Методическая статья

Прецизионное лигирование передней нисходящей ветви левой коронарной артерии с использованием анатомических ориентиров в мышиной модели инфаркта миокарда

55 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72336

⸱

18 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 2National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 3Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education & Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province (Collaborative Innovation Center for Prevention of Cardiovascular Diseases), 4School of Integrated Traditional and Western Medicine, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе индуцируется инфаркт миокарда у мышей путем постоянного лигирования левой передней нисходящей коронарной артерии, при этом передняя межжелудочковая борозда используется в качестве воспроизводимого поверхностного ориентира для точного наложения шва. Инфаркт подтверждается с помощью электрокардиографии, эхокардиографии, гистологического окрашивания и анализа сывороточных биомаркеров.

Аннотация

Перманентное лигирование передней нисходящей (ПН) коронарной артерии является наиболее широко используемым подходом для создания мышиных моделей инфаркта миокарда (ИМ) в доклинических сердечно-сосудистых исследованиях. Однако в традиционных протоколах место лигирования обычно располагается на 1–2 mm ниже ушка левого предсердия — ориентира, который зачастую трудно надежно идентифицировать во время операции. В сочетании со значительной межиндивидуальной вариабельностью анатомии коронарных артерий у мышей это часто приводит к неточному определению локализации ПН, несогласованности мест лигирования и снижению воспроизводимости результатов разными операторами. Чтобы устранить эти ограничения, в данном протоколе в качестве направляющего ориентира для лигирования ПН предлагается использовать переднюю межжелудочковую борозду (ПМБ). ПМБ представляет собой неглубокую поверхностную бороздку, которая непосредственно видна под микроскопом, при этом ПН проходит сразу под ней. В отличие от традиционных подходов, ПМБ обеспечивает стабильный анатомический ориентир, который способствует более последовательному выбору места лигирования и легче идентифицируется неопытными операторами. Протокол сочетает стандартизированную ингаляционную анестезию изофлураном с неинвазивной трахеальной интубацией и подтверждает развитие ИМ с помощью электрокардиографии, эхокардиографии, иммуноферментного анализа (ELISA), гистопатологического окрашивания и трехмерной визуализации коронарных артерий. Данный протокол представляет собой надежный и воспроизводимый экспериментальный метод индуцирования ИМ у мышей для изучения патофизиологических и иммунных изменений после ИМ.

Введение

Инфаркт миокарда (ИМ), являющийся одной из основных причин сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности во всем мире, представляет серьезную угрозу для здоровья человека1. Характеризующийся внезапным началом, критическим клиническим течением и высоким уровнем летальности, ИМ вызывается преимущественно тромботической окклюзией коронарных артерий и может привести к глубокой ишемии миокарда, последующему некрозу кардиомиоцитов и каскаду осложнений, включая аритмии, сердечную недостаточность и внезапную сердечную смерть2. Несмотря на значительные успехи в клинической кардиологии, ограниченный доступ к тканям миокарда человека продолжает препятствовать исследованию лежащих в основе патофизиологических механизмов ИМ и разработке эффективных терапевтических стратегий3. Следовательно, надежные, воспроизводимые и клинически релевантные животные модели in vivo, которые точно воспроизводят клинические признаки и прогрессирование ИМ, остаются необходимыми для изучения механизмов заболевания и доклинической оценки терапии.

С тех пор как Джонс и Олсон впервые создали мышиную модель инфаркта миокарда (ИМ) в 1954 году, методики индуцирования ИМ у мышей подвергались постоянному совершенствованию4. Перманентное лигирование передней нисходящей (ПН) коронарной артерии под прямым микроскопическим контролем стало наиболее широко применяемым методом, поскольку оно воспроизводит ключевые патологические особенности ИМ у человека, включая локальную ишемию миокарда, некроз миокарда и постинфарктное ремоделирование желудочков5. Однако традиционное лигирование ПН артерии требует значительного опыта в микрохирургии, который обычно приобретается только в результате длительного обучения, что ограничивает согласованность и воспроизводимость процедуры разными операторами и в разных лабораториях6. Более того, интраоперационные и послеоперационные осложнения, включая кровотечение, повреждение или коллапс легких, неправильное расположение лигатуры и механическое повреждение тканей вследствие неадекватной вентиляции, способствуют относительно высокой периоперационной смертности, что дополнительно ограничивает широкое применение данной модели7. В ответ на эти ограничения Гао и соавт. предложили модифицированную технику, включающую лигирование ПН артерии путем эверсии сердца, что упрощает хирургическую процедуру и снижает технический порог создания модели8. Для специфических исследовательских целей были также разработаны дополнительные экспериментальные подходы, включая криоповреждение коронарных артерий и фармакологическую индукцию повреждения миокарда9,10. Тем не менее, перманентное лигирование ПН артерии под прямым контролем остается предпочтительным методом, так как оно наиболее точно воспроизводит основные патофизиологические признаки ИМ у человека, позволяя при этом контролировать размер и локализацию инфаркта.

Несмотря на широкое применение, традиционное лигирование LAD ограничено вариативностью определения места лигирования, несогласованностью процедуры, относительно высокой периоперационной смертностью и межлабораторной вариабельностью воспроизводимости, что может повлиять на надежность и сопоставимость экспериментальных результатов11. Общая цель настоящего протокола заключается в создании более стандартизированного и воспроизводимого метода постоянного лигирования LAD у мышей с использованием передней межжелудочковой борозды (AIS) в качестве внешнего анатомического ориентира для локализации сосуда. Вместо определения места лигирования на фиксированном расстоянии ниже ушка левого предсердия, в данном протоколе AIS — неглубокая поверхностная борозда, которая непосредственно видна при микроскопической визуализации и располагается над LAD — используется как стабильный анатомический ориентир для проведения лигирования. По сравнению с традиционным методом оценки по ориентирам, данный подход призван обеспечить более последовательный выбор места лигирования, снизить зависимость от оператора и облегчить доступ для менее опытных хирургов, сохраняя при этом совместимость со стандартными процедурами моделирования MI у мышей. Таким образом, данный протокол подходит исследователям, стремящимся к использованию воспроизводимого хирургического метода создания моделей постоянного MI для изучения повреждения миокарда, ремоделирования желудочков, воспаления и связанных с ними механизмов сердечно-сосудистых заболеваний.

Протокол

Все эксперименты с использованием животных были проведены с одобрения комитета по этике Центра экспериментов на животных Юго-Западного медицинского университета (номер одобрения SWMU20240146). В данном исследовании использовали самцов мышей C57BL/6J (без специфических патогенов [SPF]) в возрасте 8–10 недель и массой 20,0 ± 3,0 g. Перед началом экспериментов мышей подвергали акклиматизации в течение 1 недели в стандартных лабораторных условиях (2°C ± 2°C; цикл 12 ч свет/12 ч темнота).

1. Предоперационная подготовка

  1. Подготовьте и стерилизуйте все хирургические инструменты в день операции, включая пинцеты, офтальмологические ножницы, иглодержатель, микрогемостат, V-образный ретрактор века, нейлоновые нити 7-0 с иглой (изгиб 3/8 окружности), нейлоновые нити 6-0 и нейлоновые нити 5-0. Автоклавируйте все металлические инструменты при 121°C в течение 20 min перед процедурой и повторно стерилизуйте их между операциями на разных животных с помощью стеклянного бисерного стерилизатора (250°C в течение 15 s) с последующим охлаждением на стерильной салфетке. Используйте шовный материал из герметичных стерильных упаковок.
  2. Организуйте две отдельные рабочие зоны для соблюдения правил асептики. В первой зоне разместите пинцеты, набор для трахеальной интубации мышей и аппарат для анестезии; во второй стерильной хирургической зоне разместите стерилизованные инструменты, ватные тампоны, повидон-йод и стерильную марлю.
  3. Нанесите депиляционный крем на область грудной клетки на 1 min. Осторожно удалите крем и волосы с помощью стерильной марли, смоченной стерильной водой или физиологическим раствором.
    1. Само по себе удаление волос не является хирургической подготовкой кожи. Окончательную асептическую дезинфекцию кожи и стерильное укрытие (драпировку) выполняйте только после проведения анестезии, интубации и фиксации мыши на операционном столе, непосредственно перед разрезом кожи (Шаг 2.6).
  4. Введите цефазолин (30 mg/kg) путем внутрибрюшинной инъекции за 1 h до операции. Растворите цефазолин натрия для инъекций в стерильном 0.9% физиологическом растворе до рабочей концентрации 30 mg/mL и введите примерно 0.2 mL на 20 g массы тела для достижения целевой дозы. Продолжайте введение один раз в день в течение 5 последовательных дней после операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе не используйте системные или местные фармакологические гемостатические средства. Обеспечьте интраоперационный гемостаз путем осторожного непрерывного давления стерильным ватным тампоном в течение 10–30 s или до остановки кровотечения.

2. Индукция анестезии и трахеальная интубация

  1. Поместите мышь в индукционную камеру (16 × 10 × 1 cm), подключенную к аппарату для наркоза. Установите скорость потока газа-носителя на 0.5 L/min и проведите индукцию анестезии 3.5%–4.0% изофлураном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите достаточность анестезии по отсутствию рефлекса отдергивания лапы. При таких настройках мышь обычно достигает хирургического уровня анестезии в течение 2–4 min.
  2. Поместите анестезированную мышь в положение на спине на платформу для трахеальной интубации грызунов. Зафиксируйте мышь, зацепив верхние резцы за резиновую ленту платформы так, чтобы голова и шея были вытянуты под углом примерно 45°. Выровняйте ротовую, глоточную и гортанную оси, чтобы глотка находилась в прямой видимости.
  3. Выполните оротрахеальную интубацию
    1. Выполните оротрахеальную интубацию при прямой ларингоскопии без трахеотомии для обеспечения контролируемой механической вентиляции. В качестве эндотрахеальной трубки используйте внутривенный катетер 20 G (внешний диаметр примерно 0.9 mm; длина примерно 15 mm).
    2. Откройте рот и осторожно сместите язык в сторону с помощью пинцета. Введите лопатку ларингоскопа для мелких животных вдоль тыльной стороны языка и надавите на основание языка.
    3. Продвигайте ларингоскоп до тех пор, пока не станет видна надгортанник. Поднимите ларингоскоп вверх и вперед по оси рукоятки, чтобы приподнять надгортанник и обнажить V-образное отверстие голосовой щели и бледные голосовые связки.
    4. Введите катетер через открытую голосовую щель на вдохе, сохраняя прямую визуализацию голосовых связок. Извлеките ларингоскоп после того, как катетер пройдет через голосовую щель.
    5. Продвиньте катетер на глубину примерно 5–7 mm. Извлеките проводник и подключите катетер к аппарату ИВЛ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите правильность установки эндотрахеальной трубки по симметричному двустороннему движению грудной стенки, синхронизированному с аппаратом ИВЛ. Если движение грудной стенки минимально, а вместо него наблюдается ритмичное движение живота, сопровождающееся постепенным ослаблением анестезии, извлеките катетер из пищевода и повторите интубацию.
    6. Если глотка не визуализируется, извлеките ларингоскоп и повторно расположите мышь на платформе для интубации с вытягиванием головы и шеи под углом примерно 45°. Снова выровняйте ротовую, глоточную и гортанную оси, удалите любые секреты из ротоглотки стерильным ватным тампоном и повторите ларингоскопию. Если у мыши появляются признаки пробуждения из анестезии, верните её в индукционную камеру, углубите анестезию, а затем повторите попытку интубации.
    7. Прекратите процедуру, если у мыши развивается цианоз, кровотечение из гортани или стойкая апноэ. Прекратите подачу изофлурана и поместите мышь на терморегулируемый нагревательный коврик (37°C) до полного восстановления.
    8. Не приступайте к торакотомии, если трахеальная интубация не удалась. Перенесите процедуру на более поздний сеанс или исключите животное из исследования, зафиксировав это как процедурную неудачу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторные попытки интубации могут вызвать отек гортани, что увеличивает риск послеоперационного респираторного дистресса. В большинстве случаев успешная интубация достигается в течение первых двух попыток после прямой визуализации глотки. Овладение техникой оротрахеальной интубации требует практики и знакомства с методом.
  4. Используйте воздух в качестве газа-носителя при скорости потока 0.5 L/min и поддерживайте анестезию 1.5%–2.0% изофлураном. Настройте аппарат ИВЛ на частоту дыхания 130 breaths/min, дыхательный объем 2 mL и соотношение фаз вдоха и выдоха 5:4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дыхательный объем, установленный на аппарате ИВЛ, превышает теоретическое значение, рассчитанное по массе тела, так как он компенсирует сжимаемый объем контура аппарата и мертвое пространство эндотрахеальной трубки. Оценивайте вентиляцию на протяжении всей процедуры, наблюдая за отсутствием цианоза и признаков баротравмы, включая пневмоторакс и подкожную эмфизему.
    1. Постоянно контролируйте глубину анестезии на протяжении всей процедуры. Оценивайте характер дыхания и рефлекс отдергивания лапы каждые 2 min. Непрерывно мониторируйте частоту сердечных сокращений (ЧСС) с помощью электрокардиограммы (ЭКГ) и регулируйте концентрацию изофлурана для поддержания ЧСС на уровне 40–50 beats/min; концентрации изофлурана 1.5%–2.0% обычно достаточно. В ходе процедуры следите за отсутствием спонтанных дыхательных усилий против аппарата ИВЛ, движением вибрисс и изменением цвета слизистых оболочек.
    2. Увеличивайте концентрацию изофлурана с шагом 0.5% до максимума 3.0%, если вновь появляется рефлекс отдергивания лапы, наблюдается движение вибрисс или возникают спонтанные дыхательные усилия против аппарата ИВЛ. Снижайте концентрацию изофлурана с шагом 0.5% до минимума 1.0%, если ЧСС падает ниже 350 beats/min. При появлении этих признаков приостанавливайте хирургическую процедуру, продолжайте мониторинг ЧСС, характера дыхания, цвета слизистых оболочек и движения вибрисс и возобновляйте процедуру только после стабилизации физиологических параметров.
  5. Наклоните мышь на правый бок, чтобы левый бок был сверху, для обеспечения доступа к левой грудной стенке. Зафиксируйте четыре конечности и хвост на платформе с помощью адгезивной ленты.
  6. Продезинфицируйте операционное поле, трижды нанеся повидон-йод. Для каждого нанесения используйте новый стерильный ватный тампон, начиная с планируемого места разреза и двигаясь наружу концентрическими спиралями примерно на 1 cm за пределы предполагаемого разреза во всех направлениях. Утилизируйте тампон после каждого нанесения; не возвращайте использованный тампон в центр операционного поля. Дайте последнему слою полностью высохнуть на воздухе, затем наложите стерильную салфетку, оставив открытым только операционное поле, прежде чем сделать разрез кожи.

3. Торакотомия и обнажение сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий ход хирургической операции, включая позиционирование животного, торакотомию, обнажение сердца, лигирование передней нисходящей артерии (LAD), закрытие грудной клетки и послеоперационное восстановление, показаны на Рисунке 1 и Рисунке 2.

Схема анатомии сердца с указанием точки лигирования и коронарных артерий; изображения операционного поля.
Рисунок 1Анатомическая локализация места лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии с использованием передней межжелудочковой борозды. (A) Вид сердца мыши с вентральной стороны перед перевязкой, на котором видна передняя межжелудочковая борозда (AIS). (B) Вид той же области после перевязки передней нисходящей ветви (LAD) левой коронарной артерии; обведенная область указывает на место перевязки. (C) Схема, демонстрирующая пространственное расположение передней межжелудочковой борозды и коронарных артерий. Передняя нисходящая ветвь (LAD) проходит вдоль передней межжелудочковой борозды, а точка перевязки находится в верхней трети борозды. RCA — правая коронарная артерия; LCA — левая коронарная артерия; LCX — огибающая ветвь левой коронарной артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Последовательность хирургической процедуры на мыши, обнажение сердца, экспериментальное исследование, пошаговая схема.
Рисунок 2Хирургическая процедура лигирования передней нисходящей артерии сердца у мышей с ориентированием по передней межжелудочковой борозде. (A) Поместите и зафиксируйте анестезированную мышь, предварительно выбрив шерсть в левой части грудной области. (B) Выполните разрез кожи над левой грудной стенкой. (C) Разведите грудные мышцы и определите подходящий межреберный промежуток для проведения торакотомии. (D, E) Введите и установите ретрактор для грудной клетки, чтобы расширить межреберный промежуток и открыть операционное поле. (F) Визуализируйте обнаженное сердце и найдите переднюю межжелудочковую борозду (ПМЖБ). (G) Проведите нейлоновую нить 7-0 через ПМЖБ под левую переднюю нисходящую (ЛПН) коронарную артерию. (H) Завяжите узел, чтобы обеспечить постоянную лигатуру ЛПН. (I) Удалите ретрактор и закройте грудную стенку. (J, K) Последовательно ушейте мышечный слой и кожу. (L) Оставьте мышь для восстановления после операции в условиях прогрева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. С помощью офтальмологических ножниц сделайте продольный разрез кожи длиной 1 cm на левой грудной стенке, параллельно продольной оси грудины и примерно в 2 mm латеральнее левого края грудины. Обнажите подлежащие грудные мышцы.
  2. С помощью тонкого пинцета тупым способом разделите большую и малую грудные мышцы вдоль направления их волокон. Отодвиньте мышцы латерально, чтобы обнажить ребра и межреберные промежутки; избегайте разрезания мышц для минимизации кровотечения.
  3. Перед вскрытием грудной полости определите подходящий межреберный промежуток. Найдите переднюю межреберную артерию — ветвь внутренней грудной артерии, которая проходит в межреберном промежутке параллельно ребрам, и определите третий межреберный промежуток, расположенный непосредственно краниально от наиболее отчетливо видимой артерии в четвертом межреберном промежутке.
  4. Если передняя межреберная артерия видна недостаточно четко, прощупайте первое ребро и отсчитайте ребра каудально, чтобы определить промежуток между третьим и четвертым ребрами. Прежде чем продолжить, убедитесь, что выбранный межреберный промежуток обеспечивает прямой, беспрепятственный обзор ушка левого предсердия и передней свободной стенки левого желудочка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точное определение третьего межреберного промежутка имеет решающее значение, так как неправильный выбор места торакотомии может ухудшить визуализацию сердца и поставить под угрозу успех процедуры.
  5. Выполните торакотомию через левый третий межреберный промежуток. Осторожно расширьте межреберный промежуток с помощью V-образного ретрактора для век, пока ушко левого предсердия и верхняя треть левого желудочка не будут четко видны в операционном поле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе сердце остается покрытым перикардом, поэтому AIS невозможно надежно идентифицировать. Идентифицируйте AIS только после вскрытия перикарда (шаг 3.6), как описано в шагах 4.2–4.3.
  6. Осторожно захватите перикард одним тонким пинцетом и приподнимите его над миокардом. С помощью второго тонкого пинцета медленно разорвите перикард, чтобы полностью обнажить сердце.

4. Лигирование передней нисходящей ветви левой коронарной артерии по анатомическим ориентирам

  1. Проведите нейлоновую нить 6-0 через грудную стенку и приложите легкое натяжение, чтобы расширить операционное поле. Полностью обнажите межжелудочковую борозду (AIS) перед определением места лигирования (Рисунок 1A).
  2. Определите AIS как неглубокую борозду, проходящую косо от основания сердца к верхушке и обозначающую поверхностную границу между левым и правым желудочками (Рисунок 1C). Под микроскопом идентифицируйте ее как квазикруговое углубление, расположенное примерно в 1–2 mm ниже нижнего края ушка левого предсердия.
  3. Если AIS трудно идентифицировать, осторожно протрите эпикардиальную поверхность ватным тампоном, смоченным теплым физиологическим раствором. Повторно осмотрите операционное поле под микроскопом, чтобы четче увидеть борозду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Под диссекционным микроскопом AIS представляет собой легко узнаваемую неглубокую борозду, которая анатомически разграничивает межжелудочковую границу, при этом передняя межжелудочковая артерия (LAD) проходит непосредственно под ней. Если после протирания AIS остается нечеткой, сначала убедитесь, что торакотомия обеспечивает достаточный обзор. Затем идентифицируйте LAD напрямую согласно ранее описанным методам: по сравнению с сопровождающей ее сердечной веной, артерия имеет более розовый цвет, меньший калибр и отчетливо пульсирует12.
    1. Если AIS или коронарную артерию LAD не удается идентифицировать, сначала проверьте, была ли торакотомия выполнена через левое третье межреберье. При необходимости измените положение разреза торакотомии, как описано в шагах 3.3–3.5, затем повторите идентификацию AIS и LAD, как описано в шагах 4.1–4.3.
    2. Прекратите процедуру, если AIS или LAD не удается идентифицировать после 10 min тщательного осмотра, при возникновении неконтролируемого кровотечения, если общая продолжительность процедуры с открытой грудной клеткой превышает 20 min или если частота сердечных сокращений остается ниже 30 ударов/мин, несмотря на коррекцию глубины анестезии. Глубоко анестезируйте мышь 5% изофлураном, проведите эвтаназию путем перелома шейных позвонков и отметьте животное как неудачу процедуры для включения в анализ хирургических исходов.
  4. Проведите нейлоновую нить 7-0 поперек борозды в верхней трети AIS (Рисунок 1B). Введите иглу перпендикулярно эпикардиальной поверхности на глубину примерно 0.5–1 mm так, чтобы точки входа и выхода находились по разные стороны борозды и охватывали примерно ее максимальную ширину.
  5. Закрепите лигатуру с помощью хирургического узла. Регулируйте лигатуру до тех пор, пока после первого затягивания не произойдет немедленное обесцвечивание миокарда дистальнее места лигирования без заметного вдавливания местных тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Затягивайте шов ровно настолько, чтобы перекрыть коронарный кровоток. Избыточное натяжение может повредить прилегающий миокард или привести к тому, что нить прорежет сосуд и окружающие ткани.
  6. Подтвердите успешную окклюзию коронарной артерии в течение 1 min после лигирования, наблюдая очаговое ишемическое обесцвечивание миокарда дистальнее места лигирования12. Дополнительно подтвердите окклюзию, зафиксировав элевацию сегмента ST на ЭКГ.
  7. Если ишемическая зона чрезмерно мала или обесцвечивание отсутствует, ослабьте лигатуру и повторите процедуру лигирования.

5. Ушивание раны и послеоперационное восстановление

  1. Осторожно удалите V-образный ретрактор век. Закройте торакотомию одним простым прерывистым швом из нейлона 5-0, проводя иглу вокруг прилежащих третьего и четвертого ребер для сопоставления третьего межреберного промежутка. Держите иглу близко к поверхности ребра, чтобы избежать повреждения межреберного нервно-сосудистого пучка. Перед завязыванием шва осторожно сожмите грудную клетку в конце выдоха для удаления остаточного внутригрудного воздуха, затем поддерживайте компрессию, фиксируя шов хирургическим узлом.
  2. Закройте разрез кожи послойно, используя швы из нейлона 5-0. Перед завершением убедитесь в полном сопоставлении краев раны.
  3. Поместите мышь на нагревательный коврик с контролируемой температурой (37°C), прекратите подачу изофлурана и продолжайте механическую вентиляцию до возобновления спонтанного дыхания. Наблюдайте за животным до полного выхода из наркоза, включая движение хвоста или вибрисс и восстановление регулярного ритма дыхания (примерно 150 breaths/min).
  4. Подтвердите готовность к экстубации, убедившись в наличии регулярного спонтанного дыхания, видимого движения стенки грудной клетки, синхронизированного с циклом вентилятора, и целенаправленного движения конечностей или вибрисс. Медленно извлеките эндотрахеальную трубку в фазе выдоха, затем продолжайте наблюдение за мышью на нагревательном коврике в течение 3–5 min для подтверждения отсутствия дыхательной недостаточности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дыхательная недостаточность после экстубации чаще всего вызвана пневмотораксом вследствие неполного закрытия межреберного промежутка. При возникновении дыхательной недостаточности временно повторно анестезируйте и вентилируйте мышь, раскройте кожные швы, осмотрите место закрытия межреберного промежутка и наложите дополнительные швы в любых точках утечки воздуха перед повторным проведением экстубации.
  5. После выхода из наркоза верните мышь в домашнюю клетку. Введите бупренорфин (0.1 mg/kg, подкожно) сразу после операции и каждые 4–6 h в течение первых 48 h.
  6. Наблюдайте за каждой мышью не менее двух раз в день в течение первых 3 послеоперационных дней и один раз в день в дальнейшем. Оценивайте массу тела, позу, активность, характер дыхания и состояние хирургической раны; проведите эвтаназию любого животного при достижении заранее определенных гуманных конечных точек, включая стойкое затрудненное дыхание, невозможность доступа к еде или воде, а также сгорбленную, неподвижную позу с отсутствием реакции на стимуляцию.

6. Электрокардиографическая (ЭКГ) оценка

  1. Запишите электрокардиографические сигналы с помощью многоканальной системы физиологической регистрации, оснащенной усилителем ЭКГ. Установите три подкожных электрода для отведения от конечностей мыши, подключив положительный вход (VIN+) к левой задней конечности, отрицательный вход (VIN−) к правой передней конечности и заземление (GND) к правой задней конечности.
  2. Подключите модуль усилителя ЭКГ к блоку сбора данных. Установите режекторный фильтр на 50 Hz (или 60 Hz, в соответствии с частотой местной электросети), затем откройте программное обеспечение для сбора данных и добавьте новый модуль усилителя ЭКГ в настройках аналоговых каналов.
    1. Настройте усилитель со следующими параметрами: коэффициент усиления = 20, режим = normal, фильтр нижних частот = 150 Hz и фильтр верхних частот = 0.05 Hz. Откройте настройки сбора данных, установите частоту дискретизации 1 kHz и закройте окно настройки.
    2. После установки электродов нажмите Start для начала записи. Установите временную развертку дисплея 0.5 s на одно большое деление и вертикальный масштаб 0.25 mV на одно большое деление, затем непрерывно записывайте ЭКГ в течение как минимум 30 s. Выберите стабильный сегмент без артефактов для анализа и репрезентативного представления.
  3. Запишите ЭКГ сразу после лигирования, поддерживая мышь под 1.5% изофлуранной анестезией и в состоянии нормотермии на нагревательной платформе. Записывайте ЭКГ как для группы с инфарктом миокарда (MI), так и для нормальной контрольной группы (NC) в одной и той же временной точке при сопоставимых условиях анестезии.

7. Эхокардиография

  1. За 1 день до проведения визуализации удалите шерсть с передней части грудной области с помощью депиляционного крема. На протяжении всего исследования поддерживайте анестезию мыши с помощью 1,5% изофлурана.
  2. Положите мышь на спину на подогреваемую платформу, закрепите четыре конечности электродами ЭКГ и нанесите ультразвуковой гель на область прекордиума. При необходимости отрегулируйте концентрацию изофлурана для поддержания частоты сердечных сокращений выше 400 beats/min.
  3. Расположите ультразвуковой датчик на уровне третьего-четвертого межреберья вдоль левого края грудины. Направьте маркер датчика в сторону правой передней конечности под углом примерно 30° и совместите датчик с продольной осью сердца.
  4. Проводите всю визуализацию с использованием линейного датчика с центральной частотой передачи 30 MHz, полосой пропускания 20–46 MHz и осевым разрешением 50 μm. Установите мощность передачи на 100%, глубину изображения на 13 mm, ширину изображения на 1 mm, динамический диапазон на 60 dB и двумерный коэффициент усиления на 40 dB. Записывайте cine-петли в B-режиме с частотой кадров 210 frames/s.
  5. Сохраните эти параметры сбора данных как системную пресет-настройку. Используйте один и тот же датчик, пресет, мощность передачи, динамический диапазон, глубину и ширину изображения для всех животных и всех сеансов визуализации; не изменяйте глубину изображения при переходе от группы NC к группе MI.
  6. В том же режиме просмотра по длинной оси расположите линию сканирования в M-режиме на уровне середины желудочка, перпендикулярно межжелудочковой перегородке и задней стенке левого желудочка, так чтобы окно выборки охватывало весь переднезадний диаметр левого желудочка. Запишите кривую в M-режиме для последующего анализа.
  7. Получите изображения в B-режиме, на которых четко визуализируются левый желудочек, левое предсердие и корень аорты, и запишите cine-петли для последующего анализа. Получите соответствующие изображения в M-режиме в той же плоскости визуализации.
  8. По полученным изображениям измерьте внутренний конечно-диастолический диаметр левого желудочка (Dd), внутренний конечно-систолический диаметр левого желудочка (Ds) и толщину межжелудочковой перегородки. Запишите пять последовательных сердечных циклов и рассчитайте средние значения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте конечно-диастолический объем левого желудочка (LVEDV) и конечно-систолический объем левого желудочка (LVESV) автоматически с помощью программного обеспечения для визуализации. Рассчитайте фракционное укорочение (FS) по формуле FS = (Dd − Ds) / Dd × 100% и фракцию выброса (EF) по формуле EF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 10%.

8. Сбор тканей, гистологическое окрашивание и ИФА

  1. Сбор тканей
    1. На 7-й день после индукции инфаркта миокарда (ИМ) проведите эхокардиографию каждой мыши. Анестезируйте мышь 4% изофлураном, соберите примерно 1.5 mL крови путем ретроорбитального кровопускания, подвергните мышь эвтаназии путем дислокации шейного отдела позвоночника и извлеките сердце.
    2. Дайте образцам крови свернуться в течение ночи при 4°C. Центрифугируйте образцы при 20 × g в течение 10 мин при 4°C, соберите сыворотку и храните ее при −80°C до проведения анализа.
  2. Иммуноферментный анализ (ИФА/ELISA)
    1. Определите количество мозгового натрийуретического пептида B-типа (BNP), интерлейкина-1β (IL-1β), фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и ядерного фактора-κB p65 (NF-κB p65) в сыворотке с использованием наборов для иммуноферментного анализа (ELISA).
      1. Доведите все реагенты и образцы сыворотки до комнатной температуры и приготовьте рабочие растворы согласно инструкции к набору. Разведите образцы сыворотки 1:5 в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS), то есть один объем сыворотки на четыре объема PBS.
      2. Добавьте по 50 μL стандартов, PBS и разведенных образцов сыворотки в соответствующие лунки для стандартов, нулевой контроль и образцов, оставив холостую лунку пустой. Добавьте 10 μL антител для детекции, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP), во все лунки, кроме холостой, закройте планшет и инкубируйте при 37°C в течение 60 мин в темноте.
      3. Удалите содержимое каждой лунки и пять раз промойте планшет промывочным буфером, выдерживая буфер в каждой лунке по 20 с во время каждого цикла промывки. Промокните планшет досуха безворсовой бумагой.
      4. Добавьте в каждую лунку 10 μL свежеприготовленного субстрата (растворы A и B, смешанные в объеме 1:1). Инкубируйте закрытый планшет при 37°C в течение 15 мин в темноте, добавьте 50 μL стоп-раствора и измерьте оптическую плотность при 450 nm.
    2. Вычтите оптическую плотность холостой пробы из каждого измерения и постройте стандартную кривую с использованием четырехпараметрической логистической (4PL) регрессионной модели. Рассчитайте концентрацию каждого образца по аппроксимирующей кривой, умножьте значение на коэффициент разведения (5) и укажите среднее значение по дубликатным лункам.
  3. Обработка тканей, заливка и нарезка срезов
    1. Кратковременно промойте каждое извлеченное сердце в ледяном фосфатно-солевом буферном растворе для удаления остатков крови. Зафиксируйте ткань в 4% параформальдегиде в течение как минимум 24 ч при комнатной температуре.
    2. Подрежьте каждое сердце так, чтобы обнажить плоскую поверхность в короткой оси, и поместите его в маркированную гистологическую кассету. Дегидратируйте ткань в серии возрастающих концентраций этанола (75% этанол 4 ч, 85% этанол 2 ч, 90% этанол 2 ч, 95% этанол 1 ч и две смены абсолютного этанола по 30 мин каждая). Переведите ткань в смесь этанола и ксилола на 5–10 мин, проведите просветление в двух сменах ксилола по 10 мин каждая и проведите инфильтрацию в трех сменах расплавленного парафина по 1 ч каждая.
    3. Залейте каждое сердце в блок так, чтобы короткая ось была обращена к поверхности блока. Сделайте серийные срезы толщиной 3 μm на уровне середины папиллярных мышц, всплывите срезы на водяной бане при 40°C, занесите их на стеклянные предметные стекла и высушите при 60°C.
    4. Депарафинизируйте срезы в двух сменах ксилола (по 15 мин каждая), затем в трех сменах абсолютного этанола (по 5 мин каждая), 75% этаноле (5 мин) и воде обратного осмоса (RO water) (5 мин).
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Параформальдегид является вероятным канцерогеном, раздражителем дыхательных путей и кожи, а ксилол легковоспламеняем и нейротоксичен. Работайте с этими реагентами в вытяжном шкафу, используя стерильные медицинские перчатки, лабораторный халат и средства защиты глаз; утилизируйте отходы в соответствии с требованиями учреждения по обращению с опасными отходами. Этанол и n-бутанол легковоспламеняемы; держите их вдали от источников возгорания.
  4. Гистологическое окрашивание
    1. Окрашивание гематоксилином и эозином
      1. Погрузите депарафинизированные и регидратированные срезы в гематоксилин на 3–5 мин. Промойте срезы в воде.
      2. Дифференцируйте срезы в 1% кислотном спирте и промойте в воде. Проведите подкрашивание в синий цвет в 0.5% водном растворе аммиака и снова промойте.
      3. Последовательно перенесите срезы в 85% этанол, 95% этанол и абсолютный этанол на 5 мин в каждом. Проведите контрастное окрашивание срезов эозином в течение 3–5 мин.
      4. Дегидратируйте срезы в трех сменах абсолютного этанола по 5 мин каждая, затем в n-бутаноле в течение 5 мин. Просветлите срезы в трех сменах ксилола по 5 мин каждая и закройте нейтральным смоляным клеем.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ядра окрашиваются в синий цвет, тогда как цитоплазма и внеклеточный матрикс — в красный.
    2. Окрашивание трихромом по Массону
      1. Протравите депарафинизированные и регидратированные срезы в 2.5% растворе дихромата калия в течение ночи (примерно 15 ч) при комнатной температуре. Промывайте срезы под проточной водой около 30 с до исчезновения желтого оттенка.
      2. Окрашивайте срезы в растворе понсо-кислого фуксина в течение 6 мин, пока ткань не станет ярко-красной. Увеличьте время окрашивания, если цвет остается бледным, и промывайте срезы под проточной водой до тех пор, пока смыв не станет бесцветным.
      3. Слейте излишки воды, не допуская высыхания срезов. Дифференцируйте срезы в водном растворе фосфомолибденовой кислоты в течение 1–2 мин, пока коллаген не станет бледным, а мышечные волокна останутся красными.
      4. Перенесите срезы непосредственно в раствор анилинового синего без промывки. Инкубируйте срезы в течение 6–30 с.
      5. Дифференцируйте срезы в трех-пяти сменах 1% уксусной кислоты примерно по 8 с на каждую смену. Быстро дегидратируйте их в трех сменах абсолютного этанола примерно по 3, 5 и 5 с соответственно.
      6. Просветлите срезы в n-бутаноле в течение 5 мин, а затем в ксилоле в течение 5 мин. Закройте срезы нейтральным смоляным клеем.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагеновые волокна окрашиваются в синий цвет, в то время как мышечные волокна, фибрин и эритроциты — в красный.
    3. Окрашивание Sirius Red
      1. Инкубируйте депарафинизированные и регидратированные срезы в растворе A Sirius Red в печи при 65°C в течение 30 мин. Промойте срезы под проточной водой до исчезновения желтого оттенка.
      2. Удалите излишки жидкости и погрузите срезы в раствор B Sirius Red на 2 мин. Кратковременно промойте срезы и удалите излишки жидкости.
      3. Погрузите срезы в раствор C Sirius Red на 30 мин. Кратковременно промойте их в течение 1–2 с.
      4. Дегидратируйте срезы в трех сменах абсолютного этанола примерно по 3 с каждая. Просветлите их в трех сменах ксилола по 5 мин каждая и закройте нейтральным смоляным клеем.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При светлопольном освещении коллагеновые волокна выглядят красными на желтом фоне.
  5. Получение и количественный анализ изображений
    1. Получите все гистологические изображения с помощью цифрового сканера предметных стекол. Используйте идентичные настройки освещения, баланса белого, экспозиции и увеличения для всех срезов всех групп; на каждом изображении должна быть калибровочная шкала.
    2. Откалибруйте пространственный масштаб перед анализом изображений. Загрузите эталонное изображение со шкалой, полученное с тем же разрешением и размером пикселей, что и исследуемые изображения. В меню Measure > Calibration > Set System создайте новую пространственную калибровку, установите единицу измерения μm, определите коэффициент пересчета пикселей в микрометры, совместив калибровочные точки со шкалой, сохраните калибровку и примените ее ко всем изображениям.
    3. Загрузите срез, окрашенный трихромом по Массону, и обведите левый желудочек с помощью инструмента выделения произвольной области (AOI). Исключите полость желудочка, правый желудочек и артефакты обработки тканей, затем зафиксируйте общую площадь левого желудочка.
    4. Откройте Measure > Count/Size и выберите Select Colors, чтобы открыть диалоговое окно сегментации. Выберите сегментацию на основе цветового куба (Color Cube Based) и установите следующие параметры: чувствительность (sensitivity) = 4, расширение выделения (expand selection) на 1 индекс цвета, минимальный размер цвета = 1 пиксель, размер ядра (kernel size) = 3 × 3. Примените одинаковые настройки сегментации ко всем срезам.
    5. С помощью инструмента «пипетка» выберите синие коллаген-положительные пиксели в качестве опорных точек. Выбирайте только отчетливо коллаген-положительные области, создайте предварительное изображение и убедитесь, что маска включает коллаген-положительные зоны, исключая окрашенный в красный миокард, полость желудочка и фон. При необходимости скорректируйте опорные точки перед применением маски.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заново выбирайте опорные пиксели для каждого среза, чтобы учесть незначительные различия в интенсивности окрашивания. Сохраняйте идентичные параметры сегментации (чувствительность, степень расширения, минимальный размер цвета и размер ядра) для всех изображений; принимайте сегментацию только тогда, когда предварительный просмотр демонстрирует полное покрытие коллаген-положительных областей с исключением не-коллагеновых структур.
    6. Примените маску сегментации и закройте диалоговое окно. В меню Measure > Select Measurements выберите Area, нажмите Count, откройте View > Statistics и зафиксируйте суммарную площадь коллаген-положительных зон.
    7. Рассчитайте объемную долю коллагена (CVF), разделив площадь коллаген-положительных зон на общую площадь левого желудочка, и выразите результат в процентах.

9. Просветление тканей и трехмерная визуализация коронарных артерий

  1. Флуоресцентное мечение коронарных сосудов
    1. Введите 20 µL 2% раствора Evans Blue в латеральную хвостовую вену для мечения коронарных сосудов. Верните мышь в клетку на 60 мин для системного распределения красителя по кровотоку.
    2. Поместите мышь в индукционную камеру (16 × 10 × 1 см), подключенную к аппарату для наркоза, и проведите индукцию анестезии с помощью 4% изофлурана. Усыпите мышь путем дислокации шейных позвонков, вскройте грудную полость, извлеките сердце, промойте его в PBS и зафиксируйте в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 24 ч при 4°C.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: PFA является вероятным канцерогеном, а также раздражителем дыхательных путей и кожи. Работайте с PFA в вытяжном шкафу, используя стерильные медицинские перчатки, лабораторный халат и средства защиты глаз; утилизируйте отходы в соответствии с установленным порядком обращения с опасными отходами.
    3. Приготовьте 3% раствор агарозы в деионизированной воде и инкапсулируйте зафиксированное сердце так, чтобы место лигирования было ориентировано соответствующим образом для визуализации. С помощью микрошприца введите 1 µL раствора DAPI в восемь точек вокруг области лигирования и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 2 дней.
  2. Просветление ткани
    1. Выполните просветление ткани с использованием набора для просветления тканей FDISCO (трехмерная визуализация органов, просветленных растворителем, с повышенной способностью к сохранению флуоресценции) согласно инструкциям производителя. Набор состоит из шести реагентов (A–F): реагенты A, B, C, D и E содержат 50%, 70%, 80%, 10% и 10% тетрагидрофурана (THF) в воде соответственно, а реагент F представляет собой дибензиловый эфир.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: THF легко воспламеняется, при хранении образует взрывоопасные перекиси, а также раздражает дыхательные пути и кожу. Дибензиловый эфир раздражает кожу и слизистую оболочку глаз. Работайте со всеми реагентами в вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты, включая стерильные медицинские перчатки, лабораторный халат и средства защиты глаз. Утилизируйте отходы в соответствии с установленным порядком обращения с опасными отходами.
    2. Последовательно инкубируйте каждое сердце в реагентах A, B, C, D и E по 6 ч в каждом реагенте. Используйте по 10 mL каждого реагента на одно сердце, что соответствует минимальному соотношению объема образца к объему реагента 1:5.
    3. Перенесите образец в реагент F и продолжайте инкубацию до тех пор, пока ткань не станет оптически прозрачной, обычно около 1 ч.
    4. Выполняйте все этапы просветления при температуре 6°C–8°C при осторожном перемешивании. Поместите образец в стеклянный контейнер, обернутый алюминиевой фольгой, и оберегайте его от света на протяжении всей процедуры для сохранения флуоресценции.
  3. Флуоресцентная микроскопия с плоскостным освещением (light-sheet)
    1. Закрепите просветленный образец в держателе. Используйте флуоресцентный микроскоп с плоскостным освещением, оснащенный объективом 4× (численная апертура = 0.28; рабочее расстояние = 20.0 mm).
    2. Погрузите закрепленный образец в дибензиловый эфир внутри камеры для визуализации. Осветите образец с обеих сторон и последовательно возбудите DAPI при 405 nm и Evans Blue при 647 nm.
    3. Установите следующие параметры сбора данных: для канала 405 nm используйте интенсивность лазера 30 условных единиц и время экспозиции 30 ms; для канала 647 nm используйте интенсивность лазера 40 условных единиц и время экспозиции 30 ms. Выполните сбор всех изображений с шагом по оси Z 6 μm и разрешением изображения 1024 × 1024 пикселя.
    4. Установите режим сбора данных камеры XYCZT, при котором сначала собираются латеральные (XY) изображения, затем следует последовательный сбор по каналам (C), перемещение по оси Z (Z) и сбор временных точек (T), согласно конфигурации программного обеспечения для визуализации.
  4. Обработка данных изображений и трехмерная реконструкция
    1. Сшейте исходные файлы изображений в формате TIFF с помощью программного обеспечения для обработки изображений, поставляемого с микроскопом. Конвертируйте сшитые файлы изображений в формат IMS, выбрав File > Convert to Imaris.
    2. Импортируйте конвертированные IMS-файлы в программное обеспечение для трехмерного анализа. Создайте реконструкции с объемным рендерингом, используя стандартные настройки рендеринга, и экспортируйте репрезентативные изображения с помощью модуля Snapshot.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трехмерные реконструкции создаются с использованием стандартного конвейера рендеринга программного обеспечения без модификаций. Сегментация изображений, пороговая обработка, шумоподавление, вычитание фона или иная предварительная обработка не применялись. Реконструированные изображения используются для качественной визуализации коронарных сосудов и не предназначены для количественного анализа.

10. Статистический анализ

  1. Представьте все данные в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего (SEM). Проведите статистический анализ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 5.0).
  2. В качестве экспериментальной единицы определите отдельное животное. Проанализируйте n = 8 мышей в группе по всем функциональным показателям, биомаркерам и гистоморфометрическим конечным точкам.
  3. Выполните сбор и анализ данных с использованием кодированных идентификаторов образцов, обеспечивая слепой метод исследования в отношении распределения по группам. Раскрывайте принадлежность к группам только после завершения всех количественных анализов.
  4. Оцените нормальность распределения данных с помощью теста Шапиро–Уилка и гомогенность дисперсии с помощью теста Ливена в программе GraphPad Prism (версия 5.0) перед выбором соответствующего статистического критерия.
  5. Сравнение двух групп с помощью двухстороннего непарного t-критерия Стьюдента t—тест, если соблюдаются условия нормальности распределения и равенства дисперсий. В противном случае следует провести тест Манна — Уитни U тест.
  6. Рассмотрите P < p < 0,05 статистически значимо. Обозначьте статистическую значимость как P < 0,05, P < 0,01, и P < 0.001.

Результаты

В качестве анатомического ориентира для локализации передней нисходящей артерии (LAD) и определения места лигирования служил передний межреберный промежуток (AIS) (Рисунок 1A–C). После идентификации AIS выполнялась последовательная хирургическая процедура по индукции инфаркта миокарда (ИМ), включающая торакотомию, обнажение сердца, лигирование LAD, закрытие грудной клетки и послеоперационное восстановление, как показано на Рисунке 2A–L. Упрощенный протокол обеспечил быстрое и воспроизводимое вызывание ИМ у мышей. Данный протокол требует длительного периода практического обучения для достижения надежного выполнения; интубация трахеи и лигирование с ориентиром на AIS являются двумя этапами с наиболее сложным процессом освоения. На начальном этапе обучения периоперационная летальность в течение первых 7 послеоперационных дней может достигать 50% или более, а доля успешного создания модели может упасть до 30% или ниже. После освоения этих методов показатель хирургического успеха стабильно превышает 90%. В настоящем исследовании в течение первых 7 послеоперационных дней периоперационных смертей не наблюдалось. Все обучающие процедуры проводились в соответствии с тем же утвержденным институциональным протоколом по использованию животных.

После лигирования ПМЖВ наблюдались характерные электрокардиографические отклонения, включая выраженное углубление зубца Q, элевацию сегмента ST с выпуклой вверх морфологией, гиперпик зубца T (который обычно сменяется инверсией зубца T в субакутной фазе), увеличение амплитуды комплекса QRS с расширением его длительности и выраженную тахикардию (Рисунок 3A). При макроскопическом исследовании в группе MI по сравнению с группой NC наблюдались локальное обесцвечивание миокарда и дилатация желудочка дистальнее места лигирования (Рисунок 3B). Гистопатологическое исследование в группе MI выявило дезорганизацию волокон миокарда, расширение межклеточных пространств, инфильтрацию воспалительными клетками, отложение коллагена и нарушение структуры миокарда, что было подтверждено окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E), трихромом по Массону и Sirius Red (Рисунок 3C). Количественный анализ срезов, окрашенных трихромом по Массону, показал значительно более высокую CVF в группе MI, чем в группе NC (18.24% ± 1.67% против 0.05% ± 0.01%; P < 0.01; Рисунок 3D).

Анализ фиброза миокарда: график ЭКГ, изображения тканей сердца, гистологические срезы, диаграмма количественной оценки фиброза.
Рисунок 3Электрокардиографические, макроанатомические и гистопатологические изменения после лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии у мышей. (A) Репрезентативные электрокардиограммы (ЭКГ), записанные непосредственно после операции в группе нормального контроля (NC) и в группе инфаркта миокарда (MI). (B) Репрезентативные макрофотографии сердец из групп NC и MI. Масштабный отрезок = 1 мм. (C) Репрезентативные поперечные срезы сердца из групп NC и MI, окрашенные гематоксилином и эозином (H&E)&E; слева), трихром по Массону (в центре) и Sirius Red (справа). На срезах, окрашенных трихромом по Массону, коллаген выглядит синим, а миокард — красным; на срезах, окрашенных Sirius Red, коллаген выглядит красным на желтом фоне. Масштабные отрезки = 1,000 µm(D) Объемная доля коллагена (CVF) в группах NC и MI, рассчитанная как отношение площади коллагеноположительных зон к общей площади левого желудочка и выраженная в процентах. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM); n = 8 мышей в группе. Статистическая значимость относительно группы NC обозначена как **P < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Нарушение функции сердца было подтверждено с помощью эхокардиографии. Репрезентативные изображения в M-режиме продемонстрировали снижение сократительной способности левого желудочка в группе MI (Рисунок 4A). Количественный анализ показал значительное снижение фракции выброса (EF) и фракции укорочения (FS) левого желудочка в группе MI по сравнению с группой NC (Рисунок 4B,C). Метод ELISA выявил значительное повышение концентрации BNP, TNF-α, NF-κB p65 и IL-1β в сыворотке крови в группе MI (Рисунок 4D–G), что соответствует нарушению функции сердца и воспалительной реакции.

Снимки ультразвукового исследования сердца с гистограммами; уровни EF, FS, BNP, TNFα, p65, IL-1β в группах NC и MI.
Рисунок 4Функциональные изменения сердца и уровни сывороточных биомаркеров после лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии. (A) Репрезентативные эхокардиографические изображения в М-режиме для группы нормального контроля (NC) и группы с инфарктом миокарда (MI). (B) Фракция выброса левого желудочка (EF). (C) Фракционное сокращение левого желудочка (FS). (D–G) Концентрации в сыворотке крови (D) мозгового натрийуретического пептида (BNP), (E) фактора некроза опухоли-α (TNF-α), (F) ядерного фактора-κB p65 (NF-κB p65) и (G) интерлейкина-1β (IL-1β), измеренные методом иммуноферментного анализа (ELISA). EF и FS выражены в процентах; BNP, TNF-α и IL-1β — в пг/мл; NF-κB p65 — в нг/мл. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM); n = 8 мышей в группе. Статистическая значимость по сравнению с группой NC обозначена символом *.P < 0,01 и **P < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Трехмерная флуоресцентная визуализация прозрачных тканей сердца позволила проследить ход LAD под AIS и показала, что лигирование в анатомически определенном месте приводило к окклюзии коронарной артерии (Рисунок 5A–F). В совокупности эти данные свидетельствуют об успешном индуцировании фенотипа ИМ в этой начальной серии из восьми животных в группе, который характеризовался дисфункцией левого желудочка, фиброзом миокарда и системным воспалением. Данное исследование было направлено на создание и демонстрацию возможности реализации модели ИМ с использованием AIS, а не на проведение всесторонней валидации размера выборки, долгосрочной стабильности модели или анатомического соответствия между AIS и LAD. Соответственно, эти аспекты признаются ограничениями настоящего исследования и рассматриваются в разделе «Обсуждение». В частности, функциональная и биохимическая оценки были ограничены острой фазой после ИМ, а взаимосвязь между AIS и LAD была продемонстрирована качественно, но еще не была количественно определена на достаточно большой когорте.

Флуоресцентная визуализация анатомии сердца; окрашивание DAPI иван-синим (Evans Blue); микроскопия, анализ клеточной структуры.
Рисунок 5Трехмерная флуоресцентная визуализация просветленной коронарной сосудистой сети мыши. Прозрачные целые сердца маркировали красителем Evans Blue для визуализации коронарных сосудов и 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для визуализации ядер, после чего проводили флуоресцентную микроскопию светового листа и трехмерную реконструкцию. (A–C) Реконструкции целого сердца, демонстрирующие (A) канал DAPI, (B) канал Evans Blue и (C) совмещенные каналы. Масштабные отрезки = 1,000 µm(D–F) Увеличенные изображения области коронарных сосудов: (D) канал DAPI, (E) канал Evans Blue и (F) совмещенные каналы. Масштабные отрезки = 400 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Не каждая процедура приводит к созданию оптимальной модели, и распознавание субоптимальных результатов важно для поиска и устранения проблем. Слишком проксимальное наложение лигатуры или слишком глубокое введение иглы могут привести к образованию чрезмерно обширного инфаркта, сопровождающегося тяжелой сердечной недостаточностью, аритмией или разрывом желудочка, что ведет к ранней летальности. Напротив, слишком дистальное или поверхностное наложение лигатуры может вызвать лишь небольшой инфаркт или вообще не привести к инфаркту. Поэтому успешность индукции модели следует оценивать по нескольким критериям. Во время операции обесцвечивание миокарда дистальнее места наложения лигатуры служит немедленным индикатором окклюзии коронарной артерии, хотя этот признак не всегда легко заметен. Послеоперационная эхокардиография и гистопатологическое исследование обеспечивают дополнительное подтверждение успешного создания модели. Дополнительная фигура 1 демонстрирует репрезентативный пример неуспешной модели, при которой гистопатологическое исследование не выявило явной инфильтрации воспалительными клетками или фиброза.

Дополнительный рисунок 1. Репрезентативные гистологические данные неудачной модели инфаркта миокарда. Репрезентативные поперечные срезы сердца мыши, у которой индукция инфаркта миокарда не удалась, окрашенные (A) гематоксилином и эозином (H&E), (B) трихромом по Массону и (C) Sirius Red. По сравнению с успешной индукцией инфаркта миокарда, на этих срезах не наблюдается явной инфильтрации воспалительными клетками или фиброзного ремоделирования миокарда левого желудочка, что соответствует неудачной окклюзии коронарной артерии. Масштабные отрезки = 1,0 µm.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В последние годы клинические и экспериментальные модели инфаркта миокарда (ИМ) приобретают всё большее значение в сердечно-сосудистых исследованиях, однако многие вопросы, касающиеся патогенеза ИМ и стратегий его лечения, остаются нерешенными. В данной статье описывается усовершенствованный метод создания модели ИМ у мышей, при котором несколько критических этапов процедуры требуют особого внимания. Первым критическим этапом является интубация трахеи. В некоторых предыдущих протоколах обеспечение проходимости дыхательных путей осуществлялось путем трахеотомии, что требовало разреза кожи шеи и препарирования тканей для обнажения трахеи перед интубацией13; в других использовалась оротрахеальная интубация, но рекомендовался срединный разрез шеи для улучшения визуализации в ходе процедуры14. В отличие от обоих подходов, в настоящем протоколе используется ларингоскоп для освещения ротоглотки и проводится оротрахеальная интубация под прямым контролем визуализации голосовой щели без разреза на шее. Хотя такой подход предъявляет более высокие требования к техническому мастерству оператора, он позволяет избежать травмирования тканей шеи, снижает риск инфекции и послеоперационных болей, а также сокращает время операции. Наиболее распространенной ошибкой при интубации является непреднамеренное введение трубки в пищевод. Если при вентиляции грудная клетка не поднимается, а на эндотрахеальной трубке при выдохе не появляется конденсат, немедленно извлеките трубку и повторите интубацию. Подключайте аппарат ИВЛ только после подтверждения симметричного двустороннего движения грудной стенки.

Вторым и наиболее критическим этапом является идентификация передней нисходящей артерии (LAD) и точное наложение лигатуры. На этом этапе традиционные методы сталкиваются с рядом трудностей. Частота сердечных сокращений мыши в покое составляет примерно 500–600 ударов/мин, а LAD проходит рядом с несколькими сопутствующими коронарными венами, что делает интраоперационную идентификацию артерии в режиме реального времени крайне сложной задачей. Более того, даже при оптимальных условиях значительная часть LAD не может быть четко визуализирована под диссекционным микроскопом15. В этом контексте более ранние протоколы, в которых место лигирования определяется как точка на 1–2 mm ниже ушка левого предсердия, ограничены нестабильностью интраоперационной идентификации этого анатомического ориентира12,14, в то время как сложный характер ветвления левой коронарной артерии может дополнительно снизить воспроизводимость16. Для решения этих проблем в настоящем протоколе в качестве анатомического ориентира для размещения лигатуры используется межжелудочковая борозда (AIS). Под диссекционным микроскопом AIS выглядит как неглубокая борозда на вентральной поверхности сердца, непосредственно под которой проходит LAD. Таким образом, она служит относительно стабильным анатомическим ориентиром, который меньше зависит от опыта оператора. Размещение лигатуры в верхней трети AIS обеспечивает постоянную анатомическую цель для окклюзии коронарной артерии. Репрезентативные результаты демонстрируют, что данный подход позволил успешно вызвать ожидаемый фенотип острого инфаркта миокарда у исследуемых животных.

Ориентир в виде борозды AIS не всегда надежен. В случаях, когда доступ к грудной клетке ограничен или кровотечение из эпикарда закрывает поверхность сердца, затрудняя идентификацию AIS, аккуратно протрите операционное поле ватной палочкой, смоченной в физиологическом растворе, и повторно осмотрите борозду перед лигированием. Если AIS по-прежнему невозможно уверенно идентифицировать, найдите LAD напрямую, как описано в протоколе, и выполните лигирование под прямым визуальным контролем, не полагаясь на AIS. При необходимости подтвердите правильный межреберный промежуток, отсчитывая каудально от первого ребра, чтобы обеспечить адекватный доступ к ушку левого предсердия и передней стенке левого желудочка.

Среди послеоперационных осложнений наиболее распространенным является пневмоторакс, который обычно проявляется в виде респираторного дистресса после экстубации. Ключом к предотвращению пневмоторакса является полное удаление остаточного воздуха из грудной полости перед закрытием межреберного пространства. При подозрении на пневмоторакс следует кратковременно повторно провести анестезию и вентиляцию мыши, снять кожные швы и осмотреть место закрытия межреберного промежутка. Если выявлены один или несколько участков неполного закрытия, наложите дополнительные швы в месте утечки воздуха перед повторной процедурой экстубации. Другим возможным осложнением является интраоперационное кровотечение, которое чаще всего возникает, когда игла прокалывает мелкий эпикардиальный сосуд или сопровождающую его коронарную вену во время лигирования. Кровотечение обычно носит ограниченный характер и, как правило, может быть остановлено путем осторожного прижатия места повреждения ватным тампоном, смоченным в физиологическом растворе, в течение нескольких секунд. Перед закрытием грудной полости убедитесь в отсутствии активного кровотечения в операционном поле, чтобы свести к минимуму послеоперационные осложнения. Кроме того, во время или сразу после процедуры у мышей могут развиться аритмии, включая преждевременные желудочковые сокращения или транзиторную фибрилляцию желудочков. Эти аритмии часто купируются поддержанием температуры тела, стабилизацией глубины анестезии и временной приостановкой процедуры для спонтанного восстановления сердечного ритма. Наконец, осложнения, связанные с анестезией, чаще всего возникают из-за несвоевременного снижения концентрации изофлурана после успешной трахеальной интубации. Снизьте концентрацию изофлурана до поддерживающего уровня сразу после подключения эндотрахеальной трубки к аппарату ИВЛ и непрерывно контролируйте частоту дыхания и сердечных сокращений на протяжении всей процедуры.

В целом, данный метод требует высокого уровня микрохирургического мастерства и, как и другие модели перманентного лигирования передней нисходящей артерии (LAD), подвержен вариабельности, обусловленной анатомическими особенностями коронарных сосудов и опытом оператора. Тем не менее, при соответствующей подготовке и соблюдении единообразной хирургической техники исследователи могут создавать модель инфаркта миокарда с приемлемой стабильностью, повышая при этом воспроизводимость процедуры и выживаемость в послеоперационном периоде.

Следует признать несколько ограничений данного метода. Во-первых, функциональная и биохимическая оценка проводились в течение одной недели после индукции инфаркта миокарда (ИМ), и, следовательно, отражают только острую фазу ИМ без систематического анализа долгосрочных исходов, таких как ремоделирование желудочков через 4–8 недель после операции. Во-вторых, как и в других моделях ИМ с постоянным лигированием с использованием нерассасывающихся нитей, данный протокол может привести к хроническим спайкам перикарда. Это является неотъемлемой характеристикой модели лигирования, а не ограничением, специфичным для подхода с ориентированием по AIS. Однако степень выраженности этих спаек и их влияние на долгосрочную функцию сердца в настоящем исследовании не количественно не оценивались. В будущих работах можно изучить использование рассасывающихся нитей и оценить их влияние на формирование спаек и эффективность модели. В-третьих, хотя трехмерная визуализация коронарных артерий качественно продемонстрировала, что LAD проходит под AIS, анатомическое соответствие между этими структурами еще не было количественно определено на достаточно большой когорте. В-четвертых, в данное исследование были включены только самцы мышей C57BL/6J. Несмотря на то, что AIS должен представлять собой стабильный анатомический ориентир, его применимость у самок мышей, других линий мышей и других видов требует дальнейшего подтверждения. Наконец, потенциальные преимущества данного протокола с точки зрения согласованности места лигирования и воспроизводимости процедуры основаны на опыте одной лаборатории и не оценивались в прямом сравнении с традиционными методами лигирования LAD или разными операторами и учреждениями. Таким образом, потребуются дополнительные валидационные исследования для установления более широкой применимости данного метода.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

Данная работа была поддержана грантами Программы науки и технологий провинции Сычуань (№ 2026NSFSC1823 и 2022YFS0618), Проектом Администрации традиционной китайской медицины провинции Сычуань (Офис Администрации традиционной китайской медицины провинции Сычуань № 7 [2024]), Проектом Сычуаньского общества интегративной традиционной китайской и западной медицины (№ ZXY2025019), а также Проектом Юго-Западного медицинского университета (гранты № 2023ZYYQ04 и 2023ZYYQ17).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% стерильный физиологический растворSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.-Восстановление цефазолина
3% агарозаSigma-AldrichA0169Встраивание образца
4% параформальдегидSigma-Aldrich158127Фиксация тканей
Абсолютный этанолChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0170AОбезвоживание тканей; легковоспламеняющееся вещество
Кислый фуксинАладдинA104916-100гПриготовление раствора понсо–раствор кислого фуксина для окрашивания по Массону (трихромное окрашивание)
программное обеспечение AcqKnowledgeBIOPAC SystemsAcqKnowledge 4.0Регистрация и анализ электрокардиограммы
0,5% водный раствор аммиакаChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.2528AПодсинение при окрашивании гематоксилином и эозином
Анилиновый синий, кислоторастворимыйАладдинA111200-100 гПриготовление раствора анилинового синего для окрашивания по методу трихрома Массона
Стерильные медицинские перчаткиNanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.-Химическая и биологическая защита
БупренорфинQinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.H10940181Послеоперационная анальгезия
Цефазолин натрия для инъекцийCSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.-Периоперационная антибиотикопрофилактика
Ватные палочкиShijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.-Взятие эпикардиальных мазков и асептическая подготовка
Раствор для окрашивания DAPIThermo FisherD1306Ядерное мечение
Депиляционный кремVeet-Удаление волос на грудной клетке
Цифровой сканер предметных стекол3DHISTECHPannoramic MIDI IIСканирование всего препарата
Усилитель ЭКГBIOPAC SystemsECG100CУсиление сигнала электрокардиограммы
Система регистрации электрокардиограммыBIOPAC SystemsMP160Регистрация электрокардиограммы
Набор для ИФА, мозговой натрийуретический пептид мышиQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RXW202726MКоличественное определение BNP в сыворотке крови
Набор для ИФА, интерлейкин-1 мышиβQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX203063MСывороточный ИЛ-1β количественное определение
набор для ИФА, ядерный фактор мыши —κB p65Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX201879MСывороточный NF-κКоличественное определение p65
набор для ИФА, фактор некроза опухоли мышиныйαQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX202412MСывороточный ФНО-α количественное определение
Кассеты для заливкиJiangsu Shitai22022Заливка тканей в парафин
Эндотрахеальный катетер, 20 GShenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.B11103Оральная интубация; внешний диаметр приблизительно 0,9–1,0 мм; перед использованием обрезать примерно до 15 мм
Эозин Y, растворимый в спиртеHefei BASF Biotechnology Co., Ltd.Y0310-100GЦитоплазматическое докрашивание при окрашивании гематоксилином и эозином
Еванс БлюJarvisbioA312001Маркировка коронарных сосудов
Прецизионный пинцетRWD Life ScienceF12011-10Работа с тканями и вскрытие перикарда
Микрохирургический прецизионный пинцетRWD Life ScienceFC12002T-08Микрохирургические методы манипуляций с тканями
Прецизионные ножницыRWD Life ScienceS12000-09Офтальмологические ножницы для разреза кожи и диссекции
Ледяная уксусная кислотаChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.-Приготовление 1% раствора уксусной кислоты для дифференцировки при окрашивании по методу Массона (трихром)
Предметные стеклаJiangsu Shitai80312/80302Заключение срезов
Стеклянный шариковый стерилизаторRWD Life ScienceRS3002Стерилизация инструментов между животными
программное обеспечение GraphPad PrismПрограммное обеспечение GraphPadВерсия 5.0Статистический анализ
ГрелкаRWD Life Science69020Послеоперационная терморегуляция
Раствор гематоксилина для окрашиванияWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1004Окрашивание ядер при гематоксилин-эозиновом окрашивании
Детектирующее антитело, конъюгированное с пероксидазой хренаQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.Входит в состав наборов для ИФАДетекция методом ИФА
Соляная кислотаChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.1337AПриготовление кислотного спирта для дифференцировки гематоксилином
программное обеспечение Image-Pro PlusКибернетика медиаВерсия 6.0Количественное определение объемной доли коллагена
Программное обеспечение ImarisБит-плоскостьВерсия 7.2.3Трехмерная реконструкция и анализ
ИзофлуранRWD Life ScienceR510-22-10Ингаляционный анестетик
Система изофлуранового наркозаRWD Life ScienceTAIJI-IEПодача изофлурана
Ларингоскоп для мелких животныхShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.SR310-MRПрямая визуализация при интубации
Светолистовой флуоресцентный микроскопИнновационные световые технологииLiToneXLТрехмерная флуоресцентная визуализация
программное обеспечение LitScanИнновационные световые технологииВерсия 3.31Сшивание и конвертация изображений
Аппарат искусственной вентиляции легкихChengdu Taimeng Software Co., Ltd.HX-101EИскусственная вентиляция легких; 130 вдохов/мин; дыхательный объем 2 мл
Микрохирургический зажим типа «москит»RWD Life ScienceFC21001R-12Удержание иглы при лигировании и ушивании
Микролитровый шприцShanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.-Локальное введение DAPI
Микропланшетный ридерMolecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.SpectraMax iD5Измерение оптической плотности при 450 нм
СтереомикроскопMaishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.MSD204Интраоперационная визуализация
Микроскоп световой, вертикальныйLeicaDM500Гистологическая визуализация
Ножи для микротомаEprediaMX35 ULTRAИзготовление парафиновых срезов
Набор для модифицированного окрашивания Sirius RedWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1078Окрашивание на коллаген; включает растворы А, B и C
н-БутанолChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0886AГистологическая дегидратация и просветление; легковоспламеняющиеся вещества
Нейтральная смола для заключения образцовShanghai YiyangYSQN41-91Заключение образцов на предметном стекле
Нейлоновая шовная нить, 7-0, с иглой 3/8 окружностиNingbo Medical Needle Co., Ltd.-Лигирование передней нисходящей ветви левой коронарной артерии
Нейлоновая шовная нить, 5-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.-Закрытие грудной полости и кожи
Нейлоновая нить, 6-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.-Экспозиция и ретракция грудной стенки
Станция для заливки парафиномWuhan Junjie ElectronicsJB-L5Заливка тканей в парафин
ПарафинН/ДНет данныхИнфильтрация и заливка тканей
Фосфатно-солевой буферный растворSigma-AldrichP3813Промывка тканей и разведение реагентов
Фосфорно-молибденовая кислотаTianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.-Дифференцировка при окрашивании трихромом по Массону
Понсо С 2RАладдинP104989-25гПриготовление раствора Понсо–раствор кислого фуксина для окрашивания по Массону (трихромное окрашивание)
Дихромат калияЗавод химических реагентов Zhengzhou Paini7778-50-9Протрава для трихромного окрашивания по Массону
Повидон–йодОдинокая дамаGB26368-2010Дезинфекция кожи
Вода обратного осмосаОчищенный в лабораторных условияхНеприменимоПриготовление раствора
Ротационный микротомLeica Instruments (Shanghai)RM2016Изготовление парафиновых срезов
Адаптер держателя образцовИнновационные световые технологииПоставляется с LiToneXLМонтирование осветленных образцов для светолистной микроскопии
Кожный адгезивный пластырьQingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.-Фиксация конечностей и хвоста
Покровные стеклаJiangsu Shitai80340-1630Закрытие покровным стеклом
Сушилка для предметных стеколШаосин Луюэ101-3BВысушивание предметных стекол
Стоп-реагентQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.Входит в состав наборов для ИФАОстановка реакции ИФА
Растворы субстрата A и BQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.Входит в состав наборов для ИФАПроявление окраски при ИФА
Ванна для флотации тканейWuhan Junjie ElectronicsJK-5/6Метод флотации срезов
Гистологический процессорWuhan Junjie ElectronicsJT-12SАвтоматизированная проводка тканей
Набор для просветления тканей, реагент А–FJarvisbioJA11012Очистка тканей на основе растворителей
Платформа для тренировки трахеальной интубацииRWD Life ScienceRe20-MПозиционирование при оральной интубации
Программное обеспечение для ультразвукового анализаFujifilm VisualSonicsVevoLAB 3.2.6Анализ данных эхокардиографии
Ультразвуковой гельTianjin Jinya Electronics Co., Ltd.TM-100Эхокардиографическое сопряжение
Система ультразвуковой визуализацииFujifilm VisualSonicsVevo 3100Эхокардиография
V-образный ретрактор векаSuqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.SS5009GВтяжение межреберий и ребер
Промывочный буферQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.Входят в состав наборов для ИФАПромывка планшета для ИФА
Система очистки водыSichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.UPT-II-20TПроизводство воды методом обратного осмоса
КсилолChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0586AПрояснение и депарафинизация тканей; легковоспламеняющиеся и нейротоксичные вещества

Ссылки

  1. Thygesen K, et al. Fourth universal definition of myocardial infarction (2018). J Am Coll Cardiol. 2018;72(18):2231-2264.
  2. Lindahl B, Mills NL. A new clinical classification of acute myocardial infarction. Nat Med. 2023;29(9):2200-2205. doi:10.1038/s41591-023-02513-2.
  3. De Villiers C, Riley PR. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Dis Model Mech. 2020;13(11):dmm046565.
  4. Johns TNP, Olson BJ. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Ann Surg. 1954;140(5):675-682.
  5. Christia P, et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. J Histochem Cytochem. 2013;61(8):555-570.
  6. Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
  7. Kumar M, et al. Animal models of myocardial infarction: mainstay in clinical translation. Regul Toxicol Pharmacol. 2016;76:221-230.
  8. Gao E, et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 2010;107(12):1445-1453.
  9. van den Bos EJ, et al. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289(3):H1291-H1300.
  10. Pinelli A, et al. Isoproterenol-induced myocardial infarction in rabbits. Protection by propranolol or labetalol: a proposed non-invasive procedure. Eur J Pharm Sci. 2004;23(3):277-285.
  11. Maruyama K, et al. Surgical protocol for permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice to generate a model of myocardial infarction. STAR Protoc. 2021;2(3):100775.
  12. Johny E, Dutta P. Left coronary artery ligation: a surgical murine model of myocardial infarction. J Vis Exp. 2022;(186).
  13. Kolk MVV, et al. LAD-ligation: a murine model of myocardial infarction. J Vis Exp. 2009;(32):1438.
  14. Lugrin J, Parapanov R, Krueger T, Liaudet L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. J Vis Exp. 2019;(150).
  15. Chen J, et al. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017;313(2):H275-H282.
  16. Ahn D, et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;286(3):H1201-H1207.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.