Методическая статья

Подготовка образцов костного мозга, фиксированных в формалине и залитых парафином, для пространственной транскриптомики с использованием декальцинации на основе ЭДТА

26 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72474

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

В этой статье

Краткое содержание

Стандартизированный рабочий процесс подготовки образцов костной ткани, фиксированных в формалине и залитых парафином, для пространственной транскриптомики включает этап декальцинации в EDTA в течение 10 дней для сохранения целостности РНК. Ключевые контрольные точки контроля качества помогают определить, соответствуют ли образцы требованиям для последующего анализа пространственной экспрессии генов.

Аннотация

Костный мозг (КМ) представляет собой сложную и динамичную структуру, в которой пространственные взаимосвязи влияют на поведение, сигнализацию и функции клеток. В связи с этим полное понимание динамики клеточных взаимодействий требует применения дополнительных методов пространственного анализа, которые позволяют сохранить и картировать архитектуру клеточных популяций in situ. Несмотря на значительные успехи в технологиях анализа единичных клеток, способствовавшие пониманию транскрипционной гетерогенности здоровой и пораженной патологией ткани КМ, пространственная организация различных типов клеток, специфичные для ниш регуляторные программы и их взаимодействия все еще требуют дальнейшего изучения. Современные достижения в области пространственной транскриптомики позволили проводить объективный анализ экспрессии генов с учетом пространственного контекста в различных тканях, что делает эти технологии дополнительными к методам анализа единичных клеток, в которых отсутствует пространственное разрешение. Хотя пространственная транскриптомика широко применяется для мягких тканей, ее использование в минерализованных тканях, таких как КМ, остается ограниченным из-за сложностей, связанных с обработкой костной ткани. Описанный здесь протокол использовался для подготовки образцов здоровых и пораженных тканей мыши и человека, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE). Для сохранения целостности РНК и обеспечения возможности применения пространственной транскриптомики к образцам трубчатых костей включен 10-дневный этап декальцинации на основе этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA). В данном протоколе описывается подготовка образцов КМ для пространственного транскриптомного анализа, включая обработку, консервацию и секционирование тканей, а также основные этапы оценки качества, такие как проверка целостности срезов, морфологии ткани и качества РНК. Рабочий процесс также поддерживает идентификацию типов клеток и интеграцию с данными транскриптомики единичных клеток для характеристики клеточного состава, определения межклеточных взаимодействий и визуализации пространственного распределения транскрипционно гетерогенных клеток в здоровом и патологическом состояниях. В целом, этот рабочий процесс позволяет подготовить полностью минерализованные здоровые и злокачественные ткани для пространственного транскриптомного анализа с сохранением архитектуры КМ.

Введение

Костный мозг (КМ) представляет собой высокосложный и компартментализированный орган, который служит основным местом гемопоэза и созревания иммунных клеток1,2. Эта гетерогенная ткань состоит из разнообразного набора линий гемопоэтических, мезенхимальных, эндотелиальных и иммунных клеток, которые сосуществуют в высокоспециализированной и организованной трехмерной нише3,4. В этой нише каждая популяция клеток занимает определенные анатомические области, и пространственный контекст играет фундаментальную роль в регуляции поведения, сигналинга и функций клеток4,5. Физическая близость к определенным структурам, таким как трабекулярная кость или сосудистые сети, определяет основные физиологические процессы, включая поддержание состояния покоя гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и ремоделирование кости6,7. Следовательно, это динамичное микроокружение и строго регулируемые взаимодействия между его клеточными и стромальными компонентами формируют регуляторные сети, которые поддерживают гомеостаз и влияют на прогрессирование гематологических злокачественных новообразований8,9,10,11,12,13.

Достижения в области секвенирования РНК единичных клеток (scRNA-seq) революционизировали наше понимание клеточного разнообразия костного мозга (КМ), позволив обнаружить ранее неизвестные подтипы клеток и предсказать их взаимодействия внутри ниши3,10,11,12,14,15,16. Однако транскриптомика единичных клеток, хотя и предоставляет информацию высокого разрешения об отдельных компонентах гемопоэтической ниши, по своей сути ограничена процессом диссоциации ткани, который отделяет клетки от их естественной среды и потенциально изменяет их исходное состояние17, а также отсутствием пространственного контекста, определяющего организацию костной ткани4,18. Эта потеря позиционного контекста делает невозможным точное картирование мест расположения конкретных транскрипционно различных популяций или определение того, как они взаимодействуют с соседними клетками19. Кроме того, плотная костная ткань часто диссоциируется лишь частично, что приводит к недостаточному представлению ключевых клеточных популяций, таких как остеоциты и адипоциты, в наборах данных scRNA-seq и к смещению в представлении гетерогенности ткани20,21. Пространственная транскриптомика позволяет изучать экспрессию генов in situ, в пространственно сохраненных срезах ткани, восстанавливая тем самым контекстную информацию и устраняя ограничения технологий анализа единичных клеток8,19,22,23,24,25,26. Данная технология представляет собой важнейший шаг вперед в этой области, так как она обеспечивает точное пространственное позиционирование и структурную организацию различных клеточных популяций, составляющих КМ, что необходимо для понимания их взаимодействий и функциональных ролей в их естественном микроокружении8,26. Более того, в контексте заболеваний пространственная транскриптомика позволяет исследователям и клиницистам преодолеть разрыв между традиционной патологией и высокопроизводительной геномикой, позволяя накладывать молекулярные данные на морфологические изображения1,8. Технологии пространственной транскриптомики можно разделить на две основные группы: методы на основе секвенирования и методы на основе визуализации17,24. Платформы на основе секвенирования, такие как Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) и открытая платформа Open-ST, фиксируют мРНК на массивах или бусинках с пространственными штрихкодами перед секвенированием следующего поколения. Методы на основе визуализации, включая Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX и Xenium, напрямую визуализируют транскрипты in situ с помощью мультиплексной гибридизации или химии замок-зондов (padlock probe chemistry)27,28. Кроме того, платформы могут быть классифицированы как таргетные или нетаргетные, в зависимости от того, требуют ли они детекции на основе зондов17,24.

Методы пространственной транскриптомики успешно применяются для исследования мягких тканей, таких как мозг, сердце и печень, где получение интактных гистологических срезов является простой задачей29,30,31. Напротив, внедрение пространственной транскриптомики в исследованиях костной ткани значительно более затруднено из-за ее минерализованной структуры, что требует проведения процесса декальцинации32,33 — контролируемого удаления фосфата кальция для размягчения ткани, что делает возможным ее секционирование и последующий гистологический или молекулярный анализ8,20,23,34. Традиционные методы декальцинации, обычно используемые в клинической практике, чаще всего основаны на применении агрессивных кислотных растворов, таких как соляная, азотная, муравьиная или фосфорная кислоты, которые серьезно нарушают целостность RNA и деградируют морфологию клеток35,36. Такая молекулярная деградация снижает соотношение сигнал/шум в пространственных анализах, что часто приводит к неприемлемо низким показателям детекции генов по сравнению с мягкими тканями8,10. Данное ограничение подчеркивает необходимость в стандартизированных протоколах декальцинации, которые надежно сохраняют целостность mRNA в минерализованных образцах для проведения пространственного анализа на основе секвенирования8,20.

В данном протоколе представлен стандартизированный рабочий процесс подготовки образцов костного мозга (КМ), фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE), для пространственной транскриптомики, который ранее применялся Muiños-Lopez et al.8. Рабочий процесс включает 10-дневный этап декальцинации с использованием этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) при контролируемом значении pH. В отличие от агрессивных кислот, EDTA действует как мягкий хелатор, который сохраняет микроскопическую структуру и поддерживает качество нуклеиновых кислот, что обосновывает ее применение в молекулярных исследованиях8,20,33,36,37. В качестве подтверждения концепции протокол был реализован на образцах костной ткани мышиных моделей здоровых животных и животных с множественной миеломой (ММ), а также на образцах КМ человека от здоровых лиц и пациентов с патологиями; в дальнейшем образцы были секвенированы на платформе Visium Spatial Gene Expression38. Рабочий процесс включает стандартизированные процедуры забора тканей из образцов костей человека и мыши, фиксацию, декальцинацию, дегидратацию, заливку парафином и микротомию с последующим комплексным контролем качества, который охватывает оценку целостности срезов, окрашивание гематоксилином и эозином (H&E), оценку качества РНК (DV200) и опциональную иммунофлуоресценцию (ИФ) для верификации типов клеток. Эти подготовительные этапы гарантируют, что только высококачественные срезы будут переданы на последующие этапы пространственной транскриптомики, включая предобработку срезов ткани, конструирование библиотек, секвенирование и последующий контроль качества и анализ данных.

Данная стандартизированная процедура предназначена для подготовки и оценки качества образцов костного мозга человека и мыши для пространственного транскриптомного анализа. Она призвана облегчить исследование нише-специфических регуляторных программ при гематологических и скелетных заболеваниях.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Директивой ЕС 2010/63/EU по охране животных, используемых в научных целях, и были одобрены Комитетом по этике в отношении экспериментов на животных Университета Наварры (Comité de Ética para la Experimentación Animal; протоколы CEEA082-20 и CEEA039-20). Уход за животными, обращение с ними и эвтаназия осуществлялись в соответствии с законодательством Испании с целью минимизации боли и страданий.

Исследование с участием людей было одобрено Комитетом по этике исследований Медицинского факультета Университета Наварры (Comisión de Ética de Investigación, CEI; проекты 2022.100mod1 и 2023.172) и Комитетом по этике исследований Службы здравоохранения Наварры (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1). Все процедуры с участием людей проводились в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации. Персональные данные обрабатывались конфиденциально в соответствии с Органическим законом Испании 3/2018 о защите персональных данных и гарантии цифровых прав, а также Законом Испании 14/2007 о биомедицинских исследованиях.

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный список реагентов и оборудования, использованных в данном исследовании, приведен в Таблица материаловКомплексный экспериментальный протокол реализации пространственной транскриптомики в костных тканях схематически представлен на Рисунок 1 процесс разделен на три операционных этапа: получение образцов, контроль качества (КК) и пространственное транскриптомное профилирование. Получение образцов включает сбор фрагментов костной ткани человека или мыши с последующей фиксацией, декальцинацией с использованием ЭДТА, дегидратацией, заливкой в парафин, а также нарезкой и подготовкой предметных стекол. На этапе КК оценивается гистологическая целостность и сохранность РНК. После валидации срезы костной ткани проходят процедуру пермеабилизации ткани непосредственно на стекле, подготовку библиотек, секвенирование и анализ данных.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема сбора образцов и подготовки костных тканей мыши и человека с использованием EDTA. Бедренные кости мышей и образцы костной ткани человека собирают, фиксируют, декальцинируют в EDTA, дегидратируют, заливают парафином и подвергают секционированию. Качество образцов оценивают с помощью окрашивания H&E и анализа целостности РНК (DV200), после чего проводят предварительную обработку тканей для пространственной транскриптомики, подготовку библиотек, секвенирование и контроль качества данных. Сокращения: BM = костный мозг; DV200 = процент фрагментов РНК длиннее 200 нуклеотидов; EDTA = этилендиаминтетрауксусная кислота; H&E = гематоксилин и эозин; QC = контроль качества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Получение и обработка образцов костной ткани

  1. Сбор костной ткани мышей
    1. Проведите анестезию животных 5% изофлураном и убедитесь в отсутствии рефлексов.
    2. После полного введения в состояние наркоза проведите эвтаназию путем вывиха шейного позвонка в соответствии с требованиями учреждения и нормативными актами.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназию должен проводить обученный персонал; перед началом сбора тканей необходимо подтвердить наступление смерти.
    3. Продезинфицируйте кожу, распылив 70% этанол на спинную поверхность мыши, затем с помощью хирургических ножниц сделайте небольшой разрез, чтобы аккуратно удалить кожу и обнажить задние конечности.
    4. Произведите диссекцию задних конечностей, отрезав их выше тазобедренного сустава, и перенесите их в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл холодного фосфатно-солевого буферного раствора Дульбекко. (ДФБС). Поместите пробирку на лед.
    5. С помощью стерильного пинцета и скальпеля удалите прилегающие мышцы и соединительную ткань.
    6. Перенесите кости в стерильный контейнер объемом 50 мл, предварительно заполненный чистым холодным DPBS, затем поместите контейнер на лед.
    7. Немедленно приступите к фиксации образцов ткани для сохранения ее целостности.
  2. Обращение с образцами костной ткани человека
    1. Поместите трепан-биоптаты костной ткани или хирургические фрагменты кости в стерильные контейнеры объемом 100 мл.
    2. Перенесите фрагменты кости в чистый стерильный контейнер объемом 100 мл, предварительно наполненный холодным DPBS, затем поместите его на лед.
    3. Немедленно приступите к фиксации образцов для сохранения целостности ткани.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Работа с образцами человека должна проводиться в условиях уровня биобезопасности BSL 2.
  3. Фиксация костной ткани
    1. Возьмите контейнер объемом 50 или 100 мл с образцом кости и слейте DPBS.
    2. Промаркируйте пластиковые кассеты и поместите образцы кости в отдельные кассеты. Плотно закройте крышки, чтобы предотвратить потерю ткани в ходе последующей обработки.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: В случае образцов кости мыши помещайте в одну кассету одну кость. В случае образцов кости человека, при необходимости, используйте стерильный скальпель, чтобы разрезать ткань на фрагменты достаточного размера для размещения в стандартных кассетах, и помещайте в каждую кассету по одному фрагменту. Если образцы кости человека слишком твердые для разделения на данном этапе, их можно оставить целыми и перенести в раствор для декальцинации; после декальцинации размягченную ткань можно разрезать на фрагменты соответствующего размера и поместить в промаркированные кассеты.
    3. Добавьте 4% раствор буферизованного формальдегида в соотношении образца к фиксатору 1:20 и инкубируйте образец в течение 24 ч при 4 °C.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Работайте с фиксатором в вытяжном шкафу в связи с его токсичностью и летучестью паров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерной фиксации (>48 ч), что снижает целостность РНК в рабочих процессах с использованием FFPE-образцов39.
  4. Декальцинация минерализованной костной ткани
    1. Слейте формалин и промойте образец кости ультрачистой водой. Прополощите водой, кратковременно перемешайте и слейте жидкость, чтобы удалить остатки формалина.
    2. Приготовьте 0,25 М раствор ЭДТА в ультрачистой воде и доведите значение pH до 6,95.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя в традиционных протоколах декальцинации pH ЭДТА часто доводят до 8,0, в данном рабочем процессе используется ЭДТА с pH приблизительно 6,95 для обеспечения эффективного хелатирования при сохранении морфологии тканей и качества РНК8.
    3. Добавьте раствор ЭДТА в контейнер с образцом кости и инкубируйте в течение 10 дней при 4 °C при осторожном перемешивании.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов тканей мыши обычно достаточно примерно 50 мл раствора ЭДТА. Для образцов костной ткани человека обычно используют около 100 мл. Тем не менее, этот объем может быть скорректирован в зависимости от размера кости для обеспечения полного погружения и эффективного декальцинации.
    4. После 5 Спустя несколько дней декальцинации удалите раствор ЭДТА и замените его таким же объемом свежего ЭДТА, так как со временем хелатирующая способность раствора истощается. Продолжите инкубацию при тех же условиях.
    5. После 10 дней инкубации удалите раствор ЭДТА и оцените полноту декальцинации.
      1. Сделайте небольшой разрез стерильным скальпелем или введите тонкую стерильную иглу в угол или периферическую область ткани, выбирая участок с низкой аналитической значимостью, чтобы избежать повреждения интересующих областей. Поместите кость в стерильную чашку Петри для стабилизации образца во время разрезания или введения иглы. Если ткань легко режется или игла проходит с минимальным сопротивлением, образец считается достаточно декальцинированным.
      2. В случае с бедренными костями мыши осторожно согните кость с помощью пинцета, чтобы оценить ее гибкость, которая является надежным индикатором полного удаления минералов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность этапа декальцинации зависит от размера и толщины образца кости, а также от объема используемого ЭДТА. Если после первоначального периода инкубации кость остается твердой, продолжайте декальцинацию до тех пор, пока ткань не станет достаточно мягкой для легкого разрезания. Чрезмерное продление этого этапа может ухудшить качество ткани и нарушить целостность РНК, поэтому увеличение времени должно быть ограничено минимальным периодом, необходимым для достижения достаточного размягчения.20.
  5. Дегидратация
    1. Промойте образец, добавив ультрачистую воду в контейнер с образцом кости, затем инкубируйте в течение 5 мин при 4 °C при перемешивании.
    2. Слейте воду и замените ее 70%-ным раствором этанола. Инкубируйте в течение 1 ч при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе процесс можно приостановить. Образцы можно хранить в 70% этаноле при 4 °C перед переходом к следующим этапам. Максимальный срок хранения в данном протоколе экспериментально не подтверждался, поэтому пользователям следует руководствоваться стандартными правилами своей лаборатории.
    3. Последовательно обезвоживайте образец в растворах этанола возрастающей концентрации (70%, 80%, 96%; 1 каждый при 4 °C), затем 100% этанолом в течение ночи при 4 °C.
    4. Слейте 100%-й этанол и замените его ксилолом. Инкубируйте в течение 4 ч при комнатной температуре (RT).
    5. Слейте ксилол и поместите кассету с образцом в стакан с расплавленным чистым парафином. Инкубируйте в расплавленном парафине в течение ночи при 60 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии систем вакуумной обработки можно использовать сокращенное время инфильтрации, так как эти устройства обеспечивают более эффективное проникновение парафина.40,41,42.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Все этапы работы с ксилолом и градуированными растворами этанола должны проводиться в вытяжном шкафу для обеспечения надлежащей вентиляции и минимизации воздействия токсичных и легковоспламеняющихся паров.
  6. Заливка парафином
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите поверхности станции для заливки с использованием раствора для деконтаминации РНказ, чтобы предотвратить деградацию РНК.
    1. Включите станцию для заливки и предварительно прогрейте резервуар с парафином, ванну для кассет с парафином, ванну для форм с парафином и подогревающую пластину для форм до 60 °CВключите охлаждающую платформу, чтобы она охладилась перед заливкой образцов.
    2. Дождитесь полного расплавления парафина, и только после этого поместите кассеты с пропитанными парафином образцами в парафиновую ванночку для кассет. Инкубируйте в течение 2 ч, чтобы обеспечить полное удаление ксилола перед заливкой.
    3. Поместите все необходимые формы в ванночку с парафином.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов тканей человека используйте стандартные металлические формы для заливки. Для образцов тканей мыши используйте пластиковые формы для заливки, совместимые с платформой Visium, которые имеют квадратную полость подходящего размера для корректного размещения срезов на предметных стеклах Visium. Поскольку целые кости мыши не помещаются в квадратную полость таких форм, непосредственно перед заливкой разрежьте кости стерильным скальпелем, чтобы получить фрагменты соответствующего размера. В одну форму можно залить один или два фрагмента кости, в зависимости от их размеров.
    4. Нанесите тонкий базовый слой свежего парафина, подав расплавленный парафин из центрального отверстия станции для заливки.
    5. Откройте кассету и осторожно перенесите ткань из кассеты в форму с помощью подогретых пинцетов.
    6. Поместите форму, заполненную парафином, на подогреваемую платформу и, пока парафин остается жидким, с помощью теплых пинцетов ориентируйте ткань в нужной плоскости среза.
    7. Поместите форму на охлажденную поверхность станции для заливки, чтобы кратковременно зафиксировать положение фрагмента кости.
    8. Полностью заполните форму расплавленным парафином из диспенсера, убедившись, что ткань полностью покрыта и в массе не осталось крупных пузырьков воздуха.
    9. Поместите промаркированную кассету сверху на форму так, чтобы она стала основанием парафинового блока.
    10. Перенесите форму с прикрепленной к ней кассетой на охлаждающую пластину станции для заливки. Оставьте парафин до полного затвердевания на 10 мин, пока блок не станет непрозрачным и твердым.
    11. После затвердевания извлеките парафиновый блок из формы и храните его при 4 °C до момента изготовления срезов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе работу можно приостановить. Парафиновый блок можно хранить при 4 °C; однако, по возможности, секционирование тканей и последующий пространственный транскриптомный анализ следует проводить в кратчайшие сроки после заливки, чтобы минимизировать деградацию РНК при хранении43,44.
  7. Срезы и подготовка предметных стекол
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите микротом и водяную баню раствором для деконтаминации РНКаз, чтобы предотвратить деградацию РНК.
    1. Наполните водяную баню дистиллированной водой и предварительно нагрейте ее до 42 °CВключите микротом и установите новое лезвие. Промаркируйте предметные стекла карандашом.
    2. Установите парафиновый блок в держатель для образцов, убедившись, что кассета ориентирована в соответствии с требуемой продольной плоскостью среза.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте пластиковый пакет со льдом. Если из-за размягчения парафина резка затрудняется, поместите пакет со льдом непосредственно на блок, пока тот закреплен в микротоме, и зафиксируйте его резинкой на несколько минут, чтобы парафин затвердел и качество срезов улучшилось.
    3. Установите толщину среза микротома на 20 мкм µm и выполните обрезку.
    4. Установите значение настройки микротома на 5 µmСоберите четыре 5 µm секции в маркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, не содержащую РНКаз. Держите пробирку на сухом льду и храните при температуре -80 °C.
    5. Продолжите серию срезов с шагом 5 мкм µm и поместите ленты с сечениями в водяную баню. Когда срез полностью расправится и станет ровным, без складок, подберите его соответствующим маркированным предметным стеклом.
      1. Через каждые несколько серий срезов (например, каждые 5–10 лент, в зависимости от размера ткани) отбирайте дополнительные 4 из 5 срезов µm секции в новую маркированную пробирку объемом 1,5 мл. Повторяйте эту процедуру до получения трех пробирок объемом 1,5 мл, содержащих по 5 µm разделы
        ПРИМЕЧАНИЕ: если ткань трескается, ломается или не удается получить непрерывный срез, это означает, что образец декальцинирован не полностью и требует дополнительного времени декальцинации. Чтобы восстановить образец, выполните действия по подготовке в обратном порядке до этапа декальцинации. Для этого расплавьте парафиновый блок при 60 °C в течение примерно 2 ч, затем перенесите образец в ксилол (2 ч). Регидрируйте образец, используя серию растворов этанола с понижающейся концентрацией (100%, 96%, 80%, 70%), и затем дистиллированную воду. Поместите регидрированный образец в свежий 0,25 M раствор EDTA (pH 6,95) и, при необходимости, продлите период декальцинации перед переходом к этапам дегидратации, повторной заливки и изготовления срезов. Данную процедуру восстановления следует использовать строго в качестве крайней меры, поскольку обращение процесса фиксации в формалине и заливки в парафин (FFPE) может привести к нарушению целостности РНК.
    6. Поместите предметные стекла в 37 °C в сушильном шкафу в течение ночи для испарения остатков воды, после чего хранить при 4 °C.
    7. Для улучшения адгезии ткани при необходимости просушите стекла в печи в течение 3 ч при 42 °C перед инкубацией в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап обычно не требуется при использовании предметных стекол, перечисленных в Таблица материалов, так как данные предметные стекла обеспечивают сильную адгезию, и ткань обычно остается прочно прикрепленной на протяжении всего процесса обработки. На этом этапе можно сделать остановку. Предметные стекла можно хранить при 4 °C; однако, по возможности, последующий пространственный транскриптомный анализ следует проводить в кратчайшие сроки после заливки в парафин, чтобы минимизировать деградацию РНК при хранении43,44.

2. Оценка качества образца

  1. Оценка качества срезов
    1. Изучите все срезы по очереди под стандартным светлопольным микроскопом (4×–10×). Осмотрите каждый препарат, чтобы убедиться в отсутствии фрагментации срезов, и зафиксируйте качество каждого из них.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте наличие складок, морщин, компрессии или «дребезжания» (chatter marks), что может указывать на проблемы с твердостью парафина, остротой ножа или неполную декальцинацию. Убедитесь, что участки ткани не отсутствуют вследствие отслоения при микротомии или переносе в водяную баню.
    2. Выберите наиболее сохранные срезы для пространственной транскриптомики (наиболее полные, с лучшей морфологией).
    3. Определите последовательные срезы, прилежащие к выбранным, и зарезервируйте их для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и иммунофлуоресценции (IF), чтобы окрашенное изображение максимально соответствовало ткани, которая будет подвергнута секвенированию.
  2. Окрашивание H&E для проверки целостности ткани
    1. Поместите стекла в стеклянную штатив-кассету для окрашивания и инкубируйте их в течение 15 мин при 60 °C.
    2. Перенесите кассету в стеклянные стаканы для окрашивания с ксилолом на 15 мин.
    3. Проведите регидратацию срезов, перемещая кассету через стаканы с 100%, 96%, 80% и 70% этанолом, инкубируя по 5 мин в каждом растворе.
      ​ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Все этапы с использованием ксилола и градиентных растворов этанола должны выполняться внутри вытяжного шкафа для обеспечения надлежащей вентиляции и минимизации воздействия токсичных и легковоспламеняющихся паров.
    4. Промойте стекла в течение 5 мин в стакане, наполненном водой.
    5. Погрузите кассету в гематоксилин на 10 мин, затем промойте под проточной водопроводной водой до тех пор, пока промывочная вода не станет прозрачной.
    6. Погрузите кассету в воду, содержащую пять капель концентрированной соляной кислоты, осторожно перемешивая до появления красноватого оттенка.
    7. Перенесите кассету в воду, насыщенную карбонатом лития, до развития стабильной синей окраски, затем коротко промойте в воде.
    8. Окрасьте срезы в 1% (масс./об.) растворе эозина в течение 5 мин, затем снова промойте в воде.
    9. Дегидратируйте стекла, перемещая кассету через стаканы с водой, 70%, 80%, 96% и 100% этанолом, инкубируя по 5 мин в каждом растворе.
    10. Проведите просветление стекол в ксилоле в течение 15 мин.
    11. Осторожно просушите обратную сторону каждого стекла, нанесите среду для заключения на покровное стекло и закройте срезы. Дайте стеклам высохнуть при RT в течение 24 ч перед визуализацией.
    12. Выполните визуализацию ткани с использованием микроскопа высокого разрешения при 20-кратном увеличении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала выполните окрашивание H&E на прилежащих срезах в качестве этапа контроля качества для оценки пригодности образца для пространственной транскриптомики. После отбора выполните второе окрашивание H&E непосредственно на срезе, предназначенном для пространственной транскриптомики, следуя руководству производителя по подготовке ткани для платформы пространственного анализа экспрессии генов, указанной в Таблице материалов.
  3. Оценка целостности РНК (DV200)
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: Для протокола пространственной экспрессии генов традиционный индекс целостности РНК (RIN) неэффективен, так как пики рибосомальной РНК 18S и 28S обычно отсутствуют в фиксированных тканях. Поэтому метрика DV200, определяемая как процент фрагментов РНК длиной более 200 нуклеотидов, обычно используется как более информативный параметр качества, чем RIN для деградированных клинических образцов. Для Visium v2 компания 10x Genomics рекомендует использовать блоки FFPE со значением DV200 ≥ 30% для обеспечения эффективной гибридизации зондов и оптимальной работы анализа. Выбор тканевых блоков с максимально возможными значениями DV200 помогает предотвратить пропуски при секвенировании и максимизирует чувствительность спотов.
    1. Возьмите пробирки объемом 1,5 мл, содержащие срезы толщиной 5 µm, собранные на этапе микротомии ткани, и поместите их на лед для экстракции РНК.
    2. Экстрагируйте общую РНК. Эта стандартизированная процедура включает депарафинизацию образца, переваривание протеиназой K для разрыва формалиновых сшивок, удаление геномной ДНК путем обработки ДНКазой I и финальное элюирование очищенной РНК в воде, свободной от РНказ.
    3. Оцените целостность РНК с помощью системы на основе капиллярного электрофореза с использованием высокочувствительного анализа РНК. Краткое описание рабочего процесса приведено в Дополнительном файле 142,45,46,47,48.
  4. Опциональная IF для верификации типов клеток
    1. Поместите стекло FFPE в стеклянную штатив-кассету для окрашивания и инкубируйте его в течение 15 мин при 60 °C.
    2. Перенесите кассету в стеклянные стаканы для окрашивания с ксилолом на 15 мин.
    3. Проведите регидратацию среза, перемещая кассету через 100%, 96%, 80% и 70% этанол по 2 мин в каждом, затем 5 мин в воде и 5 мин в PBS-Tween (1x PBS с добавлением 0,1% Tween-20).
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Все этапы с использованием ксилола и этанола должны выполняться внутри вытяжного шкафа.
    4. Выполните демаскировку антигенов в соответствии с рекомендациями производителя первичного антитела, убедившись, что буфер демаскировки, pH и условия нагрева соответствуют паспорту антитела. ПРИМЕЧАНИЕ: В данном рабочем процессе демаскировка антигенов проводится с использованием 10 mM Tris и 1 mM EDTA, pH 9,0, в системе нагрева с использованием кастрюли в течение 30 мин при 95 °C, с последующим охлаждением в течение 20 мин при RT.
    5. Промойте стекло дважды по 10 мин в PBS-Tween.
    6. Нанесите гидрофобный барьер вокруг ткани с помощью гидрофобного маркера и заблокируйте неспецифическое связывание, нанеся 5% BSA в 1x DPBS на срезы ткани минимум на 40 мин при RT в увлажненной камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увлажненная камера подготавливается путем помещения листа фильтровальной бумаги в пластиковый бокс для окрашивания стекол и его тщательного увлажнения дистиллированной водой для поддержания стабильной влажной среды во время инкубации антител.
    7. Приготовьте раствор первичных антител в 1x DPBS в рекомендуемом разведении для каждого антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном рабочем процессе для идентификации эндотелиальных клеток (EC) и мезенхимальных стволовых клеток (MSC) мыши использовались первичные антитела против Emcn (V.7C7) и Cd271 (ME20.4) соответственно, а для идентификации их человеческих аналогов — антитела против CD31 (JC70A) или PRRX1 (поликлональные), согласно протоколу производителя.
    8. Удалите блокирующий раствор, осторожно промокнув край стекла абсорбирующей бумагой для удаления остаточных капель, затем нанесите смесь первичных антител и инкубируйте стекло в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
    9. Промойте стекло дважды по 5 мин в PBS-Tween и приготовьте раствор вторичных антител в разведении, рекомендованном производителем, убедившись, что флуорофоры спектрально совместимы и не перекрываются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном рабочем процессе использовалось вторичное антитело, конъюгированное с Alexa Fluor, в разведении 1:200.
    10. Нанесите смесь вторичных антител и инкубируйте в течение 30 мин при RT в увлажненной камере, защищая от света.
    11. Промойте стекло дважды по 5 мин в PBS-Tween.
    12. Нанесите среду для заключения, содержащую DAPI, в разведении 1:10 (см. Таблицу материалов), приготовленную в растворе PBS–глицерола 1:1, и инкубируйте образец в течение 5 мин.
    13. Закройте срез покровным стеклом и загерметизируйте края лаком для ногтей для предотвращения высыхания.
    14. Визуализируйте окрашенную ткань с помощью мультиспектральной платформы визуализации.

Дополнительный файл 1: Резюме этапов протокола для оценки целостности РНК и рабочего процесса пространственной транскриптомики Visium. В данном дополнительном файле представлено подробное резюме процедурных этапов, выполненных в соответствии с инструкциями производителя. Он включает: (i) анализ High Sensitivity RNA ScreenTape, используемый для оценки целостности РНК (DV200), как описано в этапе 2.3.3 основного протокола, и (ii) обзор рабочего процесса пространственного анализа экспрессии генов Visium CytAssist, охватывающий предварительную обработку ткани, подготовку библиотек и секвенирование (этапы 3.1–3.3 основного протокола).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

3. Пространственная транскриптомика

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте рабочий процесс пространственной транскриптомики, используя платформу и реагенты, перечисленные в Таблице материалов, следуя соответствующим руководствам пользователя42,45,46. В Дополнительном файле 1 обобщены основные этапы предварительной обработки тканей, подготовки библиотек и секвенирования.

  1. Контроль качества данных пространственной транскриптомики
    1. Выполните демультиплексирование данных пространственной транскриптомики, используя стандартный конвейер обработки для наборов данных Visium (см. Список материалов).
    2. Выполните картирование ридов на соответствующий референсный геном Ensembl 105.
      ПРИМЕЧАНИЕ: для образцов человека использовалась сборка GRCh38, для образцов мыши — mm10.
    3. Сгенерируйте отфильтрованные матрицы признак-штрихкод, используя тот же конвейер, и импортируйте их в среду для последующего анализа единичных клеток/пространственного анализа (см. Таблица материалов).
    4. Осмотрите H&Изображения E в интерфейсе визуализации, предоставляемом конвейером пространственной транскриптомики (см. Таблица материалов) и вручную удалить пятна, которые перекрывают область кортикальной кости или костную ткань, в зависимости от набора данных.
    5. Нормализуйте наборы данных с помощью метода стабилизации дисперсии, который обычно применяется в рабочих процессах анализа одноклеточных систем (см. Таблица материалов).

Результаты

Чтобы оценить применимость данного рабочего процесса на основе ЭДТА для разных видов и патологических состояний, протокол был применен к четырем образцам костного мозга: двум бедренным костям мыши и двум образцам кости человека, представляющим здоровое состояние и состояние при множественной миеломе (ММ) (Таблица 1 и Рисунок 1).

Идентификация образцовВидыПолВозрастЗаболевание
YFPcγ1МышьЖенский пол210 днейЗдоровый
mMMМышьСамец314 днейММ
hHBMЧеловекСамец76 летЗдоровый
hMMЧеловекЖенский пол50 летММ

Таблица 1: Образцы костной ткани мышей и человека, включенные в исследование. Для каждого образца указаны вид, пол, возраст и состояние здоровья. Сокращения: hHBM = здоровый костный мозг человека; hMM = множественная миелома человека; mMM = множественная миелома мыши; MM = множественная миелома; YFPcγ1 = мышь здорового контроля.

Образцы, использованные в данном исследовании, были ранее охарактеризованы и описаны в предыдущих публикациях исследовательской группы, в частности в работах Muiños-Lopez et al. и Cenzano et al., за исключением образца мыши MM. Для ранее описанных экземпляров данные и результаты пространственной транскриптомики представлены в этих исследованиях8,10. Следовательно, материал, включенный в настоящую работу, используется для оценки технической пригодности протокола для пространственной транскриптомики, а не для представления новых биологических открытий.

Образцы бедренных костей мышей были получены от генетически модифицированной модели ММ (BIcγ1), которая воспроизводит клинические и иммунологические характеристики пациентов с ММ, а также от соответствующих здоровых мышей контроля (YFPcγ1)8,49. У каждого животного была извлечена одна бедренная кость, очищена и обработана в соответствии со стандартизированным протоколом (Рисунок 2A). Для данных анализов использовали именно бедренные кости, так как они обеспечивают большой объем доступного костного мозга, превосходное качество ниши и простоту воспроизводимой обработки, что делает их подходящими для платформы пространственной транскриптомики на основе секвенирования8,10. Успешная декальцинация бедренной кости мыши контроля была подтверждена макроскопически по заметному увеличению гибкости ткани при ручном манипулировании пинцетом (Рисунок 2B). Впоследствии этот фрагмент кости был эффективно залит в парафин с использованием специализированной формы, совместимой с пространственной транскриптомикой, для сохранения целостности РНК и архитектуры ткани для последующего молекулярного анализа (Рисунок 2C).

Также были проанализированы два образца костного мозга (КМ) человека с различной историей обработки8,10. Образец свежего КМ гематологически здорового человека был получен из хирургических отходов при проведении ортопедической замены тазобедренного сустава в Hospital Universitario de Navarra (Рисунок 2D–F). Чтобы продемонстрировать трансляционную применимость протокола, данный образец обрабатывали так же, как и образцы мышей. В соответствии с результатами, полученными на тканях мышей, успешная декальцинация человеческой кости с помощью EDTA была подтверждена макроскопически по полному размягчению ткани, о чем свидетельствовало легкое проникновение иглы (Рисунок 2E). Декальцинированный фрагмент человеческой кости был успешно залит в парафин с использованием стандартной металлической формы для последующей обработки (Рисунок 2F). Второй человеческий образец представлял собой архивные биопсии КМ из гребня подвздошной кости пациента с множественной миеломой (ММ), хранящиеся в отделении патологии Clínica Universidad de Navarra (CUN). Примечательно, что этот архивный образец с ММ был предварительно декальцинирован с использованием стандартного клинического протокола с применением сильных кислот36. Данный образец обеспечивает качественный контраст с образцами, обработанными EDTA; однако различия в источнике ткани, истории фиксации, условиях хранения и методе декальцинации означают, что наблюдаемые различия не могут быть приписаны исключительно декальцинирующему агенту.

figure-results-1
Рисунок 2: Образцы кости мыши и человека в процессе подготовки с использованием EDTA. (A) Целые контрольные бедренные кости мыши до декальцинации. (B) Декальцинированная контрольная бедренная кость мыши, демонстрирующая повышенную гибкость. (C) Фрагменты контрольной кости мыши, залитые в парафин. (D) Фрагменты здоровой кости человека, полученные в ходе операции на тазобедренном суставе, до декальцинации. (E) Тот же фрагмент после декальцинации EDTA, демонстрирующий проникновение иглы. (F) Декальцинированная с помощью EDTA здоровая кость человека, залитая в парафин. Масштабные отрезки: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Сокращение: EDTA = этилендиаминтетрауксусная кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для анализа общей архитектуры ткани было выполнено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) (Рисунок 3). Более высокая степень сохранности морфологии, наблюдаемая в срезах тканей мыши, может отражать различия в правилах обращения с образцами и их подготовке, а не внутренние видоспецифические особенности. Бедренные кости мышей собирались специально для пространственной транскриптомики и обрабатывались немедленно в виде целых костей, что позволило сохранить их архитектуру (Рисунок 3A, B). Напротив, образцы человека были получены либо из остаточного материала в ходе операции по замене тазобедренного сустава (Рисунок 3C) , либо из диагностических биопсий кости при множественной миеломе (MM) (Рисунок 3D); в обоих случаях преаналитическое качество ткани могло варьироваться. В результате морфологические различия между образцом человека, декальцинированным EDTA, и биопсией при MM, декальцинированной кислотой, незначительны, так как оба человеческих образца уже имеют базовые структурные ограничения, вызванные не только декальцинацией, но и общим процессом обработки тканей (Рисунок 3C, D). Следовательно, для всесторонней оценки качества образцов для пространственной транскриптомики требуется анализ нескольких различных параметров. Во-первых, необходимо тщательно контролировать целостность ткани, поскольку степень сохранности структуры может значительно варьироваться в зависимости от типа образца, а не только от используемой кислоты для декальцинации. Во-вторых, следует оценивать качество РНК, так как условия декальцинации могут влиять на него20,35,36.

figure-results-2
Рисунок 3H&Срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, используемые для оценки качества ткани. Последовательные срезы FFPE соответствуют (A) здоровая контрольная мышь10, (B) мышь с множественной миеломой, (C) здоровая кость человека8,10, и (D) биоптат множественной миеломы человека8Масштабные отрезки = 500 µm. Сокращения: FFPE = фиксированный формалином, залитый парафином; H& E = гематоксилин и эозин; MM = множественная миелома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту фигуру в более крупном масштабе.

Для дополнения гистологического анализа была проведена оценка качества РНК. В то время как окрашивание H&E выявило неоднозначные различия, целостность РНК четко дифференцировала эффекты двух методов декальцинации (Таблица 2). Значения DV200 как для образцов мышей, так и для образца здоровой человеческой кости превысили порог, рекомендуемый для анализов Visium FFPE, что указывает на достаточное распределение длины фрагментов РНК для гибридизации зондов и конструирования библиотек. Образец здоровой мыши YFP имеет показатель DV200 82.55%, а образец здоровой человеческой кости (hHBM) достигает 58%, что значительно выше порога приемлемости 30%, определенного компанией 10x Genomics. Образец мыши с множественной миеломой (mMM) показывает DV200 31.3%, что близко к нижнему пределу приемлемости; это может быть следствием длительного хранения парафинового блока при 4 °C перед срезанием, помимо других факторов, специфичных для образца. Напротив, биоптат множественной миеломы человека (hMM), подвергнутый кислотной декальцинации, демонстрирует DV200 всего 8%, что было связано с заметно более низкой целостностью РНК, даже при менее выраженном морфологическом ухудшении. Таким образом, проведение как структурных, так и молекулярных оценок имеет важное значение для определения пригодности образцов для последующего пространственного анализа.

Идентификация образцовDV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200: процент общего количества фрагментов РНК > 200 нуклеотидов.
2Данный образец был декальцинирован с использованием стандартного клинического протокола с применением сильных кислот.

Таблица 2: Качество РНК исследуемых образцов. DV200 — процент фрагментов РНК длиной более 200 нуклеотидов; значения не менее 30% считались подходящими для последующего пространственного транскриптомного анализа. Сокращения: hHBM = здоровый костный мозг человека; hMM = множественная миелома человека; mMM = множественная миелома мыши.

Также могут быть проведены дополнительные оценки качества. Для дальнейшего подтверждения целостности тканей и сохранности специфических клеточных компартментов после декальцификации ЭДТА было выполнено дополнительное окрашивание методом иммунофлуоресценции (ИФ) на соседних срезах FFPE из тканей мыши и человека. Антитела к эндомуцину (Emcn) и Cd271 использовались для визуализации эндотелиальных (EC) и мезенхимальных клеток (MSC) соответственно в образце мыши с множественной миеломой (MM) (Рисунок 4A). Данное окрашивание показало, что ткани, обработанные ЭДТА, имеют четко выраженные сосудистые структуры с непрерывным окрашиванием на Emcn и сохраненные стромальные сети, что свидетельствует о том, что исследуемые маркеры оставались детектируемыми после обработки. Более того, визуализация с высоким разрешением с использованием автоматизированной мультиспектральной системы визуализации предоставила дополнительные доказательства того, что исследуемые антигены оставались детектируемыми для верификации типов клеток, обеспечивая дополнительный уровень контроля качества перед проведением пространственного транскриптомного анализа. Кроме того, эти результаты наблюдались и в образцах здоровых пожилых людей, в которых экспрессия EC также была определена с помощью антител к CD31, а MSC — с помощью антител к PRRX1 (Paired Related Homeobox 1), что показывает, что исследуемые маркеры ниши оставались идентифицируемыми после декальцификации ЭДТА (Рисунок 4B). Напротив, эти результаты не удалось воспроизвести в биоптатах MM человека, подвергнутых различным протоколам декальцификации на основе кислот. Как упоминалось ранее, целостность РНК в этих образцах была низкой, что ограничивало последующий транскриптомный анализ. Из-за деградированного состояния этих образцов человека их дальнейшее использование было ограничено базовым транскриптомным профилированием8 и иммуногистохимической (ИГХ) оценкой злокачественных плазматических клеток (PC) (Рисунок 4C).

figure-results-3
Рисунок 4: Дополнительная иммунофлуоресценция и иммуногистохимия для верификации типов клеток. (A) Ткань MM мыши, демонстрирующая ядра, меченные DAPI (синий), CD271-положительные MSC (зеленый) и EMCN-положительные EC (красный). (B) Здоровая костная ткань человека, демонстрирующая ядра, меченные DAPI (синий), PRRX1-положительные MSC (зеленый) и CD31-положительные EC (красный)10. (C) Биоптат MM человека, демонстрирующий CD138-положительные злокачественные PC8. Масштабные отрезки: (A) 250 µm (общий вид), 20 µm (совмещенное увеличение) и 50 µm (изображения в одном канале); (B) 500 µm (общий вид) и 20 µm (совмещенные и одноканальные увеличения); (C) 500 µm. Сокращения: DAPI = 4′,6-диамидино-2-фенилиндол; EC = эндотелиальная клетка; MM = множественная миелома; MSC = мезенхимальная стромальная клетка; PC = плазматическая клетка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В совокупности морфология ткани и результаты DV200 подтверждают пригодность образцов, обработанных ЭДТА, для последующего анализа пространственной транскриптомики. Применение данного рабочего процесса подготовки для пространственной транскриптомики было описано ранее8,10.

Обсуждение

Благодаря интеграции контролируемой декальцинации на основе EDTA, стандартизированной обработки FFPE-блоков и строгих контрольных точек контроля качества, данный протокол преодолевает многие ограничения, традиционно связанные с подготовкой костной ткани для пространственной транскриптомики, в частности те, которые касаются деградации РНК и морфологических повреждений, вызванных методами декальцинации на основе сильных кислот8,10,20,33,36. Самым критическим этапом обработки минерализованных образцов для пространственной транскриптомики является декальцинация. Недостаточная декальцинация приводит к тому, что кость остается слишком жесткой для микротомии, что делает физически невозможным получение высококачественных срезов для пространственной транскриптомики8,20,23,37,50. Если костная ткань остается слишком твердой, она крошится или вибрирует при контакте с лезвием микротома, что приводит к разрывам срезов или появлению пустот, которые неточно отражают нативную архитектуру костного мозга. Важно отметить, что успех декальцинации невозможно полностью подтвердить до этапа микротомии: даже образцы, которые кажутся размягченными, могут содержать остаточные минералы, которые обнаруживаются только при попытке изготовления тонких FFPE-срезов. По этой причине тщательный мониторинг процесса декальцинации имеет важное значение для обеспечения воспроизводимых результатов.

В данном рабочем процессе используется 0.25 M EDTA при pH 6.95 в течение 10 дней при постоянном перемешивании и замене раствора на пятый день8,10. В ходе разработки протокола оценивались EDTA в чистом виде, EDTA с добавлением поливинилпирролидона и 10% муравьиная кислота, а также различные сроки декальцинации и графики замены раствора; сравнительные данные здесь не представлены. Сроки менее 10 дней часто приводили к разрыву тканей при изготовлении срезов образцов мышей, в то время как поведение образцов человека зависело от конкретного образца. Таким образом, для бедренных костей мышей используется 10-дневный период, тогда как образцы человека могут потребовать более длительной декальцинации в зависимости от плотности и содержания трабекул. Перед заливкой в парафин следует использовать контрольные точки физического контроля качества. Если в процессе микротомии обнаружится недостаточная декальцинация, используйте процедуру повторной обработки только в качестве крайней меры спасения, так как дополнительный нагрев, воздействие растворителя и регидратация могут ухудшить качество RNA.

Основным ограничением данного метода является длительное время обработки, что резко контрастирует с быстрыми протоколами на основе кислот, обычно используемыми в клинической патологии20,36. Хотя более длительное время обработки в целом допустимо в исследовательских условиях, недавние работы, такие как протокол, описанный Miao et al., в котором для декальцинации в течение 24 h используется раствор Морса (22.5% муравьиной кислоты и 10% цитрата натрия), подчеркивают растущий интерес к ускорению подготовки костной ткани для пространственного анализа20. Однако методы на основе кислот исторически несут гораздо более высокий риск деградации РНК, что снижает значения DV200 и, в конечном счете, ограничивает их совместимость с пространственной транскриптомикой1,8,35,36. Данный подход на основе ЭДТА отдает приоритет сохранению РНК, а не скорости, обеспечивая совместимость с пространственными платформами на основе секвенирования, такими как Visium.

Потенциальным ограничением пространственной транскриптомики костного мозга является высокая концентрация транскриптов иммуноглобулинов, происходящих от плазматических клеток, что может затруднить обнаружение малопредставленных генов. По аналогии со стратегиями контроля качества и фильтрации, применявшимися в предыдущем исследовании данной группы, которые включали удаление низкокачественных спотов (<200 UMIs и <150 обнаруженных генов), фильтрацию малозначимых типов клеток (<20% на спот) при анализе деконволюции и отбор маркерных генов, обнаруженных в наборах данных пространственной транскриптомики, транскрипты иммуноглобулинов также могут быть отфильтрованы вычислительными методами в ходе последующего анализа для минимизации их влияния, если это уместно8. Таргетные подходы к пространственной транскриптомике могут дополнительно улучшить обнаружение малопредставленных транскриптов в конкретных приложениях.

Потенциальные области применения данного метода обширны. Недавняя интеграция пространственных данных и данных секвенирования единичных клеток выявила специализированные остеогенные ниши человека и сложные градиенты сигнальных молекул, исходящие от трабекулярной кости3,26. Более того, пространственная транскриптомика показала, что старение перестраивает микроокружение костного мозга (КМ), изменяя пространственную организацию и взаимодействие эндотелиальных клеток (ЭК), что приводит к нарушению остеогенной поддержки и возникновению воспалительных сигнальных сетей в стареющей нише10. Мультиомикное профилирование также позволило выявить отдельные микроокружающие области, такие как артерио-эндостеальные зоны, поддерживающие ранний миелопоэз, и пери-адипоцитарные зоны, обогащенные гемопоэтическими стволовыми клетками и клетками-предшественниками3. В контексте множественной миеломы (ММ) данный протокол позволяет интегрировать пространственные и одноклеточные транскриптомные подходы для характеристики состава пораженного КМ мыши и межклеточных взаимодействий. Предыдущие работы выявили пространственно разделенное распределение злокачественных плазматических клеток (ПК) и идентифицировали иммунные и воспалительные программы, такие как NETоз и сигналинг IL-17, которые были обратно пропорциональны регионам, обогащенным опухолью. Кроме того, увеличение плотности злокачественных ПК коррелировало с переходом Т-клеток из эффекторного состояния в состояние истощения. Эти результаты были также подтверждены на образцах КМ человека, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE), что демонстрирует их трансляционную значимость при различной степени выраженности заболевания8. В конечном итоге, данный рабочий процесс подготовки образцов обеспечивает техническую основу для изучения сложных клеточных взаимодействий внутри минерализованной архитектуры КМ.

Платформы пространственной экспрессии генов с высоким разрешением позволяют проводить профилирование всего транскриптома с разрешением, близким к одноклеточному38,51,52. Эти подходы могут расширить применение данного протокола подготовки образцов для анализа пространственно организованного костного мозга и гематологических злокачественных новообразований с более высоким разрешением. Таким образом, данный рабочий процесс закладывает техническую основу для будущих исследований физиологического и злокачественного гемопоэза.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Патент на ноу-хау и экспериментальное использование мышиных моделей множественной миеломы MIcγ1 был лицензирован компании MIMO Biosciences (заявка № PCT/EP2023/071025).

Благодарности

Данная работа была поддержана Instituto de Salud Carlos III и софинансирована ERDF A way of making Europe (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) и RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011; Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC и AIRC в рамках программы Accelerator Award; The International Myeloma Foundation (Brian van Novis) и The Paula and Rodger Riney Foundation (грант FP). IAC поддерживался грантом Мари Кюри (H2020- MSCA-IF-837491) Европейской комиссии, грантом AECC Talent (INVES258003CALV) и Departamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03). MC поддерживался стипендией FPU (FPU22/03283) от Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Мы хотели бы поблагодарить сотрудников Лаборатории передовой геномики (Advanced Genomics Laboratory) и Вивария (Animal Facility) CIMA Universidad de Navarra за их неоценимую техническую и интеллектуальную помощь. Мы также выражаем признательность отделениям патоморфологии Clínica Universidad de Navarra (CUN) и Hospital Universitario de Navarra за предоставление образцов костного мозга (BM) и за выдающееся сотрудничество. Особая благодарность выражается Хосе Анхелю Мартинесу-Клименту и Марте Ларрайос за их мышиные модели множественной миеломы (MM). Благодарим Патчи Сан Мартин-Уриса, Танию Лопес и Эдуардо Лареки за отличную поддержку в оптимизации технологий, разработке протоколов и решении проблем при подготовке образцов костного мозга мышей и человека для пространственной транскриптомики. Мы также благодарим Бената Арисету и Асьера Уллате за всю их вычислительную работу по пространственной транскриптомике. Наконец, мы глубоко признательны пациентам и здоровым донорам, которые щедро приняли участие в этом исследовании.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пробирки 1,5 mLEppendorf15625367
Стерильный контейнер 100 mL deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991AСистема на основе капиллярного электрофореза–для оценки целостности РНК
Стерильный контейнер 50 mL IberoMedREOR001
Пробирка 50 mL FALCON352070
Advanced PAP PenTed Pella 22309Z377821-1EAМаркер для создания гидрофобного барьера 
Антитело к PRRX1, полученное в кроликеSigma-AldrichHPA051084
BSA (бычий сывороточный альбумин)Sigma-AldrichA9418-50G
Кассеты KartellLABWARE2921
Моноклональное антитело к CD271 (рецептор NGF) (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, антитело к эндотелиальным клеткам (концентрат), клон JC70AAligent DakoM0823
Покрывные стеклаFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (монтирующая среда VECTASHIELD Antifade с DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
Раствор для депарафинизацииQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APФосфатно-солевой буфер (DPBS, 1×), формула Дульбекко, без кальция, без магния, Thermo Scientific Chemicals
Среда для заключения срезов DPX для гистологииSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,5 M раствор, для молекулярной биологии, сверхчистый
Станция для заливки Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Антитело к Emcn (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Референсный геном Ensembl (GRCh38 / mm10, выпуск 105)EMBL-EBIN/AРеференсный геном, использованный для выравнивания чтений.
ЭозинMillipore SigmaHT110116
ЭтанолMillipore SigmaE7023-500MLХирургические ножницы
Гистологическая водяная баня Falc Instruments B-IFalc610.1030.00
Формалин 4% PanReac AppliChem2524311315Формальдегид 3,7%–4,0% масс./об., буферизированный до pH = 7 и стабилизированный метанолом (CE-IVD) для клинической диагностики
Стойка для окрашивания предметных стекол WHEATONZ710970-3EA
Стеклянные стаканы для окрашивания BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
ГлицеринSigma-AldrichC3H803
Козьи вторичные антитела против IgG мыши (H+L), кросс-адсорбированные, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Козьи вторичные антитела против IgG мыши (H+L), высоко кросс-адсорбированные, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Козьи вторичные антитела против IgG кролика (H+L), высоко кросс-адсорбированные, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Гематоксилин Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Оценка целостности РНК
High Sensitivity RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5581Оценка целостности РНК
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580Оценка целостности РНК
Микроскоп высокого разрешения Leica BiosystemsN/AСканер Aperio CS2
Соляная кислота (0,1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Платформа Illumina NextSeq 2000Illumina20038897
Козьи вторичные антитела Invitroge против IgG крысы (H+L), кросс-адсорбированные, Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
Ирисные ножницы - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Изофлуран
Карбонат лития Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/AПрограммное обеспечение, используемое для визуализации изображений Г&Э и курирования спотов Visium; открывает файлы .cloupe, созданные конвейером анализа.
Металлические формы для заливкиBio-Optica07-BM24256
Предметные стеклаavantor631-0108Предметные стекла Superfrost Plus
Лезвия для микротомаFEATHERFEAT207500006_U
Микротом HM 340EEprediaN/AМодель HM 340E
ИглаBD301156Игла BD Microlanc 3 Needle 21 G 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Световой микроскоп в светлом поле
Парафин PanReac AppliChem256993Парафин T.пл. 55–58°C пластифицированный + гранулы DMSO (CE-IVD) для клинической диагностики
Чашка Петри CorningCLS430167-100EA
Пластиковые формы для заливки Bio-Optica07-MP7070
Пинцет Поттса-СмитаF.S.T 11012-18Пинцет
Флуориметр Qubit 3.0Invotrogen Q33216
Пробирки для анализа QubitInvotrogen Q32856
Набор для анализа Qubit RNA HS Assay KitInvotrogen Q32855
Микроцентрифужная пробирка 1,5 mL, без РНКазThermo Scientific AM12400
Вода, свободная от РНКаз MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780Раствор для деконтаминации
Набор RNeasy FFPE Kit (50)Qiagen73504Экстракция общей РНК
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/AМетод стабилизирующей дисперсию нормализации, реализованный в Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/AR-пакет, используемый для анализа одноклеточной и пространственной транскриптомики.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/AПрограммное обеспечение, используемое для демультиплексирования, выравнивания и создания матриц признак-штрихкод для наборов данных Visium.
Скальпель Stlime Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/AR-пакет, используемый для визуализации и интеграции пространственной транскриптомики.
Лезвие хирургического скальпеля №23Swann-Morton210Лезвия хирургических скальпелей
Термоциклер Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455Платформа для мультиспектральной визуализации для ИФ
Набор аксессуаров Visium 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Набор зондов для транскриптома человека Visium Human Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Набор зондов для транскриптома мыши Visium Mouse Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Набор предметных стекол для пространственной экспрессии генов Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
КсилолPanreac214736Ксилол, смесь изомеров для анализа, ACS, ISO

Ссылки

  1. Cooper RA, et al. Spatial transcriptomic approaches for characterising the bone marrow landscape: pitfalls and potential. Leukemia. 2025;39(2):291-295.
  2. Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity. Nat Rev Immunol. 2012;12(1):49-60.
  3. Bandyopadhyay S, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. 2024;187(12):3120-3140.e29.
  4. Tikhonova AN, et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019;569(7755):222-228.
  5. Baccin C, et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 2020;22(1):38-48.
  6. Kunisaki Y, et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 2013;502(7473):637-643.
  7. Kusumbe AP, Ramasamy SK, Adams RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014;507(7492):323-328.
  8. Muiños-Lopez E, et al. Characterization of the bone marrow architecture of multiple myeloma using spatial transcriptomics. Commun Biol. 2025;8(1):1620.
  9. Gui G, et al. Single-cell spatial transcriptomics reveals immunotherapy-driven bone marrow niche remodeling in AML. Sci Adv. 2025;11(28):eadw4871.
  10. Cenzano I, et al. Single-cell profiling reveals RAB13+ endothelial cells and profibrotic mesenchymal cells in aged human bone marrow. Aging Cell. 2026;25(4):e70475.
  11. de Jong MME, et al. The multiple myeloma microenvironment is defined by an inflammatory stromal cell landscape. Nat Immunol. 2021;22(6):769-780.
  12. de Jong MME, et al. An IL-1β-driven neutrophil–stromal cell axis fosters a BAFF-rich protumor microenvironment in individuals with multiple myeloma. Nat Immunol. 2024;25(5):820-833.
  13. Cenzano I, et al. Stromal and endothelial transcriptional changes during progression from MGUS to myeloma and after treatment response. Nat Commun. 2026;17:74389.
  14. Ye J, et al. Deconvolution of the hematopoietic stem cell microenvironment reveals a high degree of specialization and conservation. iScience. 2022;25(5):104225.
  15. Chen L, et al. An inflammatory T-cell-stromal axis contributes to hematopoietic stem/progenitor cell failure and clonal evolution in human myelodysplastic syndrome. Nat Commun. 2025;16(1):10041.
  16. Prummel KD, et al. Inflammatory stromal and T cells mediate human bone marrow niche remodeling in clonal hematopoiesis and myelodysplasia. Nat Commun. 2025;16(1):10042.
  17. De Jonghe J, et al. scTrends: A living review of commercial single-cell and spatial 'omic technologies. Cell Genom. 2024;4(12):100723.
  18. van den Brink SC, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017;14(10):935-936.
  19. Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially resolved transcriptomes—next generation tools for tissue exploration. Bioessays. 2020;42(10):1900221.
  20. Miao J, et al. A practical protocol of processing mineralized tissue for Visium spatial transcriptomics. Mechanobiol Med. 2025;3(4):100163.
  21. Baldwin M, et al. A roadmap for delivering a human musculoskeletal cell atlas. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(11):738-752.
  22. Duan H, Cheng T, Cheng H. Spatially resolved transcriptomics: advances and applications. Blood Sci. 2023;5(1):1-12.
  23. Xiao X, et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 2023;11(1):59.
  24. Jain S, Eadon MT. Spatial transcriptomics in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2024;20(10):659-671.
  25. Tilburg J, et al. Spatial transcriptomics of murine bone marrow megakaryocytes at single-cell resolution. Res Pract Thromb Haemost. 2023;7(4):100158.
  26. Lin W, et al. Mapping the spatial atlas of the human bone tissue integrating spatial and single-cell transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2025;53(2):gkae1298.
  27. Marx V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 2021;18(1):9-14.
  28. Yue L, et al. A guidebook of spatial transcriptomic technologies, data resources and analysis approaches. Comput Struct Biotechnol J. 2023;21:940-955.
  29. Joglekar A, et al. A spatially resolved brain region- and cell type-specific isoform atlas of the postnatal mouse brain. Nat Commun. 2021;12(1):463.
  30. Madissoon E, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023;55(1):66-77.
  31. Wang F, et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023;9(24):eadf5464.
  32. Robinson MH, et al. Regulation of antigen-specific T cell infiltration and spatial architecture in multiple myeloma and premalignancy. J Clin Invest. 2023;133(15):e167303.
  33. Wehrle E, et al. Protocol for preparing formalin-fixed paraffin-embedded musculoskeletal tissue samples from mice for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 2024;5(2):103089.
  34. Sangeetha R, Uma K, Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J Oral Maxillofac Pathol. 2013;17(3):386-391.
  35. Yip RKH, et al. Profiling the spatial architecture of multiple myeloma in human bone marrow trephine biopsy specimens with spatial transcriptomics. Blood. 2025;146(15):1837-1849.
  36. Miquelestorena-Standley E, et al. Effect of decalcification protocols on immunohistochemistry and molecular analyses of bone samples. Mod Pathol. 2020;33(8):1505-1517.
  37. Ambrosi TH, et al. Human skeletal development and regeneration are shaped by functional diversity of stem cells across skeletal sites. Cell Stem Cell. 2025;32(5):811-823.e11.
  38. 10x Genomics. Visium Spatial Platform. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/platforms/visium#assays
  39. Amemiya K, et al. Influence of formalin fixation duration on RNA quality and quantity from formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissues. Pathol Int. 2023;73(12):593-600.
  40. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002;161(6):1961-1971.
  41. Nam SK, et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 2014;48(1):36-42.
  42. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000407, Revision E. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-ffpe/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe-user-guide
  43. Eccher A, et al. Pathology laboratory archives: conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 2024;14(4):333.
  44. Bai Z, et al. Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Cell. 2024;187(23):6760-6779.e24.
  45. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE—Tissue Preparation Guide. Document CG000518, Revision D. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/tissue-prep/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-for-ffpe-tissue-preparation-guide
  46. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000495, Revision G. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026. Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/library-construction/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe
  47. Agilent Technologies. High Sensitivity RNA ScreenTape assay for TapeStation systems quick guide. Version A.01.05. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/HS-RNA_QuickGuide.pdf
  48. Agilent Technologies. Agilent 4200 TapeStation system—System manual. Publication G2991-90000, Version A.02.02. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://download.chem.agilent.com/software/4200_tapestation_user_info_package_v2/tapestation%20user%20information/tapestation%20manuals/agilent%204200%20tapestation%20system%20manual_g2991-90000.pdf
  49. Larrayoz M, et al. Preclinical models for prediction of immunotherapy outcomes and immune evasion mechanisms in genetically heterogeneous multiple myeloma. Nat Med. 2023;29(3):632-645.
  50. Wang S. Resolving the bone – optimizing decalcification in spatial transcriptomics and molecular pathology. J Histotechnol. 2025;48(1):68-77.
  51. Oliveira MF, et al. High-definition spatial transcriptomic profiling of immune cell populations in colorectal cancer. Nat Genet. 2025;57(6):1512-1523.
  52. Bourgain-Chang E, Kuang X, Cang Z, Nie Q. Reconstructing single-cell resolution from spatial transcriptomics with CellRefiner. Nat Commun. 2026;17(1):3304.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FFPE
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи