Данное исследование продемонстрировало, что показатели LUS и уровень сывороточного miR-486-3p повышены у новорожденных с острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС). Их комбинированная оценка улучшила прогнозирование тяжести заболевания и исходов, а miR-486-3p, как было обнаружено, регулирует функции клеток в модели ОРДС, воздействуя на Delta-Like Canonical Notch Ligand 4.
Исследовательская статья
Прогностическая значимость показателей ультразвукового исследования легких и уровня сывороточного miR-486-3p при остром респираторном дистресс-синдроме новорожденных
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Данное исследование было направлено на оценку прогностической значимости показателя ультразвукового исследования легких (LUS) и сывороточного miR-486-3p при остром респираторном дистресс-синдроме (ОРДС) у новорожденных, а также на изучение лежащего в основе механизма. В исследование были включены 112 новорожденных с ОРДС и 100 здоровых младенцев, родившихся в тот же период, в качестве группы основных больных и группы здорового контроля соответственно. Каждому новорожденному в течение 6 ч после поступления в отделение интенсивной терапии проводилось ультразвуковое исследование легких с расчетом LUS. Для количественного определения экспрессии генов использовалась полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-qPCR), а для оценки прогностической эффективности и взаимосвязей применялись анализ кривых рабочих характеристик приемника (ROC-кривых) и корреляционный анализ Пирсона. Кроме того, была создана модель ОРДС in vitro с использованием HPMECs для изучения механизма действия miR-486-3p. Для подтверждения целевой связи между miR-486-3p и каноническим Notch-подобным лигандом 4 (DLL4) был проведен двойной люциферазный репортерный анализ. Результаты показали, что LUS и уровень сывороточного miR-486-3p были значительно повышены у новорожденных с ОРДС. Анализ ROC-кривых показал, что и miR-486-3p, и LUS могут предсказывать прогноз ОРДС у новорожденных (AUC = 0,883 и 0,873, чувствительность: 96,4% и 89,3%, специфичность: 77,4% и 73,8% соответственно), а сочетание miR-486-3p и LUS обладало лучшим прогностическим эффектом (AUC = 0,929, чувствительность: 92,9%, специфичность: 84,5%). С точки зрения механизмов, miR-486-3p воздействовал на DLL4, регулируя биологические функции клеток модели ОРДС. В совокупности комбинированная оценка LUS и сывороточного miR-486-3p может служить перспективным подходом для оценки степени тяжести заболевания и прогнозирования исхода у новорожденных с ОРДС. Для подтверждения общей применимости данного метода по-прежнему требуется дальнейшая многоцентровая валидация.
Введение
Неонатальный острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) представляет собой жизнеугрожающее критическое респираторное расстройство, характеризующееся прежде всего нарушением функции альвеолярного сурфактанта, что создает серьезные риски для выживания новорожденных1,2. Несмотря на разработку различных методов лечения, общий прогноз для новорожденных с данной патологией остается неудовлетворительным3. Таким образом, раннее определение степени тяжести заболевания и точная прогностическая оценка необходимы для оптимизации клинического вмешательства и улучшения исходов у пациентов. При развитии ОРДС функция легких новорожденного серьезно нарушается, что сопровождается сбоями в вентиляции и газообмене4. УЗИ легких может рассматриваться как основной метод визуализации для мониторинга вентиляции при ОРДС5. Оно стало предпочтительным прикроватным инструментом визуализации для мониторинга поражений легких при ОРДС, а шкала ультразвукового исследования легких (LUS) широко применяется для диагностики острых респираторных заболеваний у новорожденных, а также для оценки тяжести заболевания и прогноза в условиях отделений интенсивной терапии6. Однако отдельные методы визуализации или лабораторные исследования имеют неустранимые недостатки и не могут полностью удовлетворить потребности клинической оценки7. Поэтому поиск новых биомаркеров для создания комбинированной системы оценки имеет большое клиническое значение.
МикроРНК (миРНК) представляют собой новый класс регуляторных факторов генов, которые играют ключевую роль в патогенезе ОРДС8. Например, снижение экспрессии miR-141-3p тесно связано с тяжестью заболевания при фиброзе легких и повреждении легких9. miR-124-3p является защитным фактором при ОРДС, воздействуя на p6510. Предыдущие исследования с использованием высокопроизводительного секвенирования подтвердили, что экспрессия miR-486-3p значительно повышена у пациентов с ОРДС11. Недавние исследования выделили ось hsa_circ_0006892/miR-486-3p как потенциальный молекулярный механизм, участвующий в развитии ОРДС12. Эти данные свидетельствуют о том, что miR-486-3p тесно связана с ОРДС. Тем не менее, прогностическая и предсказательная ценность miR-486-3p в отношении тяжести и исхода ОРДС у новорожденных еще предстоит полностью выяснить.
В настоящее время основными методами оценки ОРДС у новорожденных являются рентгенография грудной клетки, анализ газов крови и определение одного биомаркера. Визуализация грудной клетки связана с радиационным облучением и не позволяет проводить мониторинг в режиме реального времени с повторными измерениями. Анализ газов крови отражает только острое состояние респираторной функции и не обладает прогностической ценностью для долгосрочного исхода. Определение одной microRNA дает объективные количественные результаты, но не может отразить морфологические изменения легочной ткани в реальном времени. По сравнению с этими традиционными подходами, сочетание LUS и сывороточного miR-486-3p объединяет преимущества прикроватной визуализации и молекулярной диагностики.
Данное исследование было сосредоточено на новорожденных, соответствующих критериям ARDS, а не на классическом РДС, вызванном дефицитом сурфактанта. Таким образом, целью данной работы является оценка того, могут ли исходные данные LUS и уровень miR-486-3p в сыворотке крови предсказать краткосрочную летальность при ARDS у новорожденных. Это исследование направлено на получение ценных данных для улучшения клинической оценки состояния заболевания и краткосрокого прогностического анализа при ARDS у новорожденных.
Протокол
Данное исследование получило одобрение комитета по медицинской этике Первой народной больницы города Юнкан в строгом соответствии с Хельсинкской декларацией.
Испытуемые
Данное одноцентровое обсервационное когортное исследование с экспериментальным компонентом in vitro проводилось с января 2022 года по декабрь 2023 года. В общей сложности в Первой народной больнице города Юнкан приняли участие 112 последовательно поступивших новорожденных с диагнозом ОРДС. Для целей сравнения в качестве контрольной группы были отобраны здоровые младенцы, родившиеся в тот же период, без асфиксии или внутриутробного дистресса в анамнезе.
Критерии включения:
Все участники соответствовали диагностическим критериям неонатального острого респираторного дистресс-синдрома согласно Монтрёским рекомендациям (издание 2017 года). Диагноз был подтвержден данными визуализации и клинической оценки: рентгенография выявила диффузные затемнения в обоих легких, характерные для отека легких, а эхокардиография не обнаружила признаков гипертензии в левом предсердии, что позволило исключить кардиогенный отек легких. Дополнительные критерии включали острое начало симптомов и необходимость искусственной вентиляции легких в течение более 3 дней при отсутствии тяжелых внелегочных инфекций. От семей новорожденных было получено надлежащее информированное согласие.
Критерии исключения:
Были исключены новорожденные с первичным дефицитом альвеолярного сурфактанта, врожденными пороками сердца, нарушениями обмена веществ или другими значимыми сопутствующими заболеваниями. Кроме того, из исследования были исключены младенцы с пороками развития легких или грудной клетки, а также с другими серьезными врожденными аномалиями. Респираторный дистресс-синдром (РДС) новорожденных также был исключен.
Клинические данные
Для всех участников были задокументированы гестационный возраст, пол, масса тела при поступлении и характеристики матери. Каждому новорожденному в течение 6 ч после поступления в отделение интенсивной терапии проводили ультразвуковое исследование (УЗИ) легких с последующей оценкой по шкале LUS. Оценка LUS проводилась по шкале с максимальным значением 36 баллов, где более высокий балл указывал на большую тяжесть легочных симптомов. Образцы крови собирали сразу после поступления в рамках первичного клинического обследования и до любого значимого терапевтического вмешательства (например, повторного введения сурфактанта, изменения режима вентиляции или назначения вазоактивных препаратов). Образцы крови здоровых новорожденных получали в момент их включения в исследование. Для выделения сыворотки цельную кровь помещали в пробирки с разделительным гелем и выдерживали в неподвижном состоянии при комнатной температуре в течение 30 мин для полного формирования сгустка. Затем образцы центрифугировали при 1500 x g в течение 15 мин при 4 °C. Верхний прозрачный супернатант сыворотки осторожно аспирировали, разделяли на аликвоты в стерильные криопробирки и немедленно помещали на хранение в морозильник сверхнизкой температуры при -80 °C для последующих экспериментов. Для последующих исследований использовали только прозрачные, негемолизировавшиеся образцы сыворотки. Использованные пробирки для сбора крови и остатки крови утилизировали как медицинские биологические отходы в соответствии с внутренними правилами учреждения.
Группировка
Все новорожденные были разделены на две отдельные группы: группу с легким течением (I–II степени) и группу с тяжелым течением (III–IV степени) на основании результатов первичной рентгенографии грудной клетки и степени тяжести состояния, оцененной через 24 ч после поступления. При интерпретации рентгенограмм грудной клетки I степень характеризовалась двусторонним снижением прозрачности легких с наличием мелких частиц и ретикулярных теней в паренхиме легких. II степень указывала на распространение очагов поражения на средние и периферические зоны легких с наличием признаков воздушной бронхограммы. При III степени наблюдалось значительное снижение прозрачности обоих легких, что приводило к размытию контуров сердца и диафрагмы. IV степень характеризовалась выраженными признаками воздушной бронхограммы, приводящими к почти полному затемнению, напоминающему картину «белого легкого».
Новорожденные с диагнозом ОРДС получали комплексную терапию после поступления в отделение интенсивной терапии новорожденных. Данный режим включал искусственную вентиляцию легких, седацию, введение легочного сурфактанта, противовоспалительную терапию, нутритивную поддержку, помощь в откашливании и меры по восполнению жидкости. Постановка диагноза ОРДС у новорожденных служила отправной точкой исследования. Конечными точками считались либо успешное выздоровление и выписка пациента, либо летальный исход вследствие неэффективности лечения. На основании клинических исходов участники были разделены на две группы: группу выживших и группу умерших.
Культивирование и обработка клеток
Микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека (HPMECs) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 U/mL пенициллина и 100 µg/mL стрептомицина. Клетки содержали при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂. Для создания клеточной модели ОРДС клетки обрабатывали липополисахаридом (LPS) в концентрации 1 mg/L13,14. Успешность создания модели подтверждали путем наблюдения за легким сморщиванием клеток под инвертированным микроскопом после обработки LPS. По завершении экспериментов отработанную культуральную среду, погибшие клетки и одноразовые материалы для культивирования утилизировали как биологически опасные отходы.
Трансфекция и группировка клеток
HPMECs высевали в культуральные планшеты и инкубировали до достижения 70% конфлюэнтности перед трансфекцией. Трансфекционные комплексы готовили согласно инструкциям производителя. Клетки разделяли на следующие группы: холостой контроль, мимик miR-486-3p, отрицательный контроль мимика, ингибитор miR-486-3p, отрицательный контроль ингибитора, мимик miR-486-3p + плазмида для гиперэкспрессии DLL4 (OE-DLL4) и мимик miR-486-3p + пустая плазмида для гиперэкспрессии (OE-NC). Трансфекционные комплексы добавляли в соответствующие лунки и инкубировали в течение 4–6 h. Среду заменяли свежей полной средой и продолжали культивирование в течение 24–48 h для последующих экспериментов. Об успешной трансфекции свидетельствовала стабильная конфлюэнтность клеток при отсутствии избыточной гибели клеток.
Количественная ПЦР в реальном времени
Общую РНК экстрагировали из образцов сыворотки и культивируемых клеток с использованием реагента для экстракции РНК. Концентрацию и чистоту РНК измеряли с помощью спектрофотометра; образцы с соотношением A260/A280 в диапазоне 1,8–2,1 считали пригодными для дальнейшего анализа. Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали с использованием набора для обратной транскрипции. Затем проводили количественную ПЦР с использованием системы ПЦР в реальном времени при следующих условиях циклирования: начальная денатурация при 95 °C в течение 3 мин, затем 40 циклов: 95 °C в течение 10 с и 60 °C в течение 30 с. Для определения микроРНК относительную экспрессию miR-486-3p рассчитывали методом 2-ΔΔCt, используя U6 snRNA в качестве внутреннего контроля. Для количественного определения мРНК экспрессию DLL4 нормировали по мРНК GAPDH с помощью того же алгоритма 2-ΔΔCt. Последовательности праймеров были следующими: miR-486-3p прямой: 5'-GTATGACGGGGCAGCTCAGTA-3' и miR-486-3p обратный: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3', U6 прямой: 5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3' и U6 обратный: 5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'. DLL4 прямой: 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC-3' и DLL4 обратный: 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA-3', GAPDH прямой: 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3' и GAPDH обратный: 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'.
Анализ пролиферации клеток с помощью CCK-8
Трансфецированные клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 103 клеток на лунку и инкубировали в течение 24, 48 и 72 ч. Затем культуральную среду аспирировали, а клетки дважды промывали 1× PBS. После этого в каждую лунку добавляли 100 µL свежего 1× PBS и 10 µL раствора CCK-8, и планшеты инкубировали при 37 °C в течение 2 ч. Оптическую плотность измеряли при 450 nm с помощью микропланшетного ридера, и на основании полученных значений оценивали пролиферацию клеток. Об успешном проведении анализа свидетельствовали зависящие от времени изменения оптической плотности в экспериментальных группах.
Анализ апоптоза методом проточной цитометрии
Клетки подвергали перевариванию 0,25% трипсином, после чего полученную клеточную суспензию собирали и центрифугировали при 1500 × g в течение 5 мин при 4 °C. Супернатант удаляли, а клеточные осадки промывали трижды предварительно охлажденным 1× PBS. Затем клетки ресуспендировали в 500 µL 1x Binding Buffer, после чего добавляли 5 µL Annexin V-FITC и 5 µL пропидий иодида (PI). После осторожного перемешивания образцы инкубировали в течение 40 мин при комнатной температуре в темноте. Апоптоз клеток измеряли методом проточной цитометрии, данные анализировали с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа данных проточной цитометрии. Об успешном проведении анализа свидетельствовал низкий уровень апоптоза в контрольной группе и выраженное увеличение апоптоза в группе с моделью ARDS.
Люциферазный репортерный анализ
Потенциальные гены-мишени miR-486-3p были идентифицированы с помощью онлайн-базы данных TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/). После определения предсказанных сайтов связывания были сконструированы плазмиды с люциферазным репортером дикого типа (DLL4-WT) и мутантного типа (DLL4-MUT), содержащие соответствующие последовательности связывания. Векторы DLL4-WT и DLL4-MUT были совместно трансфицированы в HPMECs вместе с мимиками или ингибиторами miR-486-3p соответственно. Затем относительная люциферазная активность была измерена с помощью набора для двойного люциферазного репортерного анализа. Сигналы биолюминесценции регистрировали с помощью люминометра в соответствии с инструкциями производителя. Успешная валидация мишени подтверждалась значительным снижением люциферазной активности в группе DLL4-WT после оверэкспрессии miR-486-3p.
Подробная информация о всех реагентах, расходных материалах и лабораторном оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в сопроводительной Таблице материалов.
Статистические методы
Статистический анализ и визуализация данных выполнялись с использованием SPSS версии 26.0 и GraphPad Prism версии 9.0. Данные измерений представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение; сравнение средних значений двух независимых выборок проводилось с помощью независимого t-критерия. Для сравнения трех и более групп применялись однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и ANOVA с повторными измерениями с последующим апостериорным критерием множественных сравнений Тьюки для выявления межгрупповых различий. Категориальные данные выражались в виде количества (процентов), и межгрупповые сравнения анализировались с помощью критерия хи-квадрат. Для непараметрических данных применялся критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Кроме того, была построена ROC-кривая для оценки прогностической значимости уровней экспрессии сывороточного miR-486-3p и LUS при определении летальности у детей с ОРДС. Для изучения корреляций использовался корреляционный анализ Пирсона. Для всех экспериментальных групп было проведено три независимых биологических и технических повтора. Статистической единицей считался независимый эксперимент, при этом каждый биологический повтор представлял собой отдельную партию клеточной культуры, полученную из разных пассажей, а технические повторы использовались для снижения внутриэкспериментальной вариабельности. Сначала вычислялось среднее значение данных технических повторов, после чего статистический анализ проводился на основе средних значений биологических повторов. Статистическая значимость была установлена при p < 0.05.
Результаты
Сопоставимые исходные данные между группами
Общие характеристики младенцев, включенных в исследование, представлены в Таблице 1. Между двумя группами не было обнаружено значимых различий в исходных демографических характеристиках: гестационный возраст (36,07 ± 2,71 против 35,72 ± 2,64 недели, p = 0,347), доля лиц мужского пола (59,0% против 66,1%, p = 0,290), масса тела при рождении (3,39 ± 0,57 против 3,33 ± 0,55 кг, p = 0,437), возраст матери (29,18 ± 4,00 против 29,66 ± 4,05 лет, p = 0,387) и способ родоразрешения (вагинальные роды: 54,0% против 58,0%; кесарево сечение: 46,0% против 42,0%, p = 0,554), что свидетельствует о сопоставимости этих групп. На основании рентгенологического исследования грудной клетки в группе с ОРДС 72 случая (64,3%) были классифицированы как легкая степень (I-II степень), а 40 случаев (35,7%) — как тяжелая степень (III-IV степень).
Тяжесть ОРДС коррелирует с прогнозом пациента
Сравнительный анализ показателей выживаемости между группой детей с ОРДС, которые выжили, и теми, кто скончался, представлен в Таблице 2. Из 112 новорожденных с диагнозом ОРДС выжили 84 пациента (75%), в то время как в 28 случаях (25%) наступила смерть. Примечательно, что статистически значимых различий по возрасту младенцев, полу, массе тела при рождении, возрасту матери, способу родоразрешения, характеристикам амниотической жидкости, этиологии или другим переменным между двумя группами выявлено не было (p > 0.05). Однако была отмечена значимая разница в степени тяжести ОРДС (p < 0.01), что указывает на критический прогностический фактор.
Повышение уровней miR-486-3p и LUS при ОРДС. Анализ методом RT-qPCR показал, что уровни miR-486-3p в сыворотке крови были значительно повышены у новорожденных с ОРДС по сравнению со здоровым контролем. Более того, в когорте пациентов с ОРДС в группе с тяжелым течением наблюдались заметно более высокие уровни, чем в группе с легким течением (P < 0.001) (Рисунок 1A). Кроме того, показатель LUS был выше в группе тяжелого ОРДС, чем в группе легкого ОРДС (p < 0.001) (Рисунок 1B). При разделении пациентов с ОРДС по клиническому исходу в группе летальных исходов уровни LUS и miR-486-3p были значительно выше, чем в группе выживших (Рисунок 1C,D). У пациентов без выживших была обнаружена сильная положительная корреляция между LUS и miR-486-3p в сыворотке крови (r = 0.832, p <0.001) (Рисунок 1E).
Комбинированное определение улучшает прогностическую предсказуемость
На основании протокола ROC-анализа мы оценили прогностическую эффективность отдельных и комбинированных показателей. Значения AUC для LUS и miR-486-3p при прогнозировании краткосрочной летальности составили 0,873 (95% CI: 0,809-0,936) и 0,883 (95% CI: 0,822-0,944) соответственно. Значения чувствительности составили 89,3% и 96,4%, в то время как значения специфичности составили 73,8% и 77,4% соответственно. Оптимальные пороговые значения для LUS и miR-486-3p составили 15,500 и 1,465 соответственно. Кроме того, AUC для комбинированной прогностической модели составила 0,929 (95% CI: 0,883-0,975), продемонстрировав чувствительность 92,9% и специфичность 84,5% при оптимальном пороговом значении 1,659 (Рисунок 1F).
Повышение экспрессии miR-486-3p нарушает функцию клеток
Следуя протоколу культивирования клеток и воздействия LPS, мы создали клеточную модель ОРДС in vitro с использованием HPMECs. Результаты qPCR показали, что экспрессия miR-486-3p постепенно увеличивалась с течением времени после стимуляции LPS (Рисунок 2A). Для исследования влияния на клетки модели ОРДС проводили гиперэкспрессию или нокдаун miR-486-3p (Рисунок 2B). В соответствии с протоколами анализа CCK-8 и проточной цитометрии определяли пролиферацию и апоптоз клеток. Гиперэкспрессия miR-486-3p значительно подавляла пролиферацию и стимулировала апоптоз клеток. Напротив, нокдаун miR-486-3p облегчал вызванное LPS повреждение клеток (Рисунок 2C,D).
miR-486-3p подавляет экспрессию DLL4
В соответствии с протоколом конструирования плазмид и двухлюциферазного репортерного анализа мы подтвердили взаимодействие между miR-486-3p и DLL4. Биоинформационный анализ подтвердил наличие консервативного сайта связывания между miR-486-3p и 3’-UTR DLL4 (Рисунок 3A). Люциферазная активность в группе с DLL4 дикого типа значительно снизилась после сверхэкспрессии miR-486-3p, в то время как в группе с мутантной формой явных изменений не наблюдалось (Рисунок 3B), что доказывает, что DLL4 является прямой мишенью miR-486-3p. В клеточных моделях экспрессия DLL4 снижалась зависимо от времени после обработки LPS (Рисунок 3C). Манипуляции с экспрессией miR-486-3p также оказывали негативное регулирующее воздействие на уровни DLL4 (Рисунок 3D).
В клинических образцах экспрессия DLL4 была ниже у новорожденных с ОРДС, чем в группе здорового контроля, и еще более низкой в группе летальных исходов (Рисунок 3E–F). У пациентов, не выживших после заболевания, наблюдалась отрицательная корреляция между miR-486-3p и DLL4 (r = -0.795, P < 0.001) (Рисунок 3G). Все тесты qPCR для DLL4 проводились в трех технических повторностях, и результаты были стабильными.
DLL4 обращает miR-486-3p-опосредованное повреждение клеток
После проведения протокола ко-трансфекции с использованием мимика miR-486-3p и плазмиды для сверхэкспрессии DLL4 мы провели эксперименты по рекуперации. qPCR подтвердил, что экспрессия DLL4 была эффективно восстановлена после трансфекции OE-DLL4 (Рисунок 4A). Функциональные тесты показали, что сверхэкспрессия DLL4 частично нивелировала ингибирующий эффект miR-486-3p на пролиферацию клеток и ее про-апоптотическое действие (Рисунок 4B,C). Эти результаты указывают на то, что miR-486-3p частично модулирует активность клеток, воздействуя на DLL4.
Доступность данных:
Все данные, полученные или проанализированные в ходе данного исследования, представлены в Дополнительном файле 1.
Рисунок 1: Сравнение показателей LUS и уровня miR-486-3p в сыворотке крови между группами. (A) Уровни miR-486-3p в сыворотке крови здоровых новорожденных и новорожденных с ОРДС. (B) Значения LUS у здоровых новорожденных и новорожденных с ОРДС. (C) Уровни miR-486-3p в сыворотке крови в группе выживших и группе летальных исходов. (D) Значения LUS в группе выживших и группе летальных исходов. (E) Корреляционный анализ между уровнем miR-486-3p в сыворотке и LUS у новорожденных с ОРДС с летальным исходом. (F) ROC-кривые для отдельного LUS, отдельного miR-486-3p и комбинированного определения для прогнозирования исхода неонатального ОРДС. Все количественные данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение; планки погрешностей представляют стандартное отклонение. *** = p <0.001 по сравнению со здоровой группой; ### = p <0.001 по сравнению с группой ОРДС легкой степени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Влияние miR-486-3p на клетки модели ОРДС. (A) Зависимые от времени изменения экспрессии miR-486-3p в HPMECs после обработки LPS. (B) Относительная экспрессия miR-486-3p после гиперэкспрессии и нокдаун-интервенции. (C) Пролиферативная активность клеток, определенная с помощью анализа CCK-8 после изменения экспрессии miR-486-3p. (D) Уровень апоптоза клеток, определенный методом проточной цитометрии после изменения экспрессии miR-486-3p. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение; планки погрешностей обозначают стандартное отклонение. Статистические маркеры: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.
Рисунок 3: Подтверждение связи мишени между miR-486-3p и DLL4. (A) Схематическое изображение прогнозируемого сайта связывания между miR-486-3p и 3’-UTR DLL4. (B) Анализ с использованием двойного люциферазного репортерного гена подтвердил связь мишени между miR-486-3p и DLL4. (C) Динамика экспрессии DLL4 в HPMECs после обработки LPS. (D) Экспрессия DLL4 после гиперэкспрессии или нокдауна miR-486-3p. (E) Уровни DLL4 в сыворотке крови здоровых новорожденных и новорожденных с ОРДС. (F) Уровни DLL4 в группе выживших и группе умерших новорожденных с ОРДС. (G) Корреляционный анализ между уровнями miR-486-3p и DLL4 в сыворотке крови новорожденных с ОРДС, которые не выжили. Все количественные данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение; планки погрешностей представляют стандартное отклонение. Статистические маркеры: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001 по сравнению со здоровой группой, ### = p <0.001 по сравнению с группой с легким ОРДС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Влияние miR-486-3p, нацеленной на DLL4, на клетки модели ОРДС. (A) Определение экспрессии DLL4 после ко-трансфекции мимика miR-486-3p и плазмиды для гиперэкспрессии DLL4. (B) Изменения пролиферативной активности клеток после восстановления экспрессии DLL4. (C) Изменения уровня апоптоза клеток после восстановления экспрессии DLL4. Все данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение; планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению. Статистические маркеры: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Переменная | Здоровые (n=100) | Неонатальный ОРДС (n=112) | p-значение |
| Гестационный возраст (недели) | 36.07 ± 2.71 | 35.72 ± 2.64 | 0.347 |
| Пол (мужской, %) | 59 (59.0 %) | 74 (66.1 %) | 0.29 |
| Масса тела при рождении (кг) | 3.39 ± 0.57 | 3.33 ± 0.55 | 0.437 |
| Возраст матери (лет) | 29.18 ± 4.00 | 29.66 ± 4.05 | 0.387 |
| Способ доставки | 0.439 | ||
| Вагинальный | 54 (54.0 %) | 65 (58.0 %) | |
| Кесарево сечение | 46 (46.0 %) | 47 (42.0 %) | |
| Степени тяжести ОРДС | --- | ||
| I-II | --- | 72 (64.3 %) | |
| III-IV | --- | 40 (35.7 %) |
Таблица 1: Исходные характеристики включенных младенцев. В этой таблице обобщена исходная демографическая информация о здоровых новорожденных и новорожденных с ОРДС. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения для непрерывных переменных и количества (в процентах) для категориальных переменных. Значения P указывают на статистические различия между группами. Сокращения: ОРДС = острый респираторный дистресс-синдром.
| Переменная | Выживаемость (n=84) | Летальный исход (n=28) | pp-значение |
| Гестационный возраст (недели) | 35.95 ± 2.58 | 35.04 ± 2.76 | 0.112 |
| Пол (мужской, %) | 53 (63.1 %) | 21 (75.0%) | 0.253 |
| Масса тела при рождении (кг) | 3.37 ± 0.58 | 3.23 ± 0.42 | 0.248 |
| Возраст матери (лет) | 29.49 ± 3.82 | 30.18 ± 4.74 | 0.438 |
| Способ доставки | 0.444 | ||
| Вагинальный | 47 (56.0 %) | 18 (64.3 %) | |
| Кесарево сечение | 37 (44.0 %) | 10 (35.7 %) | |
| Аномальный объем амниотической жидкости | 6 (9.5 %) | 4 (14.3 %) | 0.485 |
| Степени тяжести ОРДС | 0.001** | ||
| I-II | 61 (72.6 %) | 11 (39.3 %) | |
| III-IV | 23 (27.4 %) | 17 (60.7%) | |
| Этиология | 0.827 | ||
| Подавительная остановка дыхания (поперхивание) | 33 (39.3 %) | 12 (42.9 %) | |
| Пневмония | 17 (20.2 %) | 6 (21.4 %) | |
| Сепсис | 12 (14.3 %) | 2 (7.1 %) | |
| Синдром аспирации мекония | 22 (26.2 %) | 8 (28.6 %) |
Таблица 2: Сравнение клинических данных между группой выживших и группой умерших новорожденных с РДС. В этой таблице приведено сравнение клинических показателей между выжившими и умершими новорожденными с РДС. Непрерывные данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, категориальные данные выражены как количество (процент). Значения p указывают на статистическую значимость различий между двумя группами. ** = p<0.01. Сокращения: ARDS = острый респираторный дистресс-синдром (РДС).
Дополнительный файл 1: Исходные клинические и экспериментальные наборы данных, подтверждающие результаты данного исследования, включая индивидуальные показатели оценки ультразвукового исследования легких (LUS), экспрессии miR-486-3p в сыворотке крови, экспрессии DLL4, а также результаты клеточного анализа.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
Неонатальный ОРДС является основной причиной дыхательной недостаточности и ранней смертности среди тяжелобольных новорожденных15. Ранняя и точная оценка степени тяжести заболевания и прогноза являются необходимым условием для индивидуального подхода к лечению и снижения летальности. Растущий объем данных подтверждает, что микроРНК участвуют в патологическом прогрессировании ОРДС и могут служить перспективными циркулирующими биомаркерами16. Исследования показывают, что уровень miR-155 значительно повышен у пациентов с сепсисом, страдающих острым повреждением легких/ОРДС17. Кроме того, исследования выявили повышение уровней сывороточного miR-629-5p у детей с диагнозом ОРДС18. Сывороточный miR-34a тесно связан со степенью тяжести и прогнозом неонатального РДС19. Новые исследования демонстрируют, что miR-375 является диагностическим и прогностическим биомаркером неонатального ОРДС20. Подобно этим описанным молекулам, сывороточный miR-486-3p может быть стабильно обнаружен в периферической крови с помощью количественной ПЦР и подходит для быстрого скрининга в отделениях интенсивной терапии новорожденных (ОИТН). По сравнению с miR-375 и miR-34a, которые в основном отражают раннее начало заболевания, экспрессия miR-486-3p более тесно коррелирует с тяжестью поражения легких и динамически изменяется по мере прогрессирования повреждения легких. В сочетании с УЗИ легких (LUS) это обеспечивает более высокую прогностическую точность в отношении краткосрочной летальности. Тем не менее, miR-486-3p обладает относительно низкой специфичностью к заболеванию, а соответствующие клинические данные остаются ограниченными по сравнению с данными по общепризнанным биомаркерам miRNA. В совокупности miR-486-3p имеет потенциал служить маркером для вспомогательной диагностики или прогностического определения неонатального ОРДС.
УЗИ легких (LUS) представляет собой отработанный метод прикроватной визуализации, который позволяет оценивать аэрацию легких на основе ультразвуковых характеристик легочной ткани21. В частности, LUS служит эффективным количественным показателем для определения степени альвеолярной вентиляции22. Исследования подтвердили его полезность при оценке как степени тяжести, так и прогноза ОРДС у новорожденных23. В соответствии с предыдущими работами, наше клиническое исследование показало, что показатели LUS у новорожденных с ОРДС были значительно выше, чем у здоровых новорожденных. Кроме того, среди пораженных новорожденных в группе с тяжелым течением заболевания наблюдались заметно более высокие значения LUS, чем в группе с легким течением, что подчеркивает прямую связь между повышенными показателями LUS и степенью тяжести ателектаза, отека легких и консолидации легочной ткани24. Наши результаты также указали на то, что у пациентов, которые в итоге скончались, показатели LUS были значительно выше, чем у выживших. У новорожденных, не выживших после заболевания, наблюдалась сильная положительная корреляция между LUS и уровнем miR-486-3p в сыворотке крови, что дополнительно подтверждает синергетическую ценность этих двух показателей. Каждый метод обладает своими особенностями: LUS не сопровождается радиационным облучением, является портативным и подходит для прикроватного мониторинга в режиме реального времени, однако его интерпретация в значительной степени зависит от опыта оператора и подвержена субъективным ошибкам. Определение miR-486-3p в сыворотке крови дает объективные, воспроизводимые количественные результаты, но не может отражать морфологические изменения в легочной ткани в режиме реального времени. В клинической практике данный комбинированный подход рекомендуется для рутинного использования в отделениях интенсивной терапии новорожденных. Он подходит для ранней стратификации рисков у новорожденных с подозрением на ОРДС или подтвержденным диагнозом, регулярной динамической оценки прогрессирования заболевания и вспомогательного суждения о краткосрочном клиническом прогнозе. Однако этот метод не предназначен для замены окончательных методов визуализации или этиологических исследований; он обладает ограниченной специфичностью при применении к новорожденным с сопутствующими воспалительными заболеваниями легких. Кроме того, поскольку наше исследование проводилось в одном центре, возможность его применения к популяциям из разных регионов еще требует проверки.
Клинически мы наблюдали, что повышенные значения LUS в сочетании с высоким уровнем miR-486-3p в сыворотке крови ассоциировались с неблагоприятным прогнозом при ОРДС у новорожденных, что позволяет предположить, что miR-486-3p может быть тесно связана с тяжелым поражением сосудов легких и нарушением способности к восстановлению сосудов в незрелых легких. Наши эксперименты с клетками in vitro дополнили это клиническое наблюдение, продемонстрировав, что miR-486-3p напрямую модулирует пролиферацию и апоптоз эндотелиальных клеток, которые являются ключевыми процессами, определяющими целостность и восстановление сосудов в легких новорожденных. Кроме того, исследования показали, что микроРНК играют важнейшую роль в различных клеточных процессах25,26. Хорошо известно, что микроРНК воздействуют преимущественно через посттранскрипционную регуляцию целевых генов, что в основном включает сплайсинг микроРНК и репрессию трансляции белков27. Ген DLL4 играет важную роль в развитии сосудов и ангиогенезе28. Исследования указывают на то, что семейство microRNA-30 нацелено на DLL4 для модуляции поведения эндотелиальных клеток в ходе ангиогенеза29. Эти данные свидетельствуют о том, что модуляция DLL4 в эндотелии может быть связана с поражением сосудов легких при ОРДС у новорожденных. В нашем исследовании мы идентифицировали и подтвердили мишеневую взаимосвязь между miR-486-3p и DLL4. Последующий анализ показал, что повышенная экспрессия miR-486-3p значительно подавляла пролиферацию HPMECs, индуцированную LPS, одновременно стимулируя апоптоз. Важно отметить, что экспрессия DLL4 могла частично обратить эффекты, опосредованные miR-486-3p. Это говорит о том, что miR-486-3p воздействует на DLL4, чтобы влиять на функцию HPMECs и регулировать прогрессирование ОРДС у новорожденных. Однако вопрос о том, влияет ли это непосредственно на дисфункцию легочных сосудов и способствует ли развитию ОРДС, требует дальнейшей проверки. Примечательно, что DLL4 лишь частично обратил клеточные изменения, вызванные miR-486-3p. Будучи типичной микроРНК, miR-486-3p модулирует несколько нижележащих генов-мишеней. Будущие исследования будут сосредоточены на выявлении дополнительных генов-мишеней для полного выяснения механизма действия miR-486-3p при ОРДС у новорожденных.
Наконец, следует отметить, что строгая стандартизация ключевых этапов протокола обеспечивает получение надежных и воспроизводимых данных. Мы унифицировали процедуры сбора образцов, внедрили стандартизированные протоколы культивирования и трансфекции клеток, а также включили независимые повторности для минимизации экспериментальной ошибки. Общие операционные проблемы и способы их решения обобщены следующим образом: для оценки LUS стандартизируйте протокол сканирования 12 зон и правила подсчета баллов, а также корректируйте положение новорожденного для получения четких изображений. Для детектирования miRNA в сыворотке избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания, проверяйте чистоту РНК (A260/A280 = 1.8–2.1) и включайте технические повторности. Для клеточных моделей, индуцированных LPS, используйте свежеприготовленный раствор LPS с концентрацией 1 mg/L и стабильные условия культивирования. Оптимизируйте конфлюэнтность клеток и соотношение реагентов при трансфекции, а также заменяйте среду для снижения цитотоксичности. Обеспечьте полный лизис клеток и стандартизированное выполнение этапов для проведения двухлюциферазного анализа.
В целом, по сравнению с традиционными методами, включая визуализацию грудной клетки, анализ газов крови и тестирование на отдельные биомаркеры, комбинированная стратегия LUS/miR-486-3p не сопровождается радиационным облучением, имеет низкую стоимость, проста в исполнении и обладает улучшенной прогностической эффективностью. Она служит надежным дополнительным прогностическим инструментом при ОРДС у новорожденных. В клинической практике данный метод может быть применен для ранней стратификации рисков и динамического мониторинга состояния в отделениях интенсивной терапии для новорожденных. Он также может служить единым индексом оценки для многоцентровых исследований. С точки зрения механизмов, подтвержденная ось miR-486-3p/DLL4 открывает новые направления для изучения патологических механизмов и таргетной терапии. Однако данный комбинированный подход имеет определенные технические ограничения. Результаты LUS варьируются в зависимости от оператора, а miR-486-3p не обладает специфичностью в отношении конкретного воспалительного заболевания легких. Этот метод поддерживает только одномоментное определение и не может заменить окончательную визуализацию или этиологические исследования.
Несмотря на многообещающие результаты, следует обратить внимание на ряд ограничений. Во-первых, дизайн исследования в рамках одного учреждения ограничивает возможность обобщения наших выводов. Во-вторых, отсутствие внешней валидационной когорты не позволило подтвердить надежность прогностической эффективности панели LUS/miR-486-3p. В-третьих, уровень miR-486-3p в сыворотке крови измерялся только в одной временной точке, что не позволило зафиксировать его динамическую связь с прогрессированием заболевания. В-четвертых, отсутствие дополнительных анализов белков, а также валидации in vitro/in vivo ограничивает обоснованность наших выводов о механизмах процесса. Наконец, специфическая роль miR-486-3p в патофизиологии ОРДС у новорожденных остается недостаточно изученной и требует дальнейших исследований. В заключение, повышение показателей LUS и уровня miR-486-3p в сыворотке крови у новорожденных с диагнозом ОРДС служат важными ориентирами в клинической практике. Синергетическая оценка этих двух биомаркеров может способствовать точному прогнозированию как тяжести, так и исхода ОРДС у новорожденных, демонстрируя тем самым определенную клиническую ценность.
Раскрытие информации
Для оптимизации формулировок на английском языке, проверки грамматики и стандартизации оформления использовался сервис Grammarly. Все исследовательские идеи, эксперименты, данные и выводы являются оригинальной работой авторов.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл | Axygen | ПЦР-02-С | |
| 0,25% раствор трипсина-ЭДТА | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | |
| Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл | Axygen | MCT-150-C | |
| Инкубатор для культур клеток с увлажнением и концентрацией CO2 5% | Thermo Fisher | 3111 | |
| Культуральные планшеты на 6 лунок | Corning | 3516 | |
| 96-луночные планшеты для культивирования клеток | Corning | 3599 | |
| Абсолютированный этанол | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Набор для детекции апоптоза Annexin V-FITC | BD Biosciences | 556547 | |
| Настольная центрифуга | Eppendorf | 5810R | |
| Ламинарный шкаф микробиологической безопасности | Thermo Fisher | Серия 1300 A2 | |
| Набор для подсчета клеток CCK-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| Одноразовые стерильные пробирки для забора крови | BD Vacutainer | 367815 | |
| Плазмида для гиперэкспрессии DLL4 (OE-DLL4) | GenePharma | EX-M02151 | |
| Люциферазный репортерный плазмид DLL4-MUT | GenePharma | PGL3-DLL4-MUT | |
| Люциферазная репортерная плазмида DLL4-WT | GenePharma | PGL3-DLL4-WT | |
| Среда DMEM с высоким содержанием глюкозы | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | |
| Набор для проведения двухлюциферазного репортерного анализа | Биолаборатория | BL101A | |
| Считыватель для иммуноферментного анализа (ИФА) | Thermo Fisher | Multiskan FC | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 10099141C | |
| наконечники для дозаторов с фильтром (10 μL, 200 μL, 1000 μL) | Axygen | TF-10-R-S, TF-200-R-S, TF-1000-R-S | |
| Проточный цитометр | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Пробирки для проточной цитометрии | BD Biosciences | 352054 | |
| Высокоскоростная центрифуга с охлаждением | Eppendorf | 5424R | |
| Липополисахарид (ЛПС) из E. coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Система ультразвукового исследования легких | Mindray | M9 | |
| Микрообъемный спектрофотометр | Thermo Fisher | NanoDrop 2000 | |
| Ингибитор miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486-AS | |
| Мимик miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486 | |
| Набор праймеров для кПЦР miR-486-3p | RiboBio | HmiRQP0486 | |
| Ингибитор отрицательного контроля (NC) | RiboBio | HmiR0001-AS | |
| Имитатор отрицательного контроля (NC) | RiboBio | HmiR0001 | |
| Плазмида для негативного контроля сверхэкспрессии (OE-NC) | GenePharma | Отрицательный контроль | |
| Раствор пенициллина-стрептомицина (100×) | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | |
| Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) 1× | Gibco (Thermo Fisher) | 10010023 | |
| Набор дозаторов (10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL) | Eppendorf | Research Plus | |
| Раствор для окрашивания пропидиййодидом (PI) | BD Biosciences | 556463 | |
| Система количественной ПЦР в реальном времени | Applied Biosystems (Thermo Fisher) | 7500 Fast | |
| Вода, не содержащая РНКаз | Invitrogen (Thermo Fisher) | 10977015 | |
| Готовый набор для ОТ-ПЦР (RT-PCR Quick Master Mix) | Toyobo | FSQ-101 | |
| Стерильные одноразовые пипетки | Corning | 4487, 4488, 4489 | |
| Мастер-микс для ПЦР в реальном времени с SYBR Green | Toyobo | QPK-201 | |
| Реагент Trizol | Invitrogen (Thermo Fisher) | 15596026 | |
| Набор праймеров для кПЦР малых ядерных РНК U6 (U6 snRNA) | RiboBio | HmiRQP0001 | |
| Вортекс-миксер | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Ссылки
- Chi M, Mei YB, Feng ZC. A review on neonatal acute respiratory distress syndrome. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2018;20(9):724-728.
- Garcia MJ, Amarelle L, Malacrida L, Briva A. Novel opportunities from bioimaging to understand the trafficking and maturation of intracellular pulmonary surfactant and its role in lung diseases. Front Immunol. 2023;14:1250350.
- Wu H, et al. The value of oxygen index and base excess in predicting the outcome of neonatal acute respiratory distress syndrome. J Pediatr (Rio J). 2021;97(4):409-413.
- Coppola S, et al. Respiratory mechanics, lung recruitability, and gas exchange in pulmonary and extrapulmonary acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 2019;47(6):792-799.
- Bello G, Blanco P. Lung ultrasonography for assessing lung aeration in acute respiratory distress syndrome: a narrative review. J Ultrasound Med. 2019;38(1):27-37.
- Wu HL, et al. Lung ultrasound score for monitoring the withdrawal of extracorporeal membrane oxygenation on neonatal acute respiratory distress syndrome. Heart Lung. 2024;63:9-12.
- King A, Blank D, Bhatia R, Marzbanrad F, Malhotra A. Tools to assess lung aeration in neonates with respiratory distress syndrome. Acta Paediatr. 2020;109(4):667-678.
- Zhu Z, et al. Whole blood microRNA markers are associated with acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Med Exp. 2017;5(1):38.
- Long G, Zhang Q, Yang X, Sun H, Ji C. Diagnostic and predictive significance of serum miR-141-3p in acute respiratory distress syndrome patients with pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 2024;262(3):157-162.
- Liang Y, et al. MiR-124-3p helps to protect against acute respiratory distress syndrome by targeting p65. Biosci Rep. 2020;40(5).
- Najafipour R, et al. Screening for differentially expressed microRNAs in BALF and blood samples of infected COVID-19 ARDS patients by small RNA deep sequencing. J Clin Lab Anal. 2022;36(11):e24672.
- Zhang S, et al. Clinical significance and potential mechanism of hsa_circ_0006892 in acute respiratory distress syndrome complicated with pulmonary fibrosis. Mol Biol Rep. 2024;51(1):1120.
- Yao MY, et al. Long non-coding RNA MALAT1 exacerbates acute respiratory distress syndrome by upregulating ICAM-1 expression via microRNA-150-5p downregulation. Aging (Albany NY). 2020;12(8):6570-6585.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-338-3p is a biomarker in neonatal acute respiratory distress syndrome and has roles in the inflammatory response of ARDS cell models. Acta Med Okayama. 2022;76(6):635-643.
- Shi S, et al. Evaluation of the neonatal sequential organ failure assessment and mortality risk in neonates with respiratory distress syndrome: a retrospective cohort study. Front Pediatr. 2022;10:911444.
- Martucci G, et al. Identification of a circulating miRNA signature to stratify acute respiratory distress syndrome patients. J Pers Med. 2020;11(1).
- Wang ZF, Yang YM, Fan H. Diagnostic value of miR-155 for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome in patients with sepsis. J Int Med Res. 2020;48(7):300060520943070.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-629-5p may serve as a biomarker for pediatric acute respiratory distress syndrome and can regulate the inflammatory response. Pediatr Neonatol. 2024. doi:10.1016/j.pedneo.2024.05.003.
- Li Q, Chen Y, Lin L. Value of serum miR-34a and Ang-1 in severity evaluation and prognosis of neonatal respiratory distress syndrome. Emerg Med Int. 2022;2022:5480026.
- Deng Y, Zhang R, Jiang X. Association of umbilical cord blood miR-375 with neonatal respiratory distress syndrome and adverse neonatal outcomes in premature infants. Acta Biochim Pol. 2022;69(3):605-611.
- Ostras O, Shponka I, Pinton G. Ultrasound imaging of lung disease and its relationship to histopathology: an experimentally validated simulation approach. J Acoust Soc Am. 2023;154(4):2410-2425.
- Soliman RM, et al. Prediction of extubation readiness using lung ultrasound in preterm infants. Pediatr Pulmonol. 2021;56(7):2073-2080.
- Huang L, Ye D, Wang J. Analysis of diagnosing neonatal respiratory distress syndrome with lung ultrasound score. Pak J Med Sci. 2022;38(5):1101-1106.
- Chardoli M, et al. Lung ultrasound in predicting COVID-19 clinical outcomes: a prospective observational study. J Am Coll Emerg Physicians Open. 2021;2(6):e12575.
- Jafari N, Abediankenari S. Role of microRNAs in immunoregulatory functions of epithelial cells. BMC Immunol. 2024;25(1):84.
- Sun LL, Li WD, Lei FR, Li XQ. The regulatory role of microRNAs in angiogenesis-related diseases. J Cell Mol Med. 2018;22(10):4568-4587.
- Hynes C, Kakumani PK. Regulatory role of RNA-binding proteins in microRNA biogenesis. Front Mol Biosci. 2024;11:1374843.
- Chowdhury TA, Li K, Ramchandran R. Lessons learned from a lncRNA odyssey for two genes with vascular functions, DLL4 and TIE1. Vascul Pharmacol. 2019;114:103-109.
- Bridge G, et al. The microRNA-30 family targets DLL4 to modulate endothelial cell behavior during angiogenesis. Blood. 2012;120(25):5063-5072.