miR-488-3p может служить новым неинвазивным диагностическим маркером РА. miR-488-3p модулирует биологическую функцию синовиоцитов через ROCK1. Была выявлена значительная отрицательная корреляция этого маркера с тяжестью заболевания у пациентов с РА.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
miR-488-3p может служить новым неинвазивным диагностическим маркером РА. miR-488-3p модулирует биологическую функцию синовиоцитов через ROCK1. Была выявлена значительная отрицательная корреляция этого маркера с тяжестью заболевания у пациентов с РА.
Диагностика ревматоидного артрита (РА) остается сложной задачей из-за ограниченности существующих биомаркеров. Целью исследования было изучение потенциала miR-488-3p в сыворотке крови в качестве биомаркера РА и выявление возможного механизма его действия. В исследовании приняли участие 135 пациентов с РА, 130 пациентов с остеоартритом (ОА) и 125 здоровых добровольцев. Уровни экспрессии miR-488-3p анализировали методом RT-qPCR. Механизм действия изучали с помощью функциональных тестов (CCK-8, проточная цитометрия, ELISA) и экспериментов по валидации мишеней (люциферазный репортерный ген, RIP). Уровни экспрессии miR-488-3p в сыворотке были значимо ниже у пациентов с РА, чем у пациентов с остеоартритом (ОА) и в группе здорового контроля (p < 0.001). Анализ ROC-кривых показал, что miR-488-3p обладает высокой диагностической точностью при дифференциации РА от здорового контроля и пациентов с ОА. miR-488-3p отрицательно коррелировал со скоростью оседания эритроцитов (СОЭ), С-реактивным белком (СРБ), ревматоидным фактором (РФ) и индексами DAS28. Функциональная валидация показала, что гиперэкспрессия miR-488-3p подавляла пролиферацию и воспалительный ответ синовиоцитов, одновременно индуцируя апоптоз. Исследования механизмов показали, что miR-488-3p может напрямую воздействовать на Rho-ассоциированную протеинкиназу 1 (ROCK1), которая опосредует его защитные эффекты. miR-488-3p в сыворотке крови является перспективным новым неинвазивным диагностическим маркером РА и защищает синовиоциты от повреждения.
Ревматоидный артрит (РА) — распространенное аутоиммунное заболевание, характеризующееся синовиальным воспалением, эрозией и разрушением суставов1,2. Глобальная распространенность РА составляет примерно 0,5%–1%3, что серьезно влияет на качество жизни пациентов и их трудоспособность. Заболевание имеет постепенное начало, а ранние симптомы часто бывают нетипичными, что приводит к ошибочной диагностике или их игнорированию4. По мере прогрессирования болезни может развиться деформация суставов, утрата функций и даже повыситься риск таких осложнений, как сердечно-сосудистые заболевания5, что ложится тяжелым бременем на пациентов, их семьи и системы здравоохранения.
В настоящее время для диагностики ревматоидного артрита (РА) требуется сочетание клинических симптомов, признаков, лабораторных тестов и методов визуализации6. В качестве общепринятых лабораторных показателей используют скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и С-реактивный белок (СРБ), которые являются неспецифическими маркерами системного воспаления, а также ревматоидный фактор (РФ) и антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (анти-CCP), являющиеся важными серологическими биомаркерами РА7,8. Однако эти традиционные биомаркеры имеют ограничения: РФ может быть положительным у некоторых здоровых людей и пациентов с другими аутоиммунными заболеваниями (доля ложноположительных результатов составляет около 5%); анти-CCP, несмотря на высокую специфичность (>95%), обладают ограниченной чувствительностью на ранних стадиях заболевания (около 60–70%)4,9, а некоторые пациенты с РА остаются серонегативными10. Следовательно, важно найти более чувствительные и специфичные биомаркеры для ранней диагностики, мониторинга течения заболевания и оценки прогноза при РА11.
МикроРНК (мРНК) представляют собой группу эндогенных некодирующих регуляторных молекул РНК длиной примерно 22–25 оснований12,13. Было установлено, что мРНК выступают в качестве ключевых регуляторов в развитии различных заболеваний, и их аберрантная экспрессия тесно связана с патогенезом болезни13,14,15, что делает мРНК перспективными биомаркерами для диагностики заболеваний и терапевтического мониторинга. В последние несколько лет роль мРНК при ревматоидном артрите (РА) привлекает все больше внимания16. Исследования показали, что несколько мРНК характеризуются нарушением экспрессии (например, miR-146a, miR-155 и др.) в сыворотке крови, синовиальных тканях и мононуклеарных клетках периферической крови (PBMCs) пациентов с РА17,18,19. Эти мРНК вносят вклад в патогенез РА, регулируя выработку воспалительных цитокинов, стимулируя пролиферацию и инвазию синовиальных клеток, а также влияя на дифференцировку остеокластов20. Среди них miR-488 локализована в области 1q25.2 хромосомы человека21, и предыдущие исследования подтвердили ее нейропротекторные эффекты: она играет регуляторную роль в прогрессировании глиом22 и нейробластом23; примечательно, что miR-488-3p стимулирует апоптоз хондроцитов при остеоартрите (ОА)24. Хотя ОА и РА являются разными заболеваниями суставов, они имеют общие механизмы в патологических процессах синовиального воспаления и разрушения хряща25. Мы предположили, что miR-488-3p может играть роль при РА, регулируя аналогичные целевые пути. Однако специфическая роль и потенциальные механизмы действия miR-488-3p при РА до сих пор не были выяснены.
В данном исследовании изучались изменения уровней экспрессии miR-488-3p в сыворотке крови пациентов с ревматоидным артритом (РА), а также их связь с активностью заболевания и клиническими показателями с целью оценки потенциальной ценности данного маркера как неинвазивного диагностического инструмента для выявления РА. Эта работа предлагает новый взгляд на ранний скрининг и прогнозирование прогрессирования РА, что позволит улучшить прогноз для пациентов с данным заболеванием.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Исследование было одобрено Этическим комитетом больницы Hefei BOE (номер одобрения 2021–1), и до включения в исследование от всех участников было получено письменное информированное согласие.
Пациенты и образцы
В данное исследование было включено 135 пациентов с РА (диагноз поставлен согласно классификационным критериям ACR/EULAR 2010 года) из отделения ревматологии и иммунологии больницы Hefei BOE, 130 пациентов с ОА из отделения ортопедии (диагноз поставлен согласно диагностическим критериям ОА Китайской медицинской ассоциации 2018 года) и 125 здоровых добровольцев из центра медицинских осмотров той же больницы, сопоставимых по возрасту и полу. Возраст участников составлял 30–80 лет. Отсутствие у здоровых добровольцев аутоиммунных заболеваний, патологий суставов и острых инфекций было подтверждено путем комплексного анализа анамнеза, физикального осмотра и лабораторных исследований. Участники исключались из исследования при наличии сопутствующих аутоиммунных заболеваний, инфекций или травм в течение последних 3 месяцев, злокачественных новообразований, а также в период беременности или лактации.
Отбор и подготовка проб
У всех участников исследования была отобрана венозная кровь натощак. После коагуляции при комнатной температуре в течение 30 мин образцы сыворотки выделяли путем центрифугирования при 1500 × g в течение 15 мин. Сыворотку хранили при -80°C до проведения дальнейшего анализа.
Определение клинических и серологических маркеров
Для комплексной оценки статуса заболевания и воспалительной активности с помощью стандартизированных клинических лабораторных методов измеряли клинические и серологические биомаркеры. СОЭ определяли методом Вестергрена для оценки неспецифического системного воспаления. СРБ количественно определяли с помощью иммунотурбидиметрического анализа (нормативное справочное значение: <10 mg/L) для оценки острофазового воспалительного ответа. РФ определяли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA), при этом нормативное справочное значение составляло ≤20 IU/mL. Антитела к CCP измеряли с помощью ELISA второго поколения для получения серологического подтверждения диагноза РА.
Клеточные линии и культивирование
Клетки фибробластоподобных синовиоцитов человека при ревматоидном артрите (HFLS-RA) выращивали в модифицированной среде Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина. Клетки культивировали в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂; для всех экспериментов использовали клетки от третьего до шестого пассажа.
Экстракция РНК и количественная ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией
Общую РНК экстрагировали из образцов сыворотки с использованием реагента для экстракции РНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора для синтеза первой цепи миРНК для miRNA и набора для обратной транскрипции для целевых генов матричной РНК (mRNA) в соответствии с инструкциями производителя. Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-qPCR) выполняли с использованием системы ПЦР в реальном времени и мастер-микса для ПЦР на основе SYBR Green. Программа термоциклирования была установлена следующим образом: предварительная денатурация при 95 °C в течение 30 s, затем 40 циклов амплификации (денатурация при 95 °C в течение 5 s и отжиг/элонгация при 60 °C в течение 30 s). Каждый образец анализировали в трех повторностях. Малая ядерная РНК U6 (U6 snRNA) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) служили эндогенными референсными генами для нормализации miRNA и mRNA соответственно. Последовательности праймеров приведены в Дополнительной таблице 1. Относительные уровни экспрессии miR-488-3p и ее целевых генов рассчитывали с помощью метода 2−ΔΔCt. Также анализировали изменения уровней mRNA целевых генов после гиперэкспрессии или ингибирования miR-488-3p для подтверждения их регуляторных связей.
Трансфекция клеток
Клетки HFLS-RA высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 5 × 105 клеток/лунку. Трансфекцию клеток проводили с использованием реагента на основе липосом согласно инструкциям производителя. Группы трансфекции включали группы с одиночной трансфекцией и группы с ко-трансфекцией. Группы с одиночной трансфекцией были следующими: 1) контрольная — нетрансфицированные клетки; 2) негативный контроль мимика (NC) — клетки, трансфицированные негативным контролем мимика miR-488-3p; 3) мимик miR-488-3p — клетки, трансфицированные мимиком miR-488-3p; 4) NC ингибитора — клетки, трансфицированные негативным контролем ингибитора miR-488-3p; 5) ингибитор miR-488-3p — клетки, трансфицированные ингибитором miR-488-3p. Группы с ко-трансфекцией включали: 1) мимик miR-488-3p + оверэкспрессия-NC (oe-NC) — клетки, ко-трансфицированные мимиком miR-488-3p и негативным контролем векторов оверэкспрессии ROCK1; 2) мимик miR-488-3p + oe-ROCK1 — клетки, ко-трансфицированные мимиком miR-488-3p и векторами оверэкспрессии ROCK1. Все последовательности трансфекции обобщены в Дополнительной таблице 1. Вектор оверэкспрессии ROCK1 был создан путем клонирования области кодирующей последовательности (CDS) в плазмиду pcDNA 3.1. Трансфицированные клетки использовали для последующих экспериментов через 48 ч после трансфекции.
Анализ функций клеток
Анализ пролиферации клеток (Cell Counting Kit-8 [CCK-8]): Трансфицированные клетки HFLS-RA высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 5 × 103 клеток/лунку, по три повторности на группу. Через 0, 24, 48 и 72 ч после трансфекции в каждую лунку добавляли 10 µL раствора CCK-8 с последующей инкубацией при 37 °C в течение 2 ч. Оптическую плотность измеряли при 450 nm (рабочая длина волны) и 630 nm (контрольная длина волны) с помощью микропланшетного ридера. Относительную скорость пролиферации рассчитывали, принимая значение при 0 ч за базовую линию.
Определение апоптоза (проточная цитометрия): Апоптоз оценивали с помощью анализа на апоптоз с использованием Annexin V-флуоресцеин-изотиоцианата (FITC)/пропидий иодида (PI). Клетки трансфицировали соответствующими плазмидами, после чего собирали путем трипсинизации. Степень апоптоза определяли методом проточной цитометрии.
Анализ воспалительных факторов (иммуноферментный анализ [ELISA]): клетки HFLS-RA высевали в 24-луночные планшеты и трансфецировали соответствующим миметиком miR-488-3p, ингибитором miR-488-3p или соответствующими отрицательными контролями на 48 ч. Концентрации интерлейкина-6 (IL-6), фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-1β (IL-1β) в супернатантах клеточных культур определяли с помощью наборов для ELISA.
Валидация мишени
Прогнозирование мишени: С помощью базы данных TargetScan было предсказано, что ROCK1 является нижележащей мишенью miR-488-3p26Предполагаемые сайты связывания между miR-488-3p и ROCK1 3′нетранслируемая область (3'UTR)′НТР (нетранслируемая область) также были идентифицированы.
Двойной люциферазный репортерный анализ: Дикий тип или мутантная форма 3′UTR ROCK1 были клонированы в плазмиду pGL3. Предполагаемые сайты связывания и сайты мутаций показаны на Рисунке 4. Клетки HEK- 293T подвергали ко-трансфекции мимиком или ингибитором miR-488-3p вместе с сконструированными векторами27. Люциферазную активность измеряли через 48 ч после трансфекции мимиком или ингибитором miR-488-3p.
РНК-иммунопреципитация (RIP): Клетки HFLS-RA инкубировали с антителом к Argonaute 2 (Ago2) (RRID: AB_2882071, разведение 1:200) или контрольным антителом иммуноглобулином G (IgG) (RRID: AB_2819160, разведение 1:5000), после чего проводили экстракцию РНК и количественную ПЦР (кПЦР) для определения обогащения мРНК ROCK1 согласно описанному выше методу.
Статистический анализ
Статистический анализ исследования проводили с помощью программ SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) и GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). Данные измерений представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Все эксперименты были выполнены в трех биологических повторностях, каждая из которых анализировалась в трех технических повторах. Исходные данные приведены в дополнительных материалах. Перед применением параметрических статистических критериев данные оценивали с помощью графика нормальной вероятности (P-P plot). Для сравнения непрерывных исходных переменных (например, возраста, индекса массы тела [BMI] и др.) использовали t-критерий для независимых выборок, а для категориальных переменных (например, пола и др.) — критерий хи-квадрат. Уровни экспрессии генов сравнивали с помощью t-критерия для независимых выборок. Изменения пролиферации клеток в разные временные точки анализировали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с повторными измерениями, тогда как для сравнения показателей апоптоза, определенных методом проточной цитометрии, использовали однофакторный ANOVA. Корреляционный анализ проводили с помощью коэффициента Спирмена (для переменных, не имеющих нормального распределения) и коэффициента Пирсона (для переменных с нормальным распределением). Диагностическую эффективность оценивали с помощью анализа кривой рабочей характеристики приемника (ROC-кривой). Оптимальное пороговое значение, чувствительность и специфичность определяли с помощью максимального индекса Юдена. Все статистические тесты были двухсторонними; значение p < 0,05 считалось статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Основные характеристики участников исследования
В данное исследование для систематического анализа было включено 125 здоровых добровольцев (контрольная группа), 130 пациентов с ОА и 135 пациентов с РА (Таблица 1). Между тремя группами не было выявлено значимых различий по таким базовым характеристикам, как возраст (p = 0.191), соотношение полов (p = 0.203) и ИМТ (p = 0.562), что обеспечило сопоставимость исследуемой популяции. Что ка...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Как подчеркнули Smolen et al1 в последних рекомендациях по диагностике и лечению РА, разработка новых биомаркеров имеет значительную клиническую ценность. В данном исследовании мы подтвердили, что экспрессия сывороточного miR-488-3p была значительно снижена у пациентов с РА и продемонстрировала многообещающие диагностические характеристики с относительно удовлетворительной чувствительностью и специфичностью. Ранняя диагностика РА всегда представляла собой клиническую проблему, а существующие биома...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Нет данных.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор для определения апоптоза Annexin V-FITC | BD Bioscience | 556547 | апоптоз клеток |
| антитело к Ago2 | Proteintech | 66720-1-Ig | иммунопреципитация РНК |
| раствор CCK-8 | Dojindo | CK04 | пролиферация клеток |
| модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) | Thermo Fisher | 121000146 | культивирование клеток |
| фетальная бычья сыворотка | Thermo Fisher | 10437028 | культивирование клеток |
| Проточный цитометр | BD Bioscience | FACSCalibur | апоптоз клеток |
| Набор ELISA для определения анти-CCP антител человека | Cusabio | CSB-E09077h | определение анти-CCP |
| Набор ELISA для определения RF-IgA человека | Feien Biotechnology | EH4270 | определение RF |
| Фибробластоподобные синовиоциты при ревматоидном артрите человека (HFLS-RA) | Cell Applications | HFLS-RA-200 | валидация функции miR-488-3p in vitro |
| контрольное антитело IgG | Abcam | ab205718 | иммунопреципитация РНК |
| Набор ELISA для интерлейкина-1β (IL-1β) | R&D Systems | DY201-05 | концентрация клеточного IL-1β |
| Набор ELISA для интерлейкина-6 (IL-6) | R&D Systems | D6050B | концентрация клеточного IL-6 |
| Реагент для липосомальной трансфекции 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | трансфекция клеток |
| Считыватель микропланшетов | BioTek | ELx808 | анализ ELISA |
| Набор Mir-XTM для синтеза первой цепи miRNA | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | обратная транскрипция |
| среда Opti-MEM | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | трансфекция клеток |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | оверэкспрессия ROCK1 |
| Пенициллин-стрептомицин | Thermo Fisher | 15140122 | культивирование клеток |
| Лабораторная система Phadia 250 | Thermo Fisher | Phadia 250 | анализ крови |
| Набор PrimeScriptTM для обратной транскрипции | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | обратная транскрипция |
| проподиумйодид (PI)/рибонуклеаза (RNase) | BD Bioscience | 550825 | апоптоз клеток |
| Система QuantStudio 5 | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | ПЦР-анализ |
| Реагент RNAiso Plus | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | изоляция РНК |
| SYBR Green Premix Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | ПЦР-амплификация |
| База данных TargetScan | TargetScan | N/A | предсказание сайтов связывания, (https://www.targetscan.org/) |
| Tina-quant C-реактивный белок IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | определение CRP |
| Набор ELISA для фактора некроза опухоли-α (TNF-α) | R&D Systems | DY210-05 | концентрация клеточного TNF-α |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.