Методическая статья

Мышиная модель вагинальной коколонизации Candida albicans и Streptococcus agalactiae

59 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72557

⸱

21 августа 2026 г.

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе подробно описан метод вагинального совместного заселения мышей Candida albicans и Streptococcus agalactiae. Этот метод может быть использован для изучения полимикробных взаимодействий, взаимодействий между хозяином и микробами, а также реакций организма хозяина на эти организмы.

Аннотация

Из влагалища человека выделяют разнообразные микроорганизмы, и многие организмы, населяющие эту нишу, способны переключаться между комменсальным и патогенным образом жизни. На исходы заболеваний влияют такие факторы, как состав сообщества и среда хозяина, однако механизмы, определяющие эти исходы, изучены недостаточно. В данной работе мы описываем мышиную модель для исследования межцарственных взаимодействий и ответа хозяина на Candida albicans и Streptococcus agalactiae (Группа B) Streptococcus, GBS), патобионты, колонизирующие женский половой тракт (ЖПТ). Новые данные свидетельствуют о том, что C. albicans Колонизация является фактором риска носительства GBS в связи с их частой совместной изоляцией. Во время беременности колонизация GBS может привести к неблагоприятным исходам. включая хориоамнионит и мертворождение. GBS также может передаваться плоду in utero (внутриматочный) или новорожденного во время родов и является основной причиной неонатального менингита. Колонизация влагалища является критическим предшественником заболевания, вызванного GBS, и эта ниша оказывает многочисленные селективные воздействия, некоторые из которых могут зависеть от C. albicans колонизация. В данном протоколе описывается модель одновременной C. albicans-вагинальная коколонизация GBS с использованием антибиотикотерапии и однократной дозы 17βэстрадиол для создания C. albicans колонизация, за которой следует отмена антибиотиков и инокуляция GBS. Микробная нагрузка в просвете влагалища количественно определяется на протяжении всего эксперимента с помощью промывания, а нагрузка во всем женском репродуктивном тракте (ЖРТ) — путем вскрытия, гомогенизации и посева образцов влагалища, шейки матки и матки. Данный метод позволит изучить механизмы, посредством которых прямые и косвенные полимикробные взаимодействия влияют на образ жизни и патогенез этих двух организмов, а также на иммунный ландшафт хозяина в ЖРТ.

Введение

Streptococcus agalactiae (Группа B Streptococcus, GBS) представляет собой грамположительный бактериальный патобионт, который колонизирует несколько полимикробных участков, включая желудочно-кишечный тракт и влагалище. В то время как колонизация влагалища обычно протекает бессимптомно, во время беременности GBS может перемещаться из влагалища в матку и преодолевать целые плодные перепонки, вызывая инфицирование амниотической жидкости и плаценты. Таким образом, данный микроорганизм является основным фактором риска неблагоприятных исходов беременности, фетальной инфекции и неонатальных заболеваний.1,2Поскольку стрептококк группы B является одной из основных причин инвазивных инфекций у новорожденных, критически важно охарактеризовать факторы, влияющие на риск передачи и развития инфекции. Антибиотикопрофилактика в процессе родов может снизить вероятность вертикальной передачи и частоту возникновения раннего неонатального заболевания, вызванного GBS.3,4; однако его применение связывают с ростом показателей антибиотикорезистентности и возможными долгосрочными последствиями, связанными с введением антибиотиков в пренатальный период или в раннем возрасте5,6,7,8Эти факторы обуславливают необходимость разработки более адресных мер профилактики и терапевтического вмешательства.

Появляющиеся данные свидетельствуют о том, что состав микробиома и полимикробные взаимодействия влияют на гомеостаз и вероятность развития заболеваний9Доминирование GBS в микробиоме влагалища человека ассоциировалось со снижением Lactobacillus было отмечено влияние численности, а также специфических взаимодействий на уровне видов и штаммов что может оказывать различное влияние на колонизацию in vitro и in vivo10,11Ранее наша исследовательская группа разработала мышиную модель вагинальной колонизации GBS для изучения коррелятов приспособленности GBS со стороны хозяина и бактерий.12Это предполагает введение мышам однократной дозы 17β-эстрадиолом, после чего на следующий день проводится внутривагинальная инокуляция GBS. Данная модель использовалась для характеристики значимости поверхностных белков GBS, регуляторных сигнальных сетей и секреции токсинов в поддержании колонизации и инвазии в ткани женского репродуктивного тракта (ФРТ). Кроме того, нами было обнаружено, что GBS вступает в сложные взаимодействия с другими бактериями вагинального тракта, включая Akkermansia muciniphila и Enterococcus faecalis13,14,15продемонстрировав, как на образ жизни и персистенцию GBS влияет присутствие соседних микробов.

Хотя эта существующая модель была адаптирована для изучения межбактериальных взаимодействий, для изучения других микробов потребовались дополнительные модификации. Грибы являются недостаточно изученным компонентом микробиома влагалища, и с помощью представленной здесь модели мы стремились разработать инструмент для изучения колонизации грибами наряду с грибково-бактериальными взаимодействиями in vivo. Наиболее часто выделяемым грибом из влагалища человека является Candida albicans, который колонизирует более 70% людей16. C. albicans полиморфен и может подвергаться морфогенезу для переключения между почкующимися дрожжами и нитчатыми морфотипами. Филаментация связана с определенным репертуаром экспрессии генов17,18. Было недавно сообщено, что некоторые из этих специфических для гиф генов обеспечивают преимущество в приспособленности в контексте полимикробной колонизации19,20,21.

В нескольких исследованиях сообщалось о совместном выделении C. albicans и GBS из мазков из влагалища человека, а наша исследовательская группа недавно обнаружила, что у лиц, колонизированных C. albicans, значительно выше показатели носительства GBS22. Мы разработали систему in vivo для изучения трехстороннего взаимодействия между комменсальными грибами, бактериями и хозяином. Исследования грибов на обычных мышах обычно требуют применения антибиотиков для преодоления бактериальной резистентности к колонизации и установления устойчивой колонизации23. Чтобы добиться этого, не нарушая способность GBS к колонизации, мы обрабатываем мышей коктейлем из антибиотиков, инокулируем их C. albicans, а после установления колонизации прекращаем воздействие антибиотиков, чтобы в дальнейшем обеспечить колонизацию GBS. Этот процесс был оптимизирован таким образом, чтобы и C. albicans, и GBS колонизировали влагалищный тракт с аналогичной нагрузкой и в схожие сроки, что позволяет осуществлять прямое взаимодействие внутри влагалищного тракта. В данном протоколе описан метод предварительной обработки мышей антибиотиками, введения 17β-эстрадиола, установления колонизации как грибами, так и бактериями, а также сбора промывных вод и образцов тканей для последующего анализа.

Протокол

Работа с животными, представленная в данной рукописи, была одобрена и проведена в соответствии с требованиями Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Колорадо Аншутс согласно протоколу №00316. На приведенной ниже временной шкале день 0 соответствует дню инокуляции S. agalactiae.

1. Введите антибиотики перед инокуляцией.

  1. Приготовьте концентрированный раствор ампициллина, неомицина и гентамицина с конечной концентрацией каждого препарата 50 mg/mL, используя в качестве растворителя питьевую воду для мышей. Стерилизуйте антибиотический раствор с помощью фильтра с порами 0,22 µm.
  2. Добавьте антибиотический раствор в питьевую воду для мышей в разведении 1:100, добавляя 1 mL раствора на каждые 99 g воды.
  3. Через 7 дней замените воду, повторив шаги 1.1 и 1.2.
  4. Проводите антибиотикотерапию в течение как минимум 7–10 дней до начала эксперимента, но общая продолжительность лечения не должна превышать 14 дней.

2. Синхронизация эстрального цикла мышей (день -3).

  1. В стерильную коническую пробирку объемом 50 mL добавьте 17β-эстрадиол из расчета 0,5 mg на мышь, добавив небольшой избыток, чтобы компенсировать потери суспензии при прилипании к стенкам пробирки. Плотно закройте коническую пробирку крышкой и коротко перемешайте на вортексе для разрушения комочков.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Поскольку 17β-эстрадиол может проникать в организм через кожу или слизистые оболочки, осторожно работайте с данным реагентом и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
  2. Стерилизуйте кунжутное масло с помощью фильтра 0,45 µm и введите 100 µL масла на каждые 0,5 mg 17β-эстрадиола непосредственно в коническую пробирку с 17β-эстрадиолом. Концентрация составляет 5 mg/mL. Плотно закройте пробирку и тщательно перемешайте раствор на вортексе до получения гомогенной суспензии.
  3. Подготовьте стерильные шприцы объемом 1 mL (по одному на мышь), оттянув поршень до метки 0,15 mL и установив их вертикально поршнем вниз, а наконечником с Luer Lock вверх.
  4. Наберите суспензию 17β-эстрадиола в новый стерильный шприц объемом 10 mL, используя стерильную иглу 18G длиной 1,5”, и с его помощью заполните подготовленные шприцы объемом 1 mL, введя в каждый по 100 µL суспензии.
  5. Оснастите каждый шприц объемом 1 mL стерильной иглой 26G длиной 0,5”.
  6. Подготовьте суспензию в 100 µL кунжутного масла, содержащую 0,5 mg 17β-эстрадиола, и введите одну дозу каждой мыши путем внутрибрюшинной инъекции за один день до инокуляции C. albicans.

3. Инокуляция мышей C. albicans (день -2).

  1. За один день до инокуляции (в тот же день, что и введение 17β-эстрадиола), приготовьте ночную культуру C. albicans в объеме 5 mL в дрожжевом пептон-декстрозном бульоне в инкубаторе при 30 °C и перемешивании при 250 rpm.
  2. В день инокуляции перенесите аликвоту ночной культуры в стерильную микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте при ≤10,000 × g в течение 7–8 с или до образования осадка.
  3. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS).
  4. Используя гемоцитометр, рассчитайте концентрацию суспензии.
  5. Перенесите аликвоту суспензии в новую стерильную микроцентрифужную пробирку, повторно осадите и суспендируйте в свежем стерильном PBS до достижения конечной концентрации 109 клеток C. albicans/mL при конечном объеме не менее 10 µL на мышь. Например, если концентрация составляет 2 × 108 клеток/mL и имеется 10 мышей, осадите 500 µL и ресуспендируйте в 100 µL.
  6. Проведите внутривагинальную инокуляцию каждой мыши, используя 10 µL суспензии C. albicans в PBS с концентрацией 109 клеток/mL (107 клеток на мышь).
    1. Зафиксируйте каждую мышь, зажав кожу за загривком между большим и указательным пальцами недоминирующей руки, затем поверните запястье так, чтобы спина мыши оказалась на ладони. Используйте безымянный палец и мизинец для иммобилизации хвоста.
    2. Наберите 10 µL суспензии C. albicans в стерильный наконечник пипетки. Введите наконечник примерно на 5–10 mm в просвет влагалища, регулируя глубину в соответствии с анатомией мыши.
    3. Внесите инокулят C. albicans во влагалище и извлеките наконечник пипетки.
    4. После освобождения загривка удерживайте мышь за хвост, приподняв заднюю часть туловища. Позвольте мыши «пройтись» на двух передних лапах в течение примерно 1 min или до тех пор, пока инокулят C. albicans не перестанет быть видимым.

4. Замена питьевой воды (день -1).

  1. Через один день после инокуляции C. albicans, что совпадает с днем перед инокуляцией S. agalactiae, переведите мышей в чистые клетки.
  2. Убедитесь, что мышам предоставлена свежая вода без антибиотиков.

5. Количественное определение нагрузки C. albicans в просвете влагалища (день -1).

  1. За 1 день до начала процедуры подготовьте по одной стерильной микроцентрифужной пробирке и 100 µL стерильного PBS на каждую мышь.
  2. Зафиксируйте каждую мышь, как описано в шаге 3.6.1.
  3. Наберите 50 µL PBS в стерильный наконечник пипетки. Введите наконечник примерно на 1–5 mm в просвет влагалища и 3–5 раз проведите аспирацию и вытеснение всего объема PBS. Перенесите PBS в стерильную микроцентрифужную пробирку.
  4. Повторите шаг 5.3, чтобы получить в общей сложности 100 µL промывной жидкости.
  5. Перемешайте содержимое микроцентрифужной пробирки на вортексе, затем выполните десятикратные серийные разведения до разведения 1:10 000 в стерильном PBS.
  6. Высейте 10 µL разведенных суспензий и 25 µL неразведенной промывной жидкости на хромогенный агар с селективными свойствами для Candida.
  7. Инкубируйте чашки при 30 °C в течение 48 h. Колонии C. albicans будут иметь гладкую поверхность и сине-зеленый или зеленый цвет.

6. Инокулируйте мышей S. agalactiae (день 0).

  1. За один день до инокуляции (в тот же день, когда производится замена питьевой воды) приготовьте ночную культуру S. agalactiae объемом 3 mL в бульоне Тодда-Хьюитта (THB) в статическом инкубаторе при 37 °C.
  2. В день инокуляции разведите ночную культуру 1:10 в 4 mL THB и инкубируйте в статическом инкубаторе при 37 °C до достижения середины логарифмической фазы (оптическая плотность при 600 nm [OD600] 0,4–0,5) примерно через 1,5–2 ч.
  3. Перенесите культуру из середины логарифмической фазы в стерильную коническую пробирку объемом 15 mL и центрифугируйте при 3,000 × g в течение 5 min или до образования осадка.
  4. Удалите супернатант путем аспирации, затем суспендируйте осадок в 300 µL стерильного PBS.
  5. Используя ресуспендированный осадок, приготовьте в стерильном PBS суспензию S. agalactiae с OD600 0,4 (приблизительно 108 колониеобразующих единиц [CFU]/mL) в объеме не менее 100 µL на одну мышь плюс дополнительные 500 µL (всего ≥1,5 mL на 10 мышей).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение OD600 к CFU/mL может различаться для разных штаммов S. agalactiae. Заранее определите, какое значение OD600 соответствует 108 CFU/mL.
  6. Перенесите суспензию в новую стерильную коническую пробирку объемом 15 mL и центрифугируйте при 3,000 × g в течение 5 min или до образования осадка.
  7. Аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок в 1/10th от исходного объема стерильного PBS (если осадок был получен из 1,5 mL суспензии, ресуспендируйте в 150 µL). Эта суспензия будет иметь концентрацию 109 CFU/mL и будет служить бактериальным инокулятом.
  8. Выполните серийные разведения и высейте по 50 µL инокулята на агар Тодда-Хьюитта, затем инкубируйте чашки при 37 °C в течение 24 h для определения точной концентрации инокулята.
  9. Проведите интравагинальную инокуляцию каждой мыши, используя 10 µL суспензии S. agalactiae в PBS с концентрацией 109 CFU/mL (107 CFU на мышь), применяя технику, описанную в этапах 3.6.1–3.6.4.

7. Количественное определение нагрузки C. albicans и S. agalactiae в просвете влагалища (начиная с дня +1).

  1. Начиная через один день после инокуляции S. agalactiae, соберите 100 µL жидкости для промывания влагалища и проведите серийное разведение, используя ту же методику, что и в шагах 5.1–5.5.
  2. В двух повторах высейте 10 µL разведенных суспензий и 25 µL неразведенной жидкости для промывания на селективные хромогенные агары для Candida и StrepB.
  3. Инкубируйте чашки с Candida при 30 °C в течение 48 ч. Колонии C. albicans будут выглядеть гладкими и иметь бирюзовый или зеленый цвет.
  4. Инкубируйте чашки с StrepB при 37 °C в течение 24 ч. Колонии S. agalactiae будут выглядеть гладкими и иметь розовый или сиреневый цвет.
  5. Повторяйте шаги 7.1–7.4 ежедневно или с подходящим временным интервалом для мониторинга микробной нагрузки в просвете влагалища.

8. Количественное определение нагрузки C. albicans и S. agalactiae в тканях женского репродуктивного тракта (конечная точка эксперимента).

  1. Подготовьте три пробирки с завинчивающимися крышками объемом 2 мл, заполнив каждую примерно 0,4–0,5 г циркониевых шариков диаметром 1 мм и 500 µL стерильного PBS на одну мышь для сбора тканей (влагалища, шейки матки и матки). Также подготовьте одну стерильную микроцентрифужную пробирку и 100 µL стерильного PBS на мышь для сбора промывных вод. Запишите вес каждой пробирки с завинчивающейся крышкой, чтобы использовать его в качестве эталона при расчете веса тканей.
  2. Проведите эвтаназию мыши методом, одобренным в вашем учреждении, например, асфиксией CO2 и подвывихом шейных позвонков. Для стерилизации ножниц и пинцета используйте 70% этанол.
  3. Приподнимите заднюю часть тела мыши за хвост и проведите забор промывных вод из влагалища, используя методику, описанную в шагах 5.3–5.4.
  4. Опрыскайте живот мыши 70% этанолом и с помощью стерилизованных ножниц вскройте брюшную полость. Используйте пинцет, чтобы отогнуть кожу и сместить желудочно-кишечный тракт для обнажения тканей половой системы.
  5. С помощью стерилизованных ножниц удалите мочевой пузырь, а также висцеральный жир и пленки, закрывающие матку. Отделите рога матки от яичников, сделав разрез между телом матки и каждым яичником.
  6. С помощью стерилизованного пинцета захватите влагалище в точке ниже шейки матки. Приподнимите ткани, пока весь влагалищный тракт не станет видимым, и с помощью стерилизованных ножниц сделайте поперечный разрез как можно ближе к вульве, стараясь не захватить ткани кожи. Извлеките всю половую систему и поместите ее в стерильную чашку Петри диаметром 10 см.
  7. С помощью стерильного лезвия бритвы сделайте два поперечных разреза ниже и выше шейки матки, отделяя влагалище, шейку матки и матку. Измельчите каждую из тканей, сделав дополнительные 2–5 сагиттальных и поперечных разрезов. Поместите каждую ткань в соответствующую подготовленную пробирку с завинчивающейся крышкой.
  8. Взвесьте каждую пробирку с завинчивающейся крышкой и рассчитайте вес каждой ткани, вычтя значение из шага 8.1. Плотно закройте каждую пробирку крышкой, проведите гомогенизацию с помощью шариков (bead-beat) при 3 450 об/мин в течение 1 мин, выдержите пробирки на льду 1 мин, затем снова проведите гомогенизацию при 3 450 об/мин в течение 1 мин.
  9. Выполните серийные разведения и посев каждого гомогената тканей и образца промывных вод, используя метод, описанный в шагах 5.5–5.6. Инкубируйте чашки согласно описанию в шагах 7.3–7.4.

Результаты

Для характеристики вагинальной колонизации GBS и C. albicans мышам проводили внутривагинальное введение штамма C. albicans SC5314 или контрольного раствора PBS, после чего следовала инокуляция штаммом GBS COH1. Данный штамм представляет собой гипервирулентный капсульный серотип III, тип последовательности 17, изоляты которого чаще всего связаны с инвазивными заболеваниями и менингитом у новорожденных1. Мыши, у которых через один день после инокуляции не наблюдалось колонизации GBS, были исключены из анализа. В течение четырехдневного периода эксперимента у мышей, колонизированных только GBS, происходило постепенное очищение просвета влагалища от GBS. Большинство мышей с сочетанной колонизацией C. albicans сохраняют высокую нагрузку GBS (Рисунок 1A,B). C. albicans также колонизирует просвет влагалища мыши примерно в течение четырех дней до его очищения (Рисунок 1C). Предыдущие работы с использованием данной модели показали, что нагрузка GBS в тканях женского репродуктивного тракта (FGT), включая влагалище, шейку матки и матку, также выше у мышей с сочетанной колонизацией по сравнению с моноколонизированными животными2.

Графики колонизации GBS; статистическое сравнение, кривая выживаемости, анализ данных КОЕ/мл в логарифмической шкале.
Рисунок 1Количественное определение группы B Стрептокок колонизация Мыши линии CD-1 были колонизированы C. albicans (SC5314) или обработали фосфатно-солевым буферным раствором в качестве контроля с последующей вагинальной инокуляцией GBS (COH1). (A) Бремя GBS в жидкости при влагалищном промывании, указаны медианы. (B) Процент мышей, колонизированных в течение времени, определенный путем выявления GBS в жидкости для промывания влагалища. (С) C. albicans количество возбудителя в жидкости при влагалищном промывании, указаны медианы. Три независимых эксперимента. n = 26-27 мышей в группе. * p < 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001 при множественном t—тесты с использованием критерия множественных сравнений Холма — Сидака (A) или лог-ранговый критерий (B). Сокращения: GBS = стрептокок группы B Streptococcus, Ca = Candida albicans, КОЕ = колониеобразующие единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Вагинальная колонизация GBS представляет собой критический риск для здоровья матери, плода и новорожденного. Модели in vivo крайне важны для понимания факторов, определяющих колонизацию, и для разработки средств профилактической терапии. В данной работе мы описываем мышиную модель для совместной вагинальной колонизации мышей GBS и C. albicans, оценки микробной нагрузки в просвете влагалища и верхних отделах женского репродуктивного тракта (FGT), а также сбора соответствующих тканей для последующего анализа. Эта модель была разработана для изучения грибково-бактериальных взаимодействий и взаимодействий между микробом и хозяином в контексте полимикробной вагинальной колонизации. Наша исследовательская группа использовала эту модель для выяснения механизмов, способствующих тому, что C. albicans стимулирует вагинальную колонизацию GBS и восходящую инфекцию22.

Модели на животных успешно использовались для изучения взаимодействий между хозяином и микробами; однако включение полимикробных сообществ в такие модели может создать ряд специфических трудностей. Основными целями при разработке данной модели были: установление грибковой колонизации, предоставление времени для формирования гиф C. albicans и инокуляция GBS для мониторинга динамики колонизации до того, как какой-либо из микробов будет элиминирован организмом хозяина. Будучи полиморфным грибком, C. albicans может реагировать на ряд факторов окружающей среды, связанных с хозяином, инициируя гифальный морфогенез17. Филаментации in vivo в данной модели  было отдано приоритет в связи с накоплением данных о том, что специфические взаимодействия гиф с GBS способствуют симбиозу в FGT. Используя штамм C. albicans, экспрессирующий NRG1 под контролем репрессируемого промотора TetO, наша исследовательская группа ранее показала, что GBS демонстрирует более высокую коагрегацию и более сильную адгезию к эпителию при взаимодействии с гифальной формой C. albicans по сравнению с дрожжевой формой22. Коагрегация с C. albicans и ассоциация с клетками эпителия влагалища человека являются важными детерминантами жизнеспособности GBS в данной среде хозяина. Было показано, что другие бактерии , включая Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и различные виды Streptococcus , модулируют экспрессию генов, связанных с морфогенезом у C. albicans, а также преимущественно взаимодействуют с гифами24. В будущем изучение влияния филаментации in vivo может быть осуществлено с помощью данной модели путем колонизации мышей штаммами C. albicans , зафиксированными в гифальной или дрожжевой форме.

Существующие мышиные модели, включающие интравагинальное введение C. albicans, в основном были сосредоточены на вульвовагинальном кандидозе (ВВК)25 и использовались для характеристики гипервоспалительного состояния, связанного с симптоматической инфекцией26. Наша модель, описанная в данной работе, в большей степени соответствует состоянию колонизации. Предыдущие исследования нашей научной группы показали, что при использовании этой модели коколонизация C. albicans снижает содержание провоспалительных цитокинов IL-6, CXCL1, CXCL2 и TNFα по сравнению с колонизацией только GBS, и что уровни этих белков у коколонизированных мышей сопоставимы с уровнями у наивных животных22. Это указывает на то, что мы не наблюдаем гипервоспалительной среды, характерной для ВВК, несмотря на образование грибковых нитей в просвете влагалища. Было сообщено, что беспородные мыши CD-1 устойчивы к ВВК, возможно, из-за адекватного иммуноопосредованного контроля разрастания грибов27. Кроме того, у мышей CD-1 после интравагинального введения GBS инициируется мощный иммунный ответ, которого достаточно для контроля бактериальной популяции примерно в течение одной недели при отсутствии C. albicans28,29,30, хотя ранее мы исследовали вагинальную колонизацию GBS и на других линиях мышей12. Модель, описанная в данной работе, отражает транзиторный характер колонизации как C. albicans, так и GBS, который наблюдается у людей. Кроме того, у людей наблюдается высокая вариабельность как pH, так и состава микробиома. В данной модели поддерживаются условия с почти нейтральным pH (~6.5)31. В вагинальном микробиоме мышей CD-1 преобладают виды Enterobacteriaceae и Proteus13, которые ассоциированы с теми же типами состояний вагинального микробного сообщества, что и GBS9,32.

Обрабатывая мышей антибиотиками и вводя одну дозу 17β-эстрадиола перед инокуляцией грибка, мы подготавливаем среду для восприятия C. albicans, что облегчает колонизацию. Дополнительно введение эстрадиола способствует воспроизводимости экспериментов за счет синхронизации стадии эструса и, следовательно, локального иммунного окружения на момент инокуляции. Мы синхронизируем мышей с проэструсом при инокуляции C. albicans, что совпадает со снижением количества нейтрофилов и, как было показано, способствует увеличению грибковой нагрузки в женском репродуктивном тракте (FGT)33,34. Удаление антибиотиков и замена их свежей питьевой водой на раннем этапе эксперимента не только облегчает колонизацию GBS, но и позволяет нативным микробам повторно заселить влагалищный тракт. Кроме того, ограничение лечения эстрадиолом одной ранней дозой позволяет мышам вернуться к типичной динамике цикла эструса, хотя было показано, что постоянное введение эстрадиола способствует колонизации12. Состав иммунных клеток в FGT мышей меняется на протяжении цикла эструса, а слизистые иммунные ответы высокочувствительны к половым стероидным гормонам35,36,37. Таким образом, мы исключаем влияние повторяющегося введения эстрадиола как вмешивающейся переменной, чтобы детально изучить воздействие микробной колонизации на среду хозяина.

Данные, представленные в этом исследовании, относятся к штамму C. albicans SC5314 и штамму GBS COH1. Мы выбрали SC5314 для создания модели из-за его частого использования в микологии, наличия множества доступных генетических инструментов для данного фона, а также обширного объема знаний о его биологии и динамике in vitro и in vivo. Наша исследовательская группа также показала, что штамм C. albicans 529L может способствовать увеличению нагрузки GBS в женском репродуктивном тракте (FGT)22. Штамм GBS COH1 был использован как представитель линии серотипа III, тип последовательности 17, которая связана с антимикробной резистентностью и неонатальными инвазивными заболеваниями1,2. В данной модели используются селективные и дифференциальные среды для количественного определения содержания GBS и C. albicans в вагинальном промывном веществе и тканях. Для адаптации этой модели для использования с другими видами бактерий и грибов потребуется оптимизировать соответствующие условия селективного роста.

Взаимодействия между грибами и бактериями становятся важными медиаторами микробных образов жизни38,39. Ряд исследований показал, что такие взаимодействия могут существенно определять характер комменсализма и вирулентный потенциал. Кроме того, среда хозяина создает уникальное давление и может влиять на такие факторы, как метаболическое программирование, регулоны факторов транскрипции и профили антимикробной резистентности. Таким образом, крайне важно использовать репрезентативные модели in vivo для характеристики того, как микробы взаимодействуют друг с другом. Мышиная модель, описанная в данной статье, может быть использована для изучения того, как колонизация влагалища интересующими бактериями и грибами влияет на микробную нагрузку, экспрессию генов и ответ хозяина.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Отдел ресурсов для лабораторных животных Университета Колорадо Аншутц, включая управляющего объектом и самоотверженный персонал вивария. Данная работа поддерживается грантами NIH R01AI153332 и R21AI188719, предоставленными K.S.D.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
фильтр 0.22 µmSigma-AldrichSLGSR33SB
фильтр 0.45 µmSigma-AldrichSLHAR33SB
шприц с люер-замком 1 mLMcKesson16-S1C
циркониевые шарики 1.0 mmResearch Products International9835
шприц с люер-замком 10 mLMcKesson16-S10C
17β-эстрадиолSigma-AldrichE8875ОСТОРОЖНО: 17β-эстрадиол может впитываться через кожу и слизистые оболочки. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) и соблюдайте осторожность при работе.
игла 18G 1.5"BD305196
пробирка с завинчивающейся крышкой 2 mLFisher Scientific02-681-374
игла 26G 0.5"McKesson16-N2605
АгарAlpha BiosciencesA01-102
АмпициллинResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
ГентамицинVWR Life Science0304
НеомицинResearch Products InternationalN20040
Фосфатно-солевой буферный растворFisher ScientificBP2944
Кунжутное маслоSigma-AldrichS3547
Бульон Тодда-ХьюиттаResearch Products InternationalT47500
Декстрозный бульон с пептоном для дрожжейBD242810

Ссылки

  1. Megli CJ et al. Virulence and pathogenicity of group B Streptococcus.: virulence factors and their roles in perinatal infection. Virulence. 2025;16(1):2451173.
  2. Manuel G et al. Group B streptococcal infections in pregnancy and early life. Clin Microbiol Rev. 2025;38(1):e00154-22.
  3. Verani JR, McGee L, Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Recomm Rep. 2010;59(RR-10):1-36.
  4. Prevention of group B streptococcal early-onset disease in newborns: ACOG Committee Opinion Summary, Number 797. Obstet Gynecol. 2020;135(2):489-92.
  5. Hsu CY et al. Global patterns of antibiotic resistance in group B Streptococcu.s: a systematic review and meta-analysis. Front Microbiol. 2025;16:1541524.
  6. Sabroske EM et al. Evolving antibiotic resistance in group B Streptococci. causing invasive infant disease: 1970-2021. Pediatr Res. 2023;93(6):2067-71.
  7. Azad MB et al. Impact of maternal intrapartum antibiotics, method of birth and breastfeeding on gut microbiota during the first year of life: a prospective cohort study. BJOG. 2016;123(6):983-93.
  8. Duong QA, Curtis N, Zimmermann P. The association between prenatal antibiotic exposure and adverse long-term health outcomes in children: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 2025;90(1):106377.
  9. Mejia ME, Robertson CM, Patras KA. Interspecies interactions within the host: the social network of group B Streptococcus. Infect Immun. 2023;91(4):e00440-22.
  10. De Gregorio PR, Juárez Tomás MS, Leccese Terraf MC, Nader-Macías MEF. Preventive effect of Lactobacillus reuteri .CRL1324 on group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J Appl Microbiol. 2015;118(4):1034-47.
  11. Shiroda M, Aronoff DM, Gaddy JA, Manning SD. The impact of Lactobacillus. on group B streptococcal interactions with cells of the extraplacental membranes. Microb Pathog. 2020;148:104463.
  12. Patras KA, Doran KS. A murine model of group B Streptococcus .vaginal colonization. J Vis Exp. 2016;(117):e54708.
  13. Burcham LR et al. Interrelated effects of zinc deficiency and the microbiome on group B streptococcal vaginal colonization. mSphere. 2022;7(4):e00264-22.
  14. Marroquin SM, Cohen S, Neely MN, Doran KS. Akkermansia muciniphila impacts group B Streptococcus. vaginal colonization. mBio. 2026;17(6):e02868-25.
  15. Job AM, Doran KS, Spencer BL. A group B streptococcal type VII-secreted LXG toxin mediates interbacterial competition and colonization of the murine female genital tract. mBio. 2024;15(10):e02088-24.
  16. Beigi RH et al. Vaginal yeast colonization in nonpregnant women: a longitudinal study. Obstet Gynecol. 2004;104(5 Pt 1):926-30.
  17. Noble SM, Gianetti BA, Witchley JN. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nat Rev Microbiol. 2017;15(2):96-108.
  18. Schille TB et al. Commensalism and pathogenesis of Candida albicans .at the mucosal interface. Nat Rev Microbiol. 2025;23(8):525-40.
  19. Liang SH et al. The hyphal-specific toxin candidalysin promotes fungal gut commensalism. Nature. 2024;627(8004):620-7.
  20. Fróis-Martins R et al. Dynamic expression of candidalysin facilitates oral colonization of Candida albicans. in mice. Nat Microbiol. 2025;10(10):2472-85.
  21. Mauk KE et al. Commensal colonization of Candida albicans. in the mouse gastrointestinal tract is mediated via expression of candidalysin and adhesins. Microbiol Spectr. 2025;13(9):e00567-25.
  22. Cohen S et al. A fungal pathobiont promotes Streptococcus .vaginal persistence and pathogenesis through physical and metabolic interactions. Cell Host Microbe. 2026;34(6):1118-34.e7.
  23. Koh AY. Murine models of Candida .gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 2013;12(11):1416-22.
  24. Allison DL et al. Candida.-bacteria interactions: their impact on human disease. Microbiol Spectr. 2016;4(3):VMBF-0030-2016.
  25. Yano J, Fidel PL Jr. Protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of Candida .vaginitis. J Vis Exp. 2011;(58):e3382.
  26. Ardizzoni A, Wheeler RT, Pericolini E. It takes two to tango: how a dysregulation of the innate immunity, coupled with Candida. virulence, triggers VVC onset. Front Microbiol. 2021;12:692491.
  27. Yano J, Noverr MC, Fidel PL Jr. Vaginal heparan sulfate linked to neutrophil dysfunction in the acute inflammatory response associated with experimental vulvovaginal candidiasis. mBio. 2017;8(2):e00211-17.
  28. Patras KA et al. Group B Streptococcus. CovR regulation modulates host immune signaling pathways to promote vaginal colonization. Cell Microbiol. 2013;15(7):1154-67.
  29. Patras KA, Rösler B, Thoman ML, Doran KS. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 2015;8(6):1339-48.
  30. Spencer BL et al. Characterization of the cellular immune response to group B streptococcal vaginal colonization. J Innate Immun. 2025;17(1):566-78.
  31. Miao J, Willems HME, Peters BM. Exogenous reproductive hormones nor Candida albicans. colonization alter the near neutral mouse vaginal pH. Infect Immun. 2021;89(2):e00550-20.
  32. Rosen GH et al. Group B Streptococcus. and the vaginal microbiota. J Infect Dis. 2017;216(6):744-51.
  33. Latorre MC et al. Vaginal neutrophil infiltration is contingent on ovarian cycle phase and independent of pathogen infection. Front Immunol. 2022;13:1031941.
  34. Gómez-Oro C et al. Progesterone promotes CXCL2-dependent vaginal neutrophil killing by activating cervical resident macrophage-neutrophil crosstalk. JCI Insight. 2024;9(20):e177899.
  35. Winkler I et al. The cycling and aging mouse female reproductive tract at single-cell resolution. Cell. 2024;187(4):981-998.e25.
  36. Seavey MM, Mosmann TR. Estradiol-induced vaginal mucus inhibits antigen penetration and CD8+ T cell priming in response to intravaginal immunization. Vaccine. 2009;27(17):2342-9.
  37. Li S et al. Estrogen action in the epithelial cells of the mouse vagina regulates neutrophil infiltration and vaginal tissue integrity. Sci Rep. 2018;8(1):11247.
  38. Cohen S, Ost KS, Doran KS. Impact of interkingdom microbial interactions in the vaginal tract. PLoS Pathog. 2024;20(3):e1012018.
  39. MacAlpine J, Robbins N, Cowen LE. Bacterial-fungal interactions and their impact on microbial pathogenesis. Mol Ecol. 2023;32(10):2565-81.

Перепечатки и разрешения

Теги

Streptococcus B
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.