Исследовательская статья

Экспрессия miR-488-3p в сыворотке крови в качестве неинвазивного диагностического биомаркера у пациентов с ревматоидным артритом

27 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72346

⸱

28 августа 2026 г.

 , 
1Department of Medical Laboratory, Hefei BOE Hospital

В этой статье

Краткое содержание

miR-488-3p может служить новым неинвазивным диагностическим маркером РА. miR-488-3p модулирует биологическую функцию синовиоцитов через ROCK1. Была выявлена значительная отрицательная корреляция этого маркера с тяжестью заболевания у пациентов с РА.

Аннотация

Диагностика ревматоидного артрита (РА) остается сложной задачей из-за ограниченности существующих биомаркеров. Целью исследования было изучение потенциала miR-488-3p в сыворотке крови в качестве биомаркера РА и выявление возможного механизма его действия. В исследовании приняли участие 135 пациентов с РА, 130 пациентов с остеоартритом (ОА) и 125 здоровых добровольцев. Уровни экспрессии miR-488-3p анализировали методом RT-qPCR. Механизм действия изучали с помощью функциональных тестов (CCK-8, проточная цитометрия, ELISA) и экспериментов по валидации мишеней (люциферазный репортерный ген, RIP). Уровни экспрессии miR-488-3p в сыворотке были значимо ниже у пациентов с РА, чем у пациентов с остеоартритом (ОА) и в группе здорового контроля (p < 0.001). Анализ ROC-кривых показал, что miR-488-3p обладает высокой диагностической точностью при дифференциации РА от здорового контроля и пациентов с ОА. miR-488-3p отрицательно коррелировал со скоростью оседания эритроцитов (СОЭ), С-реактивным белком (СРБ), ревматоидным фактором (РФ) и индексами DAS28. Функциональная валидация показала, что гиперэкспрессия miR-488-3p подавляла пролиферацию и воспалительный ответ синовиоцитов, одновременно индуцируя апоптоз. Исследования механизмов показали, что miR-488-3p может напрямую воздействовать на Rho-ассоциированную протеинкиназу 1 (ROCK1), которая опосредует его защитные эффекты. miR-488-3p в сыворотке крови является перспективным новым неинвазивным диагностическим маркером РА и защищает синовиоциты от повреждения.

Введение

Ревматоидный артрит (РА) — распространенное аутоиммунное заболевание, характеризующееся синовиальным воспалением, эрозией и разрушением суставов1,2. Глобальная распространенность РА составляет примерно 0,5%–1%3, что серьезно влияет на качество жизни пациентов и их трудоспособность. Заболевание имеет постепенное начало, а ранние симптомы часто бывают нетипичными, что приводит к ошибочной диагностике или их игнорированию4. По мере прогрессирования болезни может развиться деформация суставов, утрата функций и даже повыситься риск таких осложнений, как сердечно-сосудистые заболевания5, что ложится тяжелым бременем на пациентов, их семьи и системы здравоохранения.

В настоящее время для диагностики ревматоидного артрита (РА) требуется сочетание клинических симптомов, признаков, лабораторных тестов и методов визуализации6. В качестве общепринятых лабораторных показателей используют скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и С-реактивный белок (СРБ), которые являются неспецифическими маркерами системного воспаления, а также ревматоидный фактор (РФ) и антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (анти-CCP), являющиеся важными серологическими биомаркерами РА7,8. Однако эти традиционные биомаркеры имеют ограничения: РФ может быть положительным у некоторых здоровых людей и пациентов с другими аутоиммунными заболеваниями (доля ложноположительных результатов составляет около 5%); анти-CCP, несмотря на высокую специфичность (>95%), обладают ограниченной чувствительностью на ранних стадиях заболевания (около 60–70%)4,9, а некоторые пациенты с РА остаются серонегативными10. Следовательно, важно найти более чувствительные и специфичные биомаркеры для ранней диагностики, мониторинга течения заболевания и оценки прогноза при РА11.

МикроРНК (мРНК) представляют собой группу эндогенных некодирующих регуляторных молекул РНК длиной примерно 22–25 оснований12,13. Было установлено, что мРНК выступают в качестве ключевых регуляторов в развитии различных заболеваний, и их аберрантная экспрессия тесно связана с патогенезом болезни13,14,15, что делает мРНК перспективными биомаркерами для диагностики заболеваний и терапевтического мониторинга. В последние несколько лет роль мРНК при ревматоидном артрите (РА) привлекает все больше внимания16. Исследования показали, что несколько мРНК характеризуются нарушением экспрессии (например, miR-146a, miR-155 и др.) в сыворотке крови, синовиальных тканях и мононуклеарных клетках периферической крови (PBMCs) пациентов с РА17,18,19. Эти мРНК вносят вклад в патогенез РА, регулируя выработку воспалительных цитокинов, стимулируя пролиферацию и инвазию синовиальных клеток, а также влияя на дифференцировку остеокластов20. Среди них miR-488 локализована в области 1q25.2 хромосомы человека21, и предыдущие исследования подтвердили ее нейропротекторные эффекты: она играет регуляторную роль в прогрессировании глиом22 и нейробластом23; примечательно, что miR-488-3p стимулирует апоптоз хондроцитов при остеоартрите (ОА)24. Хотя ОА и РА являются разными заболеваниями суставов, они имеют общие механизмы в патологических процессах синовиального воспаления и разрушения хряща25. Мы предположили, что miR-488-3p может играть роль при РА, регулируя аналогичные целевые пути. Однако специфическая роль и потенциальные механизмы действия miR-488-3p при РА до сих пор не были выяснены.

В данном исследовании изучались изменения уровней экспрессии miR-488-3p в сыворотке крови пациентов с ревматоидным артритом (РА), а также их связь с активностью заболевания и клиническими показателями с целью оценки потенциальной ценности данного маркера как неинвазивного диагностического инструмента для выявления РА. Эта работа предлагает новый взгляд на ранний скрининг и прогнозирование прогрессирования РА, что позволит улучшить прогноз для пациентов с данным заболеванием.

Протокол

Исследование было одобрено Этическим комитетом больницы Hefei BOE (номер одобрения 2021–1), и до включения в исследование от всех участников было получено письменное информированное согласие.

Пациенты и образцы

В данное исследование было включено 135 пациентов с РА (диагноз поставлен согласно классификационным критериям ACR/EULAR 2010 года) из отделения ревматологии и иммунологии больницы Hefei BOE, 130 пациентов с ОА из отделения ортопедии (диагноз поставлен согласно диагностическим критериям ОА Китайской медицинской ассоциации 2018 года) и 125 здоровых добровольцев из центра медицинских осмотров той же больницы, сопоставимых по возрасту и полу. Возраст участников составлял 30–80 лет. Отсутствие у здоровых добровольцев аутоиммунных заболеваний, патологий суставов и острых инфекций было подтверждено путем комплексного анализа анамнеза, физикального осмотра и лабораторных исследований. Участники исключались из исследования при наличии сопутствующих аутоиммунных заболеваний, инфекций или травм в течение последних 3 месяцев, злокачественных новообразований, а также в период беременности или лактации.

Отбор и подготовка проб

У всех участников исследования была отобрана венозная кровь натощак. После коагуляции при комнатной температуре в течение 30 мин образцы сыворотки выделяли путем центрифугирования при 1500 × g в течение 15 мин. Сыворотку хранили при -80°C до проведения дальнейшего анализа.

Определение клинических и серологических маркеров

Для комплексной оценки статуса заболевания и воспалительной активности с помощью стандартизированных клинических лабораторных методов измеряли клинические и серологические биомаркеры. СОЭ определяли методом Вестергрена для оценки неспецифического системного воспаления. СРБ количественно определяли с помощью иммунотурбидиметрического анализа (нормативное справочное значение: <10 mg/L) для оценки острофазового воспалительного ответа. РФ определяли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA), при этом нормативное справочное значение составляло ≤20 IU/mL. Антитела к CCP измеряли с помощью ELISA второго поколения для получения серологического подтверждения диагноза РА.

Клеточные линии и культивирование

Клетки фибробластоподобных синовиоцитов человека при ревматоидном артрите (HFLS-RA) выращивали в модифицированной среде Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина. Клетки культивировали в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂; для всех экспериментов использовали клетки от третьего до шестого пассажа.

Экстракция РНК и количественная ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией

Общую РНК экстрагировали из образцов сыворотки с использованием реагента для экстракции РНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора для синтеза первой цепи миРНК для miRNA и набора для обратной транскрипции для целевых генов матричной РНК (mRNA) в соответствии с инструкциями производителя. Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-qPCR) выполняли с использованием системы ПЦР в реальном времени и мастер-микса для ПЦР на основе SYBR Green. Программа термоциклирования была установлена следующим образом: предварительная денатурация при 95 °C в течение 30 s, затем 40 циклов амплификации (денатурация при 95 °C в течение 5 s и отжиг/элонгация при 60 °C в течение 30 s). Каждый образец анализировали в трех повторностях. Малая ядерная РНК U6 (U6 snRNA) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) служили эндогенными референсными генами для нормализации miRNA и mRNA соответственно. Последовательности праймеров приведены в Дополнительной таблице 1. Относительные уровни экспрессии miR-488-3p и ее целевых генов рассчитывали с помощью метода 2−ΔΔCt. Также анализировали изменения уровней mRNA целевых генов после гиперэкспрессии или ингибирования miR-488-3p для подтверждения их регуляторных связей.

Трансфекция клеток

Клетки HFLS-RA высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 5 × 105 клеток/лунку. Трансфекцию клеток проводили с использованием реагента на основе липосом согласно инструкциям производителя. Группы трансфекции включали группы с одиночной трансфекцией и группы с ко-трансфекцией. Группы с одиночной трансфекцией были следующими: 1) контрольная — нетрансфицированные клетки; 2) негативный контроль мимика (NC) — клетки, трансфицированные негативным контролем мимика miR-488-3p; 3) мимик miR-488-3p — клетки, трансфицированные мимиком miR-488-3p; 4) NC ингибитора — клетки, трансфицированные негативным контролем ингибитора miR-488-3p; 5) ингибитор miR-488-3p — клетки, трансфицированные ингибитором miR-488-3p. Группы с ко-трансфекцией включали: 1) мимик miR-488-3p + оверэкспрессия-NC (oe-NC) — клетки, ко-трансфицированные мимиком miR-488-3p и негативным контролем векторов оверэкспрессии ROCK1; 2) мимик miR-488-3p + oe-ROCK1 — клетки, ко-трансфицированные мимиком miR-488-3p и векторами оверэкспрессии ROCK1. Все последовательности трансфекции обобщены в Дополнительной таблице 1. Вектор оверэкспрессии ROCK1 был создан путем клонирования области кодирующей последовательности (CDS) в плазмиду pcDNA 3.1. Трансфицированные клетки использовали для последующих экспериментов через 48 ч после трансфекции.

Анализ функций клеток

Анализ пролиферации клеток (Cell Counting Kit-8 [CCK-8]): Трансфицированные клетки HFLS-RA высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 5 × 103 клеток/лунку, по три повторности на группу. Через 0, 24, 48 и 72 ч после трансфекции в каждую лунку добавляли 10 µL раствора CCK-8 с последующей инкубацией при 37 °C в течение 2 ч. Оптическую плотность измеряли при 450 nm (рабочая длина волны) и 630 nm (контрольная длина волны) с помощью микропланшетного ридера. Относительную скорость пролиферации рассчитывали, принимая значение при 0 ч за базовую линию.

Определение апоптоза (проточная цитометрия): Апоптоз оценивали с помощью анализа на апоптоз с использованием Annexin V-флуоресцеин-изотиоцианата (FITC)/пропидий иодида (PI). Клетки трансфицировали соответствующими плазмидами, после чего собирали путем трипсинизации. Степень апоптоза определяли методом проточной цитометрии.

Анализ воспалительных факторов (иммуноферментный анализ [ELISA]): клетки HFLS-RA высевали в 24-луночные планшеты и трансфецировали соответствующим миметиком miR-488-3p, ингибитором miR-488-3p или соответствующими отрицательными контролями на 48 ч. Концентрации интерлейкина-6 (IL-6), фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-1β (IL-1β) в супернатантах клеточных культур определяли с помощью наборов для ELISA.

Валидация мишени

Прогнозирование мишени: С помощью базы данных TargetScan было предсказано, что ROCK1 является нижележащей мишенью miR-488-3p26Предполагаемые сайты связывания между miR-488-3p и ROCK1 3′нетранслируемая область (3'UTR)′НТР (нетранслируемая область) также были идентифицированы.

Двойной люциферазный репортерный анализ: Дикий тип или мутантная форма 3′UTR ROCK1 были клонированы в плазмиду pGL3. Предполагаемые сайты связывания и сайты мутаций показаны на Рисунке 4. Клетки HEK- 293T подвергали ко-трансфекции мимиком или ингибитором miR-488-3p вместе с сконструированными векторами27. Люциферазную активность измеряли через 48 ч после трансфекции мимиком или ингибитором miR-488-3p.

РНК-иммунопреципитация (RIP): Клетки HFLS-RA инкубировали с антителом к Argonaute 2 (Ago2) (RRID: AB_2882071, разведение 1:200) или контрольным антителом иммуноглобулином G (IgG) (RRID: AB_2819160, разведение 1:5000), после чего проводили экстракцию РНК и количественную ПЦР (кПЦР) для определения обогащения мРНК ROCK1 согласно описанному выше методу.

Статистический анализ

Статистический анализ исследования проводили с помощью программ SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) и GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). Данные измерений представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Все эксперименты были выполнены в трех биологических повторностях, каждая из которых анализировалась в трех технических повторах. Исходные данные приведены в дополнительных материалах. Перед применением параметрических статистических критериев данные оценивали с помощью графика нормальной вероятности (P-P plot). Для сравнения непрерывных исходных переменных (например, возраста, индекса массы тела [BMI] и др.) использовали t-критерий для независимых выборок, а для категориальных переменных (например, пола и др.) — критерий хи-квадрат. Уровни экспрессии генов сравнивали с помощью t-критерия для независимых выборок. Изменения пролиферации клеток в разные временные точки анализировали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с повторными измерениями, тогда как для сравнения показателей апоптоза, определенных методом проточной цитометрии, использовали однофакторный ANOVA. Корреляционный анализ проводили с помощью коэффициента Спирмена (для переменных, не имеющих нормального распределения) и коэффициента Пирсона (для переменных с нормальным распределением). Диагностическую эффективность оценивали с помощью анализа кривой рабочей характеристики приемника (ROC-кривой). Оптимальное пороговое значение, чувствительность и специфичность определяли с помощью максимального индекса Юдена. Все статистические тесты были двухсторонними; значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Основные характеристики участников исследования

В данное исследование для систематического анализа было включено 125 здоровых добровольцев (контрольная группа), 130 пациентов с ОА и 135 пациентов с РА (Таблица 1). Между тремя группами не было выявлено значимых различий по таким базовым характеристикам, как возраст (p = 0.191), соотношение полов (p = 0.203) и ИМТ (p = 0.562), что обеспечило сопоставимость исследуемой популяции. Что касается характеристик заболевания, уровни СОЭ (82.63 ± 40.32 против 18.39 ± 6.38 mm/h, p < 0.001) и СРБ (56.33 ± 38.07 против 10.54 ± 4.98 mg/L, p < 0.001) в группе РА были значимо выше, чем в группе ОА, что отражает степень системного воспаления. В то же время РФ, серологический маркер, связанный с РА, был положительным в 70.37% (95/135) случаев, при этом концентрация в сыворотке была значимо выше (144.13 ± 81.05 против 5.10 ± 1.37 IU/mL, p < 0.001); частота положительного результата на анти-ЦЦП у пациентов с РА составила 56.30% (76/135), а показатель DAS28 составил 4.12 ± 1.36.

Характеристики экспрессии и диагностическая значимость miR-488-3p у пациентов с РА

Уровни экспрессии miR-488-3p в сыворотке крови были значительно снижены у пациентов с РА по сравнению с пациентами с ОА и здоровым контролем (p < 0.0001, Рисунок 1A). Анализ ROC-кривых показал, что miR-488-3p обладает высокой диагностической точностью при дифференциации РА от ОА и здорового контроля: при различении РА и здорового контроля значение AUC составило 0.931 (95% CI: 0.896–0.967), чувствительность — 96.15% (95% CI: 91.31%–98.35%), а специфичность — 80.95% (95% CI: 73.22%–86.85%, p < 0.001, Рисунок 1B); при дифференциации РА от ОА значение AUC составило 0.800 (95% CI: 0.747–0.854), при чувствительности 85.93% (95% CI: 79.06%–90.80%) и специфичности 66.15% (95% CI: 57.66%–73.72%, p < 0.001, Рисунок 1C). Многофакторный логистический регрессионный анализ определил miR-488-3p как независимый фактор, связанный с риском развития РА (OR = 0.166, 95% CI: 0.097–0.284; Таблица 2).

Корреляционный анализ miR-488-3p с клиническими показателями РА

Уровни экспрессии miR-488-3p в сыворотке крови достоверно отрицательно коррелировали с ключевыми клиническими показателями РА, включая СОЭ, СРБ, РФ и DAS28 (все p < 0.001; Таблица 3). В частности, miR-488-3p отрицательно коррелировала с СОЭ (r = −0.718), СРБ (r = −0.726), РФ (r = −0.805) и показателем DAS28 (r = −0.836) (Таблица 3).

Оверэкспрессия miR-488-3p подавляет пролиферацию клеток и воспалительные реакции, а также индуцирует апоптоз в клетках HFLS-RA

Для изучения влияния miR-488-3p на функцию HFLS-RA мы модулировали его экспрессию путем трансфекции мимиками и ингибиторами. Анализ RT-qPCR подтвердил, что уровень экспрессии miR-488-3p был значительно выше в группе с мимиком miR-488-3p по сравнению с контрольной группой (p = 0.0001), тогда как в группе с ингибитором miR-488-3p уровень экспрессии был значительно ниже (p = 0.0003, Рисунок 2A). Тест CCK-8 показал, что гиперэкспрессия miR-488-3p подавляла пролиферацию клеток, которая была значительно ниже, чем в контрольной группе, через 24 ч, 48 ч и 72 ч (p = 0.0208, p < 0.0001, p = 0.0036), а ингибирование экспрессии miR-488-3p значительно увеличивало пролиферацию клеток (Рисунок 2B). Проточная цитометрия показала, что гиперэкспрессия miR-488-3p значительно стимулировала апоптоз (p = 0.0033, Рисунок 2C).

Затем мы провели анализ ИФА, чтобы исследовать влияние повышения экспрессии miR-488-3p на уровни воспалительных цитокинов. Результаты показали, что при гиперэкспрессии miR-488-3p уровни воспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α и IL-1β) значительно снижались (p < 0,0001, Рисунок 3A-C), в то время как ингибирование экспрессии miR-488-3p приводило к противоположному эффекту. Эти значимые регуляторные эффекты были подтверждены во всех трех независимых биологических повторностях, а в отрицательных контролях значимых изменений не наблюдалось (p > 0,05).

MiR-488-3p регулирует экспрессию молекул ROCK1

Для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе роли miR-488-3p в прогрессировании ревматоидного артрита, мы изучили нижележащие мишени miR-488-3p. Биоинформатический анализ показал, что miR-488-3p предположительно связывается с областью 3'UTR ROCK1 (Рисунок 4A). Двойной люциферазный репортерный анализ подтвердил, что активность люциферазы значительно снижалась при котрансфекции 3'UTR ROCK1 дикого типа с мимиками miR-488-3p (p < 0,0001), и активность люциферазы значительно повышалась при ингибировании экспрессии miR-488-3p (p < 0,0001); в то время как после мутации сайта связывания значимых изменений в этом регуляторном эффекте не наблюдалось (Рисунок 4B). Эксперименты по RIP дополнительно подтвердили эту регуляторную связь, показав, что уровень экспрессии мРНК ROCK1 был значительно повышен в комплексах, обогащенных антителами к Ago2, по сравнению с контролем IgG (p < 0,0001, Рисунок 4C).

Кроме того, в клинических образцах ROCK1 продемонстрировал профиль экспрессии, противоположный профилю miR-488-3p: наблюдалось значимое повышение уровня ROCK1 по сравнению как с пациентами с ОА, так и со здоровым контролем (Рисунок 4D). В клетках HFLS-RA метод RT-qPCR показал, что сверхэкспрессия miR-488-3p приводила к значимому снижению экспрессии ROCK1 (p = 0.0093), тогда как ингибирование miR-488-3p значительно повышало экспрессию ROCK1 (p = 0.0003, Рисунок 4E).

ROCK1 опосредует регуляторное воздействие miR-488-3p на клетки HFLS-RA

В клетках HFLS-RA подавление экспрессии ROCK1, вызванное гиперэкспрессией miR-488-3p, было нивелировано при трансфекции векторами для гиперэкспрессии ROCK1 (Рисунок 5A). Аналогичным образом, ингибирующий эффект гиперэкспрессии miR-488-3p на пролиферацию клеток был ослаблен при гиперэкспрессии ROCK1 (Рисунок 5B). Кроме того, гиперэкспрессия ROCK1 также обратила усиление апоптоза, индуцированного miR-488-3p (Рисунок 5C), и восстановила уровни воспалительных цитокинов, которые были подавлены гиперэкспрессией miR-488-3p (Рисунок 5D).

Скрипичные диаграммы и ROC-кривые, демонстрирующие анализ экспрессии, чувствительность и специфичность в исследовании РА.
Рисунок 1. Уровни экспрессии и диагностическая эффективность miR-488-3p у пациентов с ревматоидным артритом (РА), остеоартритом (ОА) и в группе здорового контроля. (A) Сравнение относительных уровней экспрессии miR-488-3p у пациентов с РА, пациентов с ОА и здоровых добровольцев. (B) Анализ рабочих характеристик приемника (ROC-кривая) miR-488-3p для дифференциации РА от здорового контроля. (C) Анализ ROC-кривой miR-488-3p для дифференциации РА от пациентов с ОА. AUC, площадь под кривой; CI, доверительный интервал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ экспрессии генов; столбчатые диаграммы и линейный график; жизнеспособность клеток, апоптоз, эффекты miR-488-3p.
Рисунок 2. Функциональные эффекты miR-488-3p в клетках HFLS-RA. (A) Относительная экспрессия miR-488-3p в трансфицированных клетках HFLS-RA, определенная методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR). (B) Влияние гиперэкспрессии и ингибирования miR-488-3p на пролиферацию клеток. (C) Влияние гиперэкспрессии и ингибирования miR-488-3p на апоптоз. Данные представлены как среднее значение ± SD. Все измерения проводились с использованием трех биологических повторностей, каждая из которых включала три технических повторности. p < 0.05 указывает на статистически значимое различие между указанными группами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатые диаграммы концентрации цитокинов; панели A-C; IL-6, TNF-α, IL-1β; статистическое сравнение.
Рисунок 3. Влияние miR-488-3p на секрецию воспалительных цитокинов. (A) Интерлейкин-6 (IL-6). (B) Фактор некроза опухоли-α (TNF-α). (C) Интерлейкин-1β (IL-1β). Концентрации цитокинов измеряли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Данные представлены как среднее значение ± SD. Все измерения проводили с использованием трех биологических повторов, каждый из которых включал три технических повтора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Схема люциферазного анализа: взаимодействие miRNA с ROCK1, столбчатые диаграммы и результаты анализа данных.
Рисунок 4. Валидация молекулярного механизма, лежащего в основе таргетной регуляции ROCK1 посредством miR-488-3p. (A) Предсказанный сайт связывания miR-488-3p в 3′-нетранслируемой области (3′UTR) ROCK1. (B) Двойной люциферазный репортерный анализ, демонстрирующий взаимодействие между miR-488-3p и 3′UTR ROCK1 дикого типа или мутантного типа. (C) Анализ иммунопреципитации РНК (RIP), показывающий обогащение матричной РНК (мРНК) ROCK1 в комплексах, обогащенных антителами к Argonaute 2 (Ago2). (D) Относительные уровни экспрессии ROCK1 у пациентов с РА, пациентов с ОА и в группе здорового контроля. (E) Относительная экспрессия ROCK1 в трансфицированных клетках HFLS-RA, определенная с помощью количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (RT-qPCR). Данные представлены как среднее ± SD. Все измерения проводились с использованием трех биологических повторностей, каждая из которых включала три технических повторности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграммы экспрессии генов, сравнивающие уровни ROCK1 и воспалительные маркеры с использованием метода миметика miR-488-3p.
Рисунок 5. Роль ROCK1 в регуляции клеток HFLS-RA под воздействием miR-488-3p. (A) Регуляция экспрессии ROCK1 в клетках HFLS-RA после трансфекции клеток. (B) Влияние гиперэкспрессии ROCK1 на пролиферацию клеток при гиперэкспрессии miR-488-3p. (C) Влияние гиперэкспрессии ROCK1 на апоптоз при гиперэкспрессии miR-488-3p. (D) Влияние гиперэкспрессии ROCK1 на выработку воспалительных цитокинов при гиперэкспрессии miR-488-3p. Данные представлены как среднее значение ± SD. Все измерения проводились с использованием трех биологических повторностей, в каждой из которых было три технических повторности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПеременнаяКонтроль (n = 125)ОА (n = 130)Ревматоидный артрит (n = 135)pзначение p
Возраст (лет)55.10 ± 9.3057.21 ± 10.2755.22 ± 11.610.191
Пол (мужской/женский)74/5163/6769/660.203
ИМТ (кг/м²)2)22.79 ± 1.7322.98 ± 1.9823.04 ± 2.050.562
Длительность заболевания (лет)-7.96 ± 4.008.03 ± 3.830.882
Положительный результат на анти-ЦЦП (n/%)--76 (56.30)-
СОЭ (мм/ч)18.39 ± 6.3882.63 ± 40.32<0.001
СРБ (мг/л)10.54 ± 4.9856.33 ± 38.07<0.001
РФ-положительный--95 (70.37)
РФ (МЕ/мл)-5.10 ± 1.37144.13 ± 81.05<0.001
DAS28--4.12 ± 1.36-

Таблица 1: Исходные характеристики участников исследования. Три группы исследования были сопоставимы по демографическим характеристикам. У пациентов с РА наблюдались повышенные уровни маркеров воспаления и РФ.

ПеременнаяИЛИ95% ДИpзначение p
Возраст (лет)1.4110.822–2.4220.211
Пол (мужской/женский)1.2090.707–2.0670.489
ИМТ (кг/м²)2)1.3360.778–2.2950.293
Длительность заболевания (лет)1.130.663–1.9290.653
MiR-483-3p0.1660.097–0.284<0.001

Таблица 2: Независимые факторы, выявленные с помощью многофакторного логистического регрессионного анализа, которые связаны с прогрессированием остеоартрита в ревматоидный артрит. Было установлено, что MiR-488-3p связан с риском развития РА у пациентов с ОА.

Материалы и оборудованиеMiR-488-3p (Ревматоидный артрит)pзначение p
Корреляция (r)
СОЭ (мм/ч)-0.718<0.001
СРБ (мг/л)-0.726<0.001
РФ (МЕ/мл)-0.805<0.001
DAS28 -0.836<0.001

Таблица 3: Корреляции между уровнем miR-488-3p и клинико-патологическими характеристиками пациентов с РА. Уровень miR-488-3p значимо отрицательно коррелировал с СОЭ, СРБ, РФ и индексом DAS28 у пациентов с РА.

Дополнительная таблица 1. Информация о последовательностях для трансфекции клеток и ПЦР-анализа. Приведен сводный список последовательностей праймеров и реагентов для трансфекции, использованных в исследовании.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Как подчеркнули Smolen et al1 в последних рекомендациях по диагностике и лечению РА, разработка новых биомаркеров имеет значительную клиническую ценность. В данном исследовании мы подтвердили, что экспрессия сывороточного miR-488-3p была значительно снижена у пациентов с РА и продемонстрировала многообещающие диагностические характеристики с относительно удовлетворительной чувствительностью и специфичностью. Ранняя диагностика РА всегда представляла собой клиническую проблему, а существующие биомаркеры недостаточно чувствительны для диагностики РА; в то же время значительный диагностический потенциал miR-488-3p может восполнить этот пробел, особенно при выявлении пациентов с серонегативным РА. По сравнению со здоровыми людьми у пациентов с РА наблюдалось более выраженное системное воспаление. В то время как у пациентов с ОА преобладает локальное дегенеративное заболевание суставов, часто наблюдается системное воспаление низкой степени тяжести. Следовательно, дифференцирующая эффективность miR-488-3p гораздо выше при сравнении со здоровыми людьми, чем при сравнении с пациентами с ОА. Диагностическая эффективность miR-488-3p не сравнивалась напрямую с эффективностью установленных клинических биомаркеров. Пациенты, включенные в данное исследование, были диагностированы в соответствии с действующим клиническим «золотым стандартом» для РА, который включает установленные биомаркеры, такие как антитела к CCP, РФ, СОЭ и СРБ. Между пациентами с ОА и РА наблюдались значительные различия по этим маркерам (Таблица 1). Таким образом, данная когорта была непригодна для прямого сравнения диагностической эффективности miR-488-3p с этими установленными биомаркерами. Такие сравнения требуют независимой валидационной когорты.

Кроме того, было обнаружено, что уровни экспрессии miR-488-3p значительно отрицательно коррелируют с различными клиническими показателями РА, включая маркеры системного воспаления (СОЭ, СРБ)28 и аутоантитела (РФ)6. Особую клиническую значимость представляет сильная отрицательная корреляция miR-488-3p с индексом активности заболевания (DAS28). DAS28 представляет собой комплексный индекс, отражающий активность заболевания на основе припухлости суставов, болезненности, воспаления и клинического статуса пациентов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что miR-488-3p может служить потенциальным биомаркером активности РА. Это также подтверждает регуляторную роль данного микроРНК в патогенезе РА и указывает на возможность влияния на прогрессирование заболевания путем ингибирования воспалительных сигнальных путей или аутоиммунных ответов29.

В ходе функциональных экспериментов мы обнаружили, что miR-488-3p подавляет пролиферацию и стимулирует апоптоз клеток HFLS-RA, полученных от пациентов с ревматоидным артритом (РА), а также значительно снижает выработку воспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α и IL-1β). Клетки HFLS-RA играют ключевую роль в патологическом процессе РА30, и их аберрантная пролиферация и инвазивный рост могут привести к гиперплазии синовиальной оболочки и разрушению суставов, в то время как избыточная выработка воспалительных факторов дополнительно усиливает локальные и системные воспалительные реакции31. Таким образом, регуляция функций HFLS-RA с помощью miR-488-3p может напрямую ингибировать синовиальную инвазию и эрозию кости при РА, что создает теоретическую основу для разработки новых стратегий таргетной терапии. Предыдущие исследования показали, что другие микроРНК, такие как miR-155, могут влиять на прогрессирование РА путем регуляции функций синовиоцитов19, что служит дополнительным подтверждением наших выводов.

Механистические исследования показали, что miR-488-3p может напрямую воздействовать на ROCK1 и подавлять его экспрессию путем связывания с его 3'UTR. ROCK1 является ключевой эффекторной молекулой сигнального пути Rho/ROCK, который участвует в реорганизации цитоскелета, воспалительном ответе и фиброзе32. Предыдущие исследования показали, что ROCK1 высоко экспрессируется в синовиоцитах при РА и способствует их миграции и инвазии33. Как и ожидалось, гиперэкспрессия ROCK1 значительно нивелировала эффекты miR-488-3p в клетках HFLS-RA, что указывает на его участие в регуляторной роли miR-488-3p в прогрессировании РА.

Тем не менее, в рамках будущих исследований предстоит выполнить еще большой объем работы. Экспрессия miR-488-3p в клинических образцах оценивалась с помощью RT-qPCR с использованием U6 в качестве внутреннего контроля. В предыдущих работах сообщалось о противоречивых данных относительно стабильности U6, особенно в циркулирующих образцах, таких как сыворотка. Хотя в настоящем исследовании были проведены предварительные эксперименты для подтверждения стабильности U6, потенциальная вариабельность этого контроля по-прежнему остается ограничением, что повышает риск ошибочной диагностики. Целесообразно провести дальнейшую валидацию с использованием более стабильных генов внутреннего контроля. С другой стороны, клиническая оценка miR-488-3p основывалась на когорте одного центра без внешней валидации. Размер выборки был относительно небольшим и ограничен масштабами одного госпиталя. Кроме того, отсутствовало лонгитюдное наблюдение для оценки прогностической значимости miR-488-3p. Эти ограничения должны быть устранены в будущих исследованиях. Кроме того, некоторые работы показывают, что доставка miRNA in vivo остается серьезной проблемой для клинического внедрения34. В последующих исследованиях можно будет подтвердить терапевтический потенциал miR-488-3p in vivo путем создания мышей с условным нокаутом или использования систем адресной доставки, таких как наноносители35.

В заключение, данное исследование выявило потенциальную ценность miR-488-3p для диагностики и возможного терапевтического воздействия при ревматоидном артрите (РА). miR-488-3p продемонстрировала высокую диагностическую эффективность и подавляла пролиферацию и воспалительные реакции клеток HFLS-RA, одновременно стимулируя апоптоз. Это позволяет предположить, что данная молекула может стать перспективной мишенью для разработки новых терапевтических стратегий лечения РА. Будущие исследования должны быть сосредоточены на: 1) подтверждении диагностической стабильности miR-488-3p в больших многоцентровых когортах; 2) изучении ее синергических эффектов с существующими терапевтическими средствами, такими как ингибиторы JAK или биологические препараты28; и 3) оптимизации систем доставки miRNA для повышения возможности их клинического применения36.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Необработанные данные, подтверждающие результаты этого исследования, доступны в дополнительных материалах, представленных вместе с данной рукописью.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Нет данных.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для определения апоптоза Annexin V-FITCBD Bioscience556547апоптоз клеток
антитело к Ago2Proteintech66720-1-Igиммунопреципитация РНК
раствор CCK-8DojindoCK04пролиферация клеток
модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM)Thermo Fisher121000146культивирование клеток
фетальная бычья сывороткаThermo Fisher10437028культивирование клеток
Проточный цитометрBD Bioscience FACSCaliburапоптоз клеток
Набор ELISA для определения анти-CCP антител человекаCusabioCSB-E09077h определение анти-CCP
Набор ELISA для определения RF-IgA человекаFeien BiotechnologyEH4270определение RF
Фибробластоподобные синовиоциты при ревматоидном артрите человека (HFLS-RA)Cell ApplicationsHFLS-RA-200валидация функции miR-488-3p in vitro
контрольное антитело IgGAbcamab205718иммунопреципитация РНК
Набор ELISA для интерлейкина-1β (IL-1β)R&D SystemsDY201-05концентрация клеточного IL-1β
Набор ELISA для интерлейкина-6 (IL-6)R&D SystemsD6050Bконцентрация клеточного IL-6
Реагент для липосомальной трансфекции 3000Ingenuity Life TechnologiesL3000015трансфекция клеток
Считыватель микропланшетовBioTek ELx808анализ ELISA
Набор Mir-XTM для синтеза первой цепи miRNANihonbao Bioengineering Co., Ltd.638313обратная транскрипция
среда Opti-MEMIngenuity Life Technologies, Inc31985070трансфекция клеток
pcDNA 3.1InvitrogenV790-20оверэкспрессия ROCK1
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher15140122культивирование клеток
Лабораторная система Phadia 250Thermo Fisher Phadia 250анализ крови
Набор PrimeScriptTM для обратной транскрипцииNihonbao Bioengineering Co., Ltd.RR037Aобратная транскрипция
проподиумйодид (PI)/рибонуклеаза (RNase)BD Bioscience550825апоптоз клеток
Система QuantStudio 5Applied Biosystems, Inc.A28138ПЦР-анализ
Реагент RNAiso PlusNihonbao Bioengineering Co., Ltd.9108изоляция РНК
SYBR Green Premix Ex TaqNippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd.RR420AПЦР-амплификация
База данных TargetScanTargetScanN/Aпредсказание сайтов связывания, (https://www.targetscan.org/) 
Tina-quant C-реактивный белок IVRoche Diagnostics7876033190определение CRP
Набор ELISA для фактора некроза опухоли-α (TNF-α)R&D SystemsDY210-05концентрация клеточного TNF-α

Ссылки

  1. Smolen JS, et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 2018;4:18001.
  2. Kook HY, et al. Serum miR-214 as a novel biomarker for ankylosing spondylitis. Int J Rheum Dis. 2019;22(7):1196-201.
  3. Alamanos Y, Voulgari PV, Drosos AA. Incidence and prevalence of rheumatoid arthritis, based on the 1987 American College of Rheumatology criteria: a systematic review. Semin Arthritis Rheum. 2006;36(3):182-8.
  4. van der Linden MPM, et al. Long-term impact of delay in assessment of patients with early arthritis. Arthritis Rheum. 2010;62(12):3537-46.
  5. Anderson J, et al. Rheumatoid arthritis disease activity measures: American College of Rheumatology recommendations for use in clinical practice. Arthritis Care Res (Hoboken). 2012;64(5):640-7.
  6. Aletaha D, et al. 2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative. Arthritis Rheum. 2010;62(9):2569-81.
  7. Yang J, et al. MicroRNA-488: a miRNA with diverse roles and clinical applications in cancer and other human diseases. Biomed Pharmacother. 2023;165:115115.
  8. Molendijk M, Hazes JMW, Lubberts E. From patients with arthralgia, pre-RA and recently diagnosed RA: what is the current status of understanding RA pathogenesis? RMD Open. 2018;4(1):e000256.
  9. van Venrooij WJ, van Beers JJBC, Pruijn GJM. Anti-CCP antibodies: the past, the present and the future. Nat Rev Rheumatol. 2011;7(7):391-8.
  10. Szodoray P, et al. Anti-citrullinated protein/peptide autoantibodies in association with genetic and environmental factors as indicators of disease outcome in rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev. 2010;9(3):140-3.
  11. Filer A, et al. Utility of ultrasound joint counts in the prediction of rheumatoid arthritis in patients with very early synovitis. Ann Rheum Dis. 2011;70(3):500-7.
  12. Zuo C, Fan P, Yang Y, Hu C. MiR-488-3p facilitates wound healing through CYP1B1-mediated Wnt/β-catenin signaling pathway by targeting MeCP2. J Diabetes Investig. 2024;15(2):145-58.
  13. Mendell JT, Olson EN. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 2012;148(6):1172-87.
  14. Cai Z, Poulos RC, Liu J, Zhong Q. Machine learning for multi-omics data integration in cancer. iScience. 2022;25(2):103798.
  15. Fabian MR, Sonenberg N. The mechanics of miRNA-mediated gene silencing: a look under the hood of miRISC. Nat Struct Mol Biol. 2012;19(6):586-93.
  16. Duroux-Richard I, et al. Circulating miRNA-125b is a potential biomarker predicting response to rituximab in rheumatoid arthritis. Mediators Inflamm. 2014;2014:342524.
  17. Zakeri Z, et al. MicroRNA and exosome: key players in rheumatoid arthritis. J Cell Biochem. 2019;120(7):10930-44.
  18. Pauley KM, et al. Upregulated miR-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients. Arthritis Res Ther. 2008;10(4):R101.
  19. Kurowska-Stolarska M, et al. MicroRNA-155 as a proinflammatory regulator in clinical and experimental arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(27):11193-8.
  20. Pers YM, et al. miR-155 contributes to the immunoregulatory function of human mesenchymal stem cells. Front Immunol. 2021;12:624024.
  21. Fu Q, et al. miR-488-3p alleviates neuropathic pain by regulating target gene ROCK1. Acta Neurobiol Exp (Wars). 2023;83(3):271-9.
  22. Xue W, et al. PVT1 regulates the malignant behaviors of human glioma cells by targeting miR-190a-5p and miR-488-3p. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2018;1864(5 Pt A):1783-94.
  23. Muiños-Gimeno M, et al. Human microRNAs miR-22, miR-138-2, miR-148a, and miR-488 are associated with panic disorder and regulate several anxiety candidate genes and related pathways. Biol Psychiatry. 2011;69(6):526-33.
  24. Le TD, Zhang J, Liu L, Li J. Computational methods for identifying miRNA sponge interactions. Brief Bioinform. 2017;18(4):577-90.
  25. Scanzello CR, Goldring SR. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 2012;51(2):249-57.
  26. McGeary SE, et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 2019;366(6472):eaav1741.
  27. Liu X, et al. Impaired AGO2/miR-185-3p/NRP1 axis promotes colorectal cancer metastasis. Cell Death Dis. 2021;12(4):390.
  28. Smolen JS, Aletaha D, McInnes IB. Rheumatoid arthritis. Lancet. 2016;388(10055):2023-38.
  29. O'Connell RM, Rao DS, Baltimore D. microRNA regulation of inflammatory responses. Annu Rev Immunol. 2012;30:295-312.
  30. Bottini N, Firestein GS. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 2013;9(1):24-33.
  31. Firestein GS, McInnes IB. Immunopathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunity. 2017;46(2):183-96.
  32. Amano M, Nakayama M, Kaibuchi K. Rho-kinase/ROCK: a key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton (Hoboken). 2010;67(9):545-54.
  33. Peng H, et al. ROCK1 induces endothelial-to-mesenchymal transition in glomeruli to aggravate albuminuria in diabetic nephropathy. Sci Rep. 2016;6:20304.
  34. van der Meel R, et al. Smart cancer nanomedicine. Nat Nanotechnol. 2019;14(11):1007-17.
  35. Yin H, et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 2014;15(8):541-55.
  36. Setten RL, Rossi JJ, Han SP. The current state and future directions of RNAi-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(6):421-46.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сывороточный биомаркерОТ-ПЦРапоптоз синовиоцитоввоспалительный ответROC-криваямишень ROCK1проточная цитометрия
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.