Методическая статья

Безметковый метод высокопроизводительного противовирусного скрининга в режиме реального времени на основе импеданса

0 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72539

⸱

3 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, 2Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, 3Department of Pathology, Microbiology and Immunology, 4Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Метод анализа клеток в реальном времени на основе импеданса (RTCA) позволяет проводить безметочную количественную оценку цитопатического действия вирусов в режиме реального времени, предоставляя экспресс-метод оценки противовирусных соединений и моноклональных антител с помощью интегрированного программного рабочего процесса анализа.

Аннотация

Технологии на основе измерения импеданса обеспечивают надежный и объективный способ количественной оценки цитопатических эффектов (ЦПЭ) в монослоях клеточных культур, преодолевая ограничения традиционных конечных или визуально субъективных методов анализа. Цитолитические вирусы обычно вызывают выраженные морфологические изменения и гибель клеток в инфицированных культурах, что делает измерения импеданса, отражающие изменения в адгезии, морфологии и жизнеспособности клеток, чувствительным и динамичным индикатором вирусной инфекции и ее прогрессирования. В результате показатели импеданса представляют собой мощный и эффективный подход для оценки защитного действия противовирусных средств. В данном исследовании представлена бесмаркерная платформа для скрининга в режиме реального времени, использующая передовые системы измерения импеданса для непрерывного мониторинга индуцированного вирусом ЦПЭ. Этот подход позволяет проводить быструю количественную оценку противовирусной эффективности как низкомолекулярных препаратов, так и моноклональных антител без дополнительных этапов маркировки или окрашивания. В протоколе подробно описан полный рабочий процесс анализа: от посева клеток и вирусного заражения до сбора и анализа данных. Кроме того, интегрированное в систему программное обеспечение, специально адаптированное для применения в вирусологии, оптимизирует обработку и интерпретацию данных, облегчая определение нейтрализующей активности моноклональных антител и эффективности противовирусных соединений.

Введение

В условиях угрозы вирусной вспышки вакцины и противовирусные терапевтические средства представляют собой основные стратегии для ограничения передачи вируса и лечения инфицированных пациентов1. Вакцины предотвращают инфекцию, подготавливая иммунную систему к распознаванию патогенов, и обеспечивают проактивную и долгосрочную защиту. Противовирусные терапевтические средства имеют различное применение в зависимости от модальности и структуры препарата. Подобно вакцинам, моноклональные антитела могут обеспечивать проактивную, длительную защиту (от нескольких недель до многих месяцев), а также могут использоваться в качестве средства контроля после воздействия патогена. Как моноклональные антитела, так и низкомолекулярные противовирусные препараты используются для лечения установленных инфекций путем прямого воздействия на вирусные компоненты или их ингибирования, что снижает тяжесть заболевания и служит реактивным краткосрочным вмешательством.

Общепринятым подходом для функциональной оценки противовирусной активности в биологических системах является тест нейтрализации по снижению титра вируса (VRNT), который количественно определяет снижение образования бляшек в тестах нейтрализации по снижению количества бляшек (PRNT), очагов via иммуноокрашивания в тестах нейтрализации по снижению количества очагов (FRNT) или цитопатического действия (ЦПД) с использованием анализов, основанных на жизнеспособности клеток. PRNT считается «золотым стандартом» фенотипического метода определения ингибирующей активности противовирусных агентов против широкого спектра вирусных инфекций2. Однако PRNT является трудоемким и длительным процессом, а интерпретация результатов может быть субъективной, особенно при разрастании или слиянии бляшек во время длительной инкубации. Объективность считывания данных анализа может быть повышена с помощью FRNT, который основан на обнаружении вирус-специфических антигенов или экспрессии репортерного гена. Тем не менее, этот подход может быть ограничен доступностью и эффективностью высококачественных антител или детектирующих ферментов. Ряд реагентов и протоколов анализа хорошо известны и широко используются для оценки жизнеспособности клеток, измеряя определенные аспекты ЦПД. Ферментативное восстановление колориметрического реагента MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия бромид), который представляет собой монотетразолиевую соль, митохондриальными дегидрогеназами в живых клетках создает количественно определяемый колориметрический сигнал за счет образования окрашенного продукта — формазана. Реагент для анализа жизнеспособности (который лизирует клетки и высвобождает внутриклеточный ATP, запускающий реакцию, катализируемую люциферазой, в результате которой субстрат люциферин превращается в оксилюциферин) представляет собой гомогенный люминесцентный анализ. Такие анализы жизнеспособности клеток могут применяться для количественной оценки снижения ЦПД при скрининге противовирусных агентов3. Однако эти методы также требуют многократных этапов промывки и окрашивания и, подобно анализам PRNT и FRNT, являются конечными (endpoint) анализами. В результате частично эффективные противовирусные агенты, оказывающие отсроченный эффект на вирусную инфекцию, могут быть упущены, если противовирусный анализ прекращается в субоптимальный момент времени. Таким образом, существует острая необходимость в автоматизированном методе анализа средней и высокой пропускной способности, который обеспечивал бы мониторинг клеточных ответов на вирусные инфекции в режиме реального времени.

Системы анализа клеток в реальном времени (RTCA) позволяют осуществлять непрерывный мониторинг развития цитопатического действия (ЦПД) и противовирусных ответов в пермиссивных клеточных моделях с помощью безмаркерного неинвазивного считывания на основе импеданса. Вирус-индуцированное ЦПД включает в себя не только гибель клеток, но и изменения клеточной морфологии и адгезии, которые могут быть чувствительно обнаружены по изменениям электрического импеданса4,5. Эти измерения импеданса проводятся с использованием золотых микроэлектродных датчиков, встроенных в специализированный 96-луночный планшет для культивирования клеток, что позволяет количественно оценивать динамические клеточные ответы без необходимости использования маркеров или экспрессии репортерных генов. Технология RTCA широко описана для обнаружения ЦПД в различных клеточных моделях, инфицированных вирусами из многих семейств, а также для оценки нейтрализующей активности антител6–10.

Ниже представлены основные этапы данного метода бесмаркерного анализа импеданса в режиме реального времени in vitro были определены методы противовирусного анализа. Данный подход основывался на предыдущих исследованиях, включавших скрининг противовирусных соединений в клетках HEK293A, инфицированных аденовирусом 5, и оценку нейтрализующих антител с использованием репликационно-компетентного рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего гликопротеин вируса Ласса (rVSV-LASV(Lin IV)), в клетках Vero CCL-81.11Все эти эксперименты проводили на системе RTCA MP, которая поддерживает одновременную работу до 6× 96-луночные планшеты одновременно. Целью данной работы было создание основы для противовирусного скрининга на базе импедансного метода. После определения оптимальных условий анализа с помощью описанного здесь протокола данный метод можно будет легко адаптировать для широкого спектра моделей «вирус-клетка».

Протокол

Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Культивирование и пассирование пермиссивных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе клетки Vero CCL-81 используются для нейтрализации антител, тогда как клетки HEK293A применяются для скрининга противовирусных соединений. Для уменьшения вариабельности между экспериментами настоятельно рекомендуется создать банк пермиссивных клеток одного и того же пассажа для проведения анализа.

  1. Перед использованием предварительно прогрейте среду для роста клеток — модифицированную среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина, на водяной бане при 37°C.
  2. Разморозьте флакон с криоконсервированными пермиссивными клетками на водяной бане при 37°C до тех пор, пока не останется лишь небольшой кристалл льда; не погружайте крышку флакона в воду. 
  3. Протрите внешнюю поверхность флакона с размороженными клетками 70% этанолом и поместите его в бокс биологической безопасности (BSC).
  4. Осторожно перенесите клетки в новый конический пробирку объемом 50 mL и по каплям добавьте к клеткам 9 mL теплой среды для роста. Аккуратно перемешайте.
  5. Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 × g в течение 5 min при комнатной температуре (RT).
  6. Перенесите ресуспендированные в 5 mL предварительно прогретой среды для роста клетки в новый флакон T-25.
  7. Культивируйте клетки до достижения 80%–90% конфлюэнтности в инкубаторе при 37°C и 5% CO2 перед следующим субкультивированием. 
  8. Выполните пассаж клеток.
    1. Аспирируйте среду и осторожно дважды промойте монослой клеток 3 mL 1× фосфатно-солевого буфера (PBS) без кальция и магния для удаления остатков среды для роста.
    2. Добавьте во флакон 2 mL 0,25% раствора трипсин-ЭДТА, чтобы покрыть клетки.
    3. После 2–5 min инкубации при 37°C нейтрализуйте трипсин, добавив пятикратный объем предварительно прогретой среды для роста.
    4. Ресуспендируйте клетки, осторожно перемещая суспензию пипеткой вверх-вниз у стенки флакона.
    5. Рассейте клетки с использованием свежей среды с заданной плотностью посева или коэффициентом разделения. 
      ПРИМЕЧАНИЕ: Желаемая плотность посева клеток определяется эмпирически на основе скорости роста клеток, частоты пассажей и целевой конфлюэнтности на момент пассирования. Например, посев клеток Vero CCL-81 с плотностью не менее 0,4 × 104 клеток/cm2 позволяет проводить пассаж каждые 3 дня до достижения клетками 90% конфлюэнтности.

2. Скрининг противовирусных агентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 1 на схеме представлен рабочий процесс анализа противовирусного скрининга на основе импеданса. Вкратце: чувствительные клетки высевают в 96-луночные микропланшеты со встроенными микроэлектродами, и состояние клеток контролируют в течение примерно 24 ч до начала анализа. Для тестов на нейтрализацию антителами вирусы с фиксированной множественностью заражения (MOI) смешивают с антителами и преинкубируют в течение 1 ч перед добавлением к клеткам. Напротив, при скрининге противовирусных соединений вирусы с фиксированной MOI и соединения добавляют к клеткам одновременно. Индуцированный вирусом цитопатический эффект (ЦПЭ) непрерывно контролируют с помощью показателей импеданса, а анализ данных может проводиться как во время анализа, так и после его завершения.

  1. День 0: Измерение фонового сигнала планшета и посев пермиссивных клеток
    1. Для начала эксперимента откройте программное обеспечение прибора (RTCA Pro) и выберите необходимую кассету для анализа. Затем выберите Вирусология модуль перед началом эксперимента.
    2. Введите любые соответствующие примечания в Примечания к эксперименту таб. (например, Название эксперимента, Серийный номер устройства, Тип устройства, или другие соответствующие сведения). Эти поля являются необязательными и могут быть оставлены пустыми, если они неприменимы.
    3. Перейдите к Схема расположения вкладку и определите лунки, используемые в эксперименте. Если определенные лунки не будут использоваться, выделите неиспользуемые лунки, щелкните правой кнопкой мыши в интерфейсе схемы планшета и выберите Выключить лунку(и) из выпадающего меню, чтобы исключить их из анализа.
    4. Измерение фона 96-луночного микропланшета с интегрированными микроэлектродами
      1. Дозировать 50 µL аналитической среды в каждую лунку планшета с помощью многоканального дозатора в режиме обратного пипетирования для минимизации образования пузырьков.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор среды для анализа должен быть оптимизирован перед проведением скрининга, чтобы минимизировать влияние на чувствительность анализа и обеспечить точную оценку эффективности терапии. Например, анализы по нейтрализации антител проводили в среде DMEM, содержащей 2% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, тогда как в анализах по скринингу противовирусных соединений использовали среду для роста клеток — DMEM, содержащую 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина.
      2. Поместите планшет в ложемент прибора, расположенный внутри 37 °C инкубатор с 5% CO22Убедитесь, что планшет ориентирован правильно и лунка A1 расположена в соответствии с указанием. Затем проверьте вкладку Message на наличие уведомлений об ошибках.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз при установке планшета в держатель проверяйте, появилось ли сообщение «Plate scanned. Connections okay» (Планшет отсканирован. Соединения в норме). В случае возникновения ошибки извлеките планшет и установите его в держатель повторно.
      3. Перейдите к График вкладка; по умолчанию отображается Шаг 1, так как он является обязательным для измерения фона планшета. Нажмите на Старт кнопка для запуска записи данных из лунок. Шаг автоматически завершается после регистрации одного измерения фонового импеданса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Данный этап постановки фона должен быть выполнен перед каждым экспериментом. Все лунки, используемые в эксперименте, должны содержать только assay medium (т. е. до посева клеток).
    5. Пермиссивный посев клеток в 96-луночный планшет с интегрированными микроэлектродами
      1. Проведите трипсинизацию пермиссивных клеток в колбе T25, следуя этапам, описанным в разделе по пассированию пермиссивных клеток.
      2. Подсчитайте количество клеток, ресуспендированных в assay-среде, и выполните следующие расчеты:
        1. Рассчитайте общее количество жизнеспособных клеток в суспензии, используя плотность жизнеспособных клеток: Общее количество жизнеспособных клеток = плотность жизнеспособных клеток × объем суспензии
        2. Доведите суспензию клеток до конечной плотности (например, 0,30–0,35 × 106 клеток/мл для Vero CCL-81, что эквивалентно примерно 15 000–18 000 клеткам на 50 µL, или 0,12 × 106 клеток/мл для HEK293A, что эквивалентно 6 000 клеткам на 50 µL).
          ПРИМЕЧАНИЕ: Данные плотности посева были предварительно определены как оптимальные для каждой модели «вирус — клетка». Соблюдение правильной плотности посева клеток имеет принципиальное значение, так как избыточное или недостаточное количество клеток может повлиять на чувствительность анализа.
      3. Извлеките микропланшет, содержащий 50 µL извлеките среду для анализа из прибора и перенесите ее в бокс биологической безопасности для посева клеток.
      4. Дозировать 50 µL суспензии клеток в каждую лунку планшета с помощью многоканального дозатора в режиме обратного пипетирования для минимизации образования пузырьков, доводя конечный объем в каждой лунке до 100 µL.
    6. После добавления клеток оставьте планшет в боксе биологической безопасности при комнатной температуре на 30 мин для обеспечения равномерного распределения клеток по дну каждой лунки.
    7. Верните планшет в ложемент прибора, расположенный внутри 37 °C инкубатор с 5% CO22.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании нескольких планшетов четко промаркируйте каждый из них и убедитесь, что каждый планшет возвращен в тот же держатель, который использовался при измерении фона.
    8. Перейдите к Схема размещения перейдите на вкладку и откройте Клетка вкладка. Выберите соответствующие лунки, введите пермиссивную клетку Наименование и Номери нажмите на Применить для сохранения информации. Данные о клетках также могут быть введены или обновлены в любой момент в ходе эксперимента.
    9. Добавьте шаг 2 на График вкладку, используя стандартные настройки записи (100 разверток и 15-минутный интервал), затем нажмите на Старт для начала непрерывного ночного мониторинга адгезии и пролиферации клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данный этап служит мерой контроля качества (КК) клеток перед инокуляцией вируса. Поскольку клеточный индекс (Cell Index, CI) отражает адгезию и пролиферацию клеток, значения CI, полученные в течение 18–24 часов после посева, используются в качестве ключевого показателя КК. Воспроизводимость поведения клеток в разных экспериментах имеет важное значение для оптимальной воспроизводимости анализа. Следует отметить, что как амплитуда CI, так и кинетические профили зависят от типа клеток. Например, после культивирования в течение ночи здоровые клетки Vero CCL-81, посеянные в концентрации 18 000 клеток на лунку, обычно имеют клеточный индекс 6–8, тогда как здоровые клетки HEK293A, посеянные в концентрации 6 000 клеток на лунку, обычно имеют клеточный индекс 0,8–1,2.
  2. День 1: Скрининг противовирусных агентов на основе импедансного метода
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением скринингового анализа необходимо провести соответствующее титрование вируса для определения оптимального рабочего разведения. Этот этап позволяет установить концентрацию вируса, обеспечивающую стабильную и воспроизводимую работу анализа при соблюдении заданных пользователем требований, таких как желаемая продолжительность анализа. Например, в протоколе нейтрализации антител11для анализа нейтрализации была выбрана множественность заражения (MOI) 0,01, так как при таком значении наблюдался полный (100%) цитопатический эффект (ЦПЭ) в течение 40 ч после инокуляции. В анализе на основе импеданса полный ЦПЭ характеризуется снижением клеточного индекса (Cell Index) или нормализованного клеточного индекса (Normalized Cell Index) до нуля. При скрининге противовирусных соединений использовалась MOI, равная 1, при этом 100% ЦПЭ наблюдался в течение 70 ч после инокуляции. Протокол титрования вируса проводился в соответствии с общепринятыми процедурами, описанными в предыдущем отчете12Если в анализе используются инфекционные вирусы, убедитесь в соблюдении всех соответствующих мер предосторожности. Обратитесь к разделу руководства по технике безопасности при работе с инфекционными вирусами.
    1. Приготовьте вирус в заданной концентрации и сделайте серийные разведения антитела или противовирусного соединения в среде для анализа.
    2. Для проведения анализов на нейтрализующую способность моноклональных антител смешайте 60 µL вируса при 4× конечная концентрация в анализе с 60 µL антител при 4× конечная концентрация в анализе и инкубирование при 37 °C в течение 1 ч перед добавлением к пермиссивным клеткам. После смешивания вирус и антитело присутствуют в соотношении 2× их конечных рабочих концентраций в анализе. Напротив, для анализов по скринингу противовирусных соединений предварительная инкубация вируса с соединением не требуется.
    3. Перейдите к Схема расположения перейдите на вкладку и выберите Лечение вкладка для ввода информации о воздействии противовирусных препаратов в соответствующих лунках.
    4. Выберите лунки для одного и того же варианта обработки, затем введите Наименование из реагентов и введите начальное Разведение или КонцентрацияНапример, если исходная концентрация составляет 10 µg/mLВведите 10 и выберите µg/mL как «Единица». Введите 3 как Коэффициент разведения и укажите Направление разведения (например, сверху вниз).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После нажатия на Применитьконцентрации или разведения противовирусного препарата будут рассчитаны и сохранены автоматически на основе введенной схемы планшета и отображены в соответствующих лунках. Рассчитанные значения также сохраняются для последующего анализа данных. При вводе информации о вирусе (например, Наименование и Разведение) является необязательным, так как в данном анализе используется единая фиксированная множественность заражения (MOI) для всех лунок, обработанных вирусом.
    5. Назначьте лунки, подвергшиеся воздействию только вируса, в качестве положительных контролей, выбрав соответствующие лунки и указав Положительный контроль под Тип лунки.
    6. Назначьте неинфицированные лунки в качестве отрицательного контроля, выполнив описанный выше шаг и проверив Отрицательный контроль под Тип лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное определение лунок, содержащих только вирус, и неинфицированных лунок в качестве Положительный контроль и Отрицательный контроль, соответственно, с использованием Тип лунки Правильная настройка имеет решающее значение, так как значения CI в этих лунках используются во всех расчетах, связанных с нейтрализацией (например, % нейтрализации). Для расчетов, связанных с ЦПЭ (например, % ЦПЭ), требуются лунки, специально предназначенные для отрицательного контроля. Для анализов нейтрализации антител настоятельно рекомендуется включать на одну планшету как положительные, так и отрицательные контрольные антитела для обеспечения точной интерпретации данных. Однако эти контрольные антитела должны быть обозначены как Образцы под Тип лунки.
    7. Когда анализ будет готов к добавлению противовирусного агента, нажмите Прервать текущий шаг кнопка для пропуска оставшихся циклов сканирования на этапе 2 и перехода к следующему этапу.
    8. Нажмите на Разблокировка планшета нажмите кнопку, затем извлеките планшет из держателя и поместите его в бокс биологической безопасности.
    9. Осторожно дозируйте 100 µL смеси вируса с антителами или смеси вируса с противовирусным соединением в каждую лунку с помощью многоканального дозатора так, чтобы конечный объем в лунке составил 200 µLИнокулят содержит вирус и антитело или противовирусное соединение при 2× их конечные концентрации в анализе, которые разбавляются до конечных рабочих концентраций при добавлении к клеткам.
    10. После возвращения планшета в держатель перейдите к График нажмите клавишу Tab и добавьте: Шаг 3. Укажите количество Сканирования и the Интервалмежду развертками. Убедитесь, что общая продолжительность развертки (количество разверток × интервал) превышает ожидаемую продолжительность лечения. Нажмите на Начало для возобновления сбора данных и продолжения анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение отдельного этапа (например, Этап 3) после добавления противовирусного препарата облегчает идентификацию периода мониторинга после обработки. Всегда программируйте каждый этап (за исключением Этапа 1) на время, превышающее ожидаемую продолжительность анализа. Если запрограммированное время работы истечет, прибор прекратит сбор измерений, что приведет к потере точек данных.
  3. День 1 и последующие дни: анализ данных
    1. Для просмотра записи в реальном времени и/или анализа клеточных ответов в процессе сбора данных перейдите в раздел Анализ данных вкладка, выберите определенный момент времени или временной интервал, затем выберите и добавьте лунки, которые должны быть включены в анализ для отображения на графике.
    2. Выберите параметры из Ось Y выпадающее меню. Когда Нормализованный клеточный индекс выбрано (NCI), укажите Время нормализации— временную точку непосредственно перед началом лечения из выпадающего списка «Время». %ЦПЭ или %Нейтрализации также может быть отображено путем выбора соответствующего параметра в раскрывающемся меню оси Y.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор использует безразмерный параметр — клеточный индекс (Cell Index, CI) — для представления импеданса. Для оценки различий между вариантами обработки при минимизации влияния естественной вариабельности между лунками рекомендуется использовать нормализованный клеточный индекс (Normalized Cell Index, NCI).
    3. Перейдите к Параметр раздел о Анализ данных вкладка для расчета и построения различных типов графиков, таких как столбчатая диаграмма и кривые зависимости «доза — ответ» на основе 4-параметрической логистической (4PL, с переменным наклоном) регрессии для конкретной временной точки (например, в середине или в конце анализа). В качестве альтернативы, IC₅₀ значение, рассчитанное на основе площади под кривой (AUC) клеточного индекса или нормализованного клеточного индекса после обработки, позволяет оценить общий дозозависимый ответ на противовирусные препараты на протяжении всего периода лечения.
    4. По окончании теста нажмите на Паузазатем нажмите Разблокируйте планшет кнопку. Извлеките планшет из держателя и в электронном виде Выпуск it посредством the Планшет меню

3. Руководство по технике безопасности при работе с инфекционными вирусами

  1. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты: две пары перчаток, защитный экран для лица и лабораторный халат. Это настоятельно рекомендуется при работе с вирусами.
  2. Все манипуляции с материалами, содержащими вирус, и их внесение в планшеты должны проводиться исключительно внутри работающего бокса биологической безопасности (БББ).
  3. Транспортируйте флаконы с вирусом и любые планшеты, содержащие вирусы, в БББ и из него в герметичном контейнере для биобезопасности.
  4. До и после работы с материалами, содержащими вирус, в БББ тщательно распылите дезинфицирующее средство на все внутренние поверхности и выдержите время экспозиции 5 min для обеспечения полной инактивации вируса. Протрите поверхности насухо, а затем продезинфицируйте их 70% этанолом для удаления остатков дезинфицирующего средства.
  5. По завершении противовирусного скринингового анализа на основе импеданса извлеките все планшеты из прибора и переместите их в герметичном контейнере для биобезопасности непосредственно в чистый БББ.
  6. Приготовьте свежий 20% раствор гипохлорита натрия и добавьте его в каждую лунку анализ-планшетов. Выдержите раствор в течение 10 min, после чего аспирируйте его из всех лунок и утилизируйте планшеты.
  7. Продезинфицируйте раствором гипохлорита натрия все анализ-планшеты, серологические пипетки, наконечники для пипеток, пробирки и другие одноразовые пластиковые изделия, которые могли контактировать с вирусом, и утилизируйте их в специальные пакеты для биоопасных отходов.
  8. Обработайте многоразовые пластиковые изделия, такие как штативы для пробирок и пипетки, распылением дезинфицирующего средства и протрите их.

Результаты

Безмаркерное импедансное считывание в режиме реального времени выявляет вызванный вирусом ЦПЭ и противовирусную защиту
Как показано на рисунке 2A, клетки-хозяева HEK293A высевали в 96-луночный планшет с интегрированными микроэлектродами с плотностью 6 000 клеток на лунку13. После 24-часовой инкубации добавляли аденовирус 5 типа с MOI равным 1 в присутствии или отсутствии противовирусных соединений. Клеточные ответы на вирусную инфекцию и противовирусную терапию непрерывно контролировали с помощью безмаркерных измерений импеданса в режиме реального времени. В отсутствие вируса клетки непрерывно пролиферировали в течение 80-часового периода мониторинга, достигая конфлюэнтности, что проявлялось в виде устойчивого увеличения импеданса с последующим выходом на плато. Инфекция аденовирусом первоначально допускала рост клеток в течение примерно 20 ч, после чего наблюдался выраженный ЦПЭ, что привело к быстрому снижению сигнала импеданса до базового уровня примерно к 65 ч после заражения. Применение ставудина (50 µM) или рибавирина (20 µM) оказывало минимальное влияние на вызванный вирусом ЦПЭ, при этом кривые импеданса были очень схожи с кривыми клеток, инфицированных только вирусом. Ганцикловир (50 µM) продемонстрировал умеренную противовирусную активность, о чем свидетельствовало частичное восстановление нормализованного клеточного индекса (Normalized Cell Index). Напротив, цидофовир (50 µM) и бринцидофовир (1 µM) заметно ослабляли ЦПЭ, создавая профили импеданса, сравнимые с профилями неинфицированных клеток отрицательного контроля. Примечательно, что ни одно из соединений в протестированных концентрациях в предварительных исследованиях не оказывало существенного влияния на клеточный индекс по сравнению с контролем, обработанным носителем (данные не представлены).

В анализе нейтрализации антител на основе импеданса клетки Vero CCL-81 высевали с плотностью 18 000 клеток на лунку в 96-луночный планшет с интегрированными микроэлектродами и культивировали в течение 24 ч перед заражением. В день проведения анализа моноклональные антитела преинкубировали с rVSV–LASV при MOI 0,01 в течение 1 ч перед добавлением к клеткам. Для протестированных моноклональных антител (мАТ) наблюдались различные профили нейтрализации. Для наглядности на рисунке 2B представлены репрезентативные результаты для антител, проявляющих сильную, частичную или отсутствующую нейтрализующую активность. Ненейтрализующие антитела вызывали полный ЦПЭ, при этом кривые импеданса совпадали с кривыми контрольных групп, зараженных только вирусом. Антитела с промежуточной нейтрализующей активностью частично снижали индуцированную вирусом цитотоксичность, что приводило к ослаблению, но сохраняемому ЦПЭ. Напротив, полностью нейтрализующие антитела полностью подавляли ЦПЭ, поддерживая сигналы импеданса на уровне контрольных незараженных клеток. В совокупности эти профили импеданса позволили четко дифференцировать ненейтрализующие, частично нейтрализующие и полностью нейтрализующие моноклональные антитела.

Количественное определение и характеристика противовирусной активности
Продемонстрировав способность метода RTCA на основе импеданса выявлять «хиты» в библиотеке лекарственных препаратов и мАТ, авторы исследования далее стремились охарактеризовать эффективность ведущих соединений и антител. Постепенное увеличение концентрации противовирусного препарата бринцидофовир от 15,6 нМ до 1000 нМ приводит к ступенчатому росту сигнала импеданса; чем выше концентрация препарата, тем больше поведение клеток соответствует неинфицированному контролю (Рисунок 3A). Кроме того, обработка одним только бринцидофовиром привела к незначительному увеличению NCI только при самой высокой из протестированных концентраций (1100 нМ). Однако при концентрациях ниже 1100 нМ NCI умеренно снижался, хотя данный эффект не имел дозозависимого характера. Этот результат указывает на то, что восстановление клеточного индекса (Cell Index) было обусловлено исключительно противовирусной активностью препарата, а не прямым стимулированием пролиферации или адгезии клеток (Рисунок 3B). Построение графика площади под кривой нормализованного клеточного индекса (AUC) в зависимости от концентрации бринцидофовира позволяет получить кривую доза-эффект, которая демонстрирует отличное соответствие (R2 с коэффициентом 0,99) и указывает на IC50 составляющей 265 нМ (Рисунок 3C). В анализе нейтрализующей способности антител по окончании исследования (приблизительно через 50 ч после обработки) системное программное обеспечение автоматически рассчитывало процент нейтрализации для каждой концентрации мАТ и IC50 впоследствии были получены значения. Как показано в Рисунок 3Dв отличие от антитела отрицательного контроля rANDV-5, остальные три моноклональных антитела (мАТ) — r37.2D, r25.1C и r12.1F — продемонстрировали высокую противовирусную активность с IC₅₀ значения 4,315 нг/мл, 83 нг/мл или 232 нг/мл соответственно14,15.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое изображение рабочего процесса анализа противовирусного скрининга на основе импеданса. День 0, этап 1: Пермиссивные клетки высевали в микропланшеты, и рост клеток контролировали в держателе прибора, помещенного в инкубатор при 37 °C с 5% CO2 в течение примерно 24 ч. День 1, этап 2: Готовили вирус с фиксированной MOI и серийные разведения противовирусных агентов. Для анализов нейтрализации антителами вирус предварительно инкубировали с антителами при 37 °C в течение 1 ч перед добавлением смеси к клеткам. Этап 3: Смеси вируса и противовирусного агента добавляли к клеткам. День 1 и далее, этап 4: Индуцированный вирусом ЦПЭ непрерывно контролировали с помощью измерений импеданса в течение нескольких дней. Этап 5: Данные анализировали в режиме реального времени или после завершения анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Мониторинг противовирусной активности в режиме реального времени с использованием измерений индекса клеток (Cell Index) на основе импеданса. (A) Скрининг противовирусных препаратов, проведенный с помощью импедансного анализа. Все соединения тестировались в концентрации 50 µM, за исключением рибавирина (20 µM) и бринцидофовира (1 µM), в присутствии аденовируса 5 типа при MOI 1. Данные представлены как среднее значение ± SD по трем повторностям в лунках. Рисунок адаптирован из работы Zhang et al.13. (B) Анализ нейтрализации моноклональными антителами на основе импеданса. Показаны репрезентативные профили Cell Index для моноклональных антител, не проявляющих нейтрализации (полный ЦПЭ, красный), частичной нейтрализации (частичный ЦПЭ, оранжевый) или мощной нейтрализации (ЦПЭ не обнаружен, черный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Количественное определение противовирусной активности с помощью импеданса. (A) Динамические изменения нормированного клеточного индекса в реальном времени после обработки возрастающими концентрациями бринцидофовира в сочетании с инфицированием аденовирусом 5 типа при MOI 1. (B) Динамические изменения нормированного клеточного индекса в реальном времени после обработки возрастающими концентрациями только бринцидофовира. (C) Площадь под кривыми импеданса была отложена в зависимости от концентрации бринцидофовира для построения кривой доза-эффект. (A) и (C) адаптированы из работы Zhang et al.13. (D) Репрезентативные кривые нейтрализации rVSV–LASV Lineage IV (Josiah) для моноклональных антител r37.2D, r25.1C, r12.1F и rANDV-5, включенного в качестве отрицательного контроля. Моноклональные антитела 37.2D, 25.1C, 12.1F и ANDV-5 были получены рекомбинантным путем на основе имеющейся литературы (см. раздел «Результаты»). Представленные данные являются репрезентативными кривыми двух независимых экспериментов и приведены как среднее значение ± SD по трем повторностям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Как и все анализы на основе клеточных культур, метод противовирусного скрининга RTCA требует оптимизации для каждой системы «вирус–клетка». Поскольку данный анализ регистрирует вызванный вирусом цитопатический эффект (ЦПЭ) через изменения импеданса, он зависит от использования пермиссивной клеточной модели, поддерживающей репликацию вируса и развитие измеримого ЦПЭ. Вирусы, не вызывающие детектируемого по импедансу ЦПЭ, могут не подойти для данного подхода; в таких случаях, при наличии специфических антивирусных антител, могут быть использованы альтернативные методы, такие как FRNT. Другим важным аспектом является то, что изменения индекса клеток (Cell Index) не всегда вызваны исключительно вирусным цитолизом. Изменения морфологии, адгезии, пролиферации и прикрепления клеток также могут влиять на сигналы импеданса и потенциально искажать оценку противовирусной активности. Следовательно, влияние противовирусных агентов на Cell Index следует оценивать в предварительных исследованиях или с помощью соответствующих контролей, содержащих только агент. В настоящем исследовании для максимизации количества оцениваемых агентов на одну планшетку контроли с одним только противовирусным агентом тестировались перед скрининговым анализом для установления базового эффекта каждого кандидата в отсутствие вирусной инфекции. На эффективность анализа также влияют такие факторы, как плотность посева клеток, время инокуляции вируса и состав среды, которые могут воздействовать на рост клеток, репликацию вируса, развитие ЦПЭ и воспроизводимость анализа7,10,16. Следовательно, систематическая оптимизация необходима для обеспечения стабильности и надежности противовирусного скрининга на основе RTCA.

После установления оптимальных условий анализа для успешного проведения противовирусных анализов в режиме реального времени на основе импеданса требуются единообразный посев клеток, жизнеспособность клеток и стабильные условия анализа. Высокая вариабельность между лунками часто вызвана неравномерным распределением клеток или неточным дозированием; поэтому перед посевом клеточные суспензии следует тщательно перемешивать, а планшеты оставить при RT на 30 мин после посева для обеспечения равномерного оседания клеток и уменьшения краевых эффектов. Рекомендуется использовать минимум три повторности для каждого варианта обработки; также настоятельно рекомендуется использовать дополнительные повторности для отрицательного (неинфицированного) и положительного (только вирус) контролей, так как эти значения служат точками отсчета для расчета %CPE и %Neutralization для всех условий обработки. Если индуцированный вирусом CPE выражен слабо или неоднородно, следует проверить качество стока вируса и состояние пермиссивной клеточной линии. Для сохранения инфекционности вируса избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания, подготавливая одноразовые аликвоты вируса для каждого эксперимента. Наконец, для минимизации экспериментальной вариабельности и повышения воспроизводимости анализа настоятельно рекомендуется использовать банк клеток, содержащий пермиссивные клетки с одинаковым номером пассажа. Если индекс клеток (Cell Index), измеренный непосредственно перед инфицированием (обычно примерно через 24 ч после посева), оказывается ниже установленного контрольного значения для данной пермиссивной клеточной линии, что указывает на субоптимальное состояние или рост клеток, эксперимент следует прекратить. В таких случаях необходимо разморозить новый флакон криоконсервированных клеток и повторить противовирусной скрининговый анализ.

Когда антивирусный скрининговый анализ проводится в строго контролируемых, оптимизированных условиях, что подтверждается представленными здесь данными скрининга, анализ на основе импеданса позволяет точно количественно определить снижение ЦПЭ в режиме реального времени под действием противовирусных агентов. В отличие от традиционных подходов, основанных на трудоемких измерениях конечной точки, непрерывное и неинвазивное считывание импеданса обеспечивает лонгитюдный мониторинг всего спектра индуцированного вирусом повреждения клеток и кинетических профилей противовирусных ответов. Эта возможность измерения в режиме реального времени облегчает определение оптимальных временных интервалов для выявления не только ранних, но и отложенных противовирусных эффектов, которые могут быть упущены при использовании обычных анализов с измерением конечной точки.

Более того, описанный здесь протокол RTCA обеспечивает более быстрый и существенно упрощенный рабочий процесс для антивирусного скрининга по сравнению с традиционными методами. Анализ требует только первоначального этапа посева клеток с последующим добавлением вируса в присутствии или отсутствие противовирусных агентов. Дополнительные манипуляции или постобработка после анализа не требуются. Настройка эксперимента и анализ данных дополнительно оптимизированы с помощью специализированного программного модуля Virology, который позволяет автоматически рассчитывать параметры, обычно используемые в VRNT, включая %CPE, %нейтрализации, а также максимальный разведение или минимальную концентрацию противовирусного агента, обеспечивающую заданный пользователем уровень нейтрализации. В совокупности эти преимущества позволяют проводить быстрый и параллельный скрининг значительно большего количества условий анализа (сравнение препаратов, расширенные серии разведений и т. д.), чем это обычно возможно при использовании традиционных методов.

Несмотря на то, что описанный здесь анализ был разработан для 96-луночного планшета с соответствующими условиями анализа, изложенными выше, его можно адаптировать для 384-луночного формата. Для проведения этого высокопроизводительного анализа на основе импеданса может быть использована автоматизированная система RTCA, которая позволяет одновременно обрабатывать до четырех 384-луночных планшетов.

Помимо скрининга противовирусных препаратов, данный метод RTCA может быть применен в исследованиях комбинированной терапии, серологии и изучении иммунного ускользания вирусов. Измеряя способность терапевтических антител или иммунных сывороток предотвращать вызванный вирусом ЦПЭ, этот анализ обеспечивает безмаркерную оценку нейтрализующей активности и защитных иммунных ответов в режиме реального времени после инфицирования или вакцинации. Кроме того, сравнение профилей нейтрализации различных вариантов вируса позволяет выявить изменения в восприимчивости, связанные с иммунным ускользанием. В сочетании с геномным секвенированием этот подход может способствовать идентификации антителорезистентных вариантов и поддержать разработку вакцин нового поколения, терапевтических антител и противовирусных стратегий.

Раскрытие информации

J.E.C. оказывал консультационные услуги компаниям Moderna и Merck, является основателем IDBiologics и получает роялти от UpToDate. Лаборатория J.E.C. получала спонсируемые исследовательские соглашения от IDBiologics, не связанные с данным исследованием, в период проведения работы.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами U19 AI181979 и U19AI181930 Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) Национальных институтов здоровья США.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Adenovirus-GFPVector Biolabs 1060
Бринцидофовир (CMX001)AdooQA13326
CaviCideMetrex13-5024дезинфицирующее средство 
ЦидофовирSelleck S1516
Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM)ATCC30-2002
E-Plate 96Agilent523236800196-луночный планшет со встроенными микроэлектродами
Фетальная бычья сывороткаAvantor97068-085
Ганцикловир натрия Selleck S5065
Клетки HEK293AThermo Fisher Scientific  R70507
Многоканальный дозатор ViafloINTEGRAVIAFLO 96
Раствор пенициллина-стрептомицинаGibco10378016
Фосфатно-солевой буфер (1x)HyCloneSH30256.01
Рекомбинантные мАТCrowe LabN/A
РибавиринSelleck S2504
rVSV-LASV (Lin IV)Crowe LabN/A
Ставудин Selleck S1398
0.25% Трипсин 0.53 mM ЭДТА  (1x )ATCC30-2101
12-канальные резервуары для реагентовVistaLab Technologies3054-1011
Vero CCL-81ATCCCCL-81
Вирусологический модульAgilentS2807-90089
Система xCELLigence RTCA MPAgilent380601040

Ссылки

  1. Pardi N, Weissman D. Development of vaccines and antivirals for combating viral pandemics. Nat Biomed Eng. 2020;4(12):1128-1133.
  2. Rocha VPC, Quadros HC, Fernandes AMS, Gonçalves LP, Badaró R, Soares MBP, et al. An overview of the conventional and novel methods employed for SARS-CoV-2 neutralizing antibody measurement. Viruses. 2023;15(7). doi:10.3390/v15071552.
  3. Chen CZ, Shinn P, Itkin Z, Eastman RT, Bostwick R, Rasmussen L, et al. Drug repurposing screen for compounds inhibiting the cytopathic effect of SARS-CoV-2. Front Pharmacol. 2021;11:592737.
  4. Giaever I, Keese CR. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 1993;366(6455):591-592.
  5. Giaever I, Keese CR. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(17):7896-7900.
  6. Suryadevara N, Shrihari S, Gilchuk P, VanBlargan LA, Binshtein E, Zost SJ, et al. Neutralizing and protective human monoclonal antibodies recognizing the N-terminal domain of the SARS-CoV-2 spike protein. Cell. 2021;184(9):2316-2331.e15.
  7. Charretier C, Saulnier A, Benair L, Armanet C, Bassard I, Daulon S, et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 2018;252:57-64.
  8. Ebersohn K, Coetzee P, Venter EH. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 2014;199:25-28.
  9. Marlina S, Shu MH, Abubakar S, Zandi K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasit Vectors. 2015;8:240.
  10. Teng Z, Kuang X, Wang J, Zhang X. Real-time cell analysis—a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. J Virol Methods. 2013;193(2):364-370.
  11. Suryadevara N, Gilchuk P, Zost SJ, Mittal N, Zhao LL, Crowe JE Jr, et al. Real-time cell analysis: a high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 2022;3(2):101387.
  12. Zhang J, Abassi YA, Li N, Wang X, Zhang X. A streamlined, label-free real-time 50% tissue culture infectious dose (TCID50) assay using impedance for automated viral titer quantification. J Vis Exp. 2026;(227). doi:10.3791/73686.
  13. Zhang J, Giang C, Li N, Abassi YA, Lamarche BJ. Screening and characterizing antiviral drugs in real time using xCELLigence RTCA eSight's combination of impedance and imaging. Agilent Technologies; 2022.
  14. Engdahl TB, Kuzmina NA, Ronk AJ, Mire CE, Hyde MA, Kose N, et al. Broad and potently neutralizing monoclonal antibodies isolated from human survivors of New World hantavirus infection. Cell Rep. 2021;35(5):109086.
  15. Robinson JE, Hastie KM, Cross RW, Yenni RE, Elliott DH, Rouelle JA, et al. Most neutralizing human monoclonal antibodies target novel epitopes requiring both Lassa virus glycoprotein subunits. Nat Commun. 2016;7:11544.
  16. Piret J, Goyette N, Boivin G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. J Clin Microbiol. 2016;54(8):2120-2127.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.