В данном протоколе демонстрируется оценка модифицированного состава Xiaoyao San на мышиной модели депрессии, вызванной хроническим непредсказуемым легким стрессом, включая поведенческий, гистологический и молекулярный анализ некроптоза нейронов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Модифицированный препарат Сяояо-сань облегчает депрессивно-подобное поведение и некроптоз нейронов на мышиной модели хронического непредсказуемого легкого стресса
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Потеря и повреждение нейронов являются важными патологическими признаками депрессии, и в качестве потенциального механизма гибели нейронных клеток был предложен некроптоз. Анализ наборов данных Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE54565, GSE54566 и GSE54568) выявил связь между депрессией и некроптозом, что позволяет предположить, что ингибирование этого пути может стать потенциальной терапевтической стратегией. Модифицированный Xiaoyao San (MXYS), измененный состав традиционного средства китайской медицины Xiaoyao San, был разработан путем добавления трав, обладающих жаропонижающим, охлаждающим кровь, когнитивно-стимулирующим и восстанавливающим действием для повышения терапевтической эффективности. Однако его влияние на некроптоз нейронов и активные компоненты, достигающие тканей мозга, остаются неясными. Для предварительной идентификации компонентов MXYS, обнаруженных в тканях мозга, использовалась ультравысокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (UHPLC-HRMS). Терапевтическая эффективность оценивалась на мышиной модели депрессии при хроническом непредсказуемом мягком стрессе (CUMS) с использованием поведенческих тестов, гистологического исследования, иммунофлуоресценции, вестерн-блоттинга и биоинформатического анализа. Введение MXYS было связано с улучшением поведения, напоминающего депрессивное, ослаблением патологического повреждения мозга и снижением фосфорилирования рецептор-взаимодействующей протеинкиназы 3 (RIPK3) и белка с киназным доменом смешанного происхождения (MLKL). Эти результаты свидетельствуют о том, что MXYS оказывает антидепрессивное действие, которое связано со снижением маркеров некроптоза нейронов, что дает экспериментальное обоснование для дальнейшего исследования MXYS как потенциальной терапевтической стратегии лечения депрессии.
Введение
Депрессия, тяжелое психическое расстройство в спектре аффективных расстройств, характеризуется прежде всего стойким сниженным настроением и находится под влиянием множества факторов1. Клинически пациенты с депрессией обычно проявляют такие симптомы, как подавленное настроение, когнитивное замедление, снижение вербального общения и физической активности, а в тяжелых случаях — самоповреждающее поведение и суицидальные идеи2. Из-за высокой распространенности, частоты рецидивов, инвалидизации и показателей самоубийств депрессия является одной из основных причин инвалидности во всем мире и создает значительное социальное и экономическое бремя3. По данным Всемирной организации здравоохранения, прогнозируется, что к 2030 году депрессия станет основным фактором глобального бремени болезней, опередив рак, а также сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания3. Кроме того, пандемия коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) была связана с увеличением глобальной распространенности большого депрессивного расстройства на 27,6%4. В Китае ежегодная распространенность депрессии составляет 3,6%, а пожизненная распространенность — 6,8%5. Патогенез депрессии остается изученным не полностью из-за ее сложной этиологии и множества способствующих факторов. Вследствие этого варианты лечения остаются ограниченными, и примерно у 30%–40% пациентов развивается терапевтически резистентная депрессия из-за недостаточного ответа на доступные в настоящее время антидепрессанты6. Кроме того, отсроченное начало действия, остаточные симптомы, нейротоксичность и побочные эффекты, связанные с существующими антидепрессантами, продолжают создавать значительные терапевтические трудности7.
Программируемая гибель клеток давно является основным направлением биомедицинских исследований. Растущее число данных свидетельствует о том, что депрессия связана с некроптозом8,9,10,11. Некроптоз, как и апоптоз, представляет собой форму программируемой гибели клеток; однако, в отличие от апоптоза, он вызывает выраженные иммунные и воспалительные реакции12. При отсутствии активности каспазы-8 фактор некроза опухоли-α (TNF-α) связывается с рецептором 1 фактора некроза опухоли (TNFR1), что приводит к активации рецептор-взаимодействующей протеинкиназы 1 (RIPK1)13. Активированная RIPK1 взаимодействует с рецептор-взаимодействующей протеинкиназой 3 (RIPK3) с образованием некросомального комплекса, который впоследствии активирует белок с доменом, подобным киназе смешанной линии (MLKL)14. После олигомеризации MLKL перемещается из цитоплазмы к плазматической мембране, вызывая набухание органелл15,16, нарушение целостности клеточной мембраны и выход внутриклеточного содержимого, включая молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением (DAMPs), и воспалительные медиаторы, такие как TNF-α, интерлейкин (IL)-1 и IL-6, что усиливает воспалительные реакции17. Некроптоз implicated во многих воспалительных и нейродегенеративных заболеваниях, включая рассеянный склероз, депрессию, боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера18,19,20. Протеомный анализ показал, что депрессия, индуцированная хроническим непредсказуемым легким стрессом (CUMS), связана с повышенной экспрессией RIPK3 и MLKL и активацией пути некроптоза2. В другой мышиной модели депрессии, вызванной CUMS, флуоксетин проявлял антидепрессивные эффекты, которые были связаны с ингибированием RIPK1-опосредованного некроптоза10. Кроме того, было показано, что Nec-1s, ингибитор некроптоза, облегчает депрессивно-подобное поведение, индуцированное липополисахаридом (LPS)21. Поскольку повреждение нейронов является важным патологическим признаком депрессии, воздействие на некроптоз может представлять собой перспективную терапевтическую стратегию лечения депрессии.
Традиционная китайская медицина (ТКМ) имеет многолетнюю историю лечения депрессии. Согласно теории ТКМ, печень управляет свободным током ци; следовательно, депрессия в основном приписывается эмоциональному стрессу, приводящему к стагнации ци печени. Соответственно, основной терапевтической стратегией является успокоение печени и облегчение депрессии. Сяояо Сань (XYS) — это классический травяной рецепт, широко используемый для этой цели, и обширные данные подтверждают его применение при лечении депрессии22. Кроме того, сообщалось, что XYS обладает антинекроптотическими свойствами23,24. Основываясь на концепциях ТКМ о «превращении депрессии печени в огонь» и «восхождении чистого ян в мозг», состав XYS был модифицирован путем добавления коры мутанга (Mudan Pi) и плодов гардении (Zhizi) для очистки тепла и охлаждения крови, а также корневища акора татаринова (Shi Changpu) и корня полигалы (Yuan Zhi) для улучшения когнитивных функций и восстановления. Полуленный состав был назван модифицированным Сяояо Сань (MXYS) и был разработан для обеспечения усиленного терапевтического эффекта на основе принципов ТКМ. Однако в данном исследовании прямое сравнение с оригинальным составом XYS не проводилось25. Клинические исследования продемонстрировали антидепрессивную эффективность MXYS26,27,28, и его терапевтические эффекты могут быть связаны с регуляцией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (ГГН) оси и подавлением нейровоспаления29,30,31. Тем не менее, остается неясным, связан ли MXYS со снижением некроптоза нейронов.
В настоящем исследовании ультравысокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (UHPLC-HRMS) была использована для предварительной идентификации соединений, производных от MXYS, обнаруженных в тканях головного мозга. Общедоступные наборы данных Gene Expression Omnibus (GEO) и биоинформатический анализ, включая анализ взвешенных сетей коэкспрессии генов (WGCNA), анализ дифференциальной экспрессии и анализ обогащения, были использованы для изучения взаимосвязей между MXYS, депрессией и некроптозом. На основании этих данных мы выдвинули гипотезу о том, что MXYS может оказывать антидепрессивное действие, связанное со снижением маркеров некроптоза нейронов, при этом путь активационного фактора транскрипции 4 (ATF4)/белка связывающего cAMP-элемент ответа (CREB)/нейротрофического фактора мозга (BDNF) представляет собой потенциальный корреляционный механизм. Для проверки этой гипотезы с помощью UHPLC-HRMS была проведена предварительная идентификация соединений, обнаруженных в тканях мозга, выполнен биоинформатический анализ для определения потенциальных терапевтических мишеней, а также проведены эксперименты in vivo, чтобы выяснить, связана ли терапия MXYS с изменениями маркеров некроптоза и пути ATF4/CREB/BDNF. Эти результаты предоставляют предварительные доказательства, поддерживающие возможность терапевтического применения MXYS при депрессии, при этом признается необходимость проведения сравнительных исследований с оригинальной формулой XYS и валидации зависимости «доза-эффект».
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике работы с животными Хэнаньского университета китайской медицины (номер одобрения DWLLGZR202200023). Все процедуры проводились в соответствии с институциональными и государственными руководствами по благополучию животных и соответствовали рекомендациям ARRIVE. Самцы крыс линии Sprague–Dawley (SD) были получены от лицензированного поставщика лабораторных животных. Животные содержались при контролируемой температуре и влажности с 12-часовым циклом свет/темнота; стандартный корм и вода предоставлялись ad libitum.
Идентификация компонентов MXYS, содержащихся в тканях головного мозга
Приготовление лиофилизированного порошка MXYS:
11 трав, входящих в состав MXYS, настаивали в 10 объемах дистиллированной воды в течение 2 ч, после чего кипятили в течение 40 мин. Перечную мяту добавляли в течение последних 5 мин отвара. Второй отвар готовили аналогичным образом, используя 8 объемов дистиллированной воды. Два отвара объединяли, фильтровали через марлю, концентрировали при пониженном давлении до концентрации 1 g/mL (в эквиваленте сырья) и лиофилизировали под вакуумом в течение 48 ч для получения лиофилизированного порошка MXYS. Выход экстракции составил 21.7% (w/w)25,29,31.
Животные и введение MXYS:
Двенадцать самцов крыс линии SD были случайным образом разделены на две группы, которым дважды в день перорально через зонд вводили либо MXYS, либо очищенную воду. Введения проводили в 8:00 и 20:00 (с интервалом в 12 ч). Порошок MXYS растворяли в очищенной воде и вводили в дозе 24,4 g/kg (примерно в два раза превышающей клиническую дозу для крыс)25. Контрольная группа получала очищенную воду в эквивалентном объеме (10 mL/kg).
Подготовка тканей головного мозга, содержащих MXYS:
Через 14 дней, спустя 2 ч после последнего введения MXYS, все крысы были анестезированы пентобарбиталом натрия (40 mg/kg, внутрибрюшинно). Ткани головного мозга собирали после транскардиальной перфузии физиологическим раствором. Головной мозг извлекали целиком и немедленно помещали на лед для получения образцов контрольной ткани мозга и ткани мозга, подвергнутой воздействию MXYS.
Условия хроматографии/масс-спектрометрии и база данных:
Лиофилизированный порошок MXYS, холостой образец ткани мозга с добавлением порошка MXYS, холостой образец ткани мозга и экстракты ткани мозга, содержащие MXYS, анализировали с использованием системы ультраэффективной жидкостной хроматографии, оснащенной колонкой HSS-T3 (100 × 2.1 mm, 1.8 μm) при температуре 35°C. Подвижные фазы состояли из воды, содержащей 0.1% муравьиной кислоты (подвижная фаза A), и ацетонитрила, содержащего 0.1% муравьиной кислоты (подвижная фаза B). Разделение образцов проводили при скорости потока 0.3 mL/min с использованием градиента: 5% B в течение 1 min, увеличение до 98% B в течение 16 min, возврат к 5% B за 0.5 min и выдерживание при 5% B в течение 2.5 min.
Масс-спектры были получены как в режиме положительной, так и в режиме отрицательной ионизации электрораспылением с использованием метода сбора данных, зависящего от сигнала (data-dependent acquisition), в диапазоне m/z 90–1,300. Спектры MS/MS были получены для 10 наиболее интенсивных ионов-предшественников с использованием ступенчатой коллизионной диссоциации с более высокой энергией (HCD) при энергиях соударений 20, 40 и 60 eV. Температура капилляра поддерживалась на уровне 320°C, а температура нагревателя зонда была установлена на 350°C.
Аннотация соединений проводилась путем сопоставления точной массы, изотопного распределения и масс-спектров МС/МС с внутренней базой данных традиционной китайской медицины и общедоступной базой данных GNPS32, ReSpect33и MassBank34 базах данных. Были отобраны соединения с достоверным соответствием MS/MS-спектров и однородной формой хроматографических пиков. Полный список предварительно идентифицированных соединений приведен в Дополнительная таблица 1.
Биоинформатика
Выбор и предварительная обработка наборов данных из базы данных GEO:
Потенциальное участие некроптоза в патологии депрессии изучалось путем поиска в базе данных GEO по ключевому слову «depression». На основании критериев отбора для дальнейшего анализа были определены три набора данных (GSE54566, GSE54565 и GSE54568). Наборы данных были получены из разных областей мозга: GSE54565 (передняя поясная кора), GSE54566 (миндалевидное тело) и GSE54568 (дорсолатеральная префронтальная кора, BA9). Все наборы данных были созданы с использованием платформы Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array (GPL570) и состояли из образцов посмертной ткани мозга пациентов с большим депрессивным расстройством (БДР) и непсихиатрического контроля. Подробные характеристики образцов для каждого набора данных обобщены в Дополнительной таблице 2. Эти наборы данных включали транскриптомные данные из трех областей мозга, вовлеченных в развитие депрессии. Для каждого набора данных был проведен анализ дифференциальной экспрессии генов между группами БДР и контроля, а согласованно повышенно и пониженно экспрессируемые гены были интегрированы с использованием R-пакета Robust Rank Aggregation (RRA).
Все наборы данных были предварительно обработаны с использованием алгоритма робастного усреднения по нескольким массивам (RMA) для коррекции фона и нормализации. После нормализации RMA был применен алгоритм ComBat, реализованный в R-пакете sva, для корректировки пакетных эффектов в наборах данных, при этом происхождение набора данных рассматривалось как пакетная ковариата. Эта процедура позволила снизить техническую вариабельность между наборами данных и улучшить их сопоставимость для последующего анализа.
Биоинформатический анализ проводили с использованием программного обеспечения R (версия 4.2.1). Основные пакеты R включали ClusterProfiler (версия 4.8.2) для анализа обогащения Gene Ontology (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG), WGCNA (версия 1.72) для анализа взвешенных сетей коэкспрессии генов, RRA для интеграции дифференциально экспрессируемых генов и sva (версия 3.48.0) для коррекции пакетного эффекта с помощью ComBat. Аналитический рабочий процесс включал сбор данных, нормализацию RMA, коррекцию пакетного эффекта ComBat, анализ дифференциальной экспрессии с интеграцией RRA, построение модулей WGCNA, анализ обогащения GO и KEGG с уровнем ложноположительных результатов (FDR) < 0.05, а также поиск мишеней с анализом сетей белок-белковых взаимодействий (PPI).
Использование WGCNA для построения сетей коэкспрессии генов и идентификации модулей, значимо связанных с депрессией и некроптозом:
WGCNA строит взвешенные сети коэкспрессии генов путем применения мягкого порога степени (значение β) для аппроксимации безмасштабной топологии. Значение β выбиралось в тот момент, когда коэффициент корреляции между log(k) и log(p(k)) достигал как минимум 0.9. После выбора значения β модули генов идентифицировались с использованием метода динамической обрезки дерева (dynamic tree cut). Дополнительные параметры были установлены следующим образом: minModuleSize = 30, cutHeight = 0.25 и deepSplit = 2. Значение β выбиралось, когда коэффициент корреляции между log(k) и log(p(k)) достигал как минимум 0.9. Для построения сети использовалось значение мягкого порога β = 7. Для каждого модуля рассчитывался собственный ген модуля (Module Eigengene, ME) для обобщения паттернов экспрессии генов и оценки их связи с биологическими признаками. Впоследствии рассчитывались значимость гена (Gene Significance, GS) и принадлежность к модулю (Module Membership, MM), а взаимосвязи между модулями и признаками оценивались с помощью коэффициента корреляции (cor) и соответствующего значения p. Более высокие коэффициенты корреляции и более низкие значения p указывали на более сильную связь между модулями генов и биологическими признаками.
Функциональный анализ обогащения и построение сети PPI:
Для проведения анализа обогащения путей KEGG использовался пакет ClusterProfiler. Для коррекции множественных проверок применялся метод FDR Бенджамини — Хохберга, а скорректированное значение p (FDR) < 0,05 считалось статистически значимым. После идентификации целевого модуля ключевые гены этого модуля были пересечены с генами, связанными с MXYS и некроптозом. Впоследствии с помощью базы данных STRING была построена сеть белок-белковых взаимодействий (PPI).
Предсказание мишеней для соединений, обнаруженных в тканях мозга:
Для предсказания мишеней были использованы 143 соединения, предварительно идентифицированные в тканях мозга крысы после введения MXYS. Для каждого соединения потенциальные мишени были извлечены из базы данных GeneCards с помощью функции Related Targets при значении показателя релевантности > 5. Дублирующиеся мишени были объединены, и были оставлены только гены человека с официальными символами генов, что в итоге дало 3 164 уникальных мишени. Для этих мишеней был проведен анализ обогащения GO и KEGG с использованием пакета ClusterProfiler для R; статистически значимыми считались значения FDR < 0.05. Фоновый набор генов включал все белок-кодирующие гены человека, аннотированные в базе данных KEGG.
Экспериментальная проверка
Культивирование клеток:
Клетки HT-22 были получены от Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (CL-0697, RRID: CVCL_0321) и культивировались в ростовой среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 100 U/mL пенициллина/стрептомицина. Клетки содержали при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂.
Антинекроптотическая активность MXYS:
Лиофилизированный порошок MXYS восстанавливали в среде для роста клеток до концентрации 1.0 г/мл, стерилизовали через мембранный фильтр 0.22 μm и хранили при −20°C до использования. Клетки HT-22 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 8,000 клеток на лунку, по три лунки на группу. MXYS разводили в среде для роста до конечных концентраций 2, 4 и 6 мг/мл. После инкубации в течение 12 ч клетки обрабатывали гидрохлоридом SM-164 (10 nM) и ингибитором каспаз z-VAD-fmk (20 μM) в течение 30 мин, после чего стимулировали человеческим фактором некроза опухоли-α (h-TNF-α; 20 ng/мл) еще в течение 12 ч. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток в соответствии с инструкциями производителя. Люминесценцию измеряли с помощью микропланшетного ридера. Морфологию клеток исследовали под инвертированным микроскопом и получали репрезентативные изображения для анализа.
Животные:
Эксперименты с животными были одобрены Комитетом по этике работы с животными Хэнаньского университета китайской медицины (номер одобрения DWLLGZR202200023). Все процедуры проводились в соответствии с институциональными и государственными рекомендациями по благополучию животных и соответствовали руководству ARRIVE. Для создания модели CUMS использовали только самцов мышей BALB/c в возрасте 6–8 недель. Животные содержались при контролируемой температуре и влажности с 12-часовым циклом свет/темнота; стандартный корм и вода предоставлялись в свободном доступе (ad libitum).
Модель депрессии, индуцированная CUMS:
Мышей случайным образом распределяли в контрольную группу или группу CUMS. После одной недели акклиматизации мыши в группе CUMS подвергались перемежающимся и непредсказуемым легким стрессорам, в то время как контрольные мыши оставались в спокойных условиях. Парадигма стресса включала 13 различных стрессоров, в том числе наклон клетки, встряхивание клетки, смену клетки, влажную подстилку, ограничение в воде, стробоскопическое освещение, воздействие шума, непрерывный свет, непрерывную темноту, прерывистое освещение, плавание в холодной воде (4°C), плавание в теплой воде (40°C), стресс от фиксации и другие легкие стрессоры. Каждый стрессор применяли по 2–6 h за сессию в рандомизированной последовательности для обеспечения непредсказуемости. Мыши подвергались воздействию одного или двух различных стрессоров ежедневно в соответствии с рандомизированным графиком.
Группы и лечение препаратами:
После шести недель воздействия CUMS мышей случайным образом распределили по группам: CUMS, MXYS, пароксетин или Nec-1. Мыши в группе MXYS получали лиофилизированный порошок MXYS перорально через зонд в дозе 35.2 g/kg/day. Группа пароксетина получала пароксетин (20 mg/kg) перорально через зонд, а группа Nec-1 получала Nec-1 (10 mg/kg) путем внутрибрюшинных инъекций в течение четырех недель подряд. В тот же период контрольная группа и группа CUMS получали эквивалентный объем физиологического раствора перорально через зонд.
Поведенческие эксперименты:
Перед началом введения препаратов мыши были случайным образом распределены по экспериментальным группам с помощью компьютерной последовательности случайных чисел. Последовательность рандомизации была создана независимым исследователем, который не участвовал в последующих экспериментах или анализе данных.
Поведенческие тесты проводились исследователем, который не знал о распределении животных по группам лечения. Тот же исследователь выполнял видеоанализ поведения (время иммобилизации, пройденное расстояние и время пребывания в центре) с использованием программного обеспечения для автоматического трекинга, чтобы минимизировать субъективную предвзятость. Слепой исследователь не имел доступа к кодам распределения по группам до тех пор, пока все поведенческие данные не были собраны и зафиксированы.
Иммунофлуоресцентный анализ проводился отдельным исследователем, который также не знал о распределении образцов по экспериментальным группам. Образцы были маркированы кодированными идентификаторами, а распределение по группам раскрывалось только после завершения денситометрических измерений или измерений интенсивности флуоресценции. Статистический анализ выполнял третий исследователь, который не был осведомлен ни о распределении по группам, ни о соответствующих результатах экспериментов до момента сбора всех количественных данных.
Тест на предпочтение сахарозы (ТПС): Поведенческое тестирование проводили после последнего введения препарата. Перед началом тестирования мышей приучали к 1% раствору сахарозы: в течение 12 часов им предоставляли две бутылочки с 1% раствором сахарозы, затем в течение следующих 12 часов — одну бутылочку с 1% раствором сахарозы и одну бутылочку с питьевой водой. После этого перед основным тестом мышей лишали еды и воды на 12 часов. Во время теста каждой мыши предоставляли одну бутылочку с 1% раствором сахарозы и одну бутылочку с питьевой водой. Через 12 часов измеряли объем жидкости, потребленной из каждой бутылочки. Предпочтение сахарозы рассчитывали по следующей формуле:
Тест на подвешивание за хвост (TST): Хвост каждой мыши фиксировали к верхней части тестового аппарата с помощью клейкой ленты. Поведение мышей регистрировали в течение 6 мин с использованием программного обеспечения для видеозаписи и анализа поведения. Количественно определяли продолжительность иммобильности в течение последних 4 мин теста.
Тест «открытое поле» (OFT): Каждую мышь индивидуально помещали в центр установки для теста «открытое поле». Поведенческая активность регистрировалась и анализировалась в течение 5 min с помощью программного обеспечения для трекинга поведения, включая локомоторную дистанцию и двигательную активность. После каждого теста установка очищалась 75% этанолом.
Сбор образцов:
Мыши, погибшие в ходе процедуры CUMS или имевшие признаки тяжелого заболевания (например, потеря массы тела >20%, видимая инфекция или невозможность передвигаться), были исключены из исследования. Эвтаназию проводил сертифицированный персонал путем введения избыточной дозы пентобарбитала натрия (150 mg/kg, внутрибрюшинно). После потери сознания в качестве вторичного метода для подтверждения смерти проводили вывих шейного позвонка. Для окрашивания по Нисслю и иммунофлуоресцентного анализа из каждой группы случайным образом выбирали трех мышей. Ткани гиппокампа для вестерн-блот-анализа немедленно препарировали на льду и подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте.
Окрашивание по Нисслю:
Для окрашивания по Нисслю и иммунофлуоресцентного анализа мышей глубоко наркотизировали пентобарбиталом натрия (150 mg/kg, внутрибрюшинно) и декапитировали без транскардиальной перфузии. Головной мозг быстро извлекали и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 24–48 h перед заливкой в парафин. Парафиновые срезы изготавливали толщиной 3 μm. Парафиновые срезы депарафинизировали путем последовательной инкубации в депарафинизирующем растворе, абсолютном этаноле и 75% этаноле с последующим промыванием под проточной водой. Замороженные срезы, где это применимо, доводили до комнатной температуры, фиксировали фиксатором для тканей в течение 15 min и промывали под проточной водой. Срезы тканей окрашивали раствором по Нисслю в течение 2–5 min, промывали водой, дифференцировали в 0.1% ледяной уксусной кислоте, промывали для прекращения реакции, контролировали степень дифференцировки с помощью микроскопии, высушивали, просветляли в ксилоле в течение 10 min и заключали в нейтральную среду для заключения препаратов.
Иммунофлуоресценция:
Процедуры иммунофлуоресценции проводили стандартными методами. Ткань мозга фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали в парафин для иммунофлуоресцентного окрашивания. Срезы ткани инкубировали в течение ночи при 4°C с первичными антителами к NeuN (1:200), MLKL (1:300), ATF4 (1:5000) и CREB (1:1000). После инкубации с первичными антителами срезы четырежды промывали PBS и инкубировали в течение 1 ч в темноте с соответствующими флуоресцентными вторичными антителами: козьими антителами против IgG мыши, конъюгированными с CY3 (1:300, Servicebio, GB21301), для мышиных антител к ATF4; козьими антителами против IgG мыши, конъюгированными с Alexa Fluor 488 (1:400, Servicebio, GB25301), для мышиных антител к MLKL; козьими антителами против IgG кролика, конъюгированными с CY3 (1:300, Servicebio, GB21303), для кроличьих антител к NeuN; и козьими антителами против IgG кролика, конъюгированными с Alexa Fluor 488 (1:400, Servicebio, GB25303), для кроличьих антител к CREB. Затем срезы окрашивали DAPI в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали PBS, заключали в антифейдинговую среду, и изображения флуоресценции получали с помощью конфокальной микроскопии.
Вестерн-блоттинг:
Ткани головного мозга гомогенизировали в буфере для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA). Определяли концентрацию белка, после чего 20 μg общего белка на дорожку разделяли с помощью 10% электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) с последующим переносом на поливинилиденфторидные (PVDF) мембраны. После блокировки мембраны инкубировали в течение ночи при 4°C с первичными антителами (1:1000), затем инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 h. Полосы белков визуализировали с помощью системы хемилюминесцентной визуализации, а интенсивность полос количественно определяли с помощью программного обеспечения ImageJ. Для вестерн-блот-анализа тканей гиппокампа анализировали по две мыши в группе; представлены репрезентативные иммуноблотты. Для экспериментов с клетками HT-22 вестерн-блот-анализ проводили один раз в качестве репрезентативного эксперимента. Эти данные представлены как качественные наблюдения за тенденциями, а не как статистически количественные результаты.
Статистический анализ:
Различия между группами анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим множественным сравнением по критерию Тьюки. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения (SD). Значение p < 0.05 считалось статистически значимым.
Доступность данных:
Наборы данных, полученные и проанализированные в ходе данного исследования, включены в настоящую опубликованную статью и дополнительные материалы к ней. Результаты идентификации соединений методом UHPLC-HRMS представлены в Дополнительной таблице 1, а характеристики наборов данных GEO, использованных для биоинформатического анализа, обобщены в Дополнительной таблице 2. Дополнительные подтверждающие данные, включая иммунофлуоресценцию GFAP (Дополнительный рисунок 1), иммунофлуоресцентное окрашивание p-RIPK3 и p-MLKL (Дополнительный рисунок 2), схему эксперимента и график распределения животных (Дополнительный рисунок 3), а также оригинальные необрезанные изображения вестерн-блоттинга (Дополнительный рисунок 4), доступны в дополнительных материалах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
WGCNA идентифицирует связанный с депрессией генный модуль, обогащенный путем некроптоза
Пакет RRA был использован для интеграции последовательно повышающих и понижающих экспрессию дифференциально экспрессируемых генов в наборах данных GSE54566, GSE54565 и GSE54568, что позволило идентифицировать 2 513 генов. Тепловая карта этих генов представлена на Рисунке 1A. Три набора данных были получены из различных областей мозга — передней поясной коры, миндалевидного тела и дорс...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Аномальная гибель нейронов играет ключевую роль в патогенезе депрессии8. Некроптоз, форма программируемой гибели клеток, был extensively изучен, что привело к значительным успехам в разработке ингибиторов, нацеленных на этот путь39. С момента идентификации ингибитора некроптоза Nec-1 в 2005 году40 был достигнут значительный прогресс в создании соединений, воздействующих на ключевые компоненты сигнального пути некроптоза. Nec-1 продемонстрировал защит...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов:
Авторы не имеют сведений о конфликте интересов.
Благодарности
Данная работа была поддержана Ключевым научно-исследовательским проектом высших учебных заведений провинции Хэнань, Китай (№ 26A360008), Научно-исследовательским проектом в области традиционной китайской медицины провинции Хэнань (№ 2025ZY3152), Национальным природным научным фондом Китая (№ 82274496), Научно-техническим исследовательским проектом провинции Хэнань (№ 232301420018), а также Проектом по наследованию и инновациям имени Чжан Чжунцзина Департамента науки и технологий Национального управления традиционной китайской медицины (№ GZY-KJS-2022-044-1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Корневище акора татаринова (Acorus tatarinowii Schott; Ши Чанпу) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай | 231001 | Растительный ингредиент (12 г) |
| Адгезивная лента | Неприменимо | Неприменимо | Тест с подвешиванием за хвост |
| Корень дудника китайского (Angelica sinensis (Oliv.) Diels; Dang Gui) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай | G01230507-16 | Растительный ингредиент (10 г) |
| Антитела к ATF4 (иммунофлуоресценция) | Servicebio | GB111137 | Первичные антитела |
| Антитело к ATF4 (вестерн-блоттинг) | MedChemExpress | HY-P80486 | Первичные антитела |
| Антитело к BDNF | MedChemExpress | HY-P80567 | Первичные антитела для вестерн-блоттинга |
| антитело к CREB | Beyotime | AF1018 | Первичные антитела для вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции |
| антитела к GAPDH | Abcam | ab181602 | Контроль загрузки |
| Антитела к MLKL | Proteintech | 66675-1-Ig | Первичные антитела для вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции |
| антитело к NeuN | Servicebio | GB11138 | Первичные антитела для иммунофлуоресценции |
| Антитело к фосфо-CREB | Beyotime | AF5785 | Первичные антитела |
| Антитело к фосфо-MLKL | Bioss | bsm-54104R | Первичные антитела |
| Антитело к фосфо-RIPK1 | Biolynx | BX60008 | Первичные антитела |
| Антитело к фосфо-RIPK3 | Abcam | ab195117 | Первичные антитела |
| Антитело к RIPK1 | Технология клеточной сигнализации | 3493S | Первичные антитела |
| Антитела к RIPK3 | Proteintech | 17563-1-AP | Первичные антитела |
| Atractylodes macrocephala (Atractylodes macrocephala Koidz.; Бай Чжу) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай | 230801 | Растительный ингредиент (10 г) |
| Программное обеспечение для автоматизированного отслеживания поведения | Panlab (Harvard Apparatus) | Поскольку исходный текст не был предоставлен, я не могу выполнить перевод. Пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести на русский язык. | Программное обеспечение для видеотрекинга SMART 3.0 для тестов «открытое поле» и «подвешивание за хвост» |
| Набор для определения концентрации белка методом БКА | CWBIO | CW0014S | Количественное определение белка |
| Система регистрации поведенческих реакций | Panlab (Harvard Apparatus) | SMART V3.0 | Тест «открытое поле» и тест подвешивания за хвост |
| Система химилюминесцентного анализа Bio-Rad | Bio-Rad | 12003154 | Система визуализации ChemiDoc MP для детектирования хемилюминесцентного вестерн-блоттинга |
| Набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Lumi II | Beyotime | C0056XL | Анализ жизнеспособности клеток |
| Конфокальный микроскоп | Nikon Eclipse C1 | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Иммунофлуоресцентная визуализация |
| DAPI | Servicebio | G1012 | Окрашивание ядер |
| Экологически безопасный раствор для удаления парафина | Servicebio | G1128 | Депарафинизация парафина |
| Фетальная бычья сыворотка (ФБС) | БИ | C04001-500 | Добавка для культур клеток |
| Gardeniae Fructus (Gardenia jasminoides J. Ellis; Zhi Zi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., г. Чжэнчжоу, Китай | 22102109 | Растительный ингредиент (12 г) |
| Корень солодки (Glycyrrhiza uralensis Fisch.; Gan Cao) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай | 230301 | Растительный ингредиент (3 г) |
| конъюгированные с Cy3 козьи антитела к IgG мыши | Servicebio | GB21301 | Флуоресцентное вторичное антитело к мышиным антителам против ATF4 (ИФ, Cy3, 1:300) |
| козантисыворотка к IgG мыши, конъюгированная с Alexa Fluor 488 | Servicebio | GB25301 | Флуоресцентное вторичное антитело к мышиным антителам против MLKL (ИФ, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| конъюгированные с Cy3 козьи антитела к IgG кролика | Servicebio | GB21303 | Флуоресцентное вторичное антитело к кроличьим антителам против NeuN (ИФ, Cy3, 1:300) |
| коза антикроличьи IgG, конъюгированные с Alexa Fluor 488 | Servicebio | GB25303 | Флуоресцентное вторичное антитело к кроличьим антителам против CREB (ИФ, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| козьи антитела к IgG кролика, конъюгированные с HRP | Абсин | abs20040 | Вторичные антитела для вестерн-блоттинга |
| конъюгированные с HRP мышиные антитела к легкой цепи IgG кролика | ABclonal | AS061 | Вторичные антитела для вестерн-блоттинга |
| Человеческий фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α)α | Novoprotein | C008 | Индуктор некроптоза |
| клетки HT-22 | Procell | CL-0697 | RRID: CVCL_0321 |
| ростсреда HyClone | Cytiva (HyClone) | SH30022.01 | Среда для культивирования клеток |
| ImageJ | NIH (Национальные институты здравоохранения) | Бесплатное программное обеспечение | Количественный анализ полос |
| Инвертированный микроскоп | Nikon | Eclipse Ti-SR | Морфология клеток |
| Жидкий азот | Henan Jilai New Energy Technology Co., Ltd. | Данные отсутствуют | Консервация тканей |
| микропланшетный ридер Molecular Devices | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Измерение люминесценции |
| Кора пиона древовидного (Paeonia suffruticosa Andr.; Mu Danpi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., г. Чжэнчжоу, Китай | 22121714 | Растительный ингредиент (12 г) |
| Некростатин-1 (Nec-1) | Selleck | S8037 | ингибитор RIPK1 |
| Параформальдегид | Servicebio | G1101-500МЛ | Фиксация тканей |
| Пароксетина гидрохлорид гемигидрат | Аладдин | P129711 | Положительный контроль |
| Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) | Servicebio | G4202-500мл | Промывочный буфер |
| Перечная мята (Mentha haplocalyx Briq.; Бо Хэ) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай | 230101 | Растительный ингредиент (6 г) |
| Пенициллин–стрептомицин | Gibco | 15140-122 | Антибиотик для культур клеток |
| Корень полигалы (Polygala tenuifolia Willd.; Yuan Zhi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай | 20221101 | Растительный ингредиент (12 г) |
| Мембрана из поливинилиденфторида (ПВДФ) | Merck Millipore | ISEQ00010 | Вестерн-блоттинг |
| Пория (Wolfiporia cocos; Фу Лин) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай | D23070601 | Растительный ингредиент (15 г) |
| Буфер для лизиса RIPA (радиоиммунопреципитационный анализ) | CWBIO (Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd.) | CW2333S | Экстракция белка |
| Radix Bupleuri (Bupleurum chinense DC.; Чай Ху) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай | 230801 | Растительный ингредиент (12 г) |
| Реагенты для Электрофореза белков в ПААГ с SDS | Solarbio; Servicebio; Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. | Неприменимо | Акриламид, бис-акриламид, Tris, SDS, APS и TEMED собственного приготовления |
| Пентобарбитал натрия | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 69020181 | Анестетик |
| Система ультраэффективной жидкостной хроматографии | Thermo Fisher Scientific | Система UHPLC Vanquish | Анализ методом ЖХ-МС |
| колонка UHPLC HSS-T3 (100 × 2,1 мм, 1,8 μм) | Waters | 186003539 | Хроматографическое разделение |
| z-VAD-fmk | TargetMol | T6013 | Пан-каспазный ингибитор |
Ссылки
- Zhang Y, et al. Natural volatile oils derived from herbal medicines: A promising therapy way for treating depressive disorder. Pharmacol Res. 2021;164:105376.
- O’Connor EA, et al. Depression and suicide risk screening: Updated evidence report and systematic review for the US Preventive Services Task Force. JAMA. 2023;329(23):2068-85.
- World Health Organization. The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization; Geneva; 2008.
- Pedrosa-Naudín MA, et al. Non-adherence to antidepressant treatment and related factors in a region of Spain: A population-based registry study. Pharmaceutics. 2022;14(12):2696.
- Huang Y, et al. Prevalence of mental disorders in China: A cross-sectional epidemiological study. Lancet Psychiatry. 2019;6(3):211-24.
- Thase ME. New medications for treatment-resistant depression: A brief review of recent developments. CNS Spectr. 2017;22(S1):39-48.
- Monteggia LM, Malenka RC, Deisseroth K. Depression: The best way forward. Nature. 2014;515(7526):200-1.
- Cao H, et al. Hippocampal proteomic analysis reveals activation of necroptosis and ferroptosis in a mouse model of chronic unpredictable mild stress-induced depression. Behav Brain Res. 2021;403:113261.
- Sun Y, et al. Dysmyelination by oligodendrocyte-specific ablation of Ninj2 contributes to depressive-like behaviors. Adv Sci (Weinh). 2022;9(3):e2103065.
- Zeb S, et al. Necroptotic kinases are involved in the reduction of depression-induced astrocytes and fluoxetine’s inhibitory effects on necroptotic kinases. Front Pharmacol. 2022;13:1060954.
- Duan YW, Chen SX, Li QY, Zang Y. Neuroimmune mechanisms underlying neuropathic pain: The potential role of the TNF-α-necroptosis pathway. Int J Mol Sci. 2022;23(13):7191.
- Frank D, Vince JE. Pyroptosis versus necroptosis: Similarities, differences, and crosstalk. Cell Death Differ. 2019;26(1):99-114.
- Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular mechanisms of necroptosis: An ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(10):700-14.
- Linkermann A, Green DR. Necroptosis. N Engl J Med. 2014;370(5):455-65.
- Sun L, et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012;148(1-2):213-27.
- Cai Z, et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 2014;16(1):55-65.
- Kaczmarek A, Vandenabeele P, Krysko DV. Necroptosis: The release of damage-associated molecular patterns and its physiological relevance. Immunity. 2013;38(2):209-23.
- Wallach D, Kang TB, Kovalenko A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: A historical perspective. Nat Rev Immunol. 2014;14(1):51-9.
- Yuan J, Amin P, Ofengeim D. Necroptosis and RIPK1-mediated neuroinflammation in CNS diseases. Nat Rev Neurosci. 2019;20(1):19-33.
- Mitroshina EV, Saviuk M, Vedunova MV. Necroptosis in CNS diseases: Focus on astrocytes. Front Aging Neurosci. 2022;14:1016053.
- Gong Q, et al. RIPK1 inhibition mitigates neuroinflammation and rescues depressive-like behaviors in a mouse model of LPS-induced depression. Cell Commun Signal. 2024;22(1):427.
- Kwon TG, et al. A review of antidepressant and anxiolytic effects of Soyo-san (Xiaoyao-san) and modified Soyo-san in animal models. Phytomedicine. 2024;135:155387.
- Jiao H, et al. Xiaoyaosan ameliorates CUMS-induced depressive-like and anorexia behaviors in mice via necroptosis-related cellular senescence in the hypothalamus. J Ethnopharmacol. 2024;318(Pt A):116938.
- Yan ZY, et al. Antidepressant mechanism of traditional Chinese medicine formula Xiaoyaosan in a CUMS-induced depressed mouse model via RIPK1-RIPK3-MLKL-mediated necroptosis based on network pharmacology analysis. Front Pharmacol. 2021;12:773562.
- Wu M, et al. Integration of network pharmacology and experimental verification to reveal the active components and molecular mechanism of modified Danzhi Xiaoyao San in the treatment of depression. J Ethnopharmacol. 2025;337:118739.
- Chen X, et al. Therapeutic effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder combined with intravenous human umbilical cord mesenchymal stem cells on post-stroke depression. Chin J Pathophysiol. 2019;35(12):2274-79.
- Zhang J. Clinical observation of Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets in the treatment of 30 cases of depression. New J Tradit Chin Med. 2008;40(11):48-49.
- Zhang J, Zhang B. Thirty-five patients with post-stroke depression were treated with Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets. New J Tradit Chin Med. 2006;38(3):75-76.
- Su P, et al. Modified Xiaoyao San reverses lipopolysaccharide-induced depression-like behavior through suppressing microglial M1 polarization by enhancing autophagy via the PI3K/AKT/mTOR pathway in mice. J Ethnopharmacol. 2023;308:116659.
- Guo X, et al. Effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder on mineralocorticoid receptor and glucocorticoid receptor in the hippocampus of depression model rats. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 2014;20(11):119-22.
- Wang B, et al. Modified Danzhi Xiaoyaosan inhibits neuroinflammation by regulating the TRIM31/NLRP3 inflammasome in chronic unpredictable mild stress-induced depression. Exp Gerontol. 2024;187:112451.
- Wang M, et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nat Biotechnol. 2016;34(8):828-37.
- Sawada Y, et al. RIKEN tandem mass spectral database (ReSpect) for phytochemicals: A plant-specific MS/MS-based data resource and database. Phytochemistry. 2012;82:38-45.
- Horai H, et al. MassBank: A public repository for sharing mass spectral data for life sciences. J Mass Spectrom. 2010;45(7):703-14.
- Wang M, et al. Targeting programmed cell death in inflammatory bowel disease through natural products: New insights from molecular mechanisms to targeted therapies. Phytother Res. 2024;38:4587-611.
- Huang X, et al. Shikonin overcomes drug resistance and induces necroptosis by regulating the miR-92a-1-5p/MLKL axis in chronic myeloid leukemia. Aging (Albany NY). 2020;12(17):17662-80.
- Yuan J, Najafov A, Py BF. Roles of caspases in necrotic cell death. Cell. 2016;167(7):1693-704.
- Mu R, et al. Activation of TGR5 ameliorates streptozotocin-induced cognitive impairment by modulating apoptosis, neurogenesis, and neuronal firing. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:3716609.
- Gardner CR, et al. From (tool)bench to bedside: The potential of necroptosis inhibitors. J Med Chem. 2023;66(4):2361-85.
- Degterev A ,et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat Chem Biol. 2005;1(2):112-19.
- Cao L, Mu W. Necrostatin-1 and necroptosis inhibition: Pathophysiology and therapeutic implications. Pharmacol Res. 2021;163:105297.
- Vissers M, et al. Safety, pharmacokinetics and target engagement of the novel RIPK1 inhibitor SAR443060 (DNL747) for neurodegenerative disorders: Randomized, placebo-controlled, double-blind phase I/Ib studies in healthy subjects and patients. Clin Transl Sci. 2022;15(8):2010-23.
- Mo K, et al. Targeting HNRNPC suppresses thyroid follicular epithelial cell apoptosis and necroptosis through m6A-modified ATF4 in autoimmune thyroid disease. Pharmacol Res. 2023;195:106933.
- Liu J, et al. Brain-derived neurotrophic factor elevates activating transcription factor 4 (ATF4) in neurons and promotes ATF4-dependent induction of SESN2. Front Mol Neurosci. 2018;11:62.
- Tang H, Kang R, Liu J, Tang D. ATF4 in cellular stress, ferroptosis, and cancer. Arch Toxicol. 2024;98(4):1025-41.
- Pang BPS, et al. Deficiency of muscle-generated brain-derived neurotrophic factor causes inflammatory myopathy through reactive oxygen species-mediated necroptosis and pyroptosis. Redox Biol. 2024;74:103418.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.