Оптимизированный рабочий процесс отображения поверхностей дрожжей для направленной эволюции протеаз

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для направленной эволюции вирусных протеаз у Saccharomyces cerevisiae с использованием системы отбора на основе поверхностного дисплея. В нём описывается библиотека вставок ДНК и дизайн кассет субстрата, электропорация, оптимизированная для высокой эффективности трансформации, отбор клеток на основе сортировки клеток с флуоресценцией для расщепления протеаз, а также секвенирование обогащённых вариантов.

Аннотация

Направленная эволюция имитирует естественный эволюционный процесс в быстрой, контролируемой лабораторной среде, чтобы эволюционировать белки с желаемыми функциями или признаками. Скрининг большого пула мутантных генов, кодирующих белки, позволяет функционально отбирать желаемые варианты для применения в биотехнологии, медицине и синтетической биологии. Используя этот протокол, мы проводим направленную эволюцию в Saccharomyces cerevisiae для создания вариантов протеазы с высокой специфичностью для неродной последовательности субстрата. Мы размещаем эти варианты протеазы на поверхности дрожжевых клеток, чтобы облегчить отбор желаемых вариантов с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) на протяжении нескольких этапов обогащения. Четыре ключевых элемента субстрат-кассеты соэкспрессируются с протеазной библиотекой: белок-синтез, состоящий из (i) субъединицы дрожжевого адгезионного рецептора Aga2, (ii) селекционных и (iii) последовательных субстратов контрселекции, (iv) последовательностей эпитопных меток и опциональной последовательности сигнала эндоплазматического ретикулума (ER). Дрожжевые клетки, в которых расщеплена только последовательность селективного субстрата, изолируются с помощью многоцветных FACS с помощью флуоресцентных антител (с фикоэритрин/флуоресцеин-изотиоцианатом) антиэпитопов. Здесь мы предоставляем подробности оптимизированного, пошагового протокола проведения кампании по эволюции протеаз, включая проектирование библиотеки вставок ДНК и кассет субстрата, электропорирование дрожжей клеток с высокой эффективностью трансформации (до 10⁹ трансформантов на микрограмм ДНК), отбор, обогащение и секвенирование эволюционных вариантов на основе FACS. Мы демонстрируем наш протокол направленной эволюции, эволюционируя ядровую протеазу с включением A (TEVp) в табачном вирусе травления от разрезания естественной последовательности субстрата ENLYFQ↓S к расщеплению новой последовательности ENLYFE↓S.

Введение

Протеазы цистеина из семейства Potyviridae, а именно протеазы ядерного включения A (NIa), представляют собой в основном неиспользованный источник последовательно-специфических эндопептидаз. С более чем 3800 характеризованными членами семейства, протеазы NIa расщепляют отдельную семиаминокислотную субстратную последовательность. Семейство потивирусов предлагает разнообразный набор протеаз для проектирования программируемых систем контроля белков, построения ортогональных генетических цепей на основе протеаз, а также разработки последовательно-специфических биотехнологических^{инструментов 1,2}. Несмотря на это природное разнообразие, только две протеазы NIa — TEVp и протеаза вируса пятнистого пятна в табачных венах (TVMVp) — были тщательно охарактеризованы и спроектированы для широкого лабораторного и биотехнологического^{применения 3,4}. Этот ограниченный набор инструментов для протеазы ограничивает пространство для многокомпонентных схем, требующих ортогональных протеазных^{активностей 5}, тем самым стимулируя усилия по дальнейшему расширению и характеристике NIa-протеаз через направленную^{эволюцию 6,7}.

Дрожжевое поверхностное отображение стало одной из самых мощных платформ для направленной эволюции, обеспечивая высокопроизводительный скрининг библиотек белков с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS^)6,7. Например, система скрининга секвестра секвестра дрожжевого эндоплазматического ретикулума (YESS) связывает активность протеаз, чтобы проявить поверхностное отображение через секреторный путь S. cerevisiae ^6,7. Система YESS применялась для создания новых специфичностей протеазного субстрата и продемонстрировала свою полезность в многораундных кампаниях направленной эволюции. В этой системе варианты протеазы соэкспрессируются с синтезирующим белком, содержащим кассету с расщеплённым субстратом с эпитопными маркерами, а поверхностный якорь Aga1p экспрессируется в дрожжевом штамме EBY100. Дифференциальное маркирование флуоресцентными антителами отличает отсеченные от нерасщепленных субстратных кассет, отображаемых на поверхности клетки. Этот механизм, зависящий от активности, напрямую совместим с итеративным отбором на основе FACS для библиотек из 10⁷ и более^{вариантов 6,7}.

Фундаментальным условием направленной эволюции является способность внедрять библиотеки вариантов в достаточном масштабе для достижения достаточного охват целевого пространства последовательностей. Для библиотек мутагенеза насыщения сайтами, охватывающих несколько позиций аминокислот, требуется преобразование от 10⁸ до 10⁹ уникальных трансформаторов, чтобы обеспечить хорошее представление разнообразия в отсортированной популяции. Существует несколько методов введения экзогенной ДНК в S. cerevisiae, каждый из которых имеет свои пределы пропускной способности. Традиционный метод химической трансформации использует литиево-ацетат/одноцепочечную носительную ДНК/полиэтиленгликоль (LiAc/ssDNA/PEG) благодаря своей простоте и доступности. Однако обычно он достигает эффективности трансформации всего 10⁴–10^{единиц по 6} единиц формирования колоний (CFU) на микрограмм ДНК, что не хватает вариации последовательностей, необходимых для крупных библиотечных^{кампаний 8}. В отличие от этого, метод электропорации применяет высоковольтное электрическое поле для кратковременной проницаемости клеточной мембраны и облегчения поглощения ДНК. Электропорация стабильно достигает самой высокой эффективности преобразования среди доступных методов трансформации, при этом оптимизированные протоколы показывают выход 10⁸–10^{9 CFU 9}. Было замечено, что эффективность электропорации у S. cerevisiae критически чувствительна к фазе роста клеток, массе ДНК и буферному составу, что с тех пор создаёт основу, которая с тех пор была широко адаптирована для ориентированной эволюции на уровне^{библиотеки 9}.

Описанный здесь протокол использует штамм S. cerevisiae EBY100, широко используемый штамм для отражания на поверхности дрожжей. EBY100 был разработан Бодером и Виттрупом путём интеграции экспрессионной кассеты AGA1 под управлением галактозно-индуцируемого промотора GAL1 в хромосомный локус AGA1 материнского штамма BJ5465 с дефицитом протеазы¹⁰. Штамм коммерчески доступен в ATCC (каталог No MYA-4941; вкладчик К.Д. Виттруп), несущий генотип MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). В результате слияние кассет Aga1p и субстрата Aga2p экспрессируются одним и тем же промотором, индуцируемым галактозой, что обеспечивает коиндуцированное соединение двух субъединиц в дисульфидно-связанный комплекс Aga1p–Aga2p, который закрепляет демонстрируемое слияние на клеточной стенке.

Несмотря на широкое применение EBY100 в приложениях с дрожжевым отображением, ни один опубликованный протокол не был систематически оптимизирован для электропорирования этого штамма на уровне библиотеки. Специфичные для EBY100 параметры, такие как оптимальная фаза роста при сборе урожая, состав среды во время субкультуры и количественная зависимость между начальной оптической плотностью на 600 нм (_{OD 600}) и эффективностью трансформации, предстоит тщательно охарактеризовать и оптимизировать. Здесь мы сообщаем, что эффективность трансформации в EBY100 монотонно увеличивается с_{OD 600} в культуре при уборке, при этом клетки в поздней лог-фазе дают значительно более высокие скорости трансформации, чем те, что были собраны на ранней фазе логов. Мы оценили критические параметры протокола, включая начальные значения_{OD 600} при инокуляции, использование среды с 2 × дрожжевым экстрактом пептонного декстроза (YPD) для субкультур, формулы буфера электропорации и условия вырастания после электропорации. Представленный здесь протокол обеспечивает оптимизированный пошаговый рабочий процесс (рисунок 1A–C, рисунок 2, рисунок 3A–D, рисунок 4A–E) для подготовки электрокомпетентных клеток EBY100 и выполнения высокоэффективной электропорации библиотек ДНК, обеспечивая скорости трансформации стабильно выше 10⁹ CFU. Для подтверждения этого протокола мы провели комплексную кампанию направленной эволюции для проектирования TEVp с изменённой специфичностью расщепления в четырёх этапах отбора и обогащения на основе FACS. Секвенирование обогащённых вариантов протеазы подтвердило значительную диверсификацию на целевых остатках внутри кармана связывания субстрата протеазы, демонстрируя, что протокол обеспечивает достаточное покрытие библиотеки пространства последовательностей для поддержки продуктивных эволюционных кампаний. Этот протокол будет полезен для исследователей, использующих EBY100 для направленной эволюции на основе дисплея на поверхности дрожжей и совместимого с FACS, высокопроизводительного скрининга протеаз,^{антител 9},^{киназ 11} и^{рецепторов 12}, а также других белков.

Протокол

Все эксперименты с рекомбинантным S. cerevisiae проводились в соответствии с политикой и процедурами Институционального комитета по биобезопасности и химической безопасности Университета Техаса в Далласе. Рекомбинантные дрожжевые штаммы обрабатывались в рамках удержания уровня биобезопасности 1 (BSL-1) в соответствии с установленными институциональными микробиологическими практиками. Электропорация, культура и флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS) проводились в соответствии с утверждёнными институциональными процедурами биобезопасности. Культуры дрожжей и загрязнённые расходники были деконтаминированы и утилизированы как биологически опасные отходы в соответствии с институциональными рекомендациями.

1. Подготовка векторов и вставок

1. Генерация библиотек протеазных потивирусов посредством мутагенеза насыщения сайтом
   1. Проектирование с использованием программного обеспечения для проектирования последовательностей, перекрывающего 30–50 мер, прямых и обратно олигонуклеотидов для создания мутантной библиотеки протеаз. Заменим кодон дикого типа в соответствующем олигонуклеотиде на вырожденный кодон NNS, где N — это A, T, G или C, а S — G или C, для позиций, направленных на мутагенез.
   2. Спроектировать 3′-перекрытие между парой прямой и обратной олигонуклеотидной парой с температурой плавления (Tm) 55–60 °C. Спроектировать первый и последний олигонуклеотиды так, чтобы они содержали перекрытие на 50 нт с вектором дисплея на поверхности дрожжей за пределами рестрикционных сайтов.
   3. Убедитесь, что хотя бы один конец вставки точно перекрывает один конец линеаризованного вектора для облегчения гомологичной^{рекомбинации 13}. Избегайте зазоров между соседними олигонуклеотидами¹⁴.
   4. Ресуспензировать олиго до 100 мкм с деионизированным_H2O. В стерильной трубке объёмом 1,5 мл смешайте по 0,5 мкл каждого олиго в итоговый объём 200 мкл (конечная концентрация 250 нМ для каждого олиго).
   5. Настройте реакцию ПЦР с компонентами, перечисленными в Таблице 1 , чтобы собрать библиотеку протеаз, используя условия термоцикла из Таблицы 2.
   6. Настройте вторую ПЦР-реакцию с использованием внешних прямых и обратного олиго (Таблица 3), используя первый собранный продукт ПЦР в качестве шаблона. Усилите продукт, как показано в таблице 4.
   7. Запустите второй продукт ПЦР на геле агарозы 1% с бромидом этидия (0,5 мкг/мл) при 240 В в течение 30 минут. Вырезать полосу, соответствующую ожидаемой длине ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ: Этидий бромид — это мутаген, и с ним следует обращаться с помощью соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки. Избегайте контакта кожи и вдыхания. Утилизировать гели, буферы и расходные материалы с бромидом этидий в качестве опасных химических отходов в соответствии с институциональными нормами безопасности.
   8. Очищайте с помощью набора для экстракции геля. Элют в 50 мкл деионизированного_{H 2}O.
   9. Измеряйте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. Храните ДНК при −20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая реакция 50 мкл^{второго} ПЦР даёт примерно 0,5–1,0 мкг общей ДНК. Поскольку для каждой электропорации требуется 12 мкг библиотеки протеазы (то есть вставка), соответственно масштабируйте реакции.
2. Сборка кассет на подложке
   1. Подготовьте пластины LB-агар и жидкую среду LB-хлорамфеникол. См. рецепты в таблице 5.
   2. Спроектировать набор перекрывающихся 30-мерных олигонуклеотидов в прямом и обратном направлении для сборки кассетного субстрата. Спроектируйте 5′-концы каждого обратного олигонуклеотида и переднего олигонуклеотида следующего фрагмента так, чтобы они совпали на 4 нуклеотида.
   3. Суспендировать лиофилизированные олиго до 100 мкм с помощью деионизированного_{H 2O}.
   4. Смешивайте реагенты, как в таблице 6.
   5. Используйте программу циклирования из таблицы 7 для отжига и фосфорилирования олиго-смеси.
   6. Разбавьте отжжённые олиго в 4 раза в дейонизированном_{H 2}O до конечной концентрации 1,25 мкм.
   7. Объединим отжжённую олиго-смесь с вектором (например, pDD1523), следуя таблице 8.
   8. Выполните сборку Golden Gate, следуя программе велоспорта из таблицы 9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, плазмида pDD1523 имеет рестрикционный сайт типа IIS (BsmBI) ниже промотора GAL1/10. Успешная сборка позволяет индукцией галактозы кассеты^{субстрата 7}.
   9. Преобразовать полученную плазмиду в E. coli.
   10. Пластинчатые клетки на LB-агаре с соответствующим антибиотиком. Инкубировать 16–18 часов при 37 °C.
   11. Выберите отдельные колонии и инокулируйте их в 5 мл LB среды. Инкубировать в течение ночи (16–18 часов) при 37 °C с встряхиванием (220 об/мин).
   12. Извлекайте плазмиды из ночных культур с помощью минипреп-набора для плазмид.
   13. Измерьте концентрацию плазмиды с помощью спектрофотометра, затем отправьте для секвенирования.
3. Линеаризация вектора отображения дрожжей
   1. Линеаризуйте дрожжевую дисплейную плазмиду, например, переварите pDD1524 с помощью рестрикционных ферментов SphI и PstI, чтобы подготовить дрожжевого дисплейного вектора с субстратной кассетой для электропорации. Смешайте реагенты, указанные в таблице 10 , и инкубуйте при 37 °C в течение 1 часа.
   2. Запустите продукт рестрикционного дижеста на 1% агарозном геле при 240 В в течение 30 минут. Удалите полосу, соответствующую ожидаемой длине ДНК, и очистите с помощью набора для экстракции геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждые 50 мкл рестрикционного дигеста давали около 0,5–1,0 мкг общей ДНК. Поскольку каждая электропорация требует 4 мкг линеаризованного вектора, масштабируйте реакции дигестирования соответственно.

2. Электропорация

Примечание: Соблюдайте институциональные процедуры безопасности при обращении с биологическими материалами и реагентами, носите соответствующие средства индивидуальной защиты и утилизируйте биологические и химические отходы в соответствии с институциональными рекомендациями.

1. Подготовка буферов, пластин и среды (за 2 дня до электропорации)
   1. Подготовить материалы для роста (1 × YPD; 2 × YPD; Синтетические декстрозовые касаминокислоты, SDCAA+; а также синтетические галактозные касаминокислоты, SGCAA+), пластины (YPD и SDCAA), электропорационный буфер и стерильную воду по рецептам в таблице 5. Храните при 4 °C.
2. Подготовка пластины с полосами EBY100.
   1. Выбросьте дрожжи EBY100 на агар YPD из глицеролового запаса. Выращивайте при 30 °C в течение 2 дней.
   2. После роста храните тарелку при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полосатая пластина остаётся пригодной для использования до 1 месяца; Отметьте дату серии на тарелке.
3. Подготовка прекультуры EBY100 (за день до электропорации)
   1. Подготовьте 125 мл из 1 × YPD в термосте Erlenmeyer объемом 500 мл.
   2. Подготовьте 25 мл из 1 × YPD в конической трубке объемом 50 мл. С помощью наконечника микропипетки собирайте клетки EBY100 из пластины, выращиваемых в течение 2 дней. Затем перенесите клетки дрожжей с кончика пипетки в коническую трубку с 1 × YPD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полоса клеток должна образовывать размазок длиной примерно 1–2 мм.
   3. Удалите кончик микропипетки и закрутите коническую трубку для достаточного смешивания.
   4. Подготовьте 150 мл предварительной культуры, передав 25 мл 1 × YPD с дрожжевыми клетками в колбу объемом 500 мл с 125 мл 1 × YPD. Покрутите для смешивания.
   5. С помощью спектрофотометра измерьте_{OD 600} , подготовив две микрокюветы с длиной пути 1 см: одну с 1 мл 1 × YPD в качестве заготовки и другую с 1 мл прекультуры
   6. Выращивайте 150 мл предварительной культуры за ночь (16–20 часов) при 30 °C с орбитальными колебаниями при 270 об/мин.
4. Подготовка субкультуры при желаемом начальном_{OD 600} (в день электропорации)
   1. Подготовьте буфер для кондиционирования и среду вырастания, как описано в таблице 5.
   2. Измерьте_{OD 600} при ночной предкультуре (ожидаемый OD₆₀₀ равен 17–22). Чтобы попасть в линейный диапазон спектрофотометра, измерьте разбавление докультуры в соотношении 1:20.
   3. Рассчитайте объём предварительной культуры, необходимый для вакцинации субкультуры объёмом 100 мл. Рекомендуется начальный субкультурный_{OD 600} в диапазоне 3.0–4.0.
   4. Разведите культуру до желаемого первоначального_{OD 600} в 100 мл при 2 × YPD в колбе Erlenmeyer объемом 500 мл.
   5. Инкубировать субкультуру объёмом 100 мл при 30 °C с орбитальными колебаниями на скорости 270 об/мин в течение 4 часа.
5. Подготовка среды во время 4-часовой инкубации
   1. Держите ледяной электропорационный буфер и стерильную воду готовыми (начиная с шага 2.1.1).
   2. Подготовьте буфер для кондиционирования (100 мл), следуя рецепту из таблицы 5. Используйте 20 мл буфера для обусловлений на каждое преобразование; Масштабируйте соответственно. Храните при комнатной температуре (20–23 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ: Кондиционирующий буфер содержит дитиотрейтол (DTT) и литиевый ацетат (LiAc), которые являются химическими раздражителями, способными вызывать раздражение кожи и глаз. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки, и обращайтесь с этими реагентами в соответствии с институциональными процедурами химической безопасности. Утилизировать неиспользованные растворы и отработанные буферы в качестве химических отходов в соответствии с институциональными рекомендациями.
   3. Подготовьте отрастающую среду (50 мл): смешайте 25 мл 2 × YPD и 25 мл сорбитола 1 мл. Используйте 8 мл нарастающего материала на каждую трансформацию. Храните при комнатной температуре (20–23 °C).
6. Подготовка электрокомпетентных дрожжевых клеток после 4 часа инкубации.
   1. Разделите субкультуру 100 мл на две конические трубки по 50 мл. Соберите клетки центрифугой при 4 °C и 1 500 × г в течение 3 минут, затем декантуйте среду. Держите ячейки на льду до завершения шага 2.6.4.
   2. Аккуратно суспензируйте каждую клеточную гранулу 25 мл ледяной стерильной воды. Центрифугуйте при 4 °C и 1 500 × г в течение 3 минут, затем декантуйте среду.
   3. Повторите шаг 2.6.2.
   4. Аккуратно суспензируйте каждую ячейку с помощью 25 мл ледяного электропорационного буфера. Центрифугуйте при 4 °C и 1 500 × г в течение 3 минут, затем декантуйте среду.
   5. Извлеките клетки из льда и аккуратно суспензируйте каждую гранулу с помощью 10 мл буфера для кондиционирования комнатной температуры (20–23 °C). Затем собрать в одну колбу Эрленмейера объёмом 125 мл и инкубировать при 30 °C с орбитальными колебаниями при 270 об/мин в течение 30 минут.
   6. Залейте эти клетки в трубку объёмом 50 мл. Центрифуга при 4 °C и 1 500 × г в течение 3 минут. Декантировать медиа.
   7. Аккуратно суспензируйте клеточную гранулу с помощью 50 мл ледяного электропорационного буфера. Центрифугуйте при 4 °C и 1 500 × г в течение 3 минут, затем декантуйте среду.
   8. Повторно суспензировать ячеточную гранулу до конечного объёма 1 мл, добавив примерно 100–200 мкл электропорационного буфера. Держите клетки на льду до электропорации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электрокомпетентные элементы можно заморозить (то есть поместить в морозильник при температуре –80 °C) и использовать позже без значительной потери эффективности электропорации.
7. Электропорация, вырастание и покрытие
   1. Предохлаждённый электропорационный кувет(ы) с зазором 0,2 см на льду.
   2. Перенесите 380 мкл реуспензированной гранулы в стерильную трубку объёмом 1,5 мл. Смешивайте с 4 мкг плазмидной ДНК или 4 мкг линеаризованного плазмидного вектора и 12 мкг вставки. Аккуратно перемешивайте пипеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимизировать количество электропорированных клеток, концентрация ДНК вектора и вставки должна быть в идеале 700–800 нг/мкл. Если концентрации ниже, используйте вакуумный концентратор.
   3. Перенесите суспензию в предварительно охлаждённые электропорационные куветы. Держите на льду 5 минут.
   4. Протрите стенки кюветы через 5 минут безворсовой лабораторной салфеткой, чтобы убрать остаточную влагу, которая может привести к появлению дуг во время электропорации. Избегайте пузырьков или ячеек над металлическими пластинами в кювете, так как они могут привести к появлению дуг. Чтобы поддерживать холодную температуру кувета, не трогайте электроды пластины.
   5. Подготовьте 8 мл отрастающей среды в конической трубке объемом 50 мл.
   6. Электропорируйте элементы со следующими настройками: напряжение 2,5 кВ, ёмкость 25 мкФ и сопротивление 200^{Ω 9}. Допустимый временной постоянный диапазон составляет 2,8–4,5 мс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ: Электропорация включает высоковольтные электрические импульсы. Убедитесь, что кюветы правильно расположены, и следуйте инструкциям производителя. Утилизировать использованные электропорационные кюветы в качестве биологически опасных отходов в соответствии с институциональными рекомендациями.
   7. Немедленно залить кювету примерно 200 мкл среды вырастания из конической трубки и перенести электропорированные клетки в коническую трубку объёмом 50 мл. Добавьте ещё 200–350 мкл среды для вырастания, пока в кюветте не останется видимой жидкости.
   8. Инкубировать коническую трубку электропорированных клеток объемом 50 мл в 8 мл среды вырастания при 30 °C без встряхивания в течение 1 часа. Переворачивайте трубку каждые 15 минут для смешивания.
   9. Собирайте клетки центрифугой при 1 500 × г, 25 °C в течение 3 минут. Затем декантировать носитель.
   10. Суспендуйте клетки в соответствующей среде выпадения дрожжей, чтобы поддерживать отбор для трансформированных клеток. Для плазмид, содержащих селективный маркер TRP1, ресуспензировать клетки в 250 мл SDCAA+ (не содержащей триптофана), чтобы селективно восстановить дрожжи, сохранившие плазмиду.
   11. Инкубировать за ночь (16–20 часов) при 30 °C с орбитальными колебаниями при 270 об/мин.

3. Индукция, окрашивание и проточная цитометрическая сортировка дрожжевых клеток

1. Индукция протеазной библиотеки и субстратной кассеты (за 1 день до сортировки)
   1. Измерить_{OD 600} как в шаге 2.4.2 после ночного роста трансформаторов в отпадающих средах.
   2. Аликвот 12 мл дрожжей-трансформаторов и центрифугу при 3 200 × г в течение 5 минут.
   3. Удалите супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в индукционной среде SGCAA+ до_{OD 600} 0,5. Рассчитайте необходимый объём подвески с помощью уравнения разбавления: C₁V₁ = C₂V₂.
   4. Переместить в колбу Эрленмейера объёмом 125 мл и вырастить за ночь 18–24 часа при 30 °C с орбитальными колебаниями на 270 об/мин.
2. Флуоресцентное окрашивание антител (в день сортировки)
   1. Измерьте_{OD 600} клеток после индукции. Используйте две кюветы: одну с 1 мл SGCAA+, другую — 950 мкл SGCAA+ с 50 мкл клеток. Умножьте измеренное значение_{OD 600} на 20, чтобы получить истинное_{OD 600} постиндукционных элементов.
   2. Нормализуйте каждый образец до 3 × 10⁷ клеток для окрашивания антител и сортировки FACS. Используйте C₁V₁ = C_{2V 2} для расчёта объёма ячеек, которые передаются из индукционной колбы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для мутагенеза насыщения NNS с четырьмя точками теоретический размер библиотеки составляет 10⁶ вариантов. Чтобы достаточно отобрать библиотеку, используйте экран не менее чем в 10 раз больше библиотеки, или 10⁷ ячеек. Пример: если желательно C₁V₁ = 3 × 10⁷ клеток и C₂ = постиндукционный_{OD 600} из 6 (то есть 6 × 10⁷ клеток/мл), затем аликвот 500 мкл индуцированных клеток (то есть V₂ = 3 × 10⁷ клеток / 6 × 10⁷ клеток/мл = 500 мкл).
   3. Перенесите рассчитанный объём ячеек в трубку объёмом 1,5 мл и центрифугу при 5 000 × г в течение 5 минут.
   4. Удалить супернатант и ресуспензировать в 500 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) + 0,5% бычьей сывороточной альбумина (BSA).
   5. Центрифугировать при 5 000 × г в течение 5 минут и повторить шаг 3.2.4.
   6. Центрифугировать при 5 000 × г в течение 5 минут, а пока выполнить шаг 3.2.7.
   7. Приготовьте смесь для окрашивания антител в пробирке объёмом 1,5 мл, содержащей анти-HA флуоресцеин изотиоцианат (FITC) (0,5 мкг/10⁷ клеток), анти-FLAG фикоэритрин (PE) (0,05 мкг/^{10 7} клеток) и PBS + 0,5% BSA (100 мкл/^{10 7} клеток). Держите трубку на льду.
   8. Снимите супернатант и снова суспензируйте с морилкой. Используйте 300 мкл смеси для окрашивания на 3 × 10⁷ ячеек. Не создавайте вихрь трубки; Только инвертировать или фликать.
   9. Держите клетки на льду в темноте в течение 1 часа после реанимации.
3. Стирка после окрашивания
   1. Окрашенные клетки центрифугой при 5 000 × г в течение 5 минут. Удалять супернатант и повторно суспензировать гранулу в PBS, содержащем 0,5% BSA, используя 0,5 мл на 1 × 10⁷ клеток (например, 500 мкл для 1 ×^{10 7} клеток или 1,5 мл для 3 × 10⁷ клеток).
   2. Центрифуга при 5 000 × г, 5 минут. Удалить супернатант, ревзвешивать 750 мкл PBS + 0,5% BSA.
   3. Передайте ещё 750 мкл PBS + 0,5% BSA в сборную трубку на 10 мл.
4. FACS
   1. Выполнить необходимый запуск и подготовку цитометра для нового эксперимента.
   2. Создайте три точечных диаграммы. На первом точечном диаграмме выберите имя оси X, чтобы отображить канал прямого рассеяния (FSC-A), и имя оси Y для отображения бокового канала зоны рассеяния (SSC-A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это облегчит отбор живых клеток.
   3. Сохраняйте имя оси X для отображения канала FSC-A, а на втором точечном диаграмме меняйте канал по оси Y на отображение высоты прямого рассеяния (FSC-H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это облегчит выбор синглов.
   4. Выберите имя по оси X, чтобы отображить канал PE, и имя по оси Y, чтобы отображить канал FITC на третьем точечном графике.
   5. Запустите отрицательный контроль на цитометре с помощью каналов 530/30 нм (FITC) и 585/42 нм (PE). Проводите сортировку с помощью сопла диаметром 70 мкм при давлении оболочки 70 psi. Собирать образцы со скоростью 4000–5000 событий/с.
   6. Нарисуйте многоугольник вокруг основной популяции целых дрожжевых клеток, чтобы исключить мусор и мелкие частицы с низким уровнем сигналов FSC-A и SSC-A на первом точечном графике (FSC-A против SSC-A).
   7. Синглеты затвора на графике FSC-H против FSC-A внутри этого элемента, выбирая линейную популяцию, демонстрирующую пропорциональную зависимость между FSC-H и FSC-A. Исключать события, отклоняющиеся от линейного распределения и соответствующие дублетам и агрегатам клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Третий точечный график для PE и FITC покажет диагональный кластер точек для отрицательного контроля (то есть дрожжевые клетки, экспрессирующие целостную субстратную кассету).
   8. Пропустите образцы и отсортируйте клетки дрожжей по нужным значениям PE/FITC в пробирку(ы). Проанализировать общее количество ячеек, соответствующее как минимум в 10 раз большему размеру теоретической библиотеки, чтобы обеспечить адекватное представление всех вариантов (например, проанализировать ~1 × 10⁷ ячеек для библиотеки с теоретическим разнообразием ~1 ×^{10 6} вариантов).
   9. Разместите сортировочный элемент ниже диагонали PE/FITC отрицательной контрольной популяции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более строгие элементы улучшают обогащение желаемых вариантов, но снижают восстановление клеток.
5. После FACS
   1. Центр для сбора центрифуг при 3 200 × г в течение 5 минут. Аккуратно удалите супернатант, оставив 1 мл, и снова суспензуйте в 5 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте 1 мл супернатанта, так как клетка на дне не будет видна после центрифугирования.
   2. Центрифугные клетки снова на 3 200 × г в течение 5 минут. Удалите супернатант, оставив 1 мл. Повторная подвеска с 4 мл SDCAA+.
   3. В колбу Erlenmeyer объёмом 250 мл добавьте 15 мл SDCAA+. Перенесите вновь подвешенные клетки с шага 3.5.2 в эту колбу.
   4. Инкубировать ночью в течение 18–24 часов при 30 °C с орбитальными колебаниями при 270 об/мин.
   5. Повторяйте шаги 3.1, 3.2, 3.3 и 3.4 для каждого этапа направленной эволюции.

4. Восстановление плазмид и секвенирование отдельных клонов

1. Выращивать отдельные колонии
   1. Получите глицеровый бульон, смешав 500 мкл жидкой культуры после шага 3.5.4 и 500 мкл стерильного 50% глицерила, в результате чего получится 25% раствор глицерила. Вихрь для тщательного смешивания клеток.
   2. Храните в морозильнике при температуре –80 °C на ночь. Для длительного хранения — перемещение в жидкий азот.
   3. Соскребли глицероловый приклад стерильным наконечником на 1000 мкл и смешайте его со 100 мкл SDCAA+. Разложите эту смесь на тарелке SDCAA и инкубируете вверх ногами при температуре 30 °C.
   4. Собирайте колонии через 3 дня и выращивайте их за ночь в 1,5 мл SDCAA+ в 14 мл трубках.
2. Проведите минипреп дрожжей для извлечения плазмид
   1. Гранулируйте ночную культуру, центрифугируя при 16 000 × г в течение 1 минуты и снова суспендуйте в 200 мкл раствора 1 из набора для очистки дрожжевого плазмида.
   2. Добавьте 5 мкл раствора литического фермента (5 U/μL).
   3. Инкубировать в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 4 часов на сквозном миксере.
   4. Проведите цикл заморозки-оттаивания: заморозка при -80 °C в течение 20 минут и размораживание при 42 °C в течение 10 минут в водяной бане.
   5. Добавьте 200 мкл раствора 2 из набора для очистки дрожжевых плазмид, перемешайте 2–3 раза инвертируя и оставьте постоять 5 минут.
   6. Добавьте 400 мкл раствора 3 из набора для очистки дрожжевого плазмида и перемешайте путём инвертирования 2–3 раза. Центрифуга при 16 000 × г в течение 5 минут.
   7. Очистить плазмидную ДНК с помощью комплекта для очистки с высокой способностью связывания ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за большого количества сдвиговой геномной дрожжевой ДНК, поступающей из лизированных клеток, необходимо использовать колонку на основе кремнезёма с более высокой способностью связывания ДНК (35 мкг) вместо колонки для очистки ДНК плазмиды дрожжей с меньшей ёмкостью (5 мкг)¹⁵.
   8. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. Выход ДНК составляет 10–30 нг/мкл.
3. Преобразовать очищенные плазмиды в химически компетентные клетки E. coli
   1. Приготовьте SOC медиа по рецепту из таблицы 5 и тарелки с LB-хлорамфениколом. Также предварительно разогрейте водяную ванну до 42 °C.
   2. Разогрейте пластину LB-хлорамфеникола для каждой плазмиды при 37 °C в течение 20 минут.
   3. Достаньте трубку с химически компетентными клетками из морозильника при температуре –80 °C и разморозите их на льду.
   4. Аликвот 30 мкл компетентных клеток для каждой плазмиды в 1,5 мл трубку на льду.
   5. Пипетта 3 мкл плазмиды в компетентные клетки. Перемешайте и оставьте на льде 5 минут.
   6. Проведите тепловой шок, кратковременно инкубировав клетки в водяной бане при 42 °C в течение 40 секунд.
   7. Инкубировать на льду 2 минуты.
   8. Добавьте в клетки 300 мкл среды SOC и инкубируете 15 минут при 37 °C при 220 об/мин.
   9. Пластина 50–100 мкл преобразованных компетентных клеток на предварительно нагретые пластины.
   10. Инкубировать тарелки при 37 °C вверх ногами в течение 18 часов.
4. Сбор колоний
   1. Добавьте 5 мл жидкой среды LB-хлорамфеникола в 14 мл круглодонных пробирок.
   2. Выберите колонию с помощью стерильного наконечника объёмом 1000 мкл и положите её в пробирку для культуры.
   3. Поместите трубки в шейкер (220 об/мин, угол 30°–45° для максимальной аэрации) при 37 °C на 18 часов.
5. Экстракция плазмидов из бактериальных жидких культур
   1. Центрифугуйте жидкие культуры при 3 200 × г в течение 4 минут. Декантуйте супернатант.
   2. Извлекайте плазмиды из ночных культур с помощью комплекта для очистки плазмид.
   3. Измеряйте концентрацию очищенных плазмид с помощью спектрофотометра.
6. Отправить плазмиды для секвенирования
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте такие сервисы, как секвенирование нанопор целой плазмиды или, альтернативно, секвенирование Сэнгера с праймером, расположенным по фланкам мутагенизированной области.

Результаты

Эффективное строительство библиотеки крайне важно для обеспечения достаточного покрытия мутационного пространства. Чтобы избежать потери редких функциональных вариантов, количество трансформаторов должно достигать не менее 10× до 100× что соответствует размеру теоретической библиотеки. Поскольку эффективность трансформации у S. cerevisiae зависит от концентрации клеток и наиболее высокая в ранних и средних логарифмических^{ячейках 16}, мы оптимизировали начальную плотность ячеек перед электропорациями. Культуры дрожжей субкультивировались при начальных значениях_{OD 600} в диапазоне от 1,0 до 4,0 и инкубировались в течение 4 часов (n = 2–4 независимых биологических эксперимента), после чего окончательные значения_{OD 600} были отображены на кривую роста S. cerevisiae для подтверждения того, что клетки остались в средней фазе роста (рисунок 5A, дополнительный рисунок 1).

Электропорация этих культур с плазмидной ДНК с 4 мкг (n = 2 независимых биологических эксперимента) показала, что эффективность трансформации значительно различалась при начальных условиях_{OD 600} (односторонний ANOVA, p = 8,92 × 10⁻⁷). По сравнению с культурами, инициированными при_{OD 600} = 1,0, все более высокие исходные плотности клеток обеспечивали значительно большую эффективность трансформации (тест с множественными сравнениями Даннетта; _{OD 600} = 1,5, скорректированный p = 0,0020; _{OD 600} ≥ 2.0, скорректированный p < 0.0001), с наивысшей эффективностью трансформации при начальном_{OD 600} 4.0. Чтобы воспользоваться естественной способностью дрожжевых клеток выполнять гомологичную рекомбинацию, мы также электропорировали 4 мкг линеаризованного плазмидного вектора и 12 мкг вставка (то есть библиотеки протеаз) в дрожжевые клетки (n = 2 независимых биологических эксперимента). Эффективность преобразования значительно различалась между тестируемыми начальными условиями_{OD 600} (односторонний ANOVA, p = 0,0023). По сравнению с культурами, инициированными при_{OD 600} = 1,0, эффективность трансформации была значительно выше при_{OD 600} = 3,0 (скорректированное p = 0,0018), 3,5 (скорректированное p = 0,0062) и 4,0 (скорректированное p = 0,0024) (тест с множественными сравнениями Даннетта). Мы наблюдали наивысшую эффективность трансформации при средней начальной плотности субкультуры (_{OD 600} = 3,0), что указывает на оптимальный баланс между компетентностью клеток и эффективностью рекомбинации при таких условиях (рисунок 5B). По сравнению с преобразованием только плазмид, коэлектропорация линеаризованного вектора и библиотеки протеазы (n = 2 независимых биологических репликаты) обеспечила значительно более высокие эффективности преобразования в тестируемых начальных условиях_{OD 600} (двусторонний ANOVA на эффективности преобразования преобразований в log10, p = 9,40 × 10⁻¹²). В среднем коэлектропорация приводила к среднему увеличению эффективности преобразования в 121 раз (95% ДИ, 63–233 раза) по сравнению с преобразованием только с плазмидой (рисунок 5B).

Во время FACS-запуска дрожжевых клеток, содержащих библиотеку мутантных протеаз, и кассету выбора субстрата (рисунок 6A), клетки либо показывают усечённую кассету, либо протеазу, которая всё ещё расщепляет субстрат контрселекции (Q1), либо экспрессируют нефункциональные варианты протеазы (Q2), либо экспрессируют варианты протеаз, которые успешно расщепляют только селективный субстрат (Q3). Клетки дрожжей, экспрессирующие нефункциональные варианты, выглядели доминирующей популяцией, распределённой по диагонали на графиках PE и FTC, что отражает совместное удержание обоих сигналов (рисунок 6A, Q2). В отличие от этого, функциональные варианты, которые расщепляли субстрат отбора, сохраняя при этом нативный (контрсекционный) субстрат, сформировали отдельную внедиагональную популяцию, характеризующуюся высокой PE и средней или низкой интенсивностью сигнала FITC (рисунок 6A, Q3). Применение строгой стратегии гейтинга для изоляции этой внедиагональной популяции привело к постепенному обогащению функциональных вариантов в последовательных раундах^{сортировки 10}. Это обогащение визуально наблюдается как всё более выраженный кластер клеток, отделённых от диагонального кластера (рисунок 6B, слева направо). Если не наблюдается чётко внедиагональная популяция, это может указывать на низкое качество библиотеки, недостаточную экспрессию или неоптимальные условия окрашивания. В отрицательном контроле на рисунке 6C,D показаны электропорированные, индуцированные, неокрашенные дрожжевые клетки и соответствующие гистограммы флуоресценции FITC и PE.

Внутри обогащённой внедиагональной популяции субпопуляции могут быть дополнительно разрешены на основе интенсивности FITC. Ячейки с средним сигналом FITC можно отсортировать отдельно от тех, у которых низкий сигнал FITC. Секвенирование этих различных популяций выявило уникальные профили мутаций (Таблица 11), что указывает на то, что разная эффективность расщепления связана с разными вариантами протеаз.

Рисунок 1: Подготовка вектора и вставки. (A) Генерация библиотек протеазных потивирусов посредством мутагенеза насыщения сайтами. (B) Сборка кассетной подложки и интеграция в вектор дисплея дрожжей (pDD1523). (C) Линеаризация вектора дисплея дрожжей (pDD1524) посредством рестрикционного расщепления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Электропорация субстрат-кассеты и библиотеки мутантных протеаз, усиленных с помощью ПЦР, в компетентные клетки EBY100. (Пунктирная коробка) In vivo циркуляризация плазмиды, содержащей как протеозу, так и субстратную кассету. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Индукция, окрашивание и проточная цитометрическая сортировка дрожжей-клеток. (A) Индукция библиотеки протеазы и субстратной кассеты. (B) Окрашивание флуоресцентными антителами: Окрашивание антителами к анти-HA-флуоресцеину изотиоцианату (FITC) и анти-FLAG фикоэритрину (PE). (C) Окрашенные клетки сортируются с помощью флуоресцентно-активированного сортировки клеток (FACS). (D) Восстановление клеток, отсортированных FACS, в селективных средах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Восстановление плазмиды и секвенирование отсортированных дрожжевых клеток. (A) Покрытие сортированных дрожжевых клеток. (B) Экстракция плазмидов из отдельных колоний дрожжей. (C) Преобразование E. coli извлечённых плазмид. (D) Экстракция плазмидов из отдельных колоний E. coli . (E) Секвенирование нанопор извлечённых плазмид. Иконки фляжки и трубки адаптированы из DBCLS и Helicase 11 соответственно через Bioicons (https://bioicons.com) и адаптированы по условиям Международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Кривые роста дрожжей в различных средах роста и влияние начальной оптической плотности на 600 нм (_{OD 600}) субкультуры на эффективность электропорации дрожжей. (A) Кривые роста дрожжей в 1 × Экстракт дрожжей пептонной декстрозы (YPD), 2 × YPD, синтетических декстрозных касаминокислот Агар без антибиотиков (SDCAA-) и синтетических декстрозных касаминокислот Агар с антибиотиками (SDCAA+). (B) Эффективность преобразования дрожжей, электропорированных с плазмидным вектором 4 мкг, при различных начальных субкультурах_{OD 600}, а также эффективность преобразования с использованием линеаризованного вектора (4 мкг) и вставки библиотеки протеазы (12 мкг) при тех же начальных значениях_{OD 600} . Данные в (A) представлены как_{OD 600} ± SD из двух независимых биологических экспериментов (n = 2). Данные в (B) представлены как среднее количество преобразующих веществ на электропорация по логарифмической оси y, при этом отдельные биологические репликаты отображаются в виде окружностей (n = 2). Статистическая значимость для экспериментов по оптимизации электропорации с плазмидами и вектором плюс вставками была определена с помощью одностороннего ANOVA на эффективности электропорации с преобразованными в log10, после чего был проведен тест с множественными сравнениями Даннетта с использованием_{OD 600} = 1.0 в качестве контроля. ns — не значительный; p < 0,01 (**); p < 0.0001 (****). Статистическая значимость разницы между эффективностью преобразования только плазмидных и векторных плюс-вставок была определена с помощью двухнаправленного ANOVA на эффективности преобразования преобразований в log10. p < 0,0001 (****). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Обогащение клонов дрожжей на основе флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). (A) Схематическое представление стратегии гейтинга. Клетки были разделены на три области: Q1, клетки с низким содержанием фикоритрина (PE); Q2, клетки с высоким содержанием PE/флуоресцеина изотиоцианата (FITC); и Q3 — клетки с высоким содержанием PE с низкой и промежуточной флуоресценцией FITC. Клетки внутри Q3 были собраны для обогащения. (B) Репрезентативные графики FACS одной независимой эволюционной кампании, показывающие последовательные раунды сортировки с возрастающей строгостью FITC gating. Клетки среднего и низкого FITC были собраны отдельно для секвенирования. Проценты указывают на долю живых, одиночных дрожжевых клеток внутри закрытой популяции. (C) Репрезентативный график FACS, показывающий электропорированные, неокрашенные дрожжевые клетки как отрицательный контроль. (D) Гистограммы интенсивности флуоресценции FITC-A (слева) и PE-A (справа), соответствующие данным, указанным в (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Реакционная смесь для амплификации протеазной библиотеки в первом раунде ПЦР. Состав ПЦР-реакции, используемой для первого круга амплификации библиотеки протеаз, включая конечные концентрации и количества каждого реагента в реакции 50 мкл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Условия цикла для амплификации ПЦР в библиотеке протеаз. Программа термического циклирования использовалась для первого раунда ПЦР-усиления библиотеки протеаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Реакционная смесь для амплификации ПЦР во втором раунде библиотеки протеаз .Состав ПЦР-реакции, используемой для второго круга амплификации библиотеки протеаз, включая конечные концентрации и количества каждого реагента в реакции 50 мкл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Условия циклирования для амплификации ПЦР во втором раунде библиотеки протеаз .Программа термического циклирования использовалась для второго раунда ПЦР-усиления библиотеки протеаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 5: Среда и реагенты для электропорации и роста дрожжей. Табличное описание массы, необходимой от каждого химического компонента для формулирования конкретных доз: 1 × и 2 × Дрожжевого экстракта Пептон-декстроза (YPD), электропорационный буфер, кондиционирующий буфер, среда для вырастания, синтетические декстрозовые касамоинические кислоты с антибиотиками (SDCAA+), синтетические галактозные касаминокислоты с антибиотиками (SGCAA+), среду лизогенного бульона (LB), среду LB-хлорамфеникола, среду супероптимального бульона (SOB) и супероптимального бульона с катаболитной репрессией (SOC). Включены инструкции по приготовлению стандартных растворов, таких как 2 М сорбитола, 1 М дитиотрейтола (DTT) и 2 М литиевого ацетата (LiAc). Дополнительные инструкции по подготовке агарных пластин SDCAA, LB и YPD предоставляются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 6: Реакционная смесь для отжига и фосфорилирования олигус .Состав реакционной смеси, используемой для одновременного отжига и фосфорилирования олигонуклеотидов для сборки субстрата на кассете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 7: Условия циклирования для отжига и фосфорилирования олигус .Температурная программа, используемая для отжига олигонуклеотида и фосфорилирования для сборки кассет субстрата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 8: Реакционная смесь для сборки Golden Gate из субстратной кассеты и векторной плазмиды. Состав реакции сборки Golden Gate, используемой для связывания субстратной кассеты с векторной плазмидой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 9: Условия циклирования для сборки кассеты субстрата и векторной плазмиды по Золотым Воротам. Программа термического циклирования, используемая для сборки Golden Gate. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 10: Реакционная смесь для линеаризации векторной плазмиды. Состав реакции рестрикционного расщепления, используемой для линеаризации векторной плазмиды до создания библиотеки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 11: Результаты секвенирования нанопор вариантов TEVp, расщепляющих ENLYFES. Плазмиды извлекались из клеток дрожжей после четвёртой и последней сессии FACS. Мутации в каждом клоне показаны относительно последовательности дикого типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Связь между начальной и конечной плотностью культуры EBY100 во время субкультуры. Культуры EBY100 были субкультивированы при различных начальных значениях_{OD 600} , а окончательный_{OD 600} измерялся после инкубации при одинаковых условиях роста (30 °C, 220 об/мин). Окончательная плотность культуры увеличивалась линейно с увеличением начального_{OD 600} (R² = 0,969, p = 5,77 × 10⁻⁵). Точки данных представляют средние ± SD независимых биологических репликат (n = 2–4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Рациональное проектирование библиотеки мутагенеза TEVp. Мультяшное изображение TEVp (PDB ID: 1LVB) с четырьмя остатками (золотом) <5Å вдали от остатка P1 (фиолетового), направленного на мутагенез насыщения сайтом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Направленная эволюция — это метод с высокой пропускной способностью, использующий итеративные циклы диверсификации и отбора для выявления белков с усиленной или новой биохимической^{функцией 17}. В этом протоколе мы подробно описываем оптимизированный рабочий процесс для развития распознавания протеаз-субстрата с использованием системы отображения поверхностей клеток у S. cerevisiae. Система поверхностного отображения отражает активность протеазы с обнаруживаемым фенотипом на основе флуоресценции, что позволяет обогащать желаемые клоны на основе FACS. Мы предоставляем подробные шаги для сборки библиотеки протеазы и кассет на подложке, высокоэффективной электропорации, гейтинга и сортировки FACS, а также окончательного секвенирования вариантов протеаз.

Одним из важнейших шагов направленной эволюции является обеспечение достаточного разнообразия библиотек и охват потенциальных^{мутаций 17}. Наши эксперименты по эффективности электропорации показывают, что начальный субкультурный_{OD 600} при 3.0 обеспечивает наивысшую эффективность преобразования, превышающую 10–⁹ CFU. Этот масштаб, достигнутый с помощью оптимизированной электропорации дрожжей, значительно превосходит традиционные методы химического преобразования и обеспечивает достаточное покрытие больших комбинаторных библиотек ^8,9. Точное гейтинг и сортировка FACS необходимы для разделения клеток, обладающих желаемыми свойствами расщепления, от тех, у которых есть неспецифическое расщепление. В ходе нескольких этапов отбора на основе FACS стратегия гейтинга становится всё более строгой для селективного обогащения для желаемых вариантов протеаз. Если гейтинг слишком широкий, нежелательные клетки могут быть отсортированы вместе с нужными вариантами. Строгий гейтинг (например, всё более низкие пороги для сигнала FITC через раунды) позволяет популяции клеток обогащаться для вариантов протеазы с более высокой специфичностью и активностью к новой целевой последовательности^{субстрата 10}. В соответствии с предыдущими кампаниями ^7,18 мы провели мутогенез NNS-кодона четырёх остатков в кармане связывания субстрата TEVp, которые взаимодействуют с остатком субстрата P1, Q (T146, D148, H167, S170) (дополнительный рисунок 2). Графики FACS, показанные на рисунке 6B, представляют собой единый представительный эксперимент сортировки, иллюстрирующий стратегию гейтинга и рабочий процесс обогащения. Любопытно, что результаты нашей кампании дали варианты TEVp с другим набором мутаций аминокислот (Таблица 11). Эти результаты подтверждают ключевую особенность эволюции протеаз: несколько эволюционных путей могут привести к одной цели.

При проведении экспериментов могут потребоваться изменения и стратегии устранения неполадок. Например, при электропорации работа со льдом при необходимости и аккуратное повторное суспендирование клеточных гранул на каждом этапе гарантирует, что клетки остаются живыми и здоровыми до электропорации. Дрожжевые клетки чувствительны на протяжении всего этапа электропорации до этапа восстановления из роста. Кроме того, может потребоваться модификация жидкости оболочки FACS для предотвращения флокуляции дрожжевых клеток. Жидкость оболочки часто используется в аппаратах FACS и может содержать консерванты, подавляющие рост бактерий и грибков. Поэтому жидкость оболочки может быть заменена чистой PBS, чтобы предотвратить гибель клеток во время сортировки.

Система отражания поверхности дрожжей требует правильно свернутых белков для успешного прохождения секреторного пути. Некоторые варианты протеазы могут терять активность из-за неправильного сворачивания, что приводит к ложноположительным результатам при отборе FACS, вызванном неспецифическим расщеплением или фоновым флуоресценцией. Хорошо охарактеризованные источники ложноположительных результатов заслуживают внимания для таких кампаний, как эта. Поскольку расщепление воспринимается как потеря метки эпитопа C-конца, любая мутация, нарушающая этот тег, даёт тот же фенотип с низким уровнем FITC, что и настоящее событие расщепления; Такие мутации меток возникают во время крупномасштабной гомологичной рекомбинации и могут обогащаться на протяжении последовательных раундов сортировки. Недавно было показано, что хромосомная интеграция кассеты с постоянным субстратом смягчает эту^{проблему 19}. Протокол основан на использовании вставной библиотеки, при этом вектор (содержащий субстратную кассету) остаётся постоянным. Поэтому этот протокол не подходит для тех, кто хочет эволюционировать как протеазные, так и субстратные библиотеки.

Платформа YESS стала пионером общего маршрута перепрограммирования специфичности протеаз-субстрата¹⁸. Недавние улучшения включают: добавление титируемого контроля фермента/субстрата в YESS2.0⁷, подключение к секвенированию следующего поколения, обеспечение высокоразрешающего профилирования^{специфичности 20} и хромосомную интеграцию репортёров для снижения экспрессионного шума и ложноположительных^{результатов 19}. Другие ортогональные стратегии, такие как фаговая непрерывная эволюция, также применялись при разработке специфичности протеазы для терапевтических^{целей 21}. Эти инструменты нашли применение не только за пределами инженерии протеазы TEV, например, высокоразрешающее профилирование главной протеазы SARS-CoV-2 для руководства проектированием^{ингибитора 22}. Ключевым фактором такой кампании является генерация достаточного количества трансформаторов для покрытия больших комбинаторных библиотек (>10⁹), которые не были систематически оптимизированы в штаме EBY100 S. cerevisiae . Определяя фазу роста и условия электропорации, которые обеспечивают трансформацию EBY100 выше 10–⁹ CFU, этот протокол устраняет это узкое место, позволяя проводить комплексный скрининг миллионов вариантов на основе FACS.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software