствии с соответствующими руководствами и правилами биобезопасности.

Подробная информация об основных реагентах и оборудовании представлена в Таблице материалов.

1. Дизайн протокола исследования

  1. Случайным образом распределите мышей BALB/c в контрольную группу или группу модели.
  2. В день 0 введите мышам группы модели SARS-CoV-2 интраназально.
  3. В день 2 введите мышам группы модели LPS интраназально.
  4. В соответствующие моменты времени введите мышам контрольной группы равный объем физиологического раствора интраназально.
  5. Эвтаназируйте всех мышей на 3-й день после инфицирования SARS-CoV-2 и заберите ткани легких для валидации модели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Схема экспериментального процесса представлена на рисунке 1A.

2. Подготовка

  1. Подготовка животных
    1. Используйте самок мышей BALB/c в возрасте 6–8 месяцев и массой примерно 25–30 g, не имеющих специфических патогенов (SPF).
    2. С помощью таблицы случайных чисел случайным образом распределите мышей в контрольную или модельную группу по четыре животных в каждой группе.
    3. Содержите мышей в стандартных лабораторных условиях со свободным доступом к корму и воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие исследования показали, что старые мыши более восприимчивы к интраназальному заражению SARS-CoV-2, чем молодые мыши18,22. Поэтому в данном исследовании были выбраны старые мыши BALB/c для облегчения создания модели повреждения легких, ассоциированного с SARS-CoV-2.
    4. Интраназально инокулируйте каждую мышь 100 µL вирусной суспензии, что соответствует конечной инфекционной дозе 4.5 x 105 TCID₅₀ на мышь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SARS-CoV-2 был предоставлен Центром по контролю и профилактике заболеваний провинции Сычуань. В данном исследовании использовался вариант Omicron вируса SARS-CoV-2 с титром вирусного стока 4.5 x 106 TCID₅₀/mL.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Поскольку SARS-CoV-2 является высокопатогенным микроорганизмом, все процедуры с вирусом следует проводить в установлении для работы с животными уровня биобезопасности 3 (ABSL-3). При использовании других вариантов вируса или моделей животных оптимизируйте инфекционную дозу на основе предварительных экспериментов.
  2. Приготовление рабочих растворов
    1. Приготовление стокового раствора LPS: Отвесьте 3 mg порошка LPS и растворите его в 1 mL физиологического раствора. Осторожно перемешайте или непрерывно вортексируйте до полного растворения для получения стокового раствора с концентрацией 3 mg/mL. Перед введением дополнительно разбавьте стоковый раствор физиологическим раствором до требуемой рабочей концентрации в соответствии с массой тела мышей.
    2. Приготовление раствора анестетика: Реконструируйте порошок стерильной водой для инъекций, входящей в комплект Zoletil, чтобы приготовить раствор с необходимым массо-объемным соотношением для последующего использования.
    3. Приготовление рабочего раствора вируса: Перед использованием медленно разморозьте 1 mL вирусной суспензии SARS-CoV-2 на льду в боксе биологической безопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении и использовании всех рабочих растворов следуйте инструкциям соответствующих производителей.

3. Интраназальное введение препаратов мышам

  1. Взвесьте каждую мышь перед введением препаратов и зафиксируйте массу тела.
  2. Рассчитайте дозы Zoletil и LPS исходя из массы тела каждой мыши.
  3. Приготовьте соответствующие рабочие растворы и наберите необходимые объемы в подходящий шприц для последующего введения.
  4. Фиксация мыши: Осторожно захватите мышь за загривок большим и указательным пальцами левой руки, удерживая кожу за ушами и шеей.
  5. Поместите животное на ладонь, используя безымянный палец и мизинец для фиксации спины и хвоста. Расположите мышь в положении на спине так, чтобы живот был полностью открыт, а тело стабилизировано.
  6. Дезинфекция: Дезинфицируйте место инъекции в брюшную полость 75% этанолом с помощью стерильного ватного тампона.
  7. Анестезия: Введите иглу шприца с Zoletil (25mg/kg) примерно на 0,5 cm латеральнее срединной линии нижней части живота. После прокола кожи продвиньте иглу под углом 45° в брюшную полость на глубину примерно 2–3 mm. Выполните аспирацию, чтобы убедиться в отсутствии крови, затем медленно введите анестетик.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте дозу анестетика на основе предварительных экспериментов, чтобы обеспечить адекватную анестезию и минимизировать смертность. Избегайте повторных проколов для минимизации повреждения тканей.
  8. Подтверждение анестезии: Подтвердите состояние анестезии, наблюдая за стабильным и регулярным дыханием без признаков одышки или респираторного дистресса.
  9. Интраназальное введение SARS-CoV-2 (день 0): Медленно и по каплям введите 100 µL вирусной суспензии SARS-CoV-2 (по 50 µL в каждую ноздрю) в наружные ноздри с помощью микропипетки или шприца во время стабильного дыхательного цикла и в начале вдоха.
  10. Чередуйте ноздри для обеспечения равномерного вдыхания. Мышам контрольной группы введите равный объем физиологического раствора по той же процедуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите раствор по каплям, следя за тем, чтобы каждая капля была вдохнута в носовую полость перед нанесением следующей, пока не будет достигнут целевой объем.
  11. Обращение после введения: После интраназального введения удерживайте голову мыши в слегка приподнятом положении в течение примерно 30–60 s для облегчения доставки раствора в нижние дыхательные пути. Верните мышей в клетки после появления признаков выхода из наркоза и наблюдайте за ними до полного восстановления сознания.
  12. Регистрация и мониторинг: Запишите объем введенного препарата и идентификационный номер каждой мыши. Непрерывно наблюдайте за животными на протяжении всего экспериментального периода, контролируя выживаемость и общее физиологическое состояние.
  13. Интраназальное введение LPS (день 2): Введите LPS мышам на 2-й день после инфицирования SARS-CoV-2. Выполните интраназальное введение LPS (5 mg/kg) согласно тому же протоколу, который использовался для введения SARS-CoV-2. Мышам контрольной группы введите равный объем физиологического раствора по той же процедуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе LPS и физиологический раствор вводились по той же процедуре, что и инокуляция SARS-CoV-2, включая анестезию и интраназальную доставку.

4. Диссекция мыши и забор легочной ткани

  1. На 3-й день после заражения SARS-CoV-2 проведите эвтаназию мышей для сбора тканей. Сначала анестезируйте животных, затем умертвите их путем перелома шейных позвонков. С контрольными мышами поступите аналогично.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание процедуры перелома шейных позвонков приведено в Дополнительном файле 1.
  2. Зафиксируйте эвтаназированную мышь на препарировочной доске в положении на спине так, чтобы брюшная и грудная полости были полностью открыты. Увлажните шерсть на животе 75% этанолом для минимизации загрязнения.
  3. С помощью стерильных ножниц осторожно разрежьте грудину вдоль двусторонних реберных краев и постепенно откройте грудную полость. Используя пинцет, аккуратно раздвиньте ткани и пошагово препарируйте легкие, отделяя их от окружающих структур грудной клетки, сводя к минимуму механическое повреждение легочной ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно контролируйте направление кончиков ножниц при разрезании, чтобы избежать повреждения сердца, легких и крупных сосудов.
  4. Немедленно поместите иссеченные ткани легких в предварительно охлажденный PBS или физиологический раствор и осторожно промойте их 2–3 раза для удаления остатков крови и детрита. Аккуратно удалите излишки жидкости с поверхности с помощью безворсочной фильтровальной бумаги, избегая сжатия, чтобы предотвратить структурное повреждение ткани.
  5. Оперативно взвесьте обработанные ткани легких на электронных весах и запишите результаты измерений.
  6. Иссеките правую каудальную долю и немедленно зафиксируйте ее в 4% параформальдегиде в объеме, в 10 раз превышающем объем ткани, для последующего гистопатологического анализа.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Параформальдегид токсичен; работайте с ним в соответствии с правилами техники безопасности вашего учреждения.
  7. Соберите оставшиеся ткани легких, разделите их на аликвоты по криопробиркам, быстро заморозьте в жидком азоте и храните при −80 °C для сохранности. Правую краниальную долю, правую среднюю долю и добавочную долю предназначьте для определения вирусной нагрузки SARS-CoV-2 и провоспалительных цитокинов, а левое легкое зарезервируйте для анализа методом ELISA.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Жидкий азот имеет крайне низкую температуру; при работе с ним используйте соответствующие криогенные перчатки и защитные очки для предотвращения холодовых ожогов или обморожения.
  8. После завершения препарирования тщательно очистите и стерилизуйте все инструменты в соответствии со стандартными процедурами. Утилизируйте трупы животных и биологические отходы согласно институциональным и нормативным правилам проведения экспериментов на животных.

5. Окрашивание гематоксилином и эозином (HE)23

  1. Фиксируйте свежие ткани легких в 4% параформальдегиде при комнатной температуре в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно контролируйте время фиксации. Избегайте недостаточной фиксации, которая может привести к неполному сохранению тканей, и слишком длительной фиксации, которая может вызвать избыточное сшивание белков и повлиять на качество окрашивания.
  2. Проведите обработку фиксированных тканей с использованием автоматического гистопроцессора для ступенчатого обезвоживания, просветления и пропитки парафином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол работы с автоматическим гистопроцессором приведен в Дополнительном файле 2.
  3. Поместите пропитанные парафином ткани в формы для заливки. Добавьте расплавленный парафин и аккуратно ориентируйте ткань.
  4. Перенесите формы на холодную плиту для затвердевания. Извлеките парафиновые блоки из форм после полного затвердевания.
  5. Установите парафиновые блоки в микротом и отрегулируйте поверхность среза параллельно лезвию. Получите серийные срезы толщиной примерно 3–5 µm.
  6. Немедленно перенесите срезы в водяную баню при температуре около 45 °C для расправления с целью полного раскрытия ткани.
  7. Подберите срезы на предметные стекла, вертикально погружая один конец стекла в воду; используйте пинцет для обеспечения надлежащего прилипания срезов к поверхности стекла.
  8. Поместите стекла в сушилку для предметных стекол при 65 °C примерно на 1 ч для улучшения адгезии ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Регулируйте время сушки в зависимости от типа ткани, толщины среза и характеристик оборудования. Избегайте перегрева во избежание повреждения ткани.
  9. Выполните окрашивание гематоксилином и эозином (HE) высушенных срезов с использованием автоматического окрашивателя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол работы с автоматическим окрашивателем приведен в Дополнительном файле 3.
  10. Извлеките окрашенные срезы и высушите их на воздухе. Нанесите каплю нейтральногоmounting-среды и накройте стекла покровными стеклами. Изучите срезы под световым микроскопом после затвердевания mounting-среды.

6. Экспрессия вирусной нагрузки SARS-CoV-2 и провоспалительных цитокинов в легочной ткани

  1. Гомогенизация ткани легкого
    1. Подготовьте безнуклеазные пробирки для гомогенизации, добавив 4–5 стальных шариков (диаметром 3 mm) и 900 µL предварительно охлажденного лизирующего буфера в качестве среды для гомогенизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте объем лизирующего буфера в соответствии с массой ткани, обычно из расчета примерно 9 mL на 1 g ткани.
    2. Взвесьте примерно 50 mg ткани легкого, мелко измельчите ткань и перенесите ее в пробирку для гомогенизации.
    3. Гомогенизируйте ткань с помощью гомогенизатора тканей (60 Hz, 60 s, в течение 2–3 циклов с интервалами 10 s между циклами).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте параметры гомогенизации в соответствии с прибором и типом ткани.
    4. После гомогенизации проверьте образец, чтобы убедиться в полном разрушении ткани. Если видны фрагменты ткани, повторите процесс гомогенизации до получения однородного лизата.
  2. Колоночная экстракция тотальной РНК из ткани легкого
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракцию тотальной РНК из ткани легкого следует проводить методом очистки на колонках в соответствии с инструкциями производителя. При необходимости используйте альтернативные методы экстракции РНК согласно руководствам к соответствующим продуктам.
    1. Перенесите гомогенат в новую безнуклеазную микроцентрифужную пробирку объемом 2 mL. Добавьте 100 µL раствора gDNA Eliminator. Плотно закройте крышку пробирки и интенсивно встряхните в течение 15–20 s.
    2. Кратковременно откройте крышку, добавьте 180 µL хлороформа и тщательно перемешайте на вортексе в течение 15 s.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Хлороформ летуч и токсичен; работайте с ним в хорошо проветриваемом помещении или в вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты, чтобы избежать вдыхания паров и контакта с кожей.
    3. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 2 min, затем центрифугируйте при 12,000 x g в течение 15 min при 4 °C.
    4. Осторожно перенесите верхнюю водную фазу в новую пробирку. Добавьте равный объем 70% этанола и тщательно перемешайте с помощью вортекса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе водной фазы избегайте задевать интерфазу и органический слой для обеспечения чистоты РНК. Переходите к следующему шагу сразу после добавления 70% этанола, без центрифугирования.
    5. Перенесите смесь в спин-колонку и центрифугируйте при 8,000 x g в течение 15 s. Удалите фильтрат.
    6. Добавьте 700 µL промывочного буфера в спин-колонку и центрифугируйте при 8,000 x g в течение 15 s. Удалите фильтрат.
    7. Добавьте 500 µL промывочного буфера в спин-колонку и центрифугируйте при 8,000 x g в течение 15 s. Повторите этот этап промывки один раз.
    8. Перенесите спин-колонку в новую пробирку для сбора и центрифугируйте при 12,000 x g в течение 1 min для удаления остатков промывочного буфера.
    9. Поместите спин-колонку в новую безнуклеазную микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 mL. Добавьте 30 µL безнуклеазной воды непосредственно в центр мембраны и центрифугируйте при 8,000 x g в течение 1 min для элюции РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте объем безнуклеазной воды в диапазоне 30–50 µL в зависимости от последующих приложений. Для получения более высокой концентрации РНК используйте меньший объем элюции.
  3. Определение вирусной нагрузки SARS-CoV-2 методом обратной транскрипции и цифровой ПЦР (ОТ-дПЦР)
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: Для абсолютного количественного определения РНК SARS-CoV-2 использовался одноэтапный анализ ОТ-дПЦР. Для определения числа копий вирусной РНК применялись специфические наборы праймеров и зондов, нацеленных на ген нуклеокапсида (N).
    1. Разморозьте образцы РНК и реагенты на льду.
    2. Приготовьте реакционную смесь для ОТ-дПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Смешайте 20 µL реакционной смеси ОТ-дПЦР с 20 µL матрицы РНК. Кратковременно перемешайте смесь на вортексе, центрифугируйте коротким импульсом и держите на льду.
    4. Загрузите 40 µL реакционной смеси в лунки чипа для цифровой ПЦР и загерметизируйте чип согласно протоколу прибора.
    5. Проведите амплификацию, используя следующие условия термоциклирования: 50 °C в течение 40 min (1 цикл), 95 °C в течение 2 min (1 цикл), затем 40 циклов: 95 °C в течение 15 s и 57 °C в течение 60 s. Установите каналы детекции: GREEN (250 ms) и RED (150 ms).
  4. Определение экспрессии воспалительных цитокинов методом обратной транскрипции и количественной ПЦР (ОТ-кПЦР)
    1. Определите концентрацию и чистоту РНК с помощью УФ-спектрофотометра.
    2. Используйте 1,000 ng тотальной РНК на реакцию для обратной транскрипции с целью синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Проведите ОТ-кПЦР, используя 100 ng кДНК на реакцию в качестве матрицы с мастер-миксом SYBR Green для ПЦР и генспецифическими праймерами. Используйте следующие условия циклирования: 95 °C в течение 2 min, затем 40 циклов: 95 °C в течение 5 s и 60 °C в течение 10 s. Последовательности праймеров приведены в Таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте условия реакции в соответствии с используемыми реагентами и приборами, следуя соответствующим инструкциям производителя.
    4. Используйте GAPDH в качестве внутреннего референсного гена и рассчитайте относительные уровни экспрессии генов с помощью метода 2−ΔΔCt.

7. Определение содержания провоспалительных цитокинов в тканях легкого методом иммуноферментного анализа (ELISA)24

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наборы для ELISA в соответствии со специфическими протоколами, предоставленными различными производителями. При использовании наборов от альтернативных поставщиков строго следуйте соответствующим инструкциям производителя.

  1. Гомогенизируйте ткань легкого, как описано выше. В качестве среды для гомогенизации используйте PBS или специфический буфер для лизиса тканей, предназначенный для ELISA.
  2. Центрифугируйте гомогенизаты образцов (например, 12,000 x g, 4 °C, 10 мин) и соберите супернатант для последующего анализа.
  3. Перед использованием выдержите набор для ELISA при комнатной температуре в течение 30 мин. Извлеките необходимые стрипы микропланшета из алюминиевого фольгированного пакета.
  4. Подготовьте лунки для стандартов, образцов и холостых проб в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте 50 µL стандартов в лунки для стандартов и 10 µL образца вместе с 40 µL буфера для разведения образцов в лунки для образцов. Для каждого стандарта и образца выполните два технических повтора.
  5. Добавьте 100 µL антител для детекции, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP), в каждую лунку со стандартами и образцами, за исключением лунок с холостыми пробами. Закройте планшет адгезивной пленкой и инкубируйте при 37 °C в течение 60 мин.
  6. После инкубации удалите жидкость из каждой лунки и аккуратно промокните планшет абсорбирующей бумагой для удаления остатков жидкости.
  7. Добавьте промывочный буфер в каждую лунку, выдержите 1 мин, затем удалите буфер. Промокните планшет насухо. Повторите этот этап промывки в общей сложности пять раз.
  8. Последовательно добавьте 50 µL раствора субстрата A и 50 µL раствора субстрата B в каждую лунку. Осторожно перемешайте содержимое планшета и инкубируйте его при 37 °C в темноте в течение 15 мин для развития окраски.
  9. Остановите реакцию, добавив 50 µL стоп-раствора в каждую лунку. Измерьте оптическую плотность (OD) в течение 10 мин при 450 nm с помощью планшетного ридера.
  10. Постройте стандартную кривую, отложив концентрации стандартов по оси x, а значения OD по оси y, и проведите аппроксимацию кривой. Рассчитайте концентрации целевых цитокинов в образцах, подставив значения OD в уравнение стандартной кривой, и умножьте результат на соответствующие коэффициенты разведения.
  11. Определите общую концентрацию белка в ткани легкого с помощью набора для BCA-анализа белка. Нормализуйте конечные уровни цитокинов по общему содержанию белка и выразите результаты как количество целевого цитокина на миллиграмм общего белка (например, pg/mg белка).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Валидация модели была проведена путем оценки гистопатологических изменений в легких, вирусной нагрузки SARS-CoV-2, а также уровней провоспалительных цитокинов и интерферонов типа I в контрольной и модельной группах.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка (SE). Для сравнения между модельной и контрольной группами использовали непарный t-критерий Стьюдента. Этот тест был выбран, поскольку он подходит для сравне...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данном исследовании была создана мышиная модель повреждения легких, ассоциированного с COVID-19, посредством интраназального введения SARS-CoV-2 и LPS. Результаты показали, что совместное интраназальное введение SARS-CoV-2 и LPS вызывает выраженный воспалительный ответ, сопровождающийся подавлением сигналинга IFN-I. У мышей в модельной группе наблюдалась значительная потеря массы тела и увеличение индекса легких, что указывает на системное истощение и утяжеление поражения легких. Окрашивание гематоксилином и эозином (H...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.

Благодарности

Данное исследование было поддержано Национальным природным научным фондом Китая (82374291); Программой науки и технологий провинции Сычуань (2024NSFJQ0059); Специальной темой научных исследований Администрации традиционной китайской медицины провинции Сычуань (2024zd0059); Проектом ведущих талантов в области науки и технологий «План Тяньфу Цинчэн» 2022 года (Chuan Qingcheng № 1090); Совместным инновационным фондом Комиссии по здравоохранению Чэнду и Университетом традиционной китайской медицины Чэнду (WXLH202403091).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Автоматический процессор тканейDakewe Biotech Co., Ltd.HP300Используется для дегидратации тканей.
Автоматический окрашивательLeica BiosystemsLEICA ST5010Используется для окрашивания Г&Э.
ЦентрифугаDLAB Scientific D3024RИспользуется для центрифугирования образцов или реагентов.
Термостат с водяной банейShanghai LICHEN-BX Instrument Techonology Co., Ltd.HH-6Используется для поддержания постоянной температуры в водяной бане.
Система цифровой ПЦРQIAGENQIAcuity OneИспользуется для RT-dPCR.
TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)TransGen Biotech Co.,Ltd.AT341Используется для обратной транскрипции.
Раствор эозинаBASOBA4024Используется для гистологического окрашивания.
Система количественной ПЦР с флуоресценциейRocgene (Beijing) Technology Co., Ltd.Archimed X6Используется для RT-qPCR.
Раствор гематоксилинаBASOBA4041Используется для гистологического окрашивания.
Программное обеспечение IBM SPSS StatisticsIBM Corp., Armonk, NY, USAversion 22.0Используется для статистического анализа.
Липополисахариды Escherichia coli O55:B5Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.L2880Используются для моделирования на мышах.
Микропланшетный ридерMolecular Devices SpectraMax Plus 384Используется для ИФА.
Набор ИФА для определения IFN-α мышиZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37863WИспользуется для определения уровней IFN-α в ткани легких мышей.
Набор ИФА для определения IFN-β мышиZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37887WИспользуется для определения уровней IFN-β в ткани легких мышей.
Набор ИФА для определения IL-1β мышиZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37974WИспользуется для определения уровней IL-1β в ткани легких мышей.
Набор ИФА для определения IL-6 мышиZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37988WИспользуется для определения уровней IL-6 в ткани легких мышей.
Набор ИФА для определения TNF-α мышиZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-39024WИспользуется для определения уровней TNF-α в ткани легких мышей.
Набор One-Step RT-PCR для цифровой ПЦРQIAGEN4829104Используется для цифровой ПЦР.
Аппарат для заливки парафиномHubei Aristion Medical Industrial Co., Ltd.ABM-7LИспользуется для заливки ткани легких мыши в парафин.
Набор QuantiNova SYBR PCR MixQIAGEN1129280Используется для RT-qPCR.
Набор RNeasy Plus Universal Mini KitQIAGEN1062832Используется для экстракции общей РНК.
МикротомLeica BiosystemsLEICA RM2235Используется для изготовления парафиновых срезов.
Стальные шарики для гомогенизатора тканейBeyotime BiotechnologyF6621Используются для гомогенизации ткани легких.
XG primer Pool 1.0 для цифровой ПЦРQIAGEN4828104Используется для цифровой ПЦР.
Zoletil 50VIRBACBN9VS7AИспользуется для анестезии мышей.

Ссылки

  1. Zhang X, et al. SARS-CoV-2 Evolution: Immune Dynamics, Omicron Specificity, and Predictive Modeling in Vaccinated Populations. Adv Sci (Weinh). 2024;11(40):e2402639.
  2. Yu Y, et al. COVID-19 Serum Drives Spike-Mediated SARS-CoV-2 Variation. Viruses. 2024;16(5):763.
  3. Alhamlan FS, Al-Qahtani AA. SARS-CoV-2 Variants: Genetic Insights, Epidemiological Tracking, and Implications for Vaccine Strategies. Int J Mol Sci. 2025;26(3):1263.
  4. Habashi NM, Camporota L, Gatto LA, Nieman G. Functional pathophysiology of SARS-CoV-2-induced acute lung injury and clinical implications. J Appl Physiol (1985). 2021;130(3):877-891.
  5. Nie X, et al. Multi-organ proteomic landscape of COVID-19 autopsies. Cell. 2021;184(3):775-791.e14.
  6. Blanco-Melo D, et al. Imbalanced Host Response to SARS-CoV-2 Drives Development of COVID-19. Cell. 2020;181(5):1036-1045.e9.
  7. Wang J, Li Q, Qiu Y, Lu H. COVID-19: imbalanced cell-mediated immune response drives to immunopathology. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2393-2404.
  8. Sa Ribero M, Jouvenet N, Dreux M, Nisole S. Interplay between SARS-CoV-2 and the type I interferon response. PLoS Pathog. 2020;16(7):e1008737.
  9. El-Saber Batiha G, Al-Gareeb AI, Saad HM, Al-Kuraishy HM. COVID-19 and corticosteroids: a narrative review. Inflammopharmacology. 2022;30(4):1189-1205.
  10. Ye Q, Wang B, Mao J. The pathogenesis and treatment of the 'Cytokine Storm' in COVID-19. J Infect. 2020;80(6):607-613.
  11. Jiang Y, et al. Cytokine storm in COVID-19: from viral infection to immune responses, diagnosis and therapy. Int J Biol Sci. 2022;18(2):459-472.
  12. Zhang S, Wang L, Cheng G. The battle between host and SARS-CoV-2: Innate immunity and viral evasion strategies. Mol Ther. 2022;30(5):1869-1884.
  13. Beyer DK, Forero A. Mechanisms of Antiviral Immune Evasion of SARS-CoV-2. J Mol Biol. 2022;434(6):167265.
  14. Lei X, et al. Activation and evasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2. Nat Commun. 2020;11(1):3810.
  15. Mostafa-Hedeab G, et al. A raising dawn of pentoxifylline in management of inflammatory disorders in Covid-19. Inflammopharmacology. 2022;30(3):799-809.
  16. Chen Z, et al. SARS-CoV-2 immunity in animal models. Cell Mol Immunol. 2024;21(2):119-133.
  17. Johansen MD, et al. Animal and translational models of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Mucosal Immunol. 2020;13(6):877-891.
  18. Zhang Y, et al. SARS-CoV-2 rapidly adapts in aged BALB/c mice and induces typical pneumonia. J Virol. 2021;95(11):e02477-20.
  19. Sun SH, et al. A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host Microbe. 2020;28(1):124-133.e4.
  20. Muñoz-Fontela C, et al. Animal models for COVID-19. Nature. 2020;586(7830):509-515.
  21. Liu T, et al. Therapeutic potential of inosine in acute lung injury: mechanistic insights into TLR4 suppression and macrophage polarization. Phytomedicine. 2025;143:156854.
  22. Powers JM, et al. Divergent pathogenetic outcomes in BALB/c mice following Omicron subvariant infection. Virus Res. 2024;341:199319.
  23. Fan F, et al. Association between systemic immune-inflammation indexes and Nuodikang capsule's protection in LPS-induced acute lung injury in mice. Phytomedicine. 2025;147:157229.
  24. Xie N, et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 2022;103:154240.
  25. Jiang S, et al. Generic Diagramming Platform (GDP): a comprehensive database of high-quality biomedical graphics. Nucleic Acids Res. 2025;53(D1):D1670-D1676.
  26. Onohuean H, et al. Covid-19 and development of heart failure: mystery and truth. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2021;394(10):2013-2021.
  27. Zarrilli G, et al. The Immunopathological and Histological Landscape of COVID-19-Mediated Lung Injury. Int J Mol Sci. 2021;22(2):974.
  28. Fernandes de Souza WD, et al. Lung Inflammation Induced by Inactivated SARS-CoV-2 in C57BL/6 Female Mice Is Controlled by Intranasal Instillation of Vitamin D. Cells. 2023;12(7):1092.
  29. Ciesielska A, Matyjek M, Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021;78(4):1233-1261.
  30. Brandenburg K, et al. A Comparison between SARS-CoV-2 and Gram-Negative Bacteria-Induced Hyperinflammation and Sepsis. Int J Mol Sci. 2023;24(20):15169.
  31. Samsudin F, et al. SARS-CoV-2 spike protein as a bacterial lipopolysaccharide delivery system in an overzealous inflammatory cascade. J Mol Cell Biol. 2023;14(9):mjac058.
  32. Petruk G, et al. SARS-CoV-2 spike protein binds to bacterial lipopolysaccharide and boosts proinflammatory activity. J Mol Cell Biol. 2020;12(12):916-932.
  33. Martin-Sancho L, et al. Functional landscape of SARS-CoV-2 cellular restriction. Mol Cell. 2021;81(12):2656-2668.e8.
  34. Minkoff JM, tenOever B. Innate immune evasion strategies of SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 2023;21(3):178-194.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Инфекция SARS-CoV-2повреждение легких при COVID-19индукция липополисахаридомиммунно-воспалительный ответгистопатология легкихпровоспалительные цитокиныинтерфероновый ответанализ вирусной нагрузкифункция легких
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.