Методическая статья

Метод ручной фиксации мышей с учетом принципов благополучия животных для введения веществ и забора крови

21 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72535

⸱

25 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Oncology, and Tumor Immunology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 2Taskforce Refinement C3R, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 4Julius Wolff Institute for Biomechanics and Musculoskeletal Regeneration, Berlin Institute of Health at Charité – Universitätsmedizin Berlin, 5Research Facilities of Experimental Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описан новый метод ручной фиксации для иммобилизации мышей во время проведения инъекций или забора крови, что позволяет снизить уровень стресса и улучшить благополучие животных в ходе процедур.

Аннотация

Тестирование на животных остается необходимым элементом биомедицинских исследований, внося значительный вклад в понимание механизмов заболеваний, а также в оценку эффективности и безопасности лекарственных и химических веществ, при этом грызуны являются одними из наиболее часто используемых лабораторных животных. Среди самых распространенных манипуляций в лабораторной практике выделяются фиксация и иммобилизация во время таких процедур, как инъекции и забор крови, которые рутинно проводятся на мышах в сознании без седации или анестезии. Правильная фиксация необходима для обеспечения безопасности как животного, так и оператора. Однако известно, что традиционные методы фиксации, такие как ручное удерживание или использование фиксационных трубок, вызывают у мышей острые стрессовые реакции, что отрицательно сказывается на благополучии животных и может влиять на результаты экспериментов. В целях совершенствования методов в рамках принципа 3R и улучшения условий содержания животных в данном протоколе описывается использование недавно разработанного аппликационного туннеля для проведения инъекций и забора крови у мышей. Туннель обеспечивает менее жесткий, но при этом надежный метод фиксации по сравнению с традиционными методами. Этот ориентированный на благополучие метод фиксации может быть легко внедрен при выполнении стандартных процедур, таких как внутрибрюшинные и внутривенные инъекции, а также забор крови, при этом минимизируя стресс и улучшая условия обращения с лабораторными мышами.

Введение

Тестирование на животных по-прежнему играет центральную роль в биомедицинских исследованиях, внося значительный вклад в понимание механизмов заболеваний, а также в оценку эффективности и безопасности лекарственных средств и химических веществ. Грызуны являются наиболее часто используемыми видами лабораторных животных; в Европейском союзе в 2023 году в научных целях было использовано примерно 3,5 миллиона мышей и 0,5 миллиона крыс1. Растущее общественное осознание страданий, вызванных экспериментальными процедурами, привело к возникновению законодательных требований по улучшению благополучия животных в исследовательских работах в соответствии с принципом 3R2,3. Поскольку полная замена тестирования на животных альтернативными методами пока невозможна, оптимизация существующих экспериментальных процедур особенно важна для облегчения страданий животных. Манипуляции, включая использование фиксирующих устройств для иммобилизации во время таких процедур, как инъекции, являются одним из наиболее распространенных вмешательств, которым подвергаются лабораторные животные как при рутинном уходе, так и в ходе экспериментов.

Традиционная иммобилизация для внутрибрюшинных инъекций предполагает крепкое захватывание кожи и шерсти в области шеи большим и указательным пальцами, фиксацию хвоста и разворот животного для обеспечения доступа к брюшной полости. Такое положение неестественно и может привести к затруднению дыхания, что вызывает у животных чувство страха4. Уже были описаны различные усовершенствованные методы фиксации, включая, например, так называемый «метод трех пальцев», при котором давление на область шеи снижено по сравнению с классическими техниками захвата за загривок4. Другой метод в значительной степени позволяет избежать полной иммобилизации: в этом случае животные могут держаться за проволочную сетку, в то время как хвост и задние конечности фиксируются для обеспечения доступа к нижней части живота для инъекций5. Тем не менее, обе процедуры имеют свои недостатки. При использовании метода трех пальцев животных все равно приходится поднимать и помещать в неестественное положение, что потенциально может вызвать стрессовые реакции. Альтернативная же техника не обеспечивает достаточной защиты от укусов стрессированных или проявляющих агрессию животных и может ограничить время, доступное для выполнения инъекций. Помимо возможных травм от укусов, существует также повышенный риск неправильной фиксации или случайного укола иглой. Иммобилизация для внутривенных инъекций или забора крови из хвостовой вены требует использования фиксаторов, которые удерживают животных без участия рук, освобождая их для проведения процедур. Фиксаторы обычно представляют собой трубки из прозрачного акрила с закрытым концом, имеющим прорези или отверстия для хвоста, и открытым концом для помещения мышей, который можно закрепить регулируемыми пробками. Это требует того, чтобы животное брали за хвост и затягивали в фиксатор задом наперед, чтобы хвост можно было продеть через специальные прорези. Эта процедура является стрессовой и осложняется довольно узким диаметром фиксаторов, необходимым для того, чтобы мыши не могли развернуться во время манипуляций, что может привести к травмам6,7.

В данном протоколе описывается использование недавно разработанного прикладного туннеля для проведения инъекций и забора крови у мышей, который обеспечивает менее жесткую, но при этом надежную фиксацию. Туннель состоит из жесткого внешнего каркаса и съемной мягкой внутренней подкладки, которая создает темное пространство, напоминающее нору. По сравнению с традиционными фиксаторами, туннель был намеренно разработан с большими габаритами, чтобы в него можно было поместить вставку Vetbed Isobed, обрезанную по размеру; такая мягкая и комфортная внутренняя подкладка усиливает чувство безопасности животных при сохранении достаточной степени фиксации (Рисунок 1A–B). Оба конца туннеля открыты, поэтому мыши могут заходить в него спереди и выходить сзади. После попадания в туннель животные не могут развернуться, при этом хвост остается доступным для внутривенных инъекций или забора крови (Рисунок 1C). Для внутрибрюшинных инъекций доступ к каудальной области живота можно обеспечить, расположив туннель под углом (Рисунок 1D) и удерживая хвост животного у основания, одновременно оказывая легкое давление на крестцовую область, чтобы приподнять заднюю часть тела мыши вверх (Рисунок 1C). Этот метод менее стрессовый как для мышей, так и для экспериментаторов, так как не требует ручной фиксации.

Предыдущее исследование показало, что использование туннеля для внутрибрюшинных инъекций стойко снижает уровень стресса и улучшает благополучие мышей даже в экспериментальных моделях с частыми внутрибрюшинными инъекциями8. В данном исследовании туннель для применения также был успешно протестирован для внутривенного введения и забора крови из хвостовой вены у мышей обоих полов.

Протокол

Все процедуры, описанные в данном протоколе, были рассмотрены и одобрены компетентным местным органом (Государственным управлением по делам здравоохранения и социального обеспечения Берлина (LAGeSo); номер разрешения 2022-077-G) и проведены в соответствии с руководством ARRIVE 2.0. Все материалы, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблица материалов.

1. Внутривенное введение

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном методе описывается ориентированный на благополучие животных подход к ручной фиксации для внутривенного введения препаратов мышам. Внутривенные инъекции должны выполняться только обученным персоналом в соответствии с внутренними правилами учреждения, а также установленными процедурами безопасности и гигиены.

  1. Подготовка животных
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с животными всегда используйте необходимые средства индивидуальной защиты (СИЗ) в соответствии с требованиями учреждения по биобезопасности и гигиене (например, халаты, перчатки, шапочки, маски).
    1. Поместите домашнюю клетку под красную лампу на 10–15 min для стимуляции вазодилатации и улучшения видимости вен хвоста.
  2. Подготовка рабочей зоны
    1. Очистите туннель для фиксации 70% этанолом. Дайте этанолу полностью испариться в течение примерно 5 min.
    2. Поместите свернутый кусок вымытой и автоклавированной подстилки (отрежьте Vetbed Isobed до нужного размера) внутрь туннеля (Рисунок 1B).
    3. Пальцами осторожно сожмите подстилку у входа в туннель, пока оставшееся отверстие не станет примерно равным ширине двух соседних пальцев. Не сжимайте подстилку сильнее.
    4. Расположите туннель для фиксации на рабочей поверхности и положите дополнительный кусок плоской подстилки перед входом в туннель.
    5. Подготовьте инъекционный шприц с иглой 27G, содержащий необходимый раствор для инъекции, и положите его рядом с туннелем. Убедитесь, что тампоны и дезинфицирующий спрей находятся под рукой.
  3. Гуманная фиксация в туннеле
    1. Перенесите мышь из домашней клетки с помощью трубки для захвата.
    2. Позвольте мыши добровольно войти в туннель для фиксации, расположив трубку для захвата непосредственно перед отверстием туннеля (Рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мыши предпочитают сначала встать на подстилку, расположенную перед туннелем для фиксации, прежде чем добровольно войти внутрь. Чтобы мыши не заходили слишком глубоко в туннель, можно осторожно придерживать их за основание хвоста.
    3. Оказавшись внутри, мышь обычно остается в свернутой подстилке, не разворачиваясь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мыши не входят в туннель, возможно, отверстие слишком мало; слегка сожмите подстилку у входа в туннель. Если мыши слишком малы и склонны разворачиваться, затяните свернутую подстилку или добавьте дополнительный слой (Рисунок 1B).
  4. Внутривенная инъекция
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутривенная инъекция выполняется с использованием общепринятых стандартных процедур введения в вену хвоста.
    1. Осторожно выпрямите хвост, удерживая его за кончик, и продезинфицируйте предполагаемое место инъекции. Поверните хвост примерно на 90°, чтобы латеральные вены хвоста оказались в дорсальном положении.
    2. Начинайте инъекцию с дистального конца хвоста, чтобы в случае необходимости оставить возможность для дополнительных попыток в более проксимальных участках.
      КРИТИЧЕСКИЙ ЭТАП: Введите иглу под углом примерно 15–20° по отношению к хвосту, удерживая иглу почти параллельно хвосту. Продвиньте иглу лишь немного за скос, так как вены хвоста расположены поверхностно. Правильное расположение иглы характеризуется минимальным сопротивлением при введении и видимым током вводимого раствора по вене. Вводите необходимый объем медленно и равномерно (≤5 mL/kg в течение 13 s). После извлечения иглы осторожно прижмите место инъекции стерильным тампоном для предотвращения кровотечения.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Немедленно утилизируйте использованные иглы/шприцы в проколостойкие и герметичные контейнеры для острых предметов. Не пытайтесь надеть колпачок на иглу шприца во избежание травм от укола.
  5. Выпуск и положительное подкрепление
    1. Верните туннель с мышью в домашнюю клетку и позвольте животному добровольно выйти с противоположного конца туннеля (Рисунок 1C).
    2. Поместите в домашнюю клетку лакомства для положительного подкрепления и привыкания к процедуре.
  6. Очистка и обслуживание
    1. Извлеките внутреннюю подстилку из туннеля для фиксации. Очистите туннель 70% этанолом.
    2. Если подстилка осталась чистой, ее можно использовать повторно в последующих экспериментах. Если она загрязнена или имеет видимые загрязнения, промойте и автоклавируйте ее перед повторным использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одну подстилку на одну экспериментальную группу. Заменяйте подстилку между разными экспериментами, при переходе от самцов к самкам, а также всякий раз, когда этого требуют инструкции учреждения по гигиене.

2. Внутрибрюшинное введение

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном методе описывается ориентированный на благополучие животных подход к ручной фиксации для внутрибрюшинного введения препаратов мышам. Внутрибрюшинные инъекции должны выполняться только обученным персоналом в соответствии с внутренними правилами учреждения, а также установленными процедурами безопасности и гигиены. Для облегчения доступа к месту инъекции туннель для фиксации используется в сочетании с наклонной платформой (клином), которая приподнимает заднюю часть тела мыши.

  1. Подготовка рабочей зоны
    1. Очистите аппликационный туннель и клин 70% этанолом. Дайте этанолу полностью испариться в течение примерно 5 min.
    2. Поместите свернутый кусок промытого и автоклавированного подстилочного материала (вырежьте Vetbed Isobed до нужного размера) внутрь туннеля (Рисунок 1B).
    3. Пальцами аккуратно сожмите подстилку у входа в туннель, чтобы оставшееся отверстие было примерно равным ширине двух соседних пальцев. Не сжимайте подстилку сильнее.
    4. Установите аппликационный туннель поверх клина (Рисунок 1D) на рабочей поверхности и положите дополнительную плоскую подстилку перед входом в туннель.
    5. Подготовьте инъекционный шприц с иглой 27G, содержащий необходимый раствор для инъекции, и поместите его рядом с туннелем.
  2. Гуманная фиксация в туннеле
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с животными всегда используйте необходимые средства индивидуальной защиты (СИЗ) в соответствии с требованиями учреждения по биобезопасности и гигиене (например, халаты, перчатки, шапочки, маски).
    1. Переместите мышь из домашней клетки с помощью трубки для захвата. Позвольте мыши добровольно войти в аппликационный туннель, расположив трубку для захвата непосредственно перед отверстием туннеля (Рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мыши предпочитают сначала встать на подстилку, расположенную перед аппликационным туннелем, прежде чем добровольно войти в него. В этом случае дайте мыши сначала войти в туннель, прежде чем устанавливать туннель на клин.
    2. Когда животное окажется внутри, аккуратно удерживайте основание хвоста между указательным пальцем и большим пальцем, чтобы предотвратить слишком глубокое перемещение мыши в туннель. Обычно мышь остается в свернутой подстилке, не разворачиваясь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мыши не входят в туннель, возможно, отверстие слишком мало; слегка сожмите подстилку у входа в туннель. Если мыши слишком маленькие и склонны разворачиваться, затяните свернутую подстилку или добавьте дополнительный слой (Рисунок 1B).
  3. Внутрибрюшинная инъекция
    1. Удерживайте основание хвоста между большим и указательным пальцами одной руки (Рисунок 1C). Оказывайте легкое давление на сакральную область средним пальцем той же руки и слегка приподнимите хвост. Это стабилизирует животное и обеспечит свободный доступ к каудальной области брюшной полости.
    2. КРИТИЧЕСКИЙ ЭТАП: Выполните инъекцию, удерживая шприц параллельно рабочей поверхности и вводя его в четко видимую каудальную область брюшной полости.
    3. После инъекции осторожно снимите давление и отпустите хвост.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Немедленно утилизируйте использованные иглы/шприцы в проколостойкие и герметичные контейнеры для острых предметов. Не пытайтесь надеть колпачок на иглу шприца во избежание травм от укола.
  4. Выпуск и положительное подкрепление
    1. Верните туннель с мышью в домашнюю клетку и позвольте животному добровольно выйти с противоположного конца туннеля (Рисунок 1C).
    2. Предложите лакомство в домашней клетке для положительного подкрепления и привыкания к процедуре.
  5. Очистка и обслуживание
    1. Извлеките внутреннюю подстилку из аппликационного туннеля. Очистите аппликационный туннель и клин 70% этанолом.
    2. Если подстилка осталась чистой, ее можно использовать повторно в последующих экспериментах. Если она загрязнена или имеет видимые загрязнения, промойте и автоклавируйте ее перед повторным использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одну подстилку на одну экспериментальную группу. Меняйте подстилку между разными экспериментами, между самцами и самками, а также всякий раз, когда этого требуют институциональные правила гигиены.

3. Забор крови из хвостовой вены

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном методе описывается ориентированный на благополучие животных подход к ручному удерживанию мышей для забора крови из хвостовой вены. Все процедуры должны выполняться обученным персоналом в соответствии с внутренними правилами учреждения, а также установленными протоколами безопасности и гигиены.

  1. Подготовка рабочей зоны
    1. Очистите туннель для процедур 70% этанолом. Дайте этанолу полностью испариться в течение примерно 5 мин.
    2. Поместите свернутый кусок промытой и автоклавированной подстилки (отрежьте Vetbed Isobed до нужного размера) внутрь туннеля (Рисунок 1B).
    3. Пальцами осторожно сожмите подстилку у входа в туннель, чтобы оставшееся отверстие было примерно равным ширине двух соседних пальцев. Не сжимайте подстилку сильнее.
    4. Разместите туннель для процедур на рабочей поверхности и положите дополнительную плоскую подстилку перед входом в туннель.
    5. Убедитесь, что ланцеты, микропробирки для сбора крови, тампоны и дезинфицирующий спрей находятся под рукой.
  2. Ориентированная на благополучие фиксация в туннеле
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с животными всегда используйте необходимые средства индивидуальной защиты (СИЗ) в соответствии с требованиями учреждения по биобезопасности и гигиене (например, халаты, перчатки, шапочки, маски).
    1. Переместите мышь из домашней клетки с помощью трубки для захвата. Позвольте мыши добровольно войти в туннель для процедур, расположив трубку для захвата непосредственно перед отверстием туннеля (Рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мыши предпочитают сначала встать на подстилку, расположенную перед туннелем для процедур, прежде чем добровольно войти в него. Чтобы мыши не заходили слишком глубоко в туннель, можно осторожно придерживать их за основание хвоста.
    2. Оказавшись внутри, мышь обычно остается в свернутой подстилке, не разворачиваясь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мыши не входят в туннель, возможно, отверстие слишком мало; слегка сожмите подстилку у входа в туннель. Если мыши слишком маленькие и склонны разворачиваться, затяните свернутую подстилку или добавьте дополнительный слой (Рисунок 1B).
  3. Отбор крови
    1. Осторожно выпрямите хвост, удерживая его за кончик, и продезинфицируйте предполагаемое место отбора. Поверните хвост примерно на 90°, чтобы латеральные вены хвоста оказались в дорсальном положении.
    2. КРИТИЧЕСКИЙ ЭТАП: Проколите латеральную вену с помощью ланцета. Соберите капли крови в микропробирку или капилляр.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Немедленно утилизируйте использованные ланцеты в проколостойкие, герметичные контейнеры для острых предметов. Не пытайтесь надеть колпачок на ланцет во избежание травм от укола иглой.
    3. После отбора крови осторожно прижмите к месту прокола стерильный тампон, чтобы остановить кровотечение.
  4. Выпуск и положительное подкрепление
    1. Верните туннель с мышью в домашнюю клетку и позвольте животному добровольно выйти с противоположного конца туннеля (Рисунок 1C).
    2. Поместите в домашнюю клетку лакомства для положительного подкрепления и привыкания к процедуре.
  5. Очистка и обслуживание
    1. Извлеките внутреннюю подстилку из туннеля для процедур. Очистите туннель для процедур 70% этанолом.
    2. Если подстилка осталась чистой, ее можно использовать повторно в последующих экспериментах. Если она загрязнена или имеет видимые загрязнения, промойте и автоклавируйте ее перед повторным использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одну подстилку на одну экспериментальную группу. Заменяйте подстилку между разными экспериментами, при переходе от самцов к самкам и всякий раз, когда этого требуют внутренние гигиенические правила учреждения.

Результаты

Для оценки влияния новой техники фиксации на благополучие мышей проводили забор крови из хвостовой вены и внутривенные инъекции в соответствии с описанным протоколом. Самцов и самок мышей дикого типа C57BL/6 подвергали этим процедурам либо в прикладном туннеле, либо в обычном фиксаторе, после чего оценивали наличие признаков боли и стресса. Для определения уровня стресса у мышей после забора крови из хвостовой вены использовали шкалу гримас мыши (MGS). MGS представляет собой широко применяемую систему оценки, которая анализирует мимику лицевых мышц как реакцию на боль или стрессовые процедуры9,10. Для определения баллов фотографии делались сразу после освобождения мышей из фиксатора или туннеля (репрезентативные изображения показаны на Рисунке 2). Два наблюдателя, имеющие опыт оценки поведения мышей, оценивали три параметра мимики (представлены на схематических набросках на Рисунке 2C): сужение орбитальной области (закрытие века и сужение области вокруг глаза; вокруг глаза может быть видна морщина), выпуклость носа (может появиться выпуклость на переносице и вертикальные морщины по бокам носа) и положение ушей (уши разворачиваются наружу и/или назад от морды и могут складываться, образуя «острую» форму; расстояние между ушами увеличивается). Положение вибрисс и выпуклость щек не оценивались, так как темный цвет шерсти мышей затруднял надежную оценку. Каждый параметр оценивался по трехбалльной шкале от 0 до 2 (0 = отсутствует, 1 = выражен умеренно, 2 = выражен явно), и значения трех параметров лица усреднялись для получения одного среднего балла MGS на животное. Для обеспечения достоверности каждое животное оценивалось обоими наблюдателями независимо и в «слепом» режиме, после чего два значения MGS усреднялись для получения окончательного балла MGS для каждого животного. И у самок, и у самцов мышей наблюдалось значительное снижение балла MGS при заборе крови в прикладном туннеле по сравнению с обычным фиксатором (Рисунок 2A–B).

Отдельной группе мышей вводили внутривенно 100 µL 0,9% раствора хлорида натрия (NaCl), при этом регистрировали случаи слышимой вокализации, а также попытки развернуться в фиксирующем устройстве. Мыши издают слышимый писк как признак сильного стресса, особенно при возникновении боли или страха, а также во время защитного поведения11,12,13. Кроме того, мыши естественным образом реагируют на физическое ограничение паникой, что приводит к реакции бегства с целью покинуть замкнутое пространство. Таким образом, попытки развернуться на 180 градусов в фиксирующем устройстве рассматривались как признаки страха. Как у самок, так и у самцов мышей наблюдалась более высокая частота слышимой вокализации и попыток развернуться при выполнении внутривенных инъекций в фиксаторе по сравнению с использованием туннеля для аппликации (Рисунок 3).

figure-results-1
Рисунок 1: Новый туннель для манипуляций. (A) Репрезентативные изображения, иллюстрирующие разницу в размерах между обычным фиксатором и новым туннелем для манипуляций. (B) Внутренняя облицовка туннеля состоит из отрезанного по размеру куска свернутого материала Vetbed, создающего мягкую, поддерживающую и темную среду. Если мыши слишком малы и склонны разворачиваться, свернутую облицовку можно затянуть, чтобы уменьшить доступное пространство. (C) Различные этапы манипуляций в туннеле, включая вход и выход, безопасную и комфортную фиксацию, а также доступ к брюшной полости и хвосту. (D) Дополнительный клин для выполнения внутрибрюшинных инъекций в туннеле. Клин увеличивает угол наклона туннеля относительно экспериментатора, облегчая доступ к области живота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Шкала гримасы мышей после забора крови из хвостовой вены. У самцов и самок мышей проводили забор крови либо внутри туннеля для аппликации, либо в стандартном фиксаторе. Фотографии для оценки шкалы гримасы мышей делали сразу после выхода животных из фиксатора или туннеля; затем два опытных экспериментатора, не знавших о распределении мышей по группам, независимо оценивали степень зажмуривания глаз, выпуклость носа и положение ушей. Для каждого животного рассчитывался средний балл на основе двух оценок. (A) Самки мышей (туннель n = 5; фиксатор n = 8). (B) Самцы мышей (туннель n = 11; фиксатор n = 11). Данный график адаптирован из работы Schlutt et al., 2026, PLOS ONE. Исходные данные, опубликованные в виде столбчатой диаграммы по лицензии CC BY 4.0, были модифицированы и представлены здесь в виде диаграммы «ящик с усами». (C) Схематическое изображение единиц мимики лица, созданное с помощью текстового запроса авторов в ChatGPT Image 2 (OpenAI; доступно по адресу https://chatgpt.com/); финальное изображение было проверено и утверждено авторами на предмет научной точности. Данные представлены в виде диаграмм «ящик с усами» (от мин. до макс.); линия указывает среднее значение. Тест Манна-Уитни, значения p < 0.05 считались значимыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

figure-results-3
Рисунок 3: Слышимая вокализация и попытки развернуться после внутривенной инъекции. Самцам или самкам мышей вводили внутривенно 100 µL 0.9% NaCl либо внутри туннеля для аппликации, либо в обычном фиксаторе. В ходе процедуры регистрировали случаи слышимой вокализации и попыток развернуться внутри фиксирующего устройства (да/нет). Во всех группах n = 10. Данные представлены в виде стековых столбчатых диаграмм сопряженности. Значения p < 0.05 по точному критерию Фишера считались значимыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Внутрибрюшинная инъекция крысам с использованием туннеля для фиксации большего размера. Для выполнения внутрибрюшинных инъекций крысам использовался туннель для фиксации диаметром 15 см. Процедура проводилась в соответствии с тем же протоколом, который был описан для мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Данный метод фиксации был разработан для введения веществ и забора проб крови с целью поддержки наилучших практик обеспечения благополучия животных. Некоторые научные сообщества до сих пор неохотно внедряют усовершенствованные методы обращения и фиксации, которые отличаются от давно установившихся стандартизированных процедур, особенно если они требуют дополнительных временных и трудовых затрат. Однако снижение стресса у лабораторных животных не только желательно с точки зрения благополучия животных, но и вносит существенный вклад в успех эксперимента за счет снижения вариабельности данных, минимизации вызванных стрессом физиологических изменений, а также сокращения количества неудачных попыток и выбывания животных из исследования. В данном протоколе представлен простой в реализации метод, который значительно улучшает благополучие животных, обеспечивая при этом надежную фиксацию и свободный доступ рук для безопасного проведения процедур введения препаратов и забора проб.

Критически важным этапом протокола является обеспечение успешного входа и стабильного позиционирования животного внутри аппликационного туннеля. Для добровольного входа рекомендуются два возможных подхода: либо прямой переход из пересадочной трубки в туннель, либо предварительное перемещение мышей из пересадочной трубки на заранее размещенную мягкую подложку, с которой они могут войти в туннель. Оптимальный подход зависит от поведения животных, поэтому следует оценить оба метода. Предпочтительным вариантом является тот, при котором мыши входят быстрее всего и с наименьшим сопротивлением. Если мыши колеблются перед входом в туннель, следует учесть несколько факторов: (1) входное отверстие может быть слишком узким, в этом случае подложку можно слегка сжать, чтобы расширить отверстие; (2) запаховые стимулы от внутренней подложки могут влиять на принятие, поэтому подложки предпочтительно должны сохранять знакомый запах клетки, при этом обеспечивая разделение между экспериментальными группами, клетками и полами, а также замену загрязненного материала во избежание смешивания запахов; (3) было показано, что мыши чувствуют себя в большей безопасности на поверхностях, цвет которых схож с цветом их шерсти14, поэтому подбор цвета подложки в соответствии с цветом шерсти животных может быть полезен; и (4) расположение отверстия туннеля в сторону стенки клетки может стимулировать вход, так как мыши по-прежнему видят домашнюю клетку и сородичей. Потенциальным ограничением аппликационного туннеля является зависимость от добровольного входа животного, что может восприниматься как внесение небольшой задержки перед лечением или отбором проб. Однако в данном исследовании мыши входили в туннель быстро и стабильно, обычно в течение 2–10 s, что позволяло проводить процедуры в узком и воспроизводимом временном окне. Хотя этот подход может потребовать немного больше времени, чем традиционная фиксация за загривок, незначительное увеличение времени манипуляций следует сопоставить со значительным улучшением благополучия животных, достигнутым за счет снижения стресса, связанного с перемещением. Более того, помещение в обычные фиксаторы также сопряжено с временем манипуляций, так как мыши часто сопротивляются размещению, в результате чего существенной разницы не возникает. Менее чем в 5% случаев мыши не входили в туннель добровольно. Хотя описанных выше мер обычно было достаточно для стимуляции входа, при необходимости животных можно было аккуратно помочь зайти в туннель. Даже в таких случаях мягкая внутренняя подложка обеспечивает преимущество в плане благополучия по сравнению с традиционными фиксаторами.

Оказавшись внутри тоннеля, мыши могут надежно зацепиться за внутреннюю подкладку. Это крайне благоприятно с точки зрения благополучия животных, так как было показано, что фиксированные мыши испытывают меньший уровень стресса, если им позволяют держаться за поверхность во время манипуляций4. Одновременно с этим оператор может надежно удерживать основание хвоста, при этом мышь не будет пытаться развернуться. Важно, чтобы внутренняя подкладка плотно облегала животное. Если мыши слишком малы и склонны вращаться внутри тоннеля, можно быстро внести коррективы, затянув свернутую подкладку или добавив дополнительный слой. Для экспериментов с животными разных размеров (например, из-за разного возраста, пола или диеты) также можно использовать тоннели разного диаметра (см. шаблоны для печати8).

Инъекции и забор крови всегда должны выполняться обученным персоналом. Тем не менее, использование туннеля оказалось эффективным как для высококвалифицированных специалистов, так и для менее опытных пользователей. В частности, неопытный персонал сообщил о меньшем количестве неудачных попыток, что позволило сократить число повторных манипуляций и общую продолжительность процедур. Пользователи также отметили, что чувствовали себя более комфортно и уверенно при фиксации мышей в туннеле по сравнению с освоением традиционных методов ручной фиксации. Это представляет собой значительное преимущество для лабораторий с частой сменой персонала, поскольку данный метод легко внедрить, и он приносит пользу как животным, так и экспериментатору. Эти наблюдения согласуются с ранее опубликованными данными об улучшении комфорта при обращении с животными и повышении уверенности лаборантов, связанными с применением усовершенствованных методов манипулирования, таких как использование туннеля и стаканчика15.

Важно отметить, что описанный здесь метод эффективен даже для нетренированных мышей, и все представленные результаты были получены с использованием животных без предварительной габитуации. Предыдущие исследования показали, что габитуация и медицинское обучение животных могут снизить стрессовые реакции у мышей за счет ознакомления их с планируемыми процедурами16,17. Таким образом, протокол обучения, включающий использование туннеля для фиксации, может дополнительно снизить уровень стресса, особенно при необходимости частых вмешательств, которые в противном случае могли бы вызвать негативные ассоциации с туннелем. Такая программа обучения была успешно применена в предыдущем исследовании, что позволило нам использовать туннель для повторных внутрибрюшинных инъекций на протяжении многих недель8. Особенно в исследованиях, требующих повторных инъекций, использование туннеля может стать существенным усовершенствованием метода. Было показано, что усовершенствованные методы обращения с животными с использованием трубок для перемещения и снижением степени фиксации позволяют сохранять положительные эффекты даже после повторной фиксации за загривок или внутрибрюшинных инъекций, включая повышенную готовность взаимодействовать с персоналом и снижение тревожного поведения в стандартных поведенческих тестах18,19. Аналогично, повторные инъекции, выполняемые в туннеле, не приводили к увеличению показателей стресса у мышей8.

Было показано, что пищевое вознаграждение способствует привыканию за счет положительного подкрепления, что является общепринятым принципом в дрессировке животных. Поэтому рекомендуется предлагать небольшое лакомство в качестве награды в конце каждого сеанса манипуляций. При тестировании туннеля было достаточно очень малых количеств, например, одного зерна овса, что вряд ли повлияет на обычный рацион животных. Если потребление пищи вызывает опасения, например, при метаболических исследованиях, можно использовать ароматизированные лакомства, совместимые со специализированными диетами (например, кетогенными диетами). Важно понимать, что лакомства следует рассматривать как дополнительную меру по улучшению условий содержания, которая ускоряет привыкание, а не как обязательное условие для успешного использования аппликационного туннеля. После ознакомления с системой мыши также неоднократно и добровольно заходили в аппликационный туннель без получения пищевого вознаграждения.

Описанный здесь метод имеет определенные ограничения в отношении доступа к отдельным областям тела. В то время как хвост легко и безопасно доступен для внутривенных инъекций и забора крови, а каудальная область живота подходит для внутрибрюшинных инъекций, доступ к латеральным областям тела для подкожного введения ограничен. К вопросу о пероральном введении также следует подойти с осторожностью. Традиционный оральный зонд несовместим с данной системой, так как невозможно обеспечить необходимое разгибание шеи. Однако более совершенные методы перорального введения, при которых мыши добровольно потребляют вещества из наконечника пипетки (например, смешанные со сгущенным молоком)20, могут быть осуществимы через открытую сторону туннеля. В таких случаях необходимо убедиться, что голова остается четко видимой и что мышь расположена не слишком глубоко в подкладке или туннеле, чтобы подтвердить полное проглатывание вещества.

По сравнению с существующими туннелями для фиксации, описанный здесь туннель для манипуляций обладает явными преимуществами с точки зрения благополучия животных. Хотя фиксация часто необходима для безопасного проведения процедур введения препаратов и отбора проб, она также признана одним из самых сильных стрессоров, с которыми сталкиваются грызуны в ходе экспериментальных процедур7,21,22. Предыдущие исследования уже показали, что замена традиционного захвата за хвост и фиксации усовершенствованными методами, такими как перемещение с помощью туннеля или стаканчика, значительно улучшает благополучие животных. Мыши, к которым применялись эти усовершенствованные подходы, проявляют меньшую тревожность и большую готовность взаимодействовать с персоналом по сравнению с мышами, которых поднимали за хвост23,24. Использование туннеля для манипуляций, в который мыши заходят добровольно, является логическим продолжением метода перемещения в туннеле. Шкала гримас мышей, выходящих из туннеля для манипуляций, указывает на то, что животные не чувствуют себя зафиксированными или запертыми. Хотя метод внутрибрюшинных инъекций, при котором мыши держатся за решетку клетки, напоминает описанный захват за область таза5, первый основан на попытках животных вырваться. На решетке мыши цепляются лапами и тянут вперед, прочь от захвата персонала, что приводит к фиксации и, следовательно, к дистрессу. Кроме того, такой тип фиксации повышает тонус мышц брюшного пресса, что впоследствии усиливает болевые ощущения при проколе иглой. Напротив, туннель для манипуляций представляет собой усовершенствованный метод фиксации, и результаты указывают на снижение параметров, связанных со стрессом, включая более низкие баллы по шкале гримас, меньшее количество слышимых вокализаций и сохранение готовности взаимодействовать с персоналом811,12,13. Хотя ультразвуковые вокализации (USVs) всё чаще признаются этологически значимыми коммуникативными сигналами, их использование в качестве маркеров стресса у взрослых мышей всё еще исследуется, так как USVs сильно зависят от контекста и также возникают при нормальном физиологическом поведении25.

Тем не менее, последние данные свидетельствуют о том, что запись ультразвуковых вокализаций (USV) может представлять собой перспективный, неинвазивный и воспроизводимый подход к оценке поведенческих реакций на фиксацию26. Таким образом, включение записей USV в будущие исследования может обеспечить дополнительный объективный показатель для более детальной характеристики стресса и эмоциональных реакций. В совокупности эти результаты показывают, что использование туннеля для нанесения препаратов обеспечивает более безопасную и менее стрессовую процедуру фиксации для рутинного применения и отбора проб по сравнению с традиционными фиксаторами. Важно отметить, что, в отличие от прозрачных акриловых фиксаторов, мягкая внутренняя облицовка позволяет мышам надежно удерживаться за поверхность, что считается важным улучшением условий содержания в соответствии с рекомендациями NC3Rs27. Внутри туннеля наблюдалось значительно меньше попыток развернуться, что повысило как благополучие животных, так и безопасность обращения с ними. В обычных пластиковых фиксаторах попытки развернуться часто сопровождаются мочеиспусканием, а resulting влажный мех дополнительно снижает комфорт. С использованием туннеля для нанесения препаратов эта проблема была практически устранена.

Потенциальные области применения данного метода обширны. Стоит отметить, что усовершенствованный метод фиксации не ограничивается только мышами, но может быть применен и к крысам при использовании туннеля большего диаметра (Supplementary Figure 1). Грызуны являются наиболее широко используемыми лабораторными животными в различных научных дисциплинах, а фиксация для введения веществ и забора проб является рутинной процедурой во многих лабораториях. Однако было показано, что стресс при фиксации не только ухудшает благополучие животных, но и значительно влияет на научные результаты, включая поведенческие реакции28,29 и физиологические механизмы, такие как иммунная функция30. Следовательно, минимизация вариабельности, связанной со стрессом, имеет важное значение как для научной достоверности, так и для этических аспектов экспериментов на животных. За счет снижения стресса, связанного с фиксацией, при сохранении безопасного и практичного обращения, использование туннеля может существенно повысить качество и воспроизводимость экспериментов, одновременно улучшая благополучие животных.

Раскрытие информации

A.S., J.K.U. и L.H. владеют полезной моделью инъекционного туннеля в Германии (регистрационный номер 20 2024 100 448). Все остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников вивария и специалистов по благополучию животных клиники Шарите (Charité), в особенности доктора Андре Дюльснера (Dr. André Dülsner), за их поддержку; организацию Charité 3R за финансовую помощь в распространении приложения-туннеля; а также всех членов рабочей группы по улучшению условий содержания (Refinement Taskforce) Charité 3R за полезные дискуссии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стерильные ланцеты для аллергопробHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, Гамбург, Германия1110106
Аппликационный туннель с опциональным клиномТуннель, напечатанный на 3D-принтере собственными силамишаблоны для печати доступны по адресу https://osf.io/vsjnb.
Пробирки для сбора крови: Microvette 100 EDTA K3E, 100 µL SARSTEDT AG & Co. KG, NüМбрехт, Германия20.1278.100
Прозрачная пробирка для манипуляцийDatesand Group, Стокпорт, ВеликобританияGZCHTUBE-100размер: 50 x 3 x 100 мм
этанол, ≥70%Carl Roth GmbH + Co. KG, Карлсруэ, ГерманияT913.1
Одноразовый шприц для точного дозирования Inject-F, 1 мл B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Мельсунген, Германия9166017V
ОвёсШапфен М.ühle GmbH Co.KG, Ульм, ГерманияW100197автоклавированный
Инфракрасная лампа Sanitas SIL 06Beurer Europe GmbH, Ульм, Германия61424
Мягкая внутренняя подкладка: Original Vetbed Isobed SLVetbed Deutschland, Мудерсбах, Германия1999981разрезать до требуемого размера
Дезинфицирующий спрей Softasept ISO 70%B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Мельзунген, Германия19905
Sterican 27 G x ¾ стерильные гиподермические иглы для одноразового использованияB.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Мельсунген, Германия4657705Bразмер: 0,40 мм x 20 мм
Тампоны: медицинские аппликаторы FIWA appФинк & Walter GmbH, Мерхвайлер, Германия329012

Ссылки

  1. Joint Research Center (JRC-ISPRA). Summary report on statistical information on the use of animals for scientific purposes in the Member States of the European Union and Norway in 2023. Luxembourg: Publications Office of the European Union; 2026.
  2. European Parliament and Council of the European Union. Directive 2010/63/EU of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Off J Eur Union. 2010;L276:33–79.
  3. Russell WMS, Burch RL. The principles of humane experimental technique. London: Methuen & Co. Ltd.; 1959.
  4. Labitt RN, Oxford EM, Davis AK, Butler SD, Daugherity EK. A validated smartphone-based electrocardiogram reveals severe bradyarrhythmias during immobilizing restraint in mice of both sexes and four strains. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2021;60(2):201–12.
  5. Baek JM, Kwak SC, Kim JY, Ahn SJ, Jun HY, Yoon KH, et al. Evaluation of a novel technique for intraperitoneal injections in mice. Lab Anim (NY). 2015;44(11):440–4.
  6. Turner PV, Pekow C, Vasbinder MA, Brabb T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2011;50(5):614–27.
  7. Meijer MK, Spruijt BM, van Zutphen LF, Baumans V. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 2006;40(4):382–91.
  8. Schlutt A, Riesner K, Kochan M, Mess AK, Jahn D, Lurje I, et al. A novel application tunnel in combination with medical training reduces stress induced by frequent intraperitoneal injections and blood draws in mice. PLoS One. 2026;21(5):e0341404.
  9. Onuma K, Watanabe M, Sasaki N. The grimace scale: a useful tool for assessing pain in laboratory animals. Exp Anim. 2024;73(3):234–45.
  10. Whittaker AL, Liu Y, Barker TH. Methods used and application of the mouse grimace scale in biomedical research 10 years on: a scoping review. Animals (Basel). 2021;11(3).
  11. Ruat J, Genewsky AJ, Heinz DE, Kaltwasser SF, Canteras NS, Czisch M, et al. Why do mice squeak. Toward a better understanding of defensive vocalization. iScience. 2022;25(7):104657.
  12. Ehret G. Schallsignale der Hausmaus (Mus musculus). Behaviour. 1974;52(1-2):38–56.
  13. Blanchard RJ, Hebert MA, Ferrari PF, Palanza P, Figueira R, Blanchard DC, et al. Defensive behaviors in wild and laboratory (Swiss) mice: the Mouse Defense Test Battery. Physiol Behav. 1998;65(2):201–9.
  14. Kawakami K, Xiao B, Ohno R, Ferdaus MZ, Tongu M, Yamada K, et al. Color preferences of laboratory mice for bedding materials: evaluation using radiotelemetry. Exp Anim. 2012;61(2):109–17.
  15. Davies JR, Purawijaya DA, Bartlett JM, Robinson ESJ. Impact of refinements to handling and restraint methods in mice. Animals (Basel). 2022;12(17).
  16. Leussis MP, Bolivar VJ. Habituation in rodents: a review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci Biobehav Rev. 2006;30(7):1045–64.
  17. Ahlström T. Handling and training mice and rats: low stress procedures. London: National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs); 2023.
  18. Henderson LJ, Dani B, Serrano EMN, Smulders TV, Roughan JV. Benefits of tunnel handling persist after repeated restraint, injection, and anesthesia. Sci Rep. 2020;10(1):14562.
  19. Gouveia K, Hurst JL. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Sci Rep. 2019;9(1):20305.
  20. Krzyzaniak O, Steiner S, Nilsson FAM, Dietrich M, Kampfen L, Johansen P, et al. Applicability of the micropipette-guided drug administration (MDA) method for assessing reward-related behaviors in mice. Physiol Behav. 2025;299:114967.
  21. Cinelli P, Rettich A, Seifert B, Burki K, Arras M. Comparative analysis and physiological impact of different tissue biopsy methodologies used for the genotyping of laboratory mice. Lab Anim. 2007;41(2):174–84.
  22. Pare WP, Glavin GB. Restraint stress in biomedical research: a review. Neurosci Biobehav Rev. 1986;10(3):339–70.
  23. Hurst JL, West RS. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 2010;7(10):825–6.
  24. Gouveia K, Hurst JL. Reducing mouse anxiety during handling: effect of experience with handling tunnels. PLoS One. 2013;8(6):e66401.
  25. Faure A, Pittaras E, Nosjean A, Chabout J, Cressant A, Granon S. Social behaviors and acoustic vocalizations in different strains of mice. Behav Brain Res. 2017;320:383–90.
  26. Yamauchi T, Yoshioka T, Yamada D, Hamano T, Ohashi M, Matsumoto M, et al. Cold-restraint stress-induced ultrasonic vocalization as a novel tool to measure anxiety in mice. Biol Pharm Bull. 2022;45(3):268–75.
  27. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs). Handling and restraint: General principles. London: NC3Rs; https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/handling-and-restraint
  28. Lee EH, Park JY, Kwon HJ, Han PL. Repeated exposure to short-term behavioral stress resolves pre-existing stress-induced depressive-like behavior in mice. Nat Commun. 2021;12(1):6682.
  29. Mink D, Horvath D, Basler M. Protocol to study social transmission of stress in group-housed mice using restraint stress. STAR Protoc. 2025;6(4):104224.
  30. Ding JX, Rudak PT, Inoue W, Haeryfar SMM. Physical restraint of mouse models to assess immune responses under stress with or without habituation. STAR Protoc. 2021;2(4):100838.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3R
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи