Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптимизированный рабочий процесс отображения поверхностей дрожжей для направленной эволюции протеаз

331 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72559

⸱

4 августа 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для направленной эволюции вирусных протеаз у Saccharomyces cerevisiae с использованием системы отбора на основе поверхностного дисплея. В нём описывается библиотека вставок ДНК и дизайн кассет субстрата, электропорация, оптимизированная для высокой эффективности трансформации, отбор клеток на основе сортировки клеток с флуоресценцией для расщепления протеаз, а также секвенирование обогащённых вариантов.

Аннотация

Направленная эволюция имитирует естественный эволюционный процесс в быстрой, контролируемой лабораторной среде, чтобы эволюционировать белки с желаемыми функциями или признаками. Скрининг большого пула мутантных генов, кодирующих белки, позволяет функционально отбирать желаемые варианты для применения в биотехнологии, медицине и синтетической биологии. Используя этот протокол, мы проводим направленную эволюцию в Saccharomyces cerevisiae для создания вариантов протеазы с высокой специфичностью для неродной последовательности субстрата. Мы размещаем эти варианты протеазы на поверхности дрожжевых клеток, чтобы облегчить отбор желаемых вариантов с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) на протяжении нескольких этапов обогащения. Четыре ключевых элемента субстрат-кассеты соэкспрессируются с протеазной библиотекой: белок-синтез, состоящий из (i) субъединицы дрожжевого адгезионного рецептора Aga2, (ii) селекционных и (iii) последовательных субстратов контрселекции, (iv) последовательностей эпитопных меток и опциональной последовательности сигнала эндоплазматического ретикулума (ER). Дрожжевые клетки, в которых расщеплена только последовательность селективного субстрата, изолируются с помощью многоцветных FACS с помощью флуоресцентных антител (с фикоэритрин/флуоресцеин-изотиоцианатом) антиэпитопов. Здесь мы предоставляем подробности оптимизированного, пошагового протокола проведения кампании по эволюции протеаз, включая проектирование библиотеки вставок ДНК и кассет субстрата, электропорирование дрожжей клеток с высокой эффективностью трансформации (до 109 трансформантов на микрограмм ДНК), отбор, обогащение и секвенирование эволюционных вариантов на основе FACS. Мы демонстрируем наш протокол направленной эволюции, эволюционируя ядровую протеазу с включением A (TEVp) в табачном вирусе травления от разрезания естественной последовательности субстрата ENLYFQ↓S к расщеплению новой последовательности ENLYFE↓S.

Введение

Протеазы цистеина из семейства Potyviridae, а именно протеазы ядерного включения A (NIa), представляют собой в основном неиспользованный источник последовательно-специфических эндопептидаз. С более чем 3800 характеризованными членами семейства, протеазы NIa расщепляют отдельную семиаминокислотную субстратную последовательность. Семейство потивирусов предлагает разнообразный набор протеаз для проектирования программируемых систем контроля белков, построения ортогональных генетических цепей на основе протеаз, а также разработки последовательно-специфических биотехнологическихинструментов 1,2. Несмотря на это природное разнообразие, только две протеазы NIa — TEVp и протеаза вируса пятнистого пятна в табачных венах (TVMVp) — были тщательно охарактеризованы и спроектированы для широкого лабораторного и биотехнологическогоприменения 3,4. Этот ограниченный набор инструментов для протеазы ограничивает пространство для многокомпонентных схем, требующих ортогональных протеазныхактивностей 5, тем самым стимулируя усилия по дальнейшему расширению и характеристике NIa-протеаз через направленнуюэволюцию 6,7.

Дрожжевое поверхностное отображение стало одной из самых мощных платформ для направленной эволюции, обеспечивая высокопроизводительный скрининг библиотек белков с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS)6,7. Например, система скрининга секвестра секвестра дрожжевого эндоплазматического ретикулума (YESS) связывает активность протеаз, чтобы проявить поверхностное отображение через секреторный путь S. cerevisiae 6,7. Система YESS применялась для создания новых специфичностей протеазного субстрата и продемонстрировала свою полезность в многораундных кампаниях направленной эволюции. В этой системе варианты протеазы соэкспрессируются с синтезирующим белком, содержащим кассету с расщеплённым субстратом с эпитопными маркерами, а поверхностный якорь Aga1p экспрессируется в дрожжевом штамме EBY100. Дифференциальное маркирование флуоресцентными антителами отличает отсеченные от нерасщепленных субстратных кассет, отображаемых на поверхности клетки. Этот механизм, зависящий от активности, напрямую совместим с итеративным отбором на основе FACS для библиотек из 107 и болеевариантов 6,7.

Фундаментальным условием направленной эволюции является способность внедрять библиотеки вариантов в достаточном масштабе для достижения достаточного охват целевого пространства последовательностей. Для библиотек мутагенеза насыщения сайтами, охватывающих несколько позиций аминокислот, требуется преобразование от 108 до 109 уникальных трансформаторов, чтобы обеспечить хорошее представление разнообразия в отсортированной популяции. Существует несколько методов введения экзогенной ДНК в S. cerevisiae, каждый из которых имеет свои пределы пропускной способности. Традиционный метод химической трансформации использует литиево-ацетат/одноцепочечную носительную ДНК/полиэтиленгликоль (LiAc/ssDNA/PEG) благодаря своей простоте и доступности. Однако обычно он достигает эффективности трансформации всего 104–10единиц по 6 единиц формирования колоний (CFU) на микрограмм ДНК, что не хватает вариации последовательностей, необходимых для крупных библиотечныхкампаний 8. В отличие от этого, метод электропорации применяет высоковольтное электрическое поле для кратковременной проницаемости клеточной мембраны и облегчения поглощения ДНК. Электропорация стабильно достигает самой высокой эффективности преобразования среди доступных методов трансформации, при этом оптимизированные протоколы показывают выход 108–109 CFU 9. Было замечено, что эффективность электропорации у S. cerevisiae критически чувствительна к фазе роста клеток, массе ДНК и буферному составу, что с тех пор создаёт основу, которая с тех пор была широко адаптирована для ориентированной эволюции на уровнебиблиотеки 9.

Описанный здесь протокол использует штамм S. cerevisiae EBY100, широко используемый штамм для отражания на поверхности дрожжей. EBY100 был разработан Бодером и Виттрупом путём интеграции экспрессионной кассеты AGA1 под управлением галактозно-индуцируемого промотора GAL1 в хромосомный локус AGA1 материнского штамма BJ5465 с дефицитом протеазы10. Штамм коммерчески доступен в ATCC (каталог No MYA-4941; вкладчик К.Д. Виттруп), несущий генотип MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). В результате слияние кассет Aga1p и субстрата Aga2p экспрессируются одним и тем же промотором, индуцируемым галактозой, что обеспечивает коиндуцированное соединение двух субъединиц в дисульфидно-связанный комплекс Aga1p–Aga2p, который закрепляет демонстрируемое слияние на клеточной стенке.

Несмотря на широкое применение EBY100 в приложениях с дрожжевым отображением, ни один опубликованный протокол не был систематически оптимизирован для электропорирования этого штамма на уровне библиотеки. Специфичные для EBY100 параметры, такие как оптимальная фаза роста при сборе урожая, состав среды во время субкультуры и количественная зависимость между начальной оптической плотностью на 600 нм (OD 600) и эффективностью трансформации, предстоит тщательно охарактеризовать и оптимизировать. Здесь мы сообщаем, что эффективность трансформации в EBY100 монотонно увеличивается сOD 600 в культуре при уборке, при этом клетки в поздней лог-фазе дают значительно более высокие скорости трансформации, чем те, что были собраны на ранней фазе логов. Мы оценили критические параметры протокола, включая начальные значенияOD 600 при инокуляции, использование среды с 2 × дрожжевым экстрактом пептонного декстроза (YPD) для субкультур, формулы буфера электропорации и условия вырастания после электропорации. Представленный здесь протокол обеспечивает оптимизированный пошаговый рабочий процесс (рисунок 1A–C, рисунок 2, рисунок 3A–D, рисунок 4A–E) для подготовки электрокомпетентных клеток EBY100 и выполнения высокоэффективной электропорации библиотек ДНК, обеспечивая скорости трансформации стабильно выше 109 CFU. Для подтверждения этого протокола мы провели комплексную кампанию направленной эволюции для проектирования TEVp с изменённой специфичностью расщепления в четырёх этапах отбора и обогащения на основе FACS. Секвенирование обогащённых вариантов протеазы подтвердило значительную диверсификацию на целевых остатках внутри кармана связывания субстрата протеазы, демонстрируя, что протокол обеспечивает достаточное покрытие библиотеки пространства последовательностей для поддержки продуктивных эволюционных кампаний. Этот протокол будет полезен для исследователей, использующих EBY100 для направленной эволюции на основе дисплея на поверхности дрожжей и совместимого с FACS, высокопроизводительного скрининга протеаз,антител 9,киназ 11 ирецепторов 12, а также других белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с рекомбинантным S. cerevisiae проводились в соответствии с политикой и процедурами Институционального комитета по биобезопасности и химической безопасности Университета Техаса в Далласе. Рекомбинантные дрожжевые штаммы обрабатывались в рамках удержания уровня биобезопасности 1 (BSL-1) в соответствии с установленными институциональными микробиологическими практиками. Электропорация, культура и флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS) проводились в соответствии с утверждёнными институциональными процедурами биобезопасности. Культуры дрожжей и загрязнённые расходники были деконтаминированы и утилизированы как биологически опасные отходы в соответствии с институциональными рекомендациями.

1. Подготовка векторов и вставок

  1. Генерация библиотек протеазных потивирусов посредством мутагенеза насыщения сайтом
    1. Проектирование с использованием программного обеспечения для проектирования последовательностей, перекрывающего 30–50 мер, прямых и обратно олигонуклеотидов для создания мутантной библиотеки протеаз. Заменим кодон дикого типа в соответствующем олигонуклеотиде на вырожденный кодон NNS, где N — это A, T, G или C, а S — G или C, для позиций, направленных на мутагенез.
    2. Спроектировать 3′-перекрытие между парой прямой и обратной олигонуклеотидной парой с температурой плавления (Tm) 55–60 °C. Спроектировать первый и последний олигонуклеотиды так, чтобы они содержали перекрытие на 50 нт с вектором дисплея на поверхности дрожжей за пределами рестрикционных сайтов.
    3. Убедитесь, что хотя бы один конец вставки точно перекрывает один конец линеаризованного вектора для облегчения гомологичнойрекомбинации 13. Избегайте зазоров между соседними олигонуклеотидами14.
    4. Ресуспензировать олиго до 100 мкм с деионизированнымH2O. В стерильной трубке объёмом 1,5 мл смешайте по 0,5 мкл каждого олиго в итоговый объём 200 мкл (конечная концентрация 250 нМ для каждого олиго).
    5. Настройте реакцию ПЦР с компонентами, перечисленными в Таблице 1 , чтобы собрать библиотеку протеаз, используя условия термоцикла из Таблицы 2.
    6. Настройте вторую ПЦР-реакцию с использованием внешних прямых и обратного олиго (Таблица 3), используя первый собранный продукт ПЦР в качестве шаблона. Усилите продукт, как показано в таблице 4.
    7. Запустите второй продукт ПЦР на геле агарозы 1% с бромидом этидия (0,5 мкг/мл) при 240 В в течение 30 минут. Вырезать полосу, соответствующую ожидаемой длине ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ: Этидий бромид — это мутаген, и с ним следует обращаться с помощью соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки. Избегайте контакта кожи и вдыхания. Утилизировать гели, буферы и расходные материалы с бромидом этидий в качестве опасных химических отходов в соответствии с институциональными нормами безопасности.
    8. Очищайте с помощью набора для экстракции геля. Элют в 50 мкл деионизированногоH 2O.
    9. Измеряйте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. Храните ДНК при −20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая реакция 50 мклвторого ПЦР даёт примерно 0,5–1,0 мкг общей ДНК. Поскольку для каждой электропорации требуется 12 мкг библиотеки протеазы (то есть вставка), соответственно масштабируйте реакции.
  2. Сборка кассет на подложке
    1. Подготовьте пластины LB-агар и жидкую среду LB-хлорамфеникол. См. рецепты в таблице 5.
    2. Спроектировать набор перекрывающихся 30-мерных олигонуклеотидов в прямом и обратном направлении для сборки кассетного субстрата. Спроектируйте 5′-концы каждого обратного олигонуклеотида и переднего олигонуклеотида следующего фрагмента так, чтобы они совпали на 4 нуклеотида.
    3. Суспендировать лиофилизированные олиго до 100 мкм с помощью деионизированногоH 2O.
    4. Смешивайте реагенты, как в таблице 6.
    5. Используйте программу циклирования из таблицы 7 для отжига и фосфорилирования олиго-смеси.
    6. Разбавьте отжжённые олиго в 4 раза в дейонизированномH 2O до конечной концентрации 1,25 мкм.
    7. Объединим отжжённую олиго-смесь с вектором (например, pDD1523), следуя таблице 8.
    8. Выполните сборку Golden Gate, следуя программе велоспорта из таблицы 9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, плазмида pDD1523 имеет рестрикционный сайт типа IIS (BsmBI) ниже промотора GAL1/10. Успешная сборка позволяет индукцией галактозы кассетысубстрата 7.
    9. Преобразовать полученную плазмиду в E. coli.
    10. Пластинчатые клетки на LB-агаре с соответствующим антибиотиком. Инкубировать 16–18 часов при 37 °C.
    11. Выберите отдельные колонии и инокулируйте их в 5 мл LB среды. Инкубировать в течение ночи (16–18 часов) при 37 °C с встряхиванием (220 об/мин).
    12. Извлекайте плазмиды из ночных культур с помощью минипреп-набора для плазмид.
    13. Измерьте концентрацию плазмиды с помощью спектрофотометра, затем отправьте для секвенирования.
  3. Линеаризация вектора отображения дрожжей
    1. Линеаризуйте дрожжевую дисплейную плазмиду, например, переварите pDD1524 с помощью рестрикционных ферментов SphI и PstI, чтобы подготовить дрожжевого дисплейного вектора с субстратной кассетой для электропорации. Смешайте реагенты, указанные в таблице 10 , и инкубуйте при 37 °C в течение 1 часа.
    2. Запустите продукт рестрикционного дижеста на 1% агарозном геле при 240 В в течение 30 минут. Удалите полосу, соответствующую ожидаемой длине ДНК, и очистите с помощью набора для экстракции геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждые 50 мкл рестрикционного дигеста давали около 0,5–1,0 мкг общей ДНК. Поскольку каждая электропорация требует 4 мкг линеаризованного вектора, масштабируйте реакции дигестирования соответственно.

2. Электропорация

Примечание: Соблюдайте институциональные процедуры безопасности при обращении с биологическими материалами и реагентами, носите соответствующие средства индивидуальной защиты и утилизируйте биологические и химические отходы в соответствии с институциональными рекомендациями.

  1. Подготовка буферов, пластин и среды (за 2 дня до электропорации)
    1. Подготовить материалы для роста (1 × YPD; 2 × YPD; Синтетические декстрозовые касаминокислоты, SDCAA+; а также синтетические галактозные касаминокислоты, SGCAA+), пластины (YPD и SDCAA), электропорационный буфер и стерильную воду по рецептам в таблице 5. Храните при 4 °C.
  2. Подготовка пластины с полосами EBY100.
    1. Выбросьте дрожжи EBY100 на агар YPD из глицеролового запаса. Выращивайте при 30 °C в течение 2 дней.
    2. После роста храните тарелку при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полосатая пластина остаётся пригодной для использования до 1 месяца; Отметьте дату серии на тарелке.
  3. Подготовка прекультуры EBY100 (за день до электропорации)
    1. Подготовьте 125 мл из 1 × YPD в термосте Erlenmeyer объемом 500 мл.
    2. Подготовьте 25 мл из 1 × YPD в конической трубке объемом 50 мл. С помощью наконечника микропипетки собирайте клетки EBY100 из пластины, выращиваемых в течение 2 дней. Затем перенесите клетки дрожжей с кончика пипетки в коническую трубку с 1 × YPD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полоса клеток должна образовывать размазок длиной примерно 1–2 мм.
    3. Удалите кончик микропипетки и закрутите коническую трубку для достаточного смешивания.
    4. Подготовьте 150 мл предварительной культуры, передав 25 мл 1 × YPD с дрожжевыми клетками в колбу объемом 500 мл с 125 мл 1 × YPD. Покрутите для смешивания.
    5. С помощью спектрофотометра измерьтеOD 600 , подготовив две микрокюветы с длиной пути 1 см: одну с 1 мл 1 × YPD в качестве заготовки и другую с 1 мл прекультуры
    6. Выращивайте 150 мл предварительной культуры за ночь (16–20 часов) при 30 °C с орбитальными колебаниями при 270 об/мин.
  4. Подготовка субкультуры при желаемом начальномOD 600 (в день электропорации)
    1. Подготовьте буфер для кондиционирования и среду вырастания, как описано в таблице 5.
    2. ИзмерьтеOD 600 при ночной предкультуре (ожидаемый OD₆₀₀ равен 17–22). Чтобы попасть в линейный диапазон спектрофотометра, измерьте разбавление докультуры в соотношении 1:20.
    3. Рассчитайте объём предварительной культуры, необходимый для вакцинации субкультуры объёмом 100 мл. Рекомендуется начальный субкультурныйOD 600 в диапазоне 3.0–4.0.
    4. Разведите культуру до желаемого первоначальногоOD 600 в 100 мл при 2 × YPD в колбе Erlenmeyer объемом 500 мл.
    5. Инкубировать субкультуру объёмом 100 мл при 30 °C с орбитальными колебаниями на скорости 270 об/мин в течение 4 часа.
  5. Подготовка среды во время 4-часовой инкубации
    1. Держите ледяной электропорационный буфер и стерильную воду готовыми (начиная с шага 2.1.1).
    2. Подготовьте буфер для кондиционирования (100 мл), следуя рецепту из таблицы 5. Используйте 20 мл буфера для обусловлений на каждое преобразование; Масштабируйте соответственно. Храните при комнатной температуре (20–23 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ: Кондиционирующий буфер содержит дитиотрейтол (DTT) и литиевый ацетат (LiAc), которые являются химическими раздражителями, способными вызывать раздражение кожи и глаз. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки, и обращайтесь с этими реагентами в соответствии с институциональными процедурами химической безопасности. Утилизировать неиспользованные растворы и отработанные буферы в качестве химических отходов в соответствии с институциональными рекомендациями.
    3. Подготовьте отрастающую среду (50 мл): смешайте 25 мл 2 × YPD и 25 мл сорбитола 1 мл. Используйте 8 мл нарастающего материала на каждую трансформацию. Храните при комнатной температуре (20–23 °C).
  6. Подготовка электрокомпетентных дрожжевых клеток после 4 часа инкубации.
    1. Разделите субкультуру 100 мл на две конические трубки по 50 мл. Соберите клетки центрифугой при 4 °C и 1 500 × г в течение 3 минут, затем декантуйте среду. Держите ячейки на льду до завершения шага 2.6.4.
    2. Аккуратно суспензируйте каждую клеточную гранулу 25 мл ледяной стерильной воды. Центрифугуйте при 4 °C и 1 500 × г в течение 3 минут, затем декантуйте среду.
    3. Повторите шаг 2.6.2.
    4. Аккуратно суспензируйте каждую ячейку с помощью 25 мл ледяного электропорационного буфера. Центрифугуйте при 4 °C и 1 500 × г в течение 3 минут, затем декантуйте среду.
    5. Извлеките клетки из льда и аккуратно суспензируйте каждую гранулу с помощью 10 мл буфера для кондиционирования комнатной температуры (20–23 °C). Затем собрать в одну колбу Эрленмейера объёмом 125 мл и инкубировать при 30 °C с орбитальными колебаниями при 270 об/мин в течение 30 минут.
    6. Залейте эти клетки в трубку объёмом 50 мл. Центрифуга при 4 °C и 1 500 × г в течение 3 минут. Декантировать медиа.
    7. Аккуратно суспензируйте клеточную гранулу с помощью 50 мл ледяного электропорационного буфера. Центрифугуйте при 4 °C и 1 500 × г в течение 3 минут, затем декантуйте среду.
    8. Повторно суспензировать ячеточную гранулу до конечного объёма 1 мл, добавив примерно 100–200 мкл электропорационного буфера. Держите клетки на льду до электропорации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электрокомпетентные элементы можно заморозить (то есть поместить в морозильник при температуре –80 °C) и использовать позже без значительной потери эффективности электропорации.
  7. Электропорация, вырастание и покрытие
    1. Предохлаждённый электропорационный кувет(ы) с зазором 0,2 см на льду.
    2. Перенесите 380 мкл реуспензированной гранулы в стерильную трубку объёмом 1,5 мл. Смешивайте с 4 мкг плазмидной ДНК или 4 мкг линеаризованного плазмидного вектора и 12 мкг вставки. Аккуратно перемешивайте пипеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимизировать количество электропорированных клеток, концентрация ДНК вектора и вставки должна быть в идеале 700–800 нг/мкл. Если концентрации ниже, используйте вакуумный концентратор.
    3. Перенесите суспензию в предварительно охлаждённые электропорационные куветы. Держите на льду 5 минут.
    4. Протрите стенки кюветы через 5 минут безворсовой лабораторной салфеткой, чтобы убрать остаточную влагу, которая может привести к появлению дуг во время электропорации. Избегайте пузырьков или ячеек над металлическими пластинами в кювете, так как они могут привести к появлению дуг. Чтобы поддерживать холодную температуру кувета, не трогайте электроды пластины.
    5. Подготовьте 8 мл отрастающей среды в конической трубке объемом 50 мл.
    6. Электропорируйте элементы со следующими настройками: напряжение 2,5 кВ, ёмкость 25 мкФ и сопротивление 200Ω 9. Допустимый временной постоянный диапазон составляет 2,8–4,5 мс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ: Электропорация включает высоковольтные электрические импульсы. Убедитесь, что кюветы правильно расположены, и следуйте инструкциям производителя. Утилизировать использованные электропорационные кюветы в качестве биологически опасных отходов в соответствии с институциональными рекомендациями.
    7. Немедленно залить кювету примерно 200 мкл среды вырастания из конической трубки и перенести электропорированные клетки в коническую трубку объёмом 50 мл. Добавьте ещё 200–350 мкл среды для вырастания, пока в кюветте не останется видимой жидкости.
    8. Инкубировать коническую трубку электропорированных клеток объемом 50 мл в 8 мл среды вырастания при 30 °C без встряхивания в течение 1 часа. Переворачивайте трубку каждые 15 минут для смешивания.
    9. Собирайте клетки центрифугой при 1 500 × г, 25 °C в течение 3 минут. Затем декантировать носитель.
    10. Суспендуйте клетки в соответствующей среде выпадения дрожжей, чтобы поддерживать отбор для трансформированных клеток. Для плазмид, содержащих селективный маркер TRP1, ресуспензировать клетки в 250 мл SDCAA+ (не содержащей триптофана), чтобы селективно восстановить дрожжи, сохранившие плазмиду.
    11. Инкубировать за ночь (16–20 часов) при 30 °C с орбитальными колебаниями при 270 об/мин.

3. Индукция, окрашивание и проточная цитометрическая сортировка дрожжевых клеток

  1. Индукция протеазной библиотеки и субстратной кассеты (за 1 день до сортировки)
    1. ИзмеритьOD 600 как в шаге 2.4.2 после ночного роста трансформаторов в отпадающих средах.
    2. Аликвот 12 мл дрожжей-трансформаторов и центрифугу при 3 200 × г в течение 5 минут.
    3. Удалите супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в индукционной среде SGCAA+ доOD 600 0,5. Рассчитайте необходимый объём подвески с помощью уравнения разбавления: C1V1 = C2V2.
    4. Переместить в колбу Эрленмейера объёмом 125 мл и вырастить за ночь 18–24 часа при 30 °C с орбитальными колебаниями на 270 об/мин.
  2. Флуоресцентное окрашивание антител (в день сортировки)
    1. ИзмерьтеOD 600 клеток после индукции. Используйте две кюветы: одну с 1 мл SGCAA+, другую — 950 мкл SGCAA+ с 50 мкл клеток. Умножьте измеренное значениеOD 600 на 20, чтобы получить истинноеOD 600 постиндукционных элементов.
    2. Нормализуйте каждый образец до 3 × 107 клеток для окрашивания антител и сортировки FACS. Используйте C1V1 = C2V 2 для расчёта объёма ячеек, которые передаются из индукционной колбы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для мутагенеза насыщения NNS с четырьмя точками теоретический размер библиотеки составляет 106 вариантов. Чтобы достаточно отобрать библиотеку, используйте экран не менее чем в 10 раз больше библиотеки, или 107 ячеек. Пример: если желательно C1V1 = 3 × 107 клеток и C2 = постиндукционныйOD 600 из 6 (то есть 6 × 107 клеток/мл), затем аликвот 500 мкл индуцированных клеток (то есть V2 = 3 × 107 клеток / 6 × 107 клеток/мл = 500 мкл).
    3. Перенесите рассчитанный объём ячеек в трубку объёмом 1,5 мл и центрифугу при 5 000 × г в течение 5 минут.
    4. Удалить супернатант и ресуспензировать в 500 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) + 0,5% бычьей сывороточной альбумина (BSA).
    5. Центрифугировать при 5 000 × г в течение 5 минут и повторить шаг 3.2.4.
    6. Центрифугировать при 5 000 × г в течение 5 минут, а пока выполнить шаг 3.2.7.
    7. Приготовьте смесь для окрашивания антител в пробирке объёмом 1,5 мл, содержащей анти-HA флуоресцеин изотиоцианат (FITC) (0,5 мкг/107 клеток), анти-FLAG фикоэритрин (PE) (0,05 мкг/10 7 клеток) и PBS + 0,5% BSA (100 мкл/10 7 клеток). Держите трубку на льду.
    8. Снимите супернатант и снова суспензируйте с морилкой. Используйте 300 мкл смеси для окрашивания на 3 × 107 ячеек. Не создавайте вихрь трубки; Только инвертировать или фликать.
    9. Держите клетки на льду в темноте в течение 1 часа после реанимации.
  3. Стирка после окрашивания
    1. Окрашенные клетки центрифугой при 5 000 × г в течение 5 минут. Удалять супернатант и повторно суспензировать гранулу в PBS, содержащем 0,5% BSA, используя 0,5 мл на 1 × 107 клеток (например, 500 мкл для 1 ×10 7 клеток или 1,5 мл для 3 × 107 клеток).
    2. Центрифуга при 5 000 × г, 5 минут. Удалить супернатант, ревзвешивать 750 мкл PBS + 0,5% BSA.
    3. Передайте ещё 750 мкл PBS + 0,5% BSA в сборную трубку на 10 мл.
  4. FACS
    1. Выполнить необходимый запуск и подготовку цитометра для нового эксперимента.
    2. Создайте три точечных диаграммы. На первом точечном диаграмме выберите имя оси X, чтобы отображить канал прямого рассеяния (FSC-A), и имя оси Y для отображения бокового канала зоны рассеяния (SSC-A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это облегчит отбор живых клеток.
    3. Сохраняйте имя оси X для отображения канала FSC-A, а на втором точечном диаграмме меняйте канал по оси Y на отображение высоты прямого рассеяния (FSC-H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это облегчит выбор синглов.
    4. Выберите имя по оси X, чтобы отображить канал PE, и имя по оси Y, чтобы отображить канал FITC на третьем точечном графике.
    5. Запустите отрицательный контроль на цитометре с помощью каналов 530/30 нм (FITC) и 585/42 нм (PE). Проводите сортировку с помощью сопла диаметром 70 мкм при давлении оболочки 70 psi. Собирать образцы со скоростью 4000–5000 событий/с.
    6. Нарисуйте многоугольник вокруг основной популяции целых дрожжевых клеток, чтобы исключить мусор и мелкие частицы с низким уровнем сигналов FSC-A и SSC-A на первом точечном графике (FSC-A против SSC-A).
    7. Синглеты затвора на графике FSC-H против FSC-A внутри этого элемента, выбирая линейную популяцию, демонстрирующую пропорциональную зависимость между FSC-H и FSC-A. Исключать события, отклоняющиеся от линейного распределения и соответствующие дублетам и агрегатам клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Третий точечный график для PE и FITC покажет диагональный кластер точек для отрицательного контроля (то есть дрожжевые клетки, экспрессирующие целостную субстратную кассету).
    8. Пропустите образцы и отсортируйте клетки дрожжей по нужным значениям PE/FITC в пробирку(ы). Проанализировать общее количество ячеек, соответствующее как минимум в 10 раз большему размеру теоретической библиотеки, чтобы обеспечить адекватное представление всех вариантов (например, проанализировать ~1 × 107 ячеек для библиотеки с теоретическим разнообразием ~1 ×10 6 вариантов).
    9. Разместите сортировочный элемент ниже диагонали PE/FITC отрицательной контрольной популяции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более строгие элементы улучшают обогащение желаемых вариантов, но снижают восстановление клеток.
  5. После FACS
    1. Центр для сбора центрифуг при 3 200 × г в течение 5 минут. Аккуратно удалите супернатант, оставив 1 мл, и снова суспензуйте в 5 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте 1 мл супернатанта, так как клетка на дне не будет видна после центрифугирования.
    2. Центрифугные клетки снова на 3 200 × г в течение 5 минут. Удалите супернатант, оставив 1 мл. Повторная подвеска с 4 мл SDCAA+.
    3. В колбу Erlenmeyer объёмом 250 мл добавьте 15 мл SDCAA+. Перенесите вновь подвешенные клетки с шага 3.5.2 в эту колбу.
    4. Инкубировать ночью в течение 18–24 часов при 30 °C с орбитальными колебаниями при 270 об/мин.
    5. Повторяйте шаги 3.1, 3.2, 3.3 и 3.4 для каждого этапа направленной эволюции.

4. Восстановление плазмид и секвенирование отдельных клонов

  1. Выращивать отдельные колонии
    1. Получите глицеровый бульон, смешав 500 мкл жидкой культуры после шага 3.5.4 и 500 мкл стерильного 50% глицерила, в результате чего получится 25% раствор глицерила. Вихрь для тщательного смешивания клеток.
    2. Храните в морозильнике при температуре –80 °C на ночь. Для длительного хранения — перемещение в жидкий азот.
    3. Соскребли глицероловый приклад стерильным наконечником на 1000 мкл и смешайте его со 100 мкл SDCAA+. Разложите эту смесь на тарелке SDCAA и инкубируете вверх ногами при температуре 30 °C.
    4. Собирайте колонии через 3 дня и выращивайте их за ночь в 1,5 мл SDCAA+ в 14 мл трубках.
  2. Проведите минипреп дрожжей для извлечения плазмид
    1. Гранулируйте ночную культуру, центрифугируя при 16 000 × г в течение 1 минуты и снова суспендуйте в 200 мкл раствора 1 из набора для очистки дрожжевого плазмида.
    2. Добавьте 5 мкл раствора литического фермента (5 U/μL).
    3. Инкубировать в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 4 часов на сквозном миксере.
    4. Проведите цикл заморозки-оттаивания: заморозка при -80 °C в течение 20 минут и размораживание при 42 °C в течение 10 минут в водяной бане.
    5. Добавьте 200 мкл раствора 2 из набора для очистки дрожжевых плазмид, перемешайте 2–3 раза инвертируя и оставьте постоять 5 минут.
    6. Добавьте 400 мкл раствора 3 из набора для очистки дрожжевого плазмида и перемешайте путём инвертирования 2–3 раза. Центрифуга при 16 000 × г в течение 5 минут.
    7. Очистить плазмидную ДНК с помощью комплекта для очистки с высокой способностью связывания ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за большого количества сдвиговой геномной дрожжевой ДНК, поступающей из лизированных клеток, необходимо использовать колонку на основе кремнезёма с более высокой способностью связывания ДНК (35 мкг) вместо колонки для очистки ДНК плазмиды дрожжей с меньшей ёмкостью (5 мкг)15.
    8. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. Выход ДНК составляет 10–30 нг/мкл.
  3. Преобразовать очищенные плазмиды в химически компетентные клетки E. coli
    1. Приготовьте SOC медиа по рецепту из таблицы 5 и тарелки с LB-хлорамфениколом. Также предварительно разогрейте водяную ванну до 42 °C.
    2. Разогрейте пластину LB-хлорамфеникола для каждой плазмиды при 37 °C в течение 20 минут.
    3. Достаньте трубку с химически компетентными клетками из морозильника при температуре –80 °C и разморозите их на льду.
    4. Аликвот 30 мкл компетентных клеток для каждой плазмиды в 1,5 мл трубку на льду.
    5. Пипетта 3 мкл плазмиды в компетентные клетки. Перемешайте и оставьте на льде 5 минут.
    6. Проведите тепловой шок, кратковременно инкубировав клетки в водяной бане при 42 °C в течение 40 секунд.
    7. Инкубировать на льду 2 минуты.
    8. Добавьте в клетки 300 мкл среды SOC и инкубируете 15 минут при 37 °C при 220 об/мин.
    9. Пластина 50–100 мкл преобразованных компетентных клеток на предварительно нагретые пластины.
    10. Инкубировать тарелки при 37 °C вверх ногами в течение 18 часов.
  4. Сбор колоний
    1. Добавьте 5 мл жидкой среды LB-хлорамфеникола в 14 мл круглодонных пробирок.
    2. Выберите колонию с помощью стерильного наконечника объёмом 1000 мкл и положите её в пробирку для культуры.
    3. Поместите трубки в шейкер (220 об/мин, угол 30°–45° для максимальной аэрации) при 37 °C на 18 часов.
  5. Экстракция плазмидов из бактериальных жидких культур
    1. Центрифугуйте жидкие культуры при 3 200 × г в течение 4 минут. Декантуйте супернатант.
    2. Извлекайте плазмиды из ночных культур с помощью комплекта для очистки плазмид.
    3. Измеряйте концентрацию очищенных плазмид с помощью спектрофотометра.
  6. Отправить плазмиды для секвенирования
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте такие сервисы, как секвенирование нанопор целой плазмиды или, альтернативно, секвенирование Сэнгера с праймером, расположенным по фланкам мутагенизированной области.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эффективное строительство библиотеки крайне важно для обеспечения достаточного покрытия мутационного пространства. Чтобы избежать потери редких функциональных вариантов, количество трансформаторов должно достигать не менее 10× до 100× что соответствует размеру теоретической библиотеки. Поскольку эффективность трансформации у S. cerevisiae зависит от концентрации клеток и наиболее высокая в ранних и средних логарифмическихячейках 16, мы оптимизировали нача...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Направленная эволюция — это метод с высокой пропускной способностью, использующий итеративные циклы диверсификации и отбора для выявления белков с усиленной или новой биохимическойфункцией 17. В этом протоколе мы подробно описываем оптимизированный рабочий процесс для развития распознавания протеаз-субстрата с использованием системы отображения поверхностей клеток у S. cerevisiae. Система поверхностного отображения отражает активность протеазы с обнаружив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах. Исходные данные, поддерживающие этот протокол, включая FASTQ-файлы секвенирования Nanopore, файлы проточной цитометрии (FCS) и исходные данные, используемые для генерации фигур и таблиц, а также плазмиды pDD1523 и pDD1524, были размещены в Zenodo и доступны публично по адресу 10.5281/zenodo.20746804

Благодарности

Мы благодарим всех членов лаборатории Дингал за их советы, экспертизу и обсуждения. Мы также благодарим UTD Flow Cytometry Core за инфраструктуру и поддержку. M.B.L. поддерживается стипендией UTD Eugene McDermott Graduate Fellowship. Это исследование было поддержано Фондом стартапов UTD и наградами Национальных институтов здоровья (NIGMS) для лаборатории P.C.D.P.D. (R35GM150967).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реактивы
10 мМ dNTP MixNEBN0447SPCR-реакции (Таблицы 1, 3)
10X PBS, pH 7.4FisherBP3994Базовый буфер для окрашивания (Шаги 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction BufferNEBB9027SПродается отдельно; также входит в состав полимеразы Q5
Агар, BactoBD Difco281230-500gАгарные пластинки SDCAA (Таблица 5); 15 г/л
Агароза (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagentsBP160-500Гелевое электрофорезирование
Анти-FLAG PE антителоBioLegend637309Окрашивание для FACS; PE-конъюгат анти-FLAG
Анти-HA Tag антитело [FITC]GenScriptA01621Окрашивание для FACS; FITC-конъюгат анти-HA
Bacto Casamino AcidsBD Difco223120SDCAA+, SGCAA+, SCAA среды (Таблица 5); 5 г/л
Bacto Peptone / TryptoneRPIT60060-10000.0Приготовление сред LB/SOB; 20 г/л в YPD (Таблица 5)
БСА, альбумин сыворотки быка, фракция VSigma-Aldrich126575-10GM0.5% в PBS; буфер для окрашивания (Шаги 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)NEBR0739SСборка Golden Gate кассеты-субстрата (Таблица 8)
Раствор хлорида кальция (1 М)Sigma-Aldrich21115-100mLБуфер для электропорации: окончательная концентрация 1 мМ (Таблица 5)
ColiRollers® Платирующие бусиныSigma-Aldrich71013-3Стерилизация путем размещения в бутылках с реактивами и автоклавирования при 121ºC, 15 psi, в течение 15 мин.
D-ГалактозаThermo FisherA12813.30250 г; 20% w/v запас для индукции SGCAA+ (Таблица 5)
D-СорбитолThermo Fisher1327300.10Буфер для электропорации (1 М) и среда для развития (Таблица 5)
Декстроза (D-Глюкоза), безводнаяSigma-AldrichG8270-1KGYPD, SDCAA+, 20% w/v запас декстрозы (Таблица 5)
Difco Yeast Nitrogen Base без аминокислотSigmaY0626-250G6.7 г/л в SDCAA/SGCAA (Таблица 5)
Difco YPD бульон (предсмешанный)BD242820-500gГотовые YPD альтернативы; 500 г
DL-Дитиотреитол (DTT)Sigma-AldrichD0632-1GБуфер кондиционирования: окончательная концентрация 10 мМ; аликотировать 250 μL, хранить −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification KitOmega Bio-tekD6492-02Очистка продукта PCR
E.Z.N.A. Gel Extraction KitOmega Bio-tekD2500-01Очистка геля после PCR и рестрикции (Шаги 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-tekD6942-02Очистка плазмид (Шаг 4.2)
Глицерин (≥99%)FisherBP229-450% v/v запас для глицериновых запасов (Шаг 4.1.1)
Сульфат канамицина FisherBP906-5SDCAA+ и SGCAA+: окончательная концентрация 50 μг/мл; заменяет Sigma K0879-5G
KLD Enzyme MixNEBM0554SКиназа-лигаза-DpnI; точечная мутагенез
KLD Reaction BufferNEBB0554AИспользуется с KLD Enzyme Mix
LB бульон (Lennox)Sigma-AldrichL3022-1KGЖидкая культура E. coli
Дигидроттартрат лития (LiOAc·2H2O)Thermo FisherA17921.30Буфер кондиционирования: окончательная концентрация 0.1 М; добавлять перед DTT (Таблица 5)
Luria агар (Luria-Bertani агар)RPIL24020-2000.0Посев E. coli; заменяет Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino AcidsSigma2240-500GMАльтернативный источник аминокислот
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Раствор пенициллин-стрептомицин, 100XCorning30-002-CISDCAA+, SGCAA+: окончательная концентрация 1X
PstI-HF (5000 U)NEBR3140SЛинейризованные векторы (Таблица 10); использовать версию HF
Q5 HF DNA полимеразаNE

Ссылки

  1. Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471–487.
  2. Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.
  3. Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312–318.
  4. Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108–115.
  5. Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284–2301.
  6. Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167–174.
  7. Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63–71.
  8. Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31–34.
  9. Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155–159.
  10. Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553–557.
  11. Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22–28.
  12. Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651–5656.
  13. Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201–216.
  14. Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893–901.
  15. Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.
  16. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163–168.
  17. Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995–10000.
  18. Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229–7234.
  19. Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.
  20. Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510–518.
  21. Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.
  22. Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474–1483.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

234234PotyviridaeSaccharomyces cerevisiae

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.