В данном протоколе описывается модель эксцизионной раны кожи крысы с использованием влажной камеры. Эта система позволяет проводить оценку местных жидких лекарственных форм, клеточных суспензий, биоматериалов и других средств для лечения ран.
Методическая статья
Модель эксцизионной раны у крыс для исследования терапевтических средств при критических повреждениях кожи
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Раны кожи представляют собой серьезную проблему для мирового здравоохранения, вызывая значительную заболеваемость и создавая экономическое бремя. Надежные и клинически релевантные модели на животных необходимы для изучения механизмов восстановления тканей и оценки новых терапевтических стратегий. Однако традиционные модели эксцизионных ран у грызунов ограничены быстрым сокращением раны за счет наличия panniculus carnosus, что существенно отличается от заживления ран у человека. Последнее происходит преимущественно за счет образования грануляционной ткани и реэпителизации. В данной работе описывается модель эксцизионной раны у крыс, предназначенная для ограничения сокращения раны и обеспечения защищенной среды для тестирования чувствительных терапевтических воздействий. У крыс линии Sprague Dawley создавались полнослойные дорсальные эксцизионные раны диаметром 10 mm, которые стабилизировались с помощью уплотнительного кольца из нитрил-бутадиенового каучука (NBR), закрепленного прерывистыми швами. Для поддержания влажной среды раны применялись когезивный запечатывающий гель Eakin и прозрачная адгезивная пленка для формирования камеры, подходящей для местного введения клеток, биоматериалов или фармацевтических соединений. Дополнительные защитные слои, состоящие из пенной повязки, адгезивной ленты, трубчатого бинта и системы фиксации на оба плеча, использовались для того, чтобы животные не могли удалить повязку. Заживление ран контролировалось в течение 14 дней с помощью цифровой планиметрии и гистологической оценки с окрашиванием гематоксилином и эозином. Процедура занимала примерно 30 min на одно животное и давала стабильные результаты заживления. Кольцо NBR использовалось в качестве шины для ограничения сокращения раны. Заживление происходило преимущественно за счет образования грануляционной ткани и реэпителизации. Повязки оставались неповрежденными до семи дней без признаков инфекции. Гистологический анализ продемонстрировал активное восстановление тканей, характеризующееся регенерацией эпидермиса и инфильтрацией воспалительных клеток. Данная модель представляет собой платформу для доклинической оценки средств лечения ран и передовых методов регенеративной терапии.
Введение
Раны кожи, включая труднозаживающие раны, затрагивают более 40 миллионов пациентов во всем мире и создают значительную нагрузку на системы здравоохранения, при этом ежегодные затраты к 2024 году достигли 22 миллиардов долларов. Только в Европе ежегодно 4 миллиона пациентов страдают от труднозаживающих ран, что занимает до половины всех доступных мест в отделениях неотложной помощи1. Несмотря на достижения в хирургической технике, интраоперационной практике и доступность современных перевязочных материалов, некоторые раны остаются рефрактерными, и в конечном итоге развиваются осложнения. Следовательно, крайне важно разработать новые терапевтические подходы, что требует создания экспериментальной животной модели ран кожи для тестирования широкого спектра местных средств.
Среди экспериментальных моделей кожных ран на животных иссечение кожи является наиболее применимым методом создания модели заживления ран2. Такая модель позволяет исследовать кровотечение, воспалительные реакции, грануляцию, реэпителизацию, ангиогенез и ремоделирование тканей3. Эксцизионные раны создаются преимущественно на спине животного путем хирургического удаления определенного участка кожи. Рана должна иметь критический размер, чтобы избежать спонтанного заживления. Такая эксцизионная рана критического размера обеспечивает прямой доступ для изучения местного применения различных химических веществ, клеток или биоматериалов, а также их участия в процессе заживления4,5.
Кожа грызунов и человека имеют сходства в клеточных и молекулярных фазах заживления ран, включая гемостаз, воспаление, пролиферацию и ремоделирование. Крысы и мыши являются наиболее широко используемыми видами в моделях ран благодаря их доступности, малому размеру, относительной простоте генетических манипуляций и удобству в обращении. Крысы обладают рядом практических преимуществ перед мышами, включая большие размеры тела и более толстую кожу, состоящую из большего количества слоев кератиноцитов, чем у мышей. Раны у мышей обычно заживают в течение 7 дней, тогда как у крыс процесс заживления можно оценивать на протяжении примерно 12–14 дней6.
Основной проблемой при использовании грызунов с рыхлой кожей является сокращение раны3. Кожа грызунов имеет слой panniculus carnosus, который сокращается после повреждения, чтобы уменьшить открытую площадь. Напротив, человеческие раны обладают ограниченной способностью к сокращению и при заживлении зависят от грануляции и реэпителизации7. Одним из способов преодоления ограничений моделей на животных является физическая фиксация или шинирование кожи вокруг области раны8. Титановые раневые камеры были одними из устройств, успешно разработанных для предотвращения сокращения раны9, но они имели ряд недостатков, включая сильный стресс у животных из-за веса камеры, сложность хирургического размещения, вероятность смещения устройства, риск инфицирования и высокую стоимость. Концепция модели раны с шинированием была представлена Galiano et al.10 в 2004 году путем наложения швов жестким силиконовым кольцом вокруг края раны. Этот подход значительно снижает сокращение раны11, но имеет несколько недостатков и ограничений, связанных прежде всего с возможностью повреждения мягких тканей, высокой частотой смещения шины и неоднородным заживлением ран. Шины (такие как жесткие силиконовые кольца) могут оказывать чрезмерное давление на окружающую кожу, что приводит к ишемии, раздражению и некрозу, особенно при неправильном применении. Силиконовые шины часто повреждаются, ломаются или смещаются из-за движений или груминга животных 8,11. Неравномерные швы часто создают разное натяжение вокруг раны, что приводит к нестабильному заживлению. В представленной здесь модели уплотнительное кольцо из нитрил-бутадиенового каучука (NBR) пришивается к краю раны кожи путем наложения 8–12 простых прерывистых полиамидных швов, равномерно распределенных по кольцу. Ожидается, что такой подход минимизирует вышеупомянутые риски и достаточно ограничит сокращение раны, позволяя ей заживать путем формирования грануляционной ткани и реэпителизации, что схоже с процессом заживления ран у человека. Такой механизм заживления облегчит перенос результатов исследований с моделей на животных в клиническую практику.
Теория влажного заживления ран была представлена Джорджем Д. Уинтером в 1962 году в качестве концепции для разработки средств по уходу за ранами12. На основе этой теории за последние десятилетия были разработаны различные перевязочные материалы, такие как марлевые повязки, прозрачные пленки, пены и гидрогели13. С другой стороны, в 1974 году было разработано формуемое гидроколлоидное кольцо-барьер для стомы для предотвращения и защиты от протеканий. Такие кольца легко формуются и подгоняются под края раны, особенно при уходе за стомами. В данной модели когезивный уплотнитель наносится на внешнюю сторону раны и вместе со стерильными прозрачными пленками создает влажную камеру, имитирующую клиническую ситуацию у пациентов с кожными ранами, проходящих лечение, что способствует эпителизации раны и защищает местно применяемые агенты (например, клетки, биоматериалы, соединения) от вытекания.
Перевязка раны имеет жизненно важное значение для защиты раневого ложа от физических травм и микробной инфекции. Перевязка ран у крыс всегда была сложной задачей из-за их низкой переносимости подобных манипуляций. Крысы часто удаляют или уничтожают повязки, перекусывая и разрывая их почти сразу после выхода из наркоза. Это значительно затрудняет удержание местных средств, таких как клетки и фармацевтические препараты, и делает невозможной защиту ран от внешних патогенов и загрязнений. Данный аспект является еще одной проблемой при использовании модели грызунов, особенно в исследованиях, требующих стерильной среды, таких как тестирование биологических препаратов, клеточная терапия и разработка высокотехнологичных лекарственных препаратов. В представленной здесь модели для закрытия влажной камеры использовались поролоновая повязка и липкая лента. Затем с помощью эластичного трубчатого бинта, фиксирующего бинта и микропористой хирургической ленты была наложена перевязка с двойным перекрестом на плечах, чтобы предотвратить удаление или повреждение повязок крысами.
Представленная здесь модель объединяет в себе несколько элементов из различных протоколов и разрабатывалась в течение нескольких лет. Целью было создание модели эксцизионной раны у крыс с использованием влажной камеры, которая хорошо переносится животным и облегчает тестирование чувствительных местных средств, особенно в жидкой форме.
Протокол
Все описанные ниже процедуры с животными были одобрены Этическим комитетом Линчёпинга (Dnr 5163-2023), Швеция. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.
1. Опытразумные животные
- Используйте взрослых самцов крыс линии Sprague Dawley в возрасте 8–14 недель.
- Перед началом эксперимента подвергните крыс акклиматизации в течение не менее 1 недели при 12-часовом цикле свет/темнота и стандартном рационе питания.
2. Предоперационная подготовка
- Проведите анестезию животного, используя 1,5%–2,5% изофлурана (4,5% для индукции) в смеси с кислородом с потоком 1,0–1,5 L/min. Поместите животное в положение на животе на грелочную подушку для поддержания тепла. Нанесите офтальмологическую смазку для защиты глаз и подкожно в область спины введите 0,05 mg/kg бупренорфина (в расчете на массу тела), разведенного в физиологическом растворе, для послеоперационного обезболивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать тонкий слой одноразовой подстилки в качестве изоляции между животным и подушкой.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Изофлуран является депрессантом центральной нервной системы и раздражителем дыхательных путей. Используйте калиброванный испаритель с активной системой удаления отходящих газов для предотвращения воздействия паров. - Выбрейте шерсть на дорсальной поверхности с помощью электрического триммера от основания шеи вниз примерно на 10 cm. Тщательно очистите выбритую область дважды с помощью хлоргексидина и 70% этанола, затем накройте животное фенестрированной хирургической салфеткой так, чтобы была открыта только очищенная область.
3. Создание эксцизионной раны
- Используйте подходящие стерилизованные хирургические инструменты, такие как ножницы и пинцет.
- С помощью шаблона и хирургического перманентного маркера начертите круг диаметром 10 mm примерно в 4 cm каудальнее основания шеи.
- Захватите пинцетом центр отмеченной области кожи и иссеките marked ткань кожи ножницами. Глубина раны должна достигать поверхностной фасции. Определить ее можно по отделению всей толщи кожи и визуализации полупрозрачной фасции, покрывающей мышцу.
- Приложите NBR O-ring к краю раны кожи и зафиксируйте его в этом положении, наложив 8-12 швов. Целью фиксации кольца является предотвращение сокращения кожи. Убедитесь, что первичные швы накладываются в позициях «12 часов», затем «6 часов», «3 часа» и «9 часов». В случае наложения 8 швов, каждый последующий шов накладывается посередине пространства между двумя первичными швами (Рисунок 1A).
- Снаружи от NBR O-ring нанесите когезионный герметик, используя его адгезивные свойства, чтобы создать влажную камеру вместе со стерильной прозрачной адгезивной пленкой (Рисунок 1B). На этом этапе рана зафиксирована с помощью NBR O-ring, а боковые стенки аппликационной камеры образованы краем кожи и когезионным герметиком; дно представляет собой поверхность открытой раны, а крышку образует прозрачная пленка.
- Накройте рану одним слоем пленки, после чего через пленку на поверхность раны введите терапевтический раствор (суспензию клеток или раствор соединения). Камера described размера легко вмещает 100 µL.
- Накройте место инъекции еще одним слоем пленки, чтобы предотвратить утечку препарата (Рисунок 1C).
- Покройте пленку мягким силиконовым бинтом для ее защиты (Рисунок 1D).
- Наложите адгезивные пластыри (Рисунок 1E), затем эластичный трубчатый бинт в конфигурации «двойное плечо» вокруг крысы с фиксирующим бинтом и микропористыми хирургическими пластырями (Рисунок 1F–H).
- Подстригите когти крыс, чтобы они не могли сорвать повязку.
- Перед выходом животного из наркоза подкожно введите карпрофен (5 mg/kg массы тела), разведенный в физиологическом растворе.
4. Послеоперационные процедуры
- Держите животное на грелке, укрыв его одеялом, до полного пробуждения от наркоза. Поместите животных в отдельные клетки или в одну клетку с разделителем, чтобы предотвратить взаимные укусы и удаление повязки.
- На следующее утро подкожно введите карпрофен в дозе 5 mg/kg массы тела, разведенный в физиологическом растворе, для купирования послеоперационной боли. Необходимо ежедневно контролировать состояние крыс на предмет послеоперационной боли или потери веса; при необходимости может быть введена дополнительная доза анальгетика.
5. Измерение размеров раны и смена повязки
- Ежедневно осматривайте каждое животное в течение первой недели после операции по созданию раны. Следует проверять повязку и корректировать ее, если животные испытывают трудности при движении или проявляют признаки дискомфорта.
- Замените повязку на 7-й день, пока животное находится под анестезией, как описано в шаге 2.1.
- Осторожно удалите фиксирующее покрытие повязки с кожи. Сделайте фотографии раны с приложенной линейкой для масштаба. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения Fiji/ImageJ для оценки площади поверхности раны.
- Проведите измерения или другие процедуры по усмотрению исследователя.
- Наложите чистую повязку, как описано в шагах 3.8–3.11, и дайте животному прийти в себя, как описано в шаге 4.1.
6. Сбор образцов ран и эвтаназия
- Проведите анестезию, как указано в пункте 2.1, на 14-й день или иным образом в соответствии с конкретным планом эксперимента. Снимите повязку и сфотографируйте места расположения ран.
- Снимите повязку и сфотографируйте места расположения ран.
- Соберите ткани кожи из области раны. С помощью скальпеля вырежьте кожу вокруг раны, захватывая часть здоровой ткани.
- Поместите вырезанный образец в пробирку объемом 2 mL и подвергните мгновенной заморозке в жидком азоте для последующего молекулярного анализа или поместите в 4% буферный формальдегид при комнатной температуре для гистологического исследования. В качестве альтернативы разделите образец на две части для проведения обоих видов анализа.
- После удаления тканей раны усыпите животное путем вдыхания CO2 или иным методом в соответствии с этическим разрешением.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: CO2 вызывает боль, стресс и быстрое закисление слизистых оболочек до наступления потери сознания. Используйте регулируемый расходомер для вытеснения воздуха из камеры.
7. Гистохимическое окрашивание: фиксация, заливка и срезание раневого участка
- Зафиксируйте биоптаты тканей раны в 4% растворе формальдегида в течение 3 ч при комнатной температуре, затем выдержите их при 4 °C в течение ночи.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Формальдегид токсичен, является сильным сенсибилизатором и известным канцерогеном для человека. Работайте с раствором в вытяжном шкафу, используя средства индивидуальной защиты. - Промойте биоптаты дважды в PBS, по 30 мин каждый раз.
- Замените PBS этанолом (70%) и храните при 4 °C.
- Храните биоптаты не более 24–48 ч перед дальнейшей обработкой во избежание потери антигенов или в течение 1–2 недель для простой гистологической характеристики.
- Тщательно промойте биоптаты под проточной водопроводной водой, чтобы удалить остатки формальдегида.
- Дегидратируйте ткань в этаноловых ваннах в следующем порядке: 70% этанол в течение 20 мин; две смены 95% этанола по 20 мин каждая; две смены 100% этанола по 20 мин каждая.
- Выдержите биоптаты при 65 °C в парафиновой ванне.
- Разлейте расплавленный парафин в соответствующую форму, поместив биоптаты в центр, и дайте ему остыть и затвердеть. Биоптаты должны быть ориентированы перпендикулярно поверхности формы, чтобы при срезании была видна вся толща слоев кожи.
- Сделайте срезы парафинового блока ткани толщиной 5 μm с помощью микротома и поместите их в водную баню с деионизированной водой при 39 °C.
- Перенесите срезы на предметные стекла и высушите их, чтобы ткань прикрепилась к поверхности стекла. Слайды можно хранить при 4 °C для последующего использования или сразу подвергнуть гистохимическому окрашиванию.
8. Окрашивание гематоксилином и эозином (HE)
- Удалите парафин со стекол на нагревательных плитках при 60 °C в течение 30 мин, затем трижды смените ксилол (или любой заменитель) по 5 мин каждый, после чего один раз промойте в PBS в течение 2 мин.
ОСТОРОЖНО: Ксилол токсичен и легковоспламеняем. Работайте с раствором в вытяжном шкафу, соблюдая стандартные меры индивидуальной защиты. - Проведите регидратацию в 100% этаноле, 96% этаноле, а затем в dH2O по 5 мин в каждом растворе.
- Проведите окрашивание гематоксилином в течение 5 мин, затем промойте под проточной водопроводной водой в течение 5 мин.
- Проведите дифференцировку в 0,3% кислотном спирте (0,3% соляной кислоты в 70% этаноле) путем нескольких кратковременных погружений, затем промойте под проточной водопроводной водой в течение 5 мин.
- Окрасьте эозином Y (0,2%) в течение 30 s, затем промойте под проточной водопроводной водой в течение 5 мин.
- Обезводите в 96% этаноле в течение 1 мин и в 100% этаноле в течение 1 мин.
- Нанесите несколько капель среды для заключения, затем накройте покровным стеклом.
- Изучите стекла под световым микроскопом и сделайте цифровые фотографии.
Результаты
Хирургическая операция по созданию модели эксцизионной раны у крыс при эффективном выполнении занимала примерно 30 мин на одно животное. Различные этапы создания модели, фиксации уплотнительного кольца и наложения повязки показаны на Рисунке 1.
Рисунок 2 демонстрирует процесс заживления раны на 7-й и 14-й дни. Радиус раны измеряли в mm, а площадь поверхности рассчитывали по формуле (площадь = πr2), где r = 5 mm в день 0. Прогресс закрытия раны представляли как процент незажившей области от площади индуцированной раны на 14-й день. С помощью программного обеспечения Fiji/ImageJ анализировали цифровое изображение области раны, откалибровав масштаб до 10 mm с помощью линейки, включенной в изображение (Рисунок 2D). После обводки и измерения области раны площадь представляли в mm2. Остаточная площадь раны на 14-й день (29.4% ± 10.1%; n = 7) представлена на Рисунке 3.
Окрашивание гематоксилином и эозином (HE) раны кожи на 14-й день представлено на Рисунке 4. Анализ срезов показал, что заживление биоптатов происходило естественным путем от периферии к центру. Заживление раны оставалось неполным: в центре отсутствовала нормальная классическая многослойная структура с тонким эпидермальным слоем. В дерме наблюдалась обильная инфильтрация воспалительными клетками, что важно для процесса физиологического заживления. В целом модель хорошо переносилась животными, при этом сокращение кожи было затруднено, а заживление оставалось неполным, но физиологичным.
Рисунок 1: Создание эксцизионной раны и процедура наложения повязки. (A) Эксцизионная рана, созданная на дорсальной поверхности крысы, с пришитым вокруг краев раны уплотнительным кольцом. (B) Формируемое гидроколлоидное барьерное кольцо, нанесенное вокруг уплотнительного кольца. (C) Два слоя прозрачной адгезивной пленки, наложенные поверх гидроколлоидного барьерного кольца. (D) Пенная повязка, помещенная поверх прозрачной адгезивной пленки. (E) Эластичный адгезивный пластырь, нанесенный для фиксации повязки. (F–H) Трубчатый фиксирующий бинт, наложенный вокруг крысы, с последующим наложением фиксирующего бинта и хирургического пластыря в конфигурации «двойное плечо» для закрепления повязки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения заживления ран. (A) Репрезентативное изображение раны, полученное на 7-й день. (B–D) Репрезентативные изображения ран, полученные на 14-й день, демонстрирующие рану с установленным уплотнительным кольцом (B) и после удаления уплотнительного кольца (C,D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка площади раны на 14-й день. Процент оставшейся площади раны на 14-й день, демонстрирующий уменьшение размера раны. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD) (n = 7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистологическая оценка заживления раны на 14-й день. Репрезентативные срезы тканей раны, окрашенные гематоксилином и эозином (HE), при увеличении 10×, 20× и 40×. В центре раны наблюдалась неполная реэпителизация, в то время как по краям раны отмечалось физиологическое заживление эпидермиса. В дерме содержалось большое количество воспалительных клеток, что соответствует нормальной реакции заживления раны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Обсуждение
Труднозаживающие раны кожи — это раны, которые не проходят через нормальные стадии заживления в ожидаемые сроки и могут быть следствием хирургических процедур, травм и аллергических реакций, в дополнение к тому, что они могут быть вторичными по отношению ко многим другим проблемам со здоровьем, включая сосудистую недостаточность, диабет и ожирение14. Несмотря на наличие нескольких методов лечения, у многих пациентов заживление происходит неправильно. Исследование новых путей терапии, таких как клеточная терапия, химические вещества, растительные экстракты и недавно открытые соединения, имеет решающее значение для поиска новых стратегий лечения. Данная модель может быть применена в широком спектре исследований заживления ран. Разработка стандартизированного протокола для тестирования лекарственных препаратов, клеток и биологических методов лечения может облегчить проведение доклинических исследований заживления ран. Модель эксцизионной раны и описанный здесь протокол решают основные проблемы модели раны кожи крысы в исследованиях, а именно: сокращение кожи и перевязку ран.
Титановые шины часто используются для уменьшения сокращения раны в моделях иссечения кожи у мышей; однако их применение имеет свои ограничения. Жесткость шины изменяет механическую среду раны и окружающих тканей, что может повлиять на клеточные ответы, воспаление и ремоделирование матрикса. В результате заживление происходит в условиях, отличных от условий в необработанной коже грызунов. Хотя ограничение сокращения улучшает сопоставимость с процессом закрытия ран у человека, механические ограничения, создаваемые шиной, могут также вызвать артефакты, влияющие на процесс заживления, что следует учитывать при интерпретации результатов экспериментов15.
Для этой цели в модели использовались уплотнительные кольца из NBR для ограничения сокращения кожи, которые фиксировались по краю первоначальной раны. Кольца хорошо переносились животными и оставались зафиксированными в течение всех 14 дней эксперимента. Хотя значительного сокращения раны качественно не наблюдалось ни у одного животного, татуирование краев раны или другие количественные методы позволили бы более точно оценить сокращение раны в будущих исследованиях. Таким образом, татуирование может рассматриваться как дополнительный, необязательный этап данного протокола.
Применение повязок защищало раны от загрязнения и инфекции, поддерживая при этом воздействие препарата в месте повреждения, что имеет решающее значение для моделей заживления ран кожи. Однако нередко случается, что животные удаляют повязки различных типов. Крысы часто вылизывают и затрагивают область раны, что может привести к смещению или полному удалению повязки, несмотря на использование адгезивных пленок или методов вторичной фиксации. Потеря защитного слоя повязки может изменить среду в ране, повлиять на доставку препарата и увеличить вариабельность между животными16. В представленной здесь модели повязка оставалась нетронутой до 7 дней, не будучи удаленной или поврежденной животными. Признаков инфекции ран кожи ни у одного из экспериментальных животных обнаружено не было. Рекомендуется менять повязки еженедельно, так как по мере роста и увеличения веса животных повязка становится слишком тесной. Следует соблюдать баланс между надежностью фиксации и мобильностью животных, следя за тем, чтобы повязка не была слишком свободной, что позволило бы животным её снять.
Данный протокол является гибким и может быть адаптирован под конкретные задачи. Несмотря на то, что мы рекомендуем ингаляцию изофлураном из-за быстрого восстановления и высокого уровня безопасности, исследователи могут альтернативно использовать инъекционную анестезию, например кетамин/ксилазин, если испаритель изофлурана недоступен. Хотя в данном исследовании использовались только самцы крыс, протокол в равной степени применим и к самкам крыс.
Мы рекомендуем введение анальгетиков в виде сочетания бупренорфина с карпрофеном, что усиливает обезболивание. Бупренорфин сам по себе также может обеспечить адекватную послеоперационную анальгезию благодаря относительно длительному периоду действия. Этот препарат оказывает минимальное влияние на иммунную функцию по сравнению с другими опиоидами, что дает преимущество для заживления ран в соответствии с воспалительным процессом17. При исследовании воспаления следует избегать использования нестероидных противовоспалительных препаратов, которые подавляют воспаление и уменьшают боль. Несмотря на то, что в данном исследовании на каждом животном была создана одна рана, исследователи могут создавать дополнительные раны, используя тот же протокол, в соответствии с этическим разрешением и дизайном эксперимента. Необходимо тщательно учитывать вопросы благополучия животных и принципы 3R. При использовании моделей на животных исследователи должны соблюдать принципы 3R (замена, сокращение и совершенствование) и уважать благополучие животных. Хирургические процедуры должны соответствовать руководящим принципам и строго следовать утвержденному протоколу работы с животными. В данном исследовании заживление ран оценивали путем измерения площади раны и гистологического анализа, при этом реэпителизация представляла собой один из компонентов процесса заживления. Наличие швов относительно кольцевой фиксации может препятствовать местному заживлению. Количество швов должно быть одинаковым для всех животных. Оценка площади раны должна включать все необработанные участки, в том числе места наложения швов18. Данная модель может быть модифицирована для включения различных сопутствующих состояний, связанных с ранами кожи, таких как ишемия, диабет и старение. Основными ограничениями данного исследования были отсутствие контрольной группы без шинирования, отсутствие количественной оценки сокращения раны и ограниченный набор количественных биологических показателей, помимо оценки площади раны и описательной гистологии. В ходе разработки данной модели возникли определенные технические сложности и проблемы, потребовавшие устранения. Правильный подбор защитного жилета/повязки имеет решающее значение для благополучия животного и успешного заживления раны. Слишком свободная повязка может быть удалена животным после выхода из наркоза, тогда как слишком тугая повязка может ограничить подвижность, нарушить кровообращение или повлиять на дыхание. Между повязкой и кожей должно оставаться достаточно места для одного пальца (или мизинца для более мелких крыс). За животными следует наблюдать ежедневно, а повязку необходимо корректировать при обнаружении признаков дискомфорта, ограниченной подвижности или abnormal posture. Послеоперационное обезболивание может варьироваться у отдельных животных из-за различий в чувствительности к анальгетикам. Животных следует регулярно осматривать на наличие признаков боли, включая сгорбленность, снижение активности, потерю аппетита и снижение массы тела. При необходимости следует обеспечить дополнительную анальгезию в соответствии с внутренними правилами учреждения. Стабильная фиксация кольца имеет критическое значение для предотвращения сокращения раны. 8–12 простых прерывистых швов должны быть равномерно распределены вокруг кольца для равномерного распределения натяжения и предотвращения приподнимания или деформации. Каждый шов следует закрепить хирургическим узлом, чтобы минимизировать его ослабление в период восстановления. Наконец, мы рекомендуем использовать в рамках одного исследования крыс одной линии, одного возраста, массы тела и пола для минимизации вариабельности. Также все хирургические процедуры может выполнять один и тот же опытный исследователь. Для исключения предвзятости мы рекомендуем использовать двойной слепой метод при проведении гистологических и молекулярных анализов.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.
Благодарности
Авторы выражают благодарность региону Эстергётланд за финансирование данного исследования. Авторы благодарят г-на Андерса Деллескога из CBR Линчёпингского университета за предложения, поддержку и помощь в создании животной модели. Авторы также благодарят д-ра Марию Нтзуни из Core Facility Линчёпингского университета за поддержку и руководство по вопросам заливки тканей кожи в парафин, изготовления срезов и окрашивания гематоксилином и эозином (HE). Особая благодарность Салламу Абдалле из R&подразделение #38;D по исследованию кожи и культур клеток Университета Линчёпинга, подготовка образцов кожи и окрашивание гематоксилином и эозином (Г&Э).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бупренорфин | Salfarm Scandinavia | 451790 | Конц. 0,3 мг/мл |
| Карпрофен | Zoetis Animal Health | 191380 | Rimadyl 50 мг/мл |
| уплотнение Икина | Swemed | 2076152 | Толщина 3 мм |
| Станция для заливки образцов | Leica Biosystems | EG1150 H&C | |
| Эозин | Histolab | 1650 | 0,2% цветной раствор |
| Абсолютный этанол | Solveco | 1015 | Чистый (аналитической чистоты) |
| Фиксирующая повязка | Swemed | 2048934 | 4 см x 4 м ПА/вискоза |
| Формальдегид | Histolab | 2176 | 4% в PBS, pH 7,2–7,4 |
| Триммер для волос | Свевет | F95000 | Длина среза: 0,5 мм |
| Гематоксилин | Histolab | 1800 | Harris HTX |
| Histolab-Clear | Histolab | 14250 | Заменитель ксилола |
| Изофлуран | VM Pharma | 448210 | Attane vet 1000 мг/г |
| Lekotape | Swemed | 2056774 | |
| Mepilex | Swemed | 2059125 | 7,5x8,5 см |
| пленка Mepore | Swemed | 2057753 | 6x7 см с рамкой |
| Микропористая хирургическая лента | Swemed | 2063856 | 1,2 см x 9,1 м |
| Микротом | Thermo Fisher Scientific | 387861 | Microm HM355S |
| Среда для заключения препаратов | Гистолаборатория | 00840-05 | Pertex |
| Уплотнительное кольцо | Руилогод | B0B1TRQBRT | внутренний диаметр 11 мм, ширина 1 мм |
| Шовный материал (Ethilon 4-0) | Scandivet | 21274-A | Нерассасывающийся полиамид |
| Обезвоживание тканей | Leica Biosystems | Leica TP1020 | |
| Tubifast с двусторонним растяжением | Swemed | 2069292 | 7,5 см x 10 м ПЭС/ПА |
Ссылки
- Europe advanced wound care market size & share 2025-2034: market size by product, by application, by end use, regional forecast. Global Market Insights. Available from: https://www.gminsights.com/industry-analysis/europe-advanced-wound-care-market.
- Nauta AC, Gurtner GC, Longaker MT. Adult stem cells in small animal wound healing models. In: Gourdie RG, Myers TA, editors. Wound Regeneration and Repair Methods and Protocols. New York (NY): Humana Press; 2013. p. 81-98.
- Masson-Meyers DS, et al. Experimental models and methods for cutaneous wound healing assessment. Int J Exp Pathol. 2020;101(1-2):21-37.
- Wong VW, et al. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011;2011:969618.
- Shahin H, et al. MicroRNA-155 mediates multiple gene regulations pertinent to the role of human adipose-derived mesenchymal stem cells in skin regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 2024;12:1328504.
- Ojeh N, et al. The Wound Reporting in Animal and Human Preclinical Studies (WRAHPS) guidelines. Wound Repair Regen. 2024;33(1):e13232.
- Flynn K, et al. Chronic wound healing models. ACS Pharmacol Transl Sci. 2023;6(5):783-801.
- Davidson JM, Yu F, Opalenik SR. Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013;2(4):142-148.
- Nuutila K, et al. Titanium wound chambers for wound healing research. Wound Repair Regen. 2016;24(6):1097-1102.
- Galiano RD, Michaels J, Dobryansky M, Levine JP, Gurtner GC. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 2004;12(4):485-492.
- Miller AW, Anderson AR, Suarez-Arnedo A, Segura T. Wound healing splinting devices for faster access and use. JID Innov. 2024;5(2):100332.
- Winter GD. Formation of the scab and the rate of epithelialization of superficial wounds in the skin of young domestic pig. Nature. 1962;193:293-294.
- Laurano R, Boffito M, Ciardelli G, Chiono V. Wound dressing products: a translational investigation from the bench to the market. Eng Regen. 2022;3(2):182-200.
- Rhea L, Dunnwald M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. J Vis Exp. 2020;(162):61616.
- Davidson JM, Yu F, Opalenik SR. Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013;2(4):142-148.
- Bae SH, Bae YC, Nam SB, Choi SJ. A skin fixation method for decreasing the influence of wound contraction on wound healing in a rat model. Arch Plast Surg. 2012;39(5):457-462.
- DeMarco GJ, Nunamaker EA. A review of the effects of pain and analgesia on immune system function and inflammation: relevance for preclinical studies. Comp Med. 2019;69(6):520-534.
- Jorgensen LB, Sorensen JA, Jemec GBE, Yderstraede KB. Methods to assess area and volume of wounds: a systematic review. Int Wound J. 2016;13(4):540-553.