Методическая статья

Платформа на основе жертвенных чернил для 3D-печати для получения изображений высокого разрешения функций эндотелиальных клеток в извитых сосудах и аневризмах

80 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72574

⸱

29 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Tissue Morphodynamics, Cell Biology and Physiology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Biomedical Engineering and Physical Science Shared Resource, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Center for Biomedical Engineering Technology Acceleration, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 4Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе подробно описывается способ проектирования и сборки кровеносных сосудов in vitro с извитыми сегментами или сегментами с аневризмой с использованием экструзионного принтера или ручного нанесения пастеризованных жертвенных чернил, а также методы анализа гемодинамического потока и реакций эндотелиальных клеток.

Аннотация

Извитость сосудов и аневризмы представляют серьезную угрозу для здоровья в различных тканях человека и для разных типов кровеносных сосудов. Эти изменения формы сосудов вызывают аномалии в динамике кровотока, что существенно влияет на функцию эндотелия. Модели этих сосудистых заболеваний на животных в некоторых случаях оказались информативными, однако их создание обходится дорого, и они ограничены физиологией конкретного вида животных. В связи с этим модели 3D «орган-на-чипе» (OOC) in vitro стали мощным инструментарием для оценки сосудистой функции и эндотелиальных ответов в клетках человека. Несмотря на преимущества каждой из моделей OOC, необходима доступная система для изучения проницаемости сосудов — ключевого показателя функции сосудов при их извитости и наличии аневризм в условиях физиологической скорости сдвига и давления. В данной работе представлена методика, позволяющая изучать ответы эндотелиальных клеток человека на аномалии потока в экономичной модельной системе изогнутого сосуда с использованием биопринтера начального уровня. Создаваемые таким образом сосуды совместимы с физиологическими скоростями потока жидкости, пригодны для исследований проницаемости и световой микроскопии высокого разрешения, а также имеют поддержку внеклеточного матрикса с физиологической жесткостью.

Введение

Морфология кровеносных сосудов является важным показателем сосудистой функции, поскольку извитость сосудов и аневризмы являются ключевыми признаками различных заболеваний и факторов риска для здоровья. Сосудистая извитость может быть врожденной, как при таких синдромах, как синдром Марфана1, синдром Тернера2 и синдром Лойса-Дитца3, или развиться позже в жизни как характерный признак ряда заболеваний, включая гипертонию, диабет, рак и, возможно, атеросклероз4,5,6. Аневризмы артериальных тканей, включая сонные7, коронарные8, бедренные9, аортальные10 и церебральные11 артерии, связаны с заболеваемостью и рисками для здоровья из-за спонтанной диссекции или разрыва. Помимо возникновения нарушений кровотока и связанного с этим воспаления эндотелия, извитость сосудов и аневризмы могут указывать на лежащую в основе дисфункцию тканей и воспаление. Например, у новорожденных и детей синдром извитости артерий клинически предсказывает детский инсульт12, стойкую легочную гипертензию и диссекцию аорты4,13. У взрослых ретинальный васкулит проявляется извитостью сосудов сетчатки, которая становится менее выраженной по мере купирования воспаления14. Вопрос о том, как извитость распознается и преобразуется в аномальные сигналы, которые стимулируют прогрессирование заболевания, остается активной областью исследований. Считается, что эндотелиальные клетки, выстилающие кровеносные сосуды, действуют как первичные сенсоры в этом процессе. Нарушенный или замедленный кровоток, вызванный извитостью сосудов или аневризмами, изменяет напряжение сдвига, вызывая изменения в воспалительной сигнализации15 и барьерной функции16 эндотелия. Эндотелиальные клетки высокочувствительны к потоку жидкости через механизмы с участием первичных ресничек17, механочувствительных адгезионных белков18,19 и ионных каналов20,21, которые запускают передачу сигналов, способную активировать утечку, воспаление и перепрограммирование эндотелия22,23,24. Таким образом, методы изучения эндотелиальных ответов на извитую геометрию сосудов важны для разработки методов терапии сосудистых заболеваний.

Эндотелиальные функции при сосудистых заболеваниях моделировали с использованием моделей животных in vivo, систем «орган на чипе» (OOC) и методов биопечати. Модели на мышах позволяют контролировать экспрессию известных генов заболеваний и учитывают сложность архитектуры и физиологии тканей, включая участие муральных и иммунных клеток. Мышиные модели атеросклероза25, синдрома Марфана26 и различных аневризм27,28,29 позволяют изучить патологии, связанные с сосудистой дисфункцией. Несмотря на эти преимущества, прямое наблюдение, экспериментальное манипулирование и количественная оценка эндотелиальных клеток труднодостижимы, за исключением таких общепопуляционных методов, как секвенирование РНК. Кроме того, модели на животных сопряжены с этическими вопросами и затратами, а также ограничены видоспецифичной физиологией.

Для изучения реакций эндотелия человека на ламинарный и турбулентный потоки in vitro было разработано несколько подходов «орган-на-чипе» (OOC) 30,31,32 как для 2D-систем33,34, так и для 3D-систем35,36,37. Обширная литература по OOC38 в значительной степени развивалась под влиянием биомедицинской инженерии, где особенности конструкции были направлены на решение конкретных биомедицинских задач. Во многих сосудистых моделях OOC используются подложки из полидиметилсилоксана (PDMS) для контроля архитектуры сосудов38. Эти модели обеспечивают высокоточное управление сложной геометрией и позволяют моделировать взаимодействия между органами и сосудами, в том числе с участием печени39, мозга40 и легких41. Однако определенные ограничения сохраняются. Низкая проницаемость PDMS и аналогичных полимеров для макромолекул может ограничивать исследования функции сосудистого барьера. Кроме того, большинство отвержденных образцов PDMS имеют жесткость примерно 0,8–10 MPa42, хотя альтернативные составы позволяют достичь более физиологических диапазонов 8–200 kPa43. Оценки жесткости сосудистой базальной мембраны варьируются от ~350 Pa44 до ~70 kPa45 в зависимости от типа сосуда и методики измерения, при этом большинство здоровых сосудистых базальных мембран находятся в диапазоне 2–3 kPa46. Поскольку такие сосудистые заболевания, как атеросклероз и гипертония, частично связаны с повышенной жесткостью внеклеточного матрикса (ВКМ)47,48,49,50,51, а эндотелиальные клетки реагируют на жесткость ВКМ, контроль жесткости в физиологических пределах имеет важное значение для моделей in vitro. Более современные подходы OOC используют физиологические субстраты, которые допускают создание сложной геометрии52,53, включают несколько типов клеток для воссоздания функций органов39,54,55,56,57 или иммунно-сосудистых взаимодействий58, моделируют индивидуальные сосудистые структуры пациентов59,60 и поддерживают доклиническую разработку лекарственных препаратов61,62. Во многих микрососудистых моделях, включающих взаимодействие с другими типами клеток, эндотелиальные клетки спонтанно формируют сосуды с относительно неконтролируемой геометрией63. И наоборот, системы OOC, позволяющие задавать определенную геометрию сосудов при контролируемом потоке, часто требуют значительной инженерной инфраструктуры, специальных материалов и экспертных знаний53,64. Следовательно, необходимы надежные методы, доступные для специалистов других профилей, чтобы облегчить изучение поведения сосудистых клеток в физиологически релевантных условиях.

Платформы для биопечати, совместимые с физиологическими гидрогелями внеклеточного матрикса (ECM), обеспечивают создание универсальных моделей in vitro для изучения функции эндотелия при различных геометриях сосудов65. В этих подходах используется либо направленное нанесение гелей, содержащих эндотелиальные клетки, в форме кровеносного сосуда66, либо жертвенные чернила для создания открытых трубчатых просветов, встроенных в ECM, которые впоследствии могут быть растворены, оставляя просвет, пригодный для заселения эндотелиальными клетками54. Биосовместимые субстраты ECM, включая желатин, коллаген и фибрин, могут быть настроены на жесткость, приближенную к жесткости сосудистой базальной мембраны (1–3 kPa67), и позволяют проводить анализы проницаемости сосудов, аналогичные тем, что используются in vivo. Хотя эти подходы не позволяют достичь такого же разрешения по форме и размеру, как изготовление из PDMS, могут быть созданы изогнутые, разветвленные и стенозированные сосуды52,66,68. Таким образом, такие платформы хорошо подходят для моделирования геометрии сосудов, включая извитые и аневризматические сосуды.

Описываемый здесь метод основан на подходе 3D-печати с использованием пневматической экструзии, трехмерного позиционирования с микронной точностью, контроля температуры печатной платформы и печатающей головки с чернилами, а также жертвенных чернил, ранее разработанных для моделирования почечно-сосудистых взаимодействий на чипе67,69. Жертвенные чернила печатаются в соответствии с заданной геометрией сосудов и немедленно заключаются в матрикс внеклеточного матрикса (ВКМ). Последующее изменение температуры удаляет чернила, оставляя открытый просвет ВКМ, который заселяется человеческими эндотелиальными клетками. Базовый ВКМ состоит из желатина и фибрина, что обеспечивает быстрое гелеобразование и опосредованную тромбином полимеризацию фибрина, обеспечивая при этом механическую жесткость, соответствующую многим сосудистым базальным мембранам. Для более точного имитирования состава базальной мембраны сосудов70,71,72 и улучшения адгезии эндотелия могут быть добавлены дополнительные компоненты ВКМ, такие как ламинин или фибронектин. Система собирается в многоразовых камерах Роуза73, содержащих металлические опоры, силиконовые прокладки и покровные стекла для микроскопии высокого разрешения, что позволяет подключить её к жидкостному насосу через иглы с Luer-lock. В качестве альтернативы верхняя и нижняя пластины могут быть изготовлены методом 3D-печати с использованием полимолочной кислоты или материала, армированного углеволокном. Собранная система выдерживает давление, создаваемое физиологическими скоростями потока жидкости. Процедура пастеризации также повышает стерильность жертвенных чернил без изменения их физических свойств. Кроме того, подход с использованием иглы-шаблона и биочернил позволяет создавать прямые сосуды с аневризмой без использования биопринтера. Полученные эндотелизированые извилистые или аневризматические сосуды можно исследовать при физиологическом потоке с помощью световой микроскопии высокого разрешения в течение примерно одной недели, что позволяет изучать острые эндотелиальные реакции на изменение геометрии сосудов.

Основным преимуществом данной системы является ее совместимость со световой микроскопией. Сосуды in vitro, созданные по данному протоколу, пригодны для использования нескольких методов визуализации и особенно подходят для спин-дисковой или лазерной сканирующей конфокальной флуоресцентной микроскопии. При выборе условий визуализации необходимо учитывать пространственное и временное разрешение, чувствительность и рабочее расстояние объектива. Для большинства сосудов, созданных с помощью этой системы, объектив должен иметь достаточное рабочее расстояние, чтобы достичь глубины примерно 100–300 µm от покровного стекла и произвести визуализацию через середину сосуда. Объективы с высокой числовой апертурой необходимы для получения изображений эндотелиальных структур с высоким разрешением, включая органеллы и клеточные адгезии, а также для прижизненной визуализации, требующей высокого временного разрешения, например, для отслеживания реперных микросфер в потоке. Некоторые анализы, не требующие столь эффективного захвата фотонов, такие как измерения барьерной функции эндотелия на основе флуоресценции, могут быть выполнены с использованием объективов с меньшей числовой апертурой, например, воздушных объективов 10–20×.

В данном протоколе описывается создание извитых и аневризматических сосудов, состоящих из эндотелиальных клеток человека, в системе in vitro, которая поддерживает физиологический ток жидкости и микроскопию высокого разрешения. Рабочий процесс включает проектирование сосудов, изготовление камеры, подготовку и 3D-печать жертвенных чернил, подготовку внеклеточного матрикса (ECM) и удаление чернил, посев эндотелиальных клеток и их культивирование в условиях потока, оценку сосудистой проницаемости, картирование потока и иммунофлуоресцентное окрашивание (Рисунок 1).

Протокол

1. Проектирование сосуда

  1. Выберите сегмент сосуда, который поместится в камеру, совместимую с микроскопом. Для камеры Роуза расстояние между входным и выходным резервуарами должно составлять не более 1.6cm.
  2. Импортируйте изображение контрастной КТ-ангиографии (Рисунок 2A), магнитно-резонансной ангиографии или флюороскопической ангиографии в ImageJ/FIJI или другую программу для анализа изображений.
  3. Используйте инструмент точечного измерения для определения координат XY вдоль осевого центра сосуда. Экспортируйте координаты в программу для работы с электронными таблицами (Рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: STL-файлы, полученные с помощью КТ-ангиографии, можно импортировать напрямую в большинство программ для печати; однако полигональная печать может потребовать нескольких проходов и привести к созданию «плетеных» сосудов (Дополнительный рисунок 1). Для однопроходной печати используйте прямой G-код. По этой причине предпочтительны картирование координат и проектирование в G-коде. Пример G-кода приведен в Дополнительных файлах.
  4. Измените координаты XY в таблице, чтобы расположить центр сосуда в графическом начале координат. При необходимости импортируйте границы камеры, чтобы подтвердить, что итоговая распечатка поместится в камеру.
  5. Используйте координаты XY сосуда для проектирования сосуда в первом слое печати (Рисунок 2C). Установите высоту первого слоя, включая сосуд и примыкающие к нему входной и выходной резервуары, на уровне 200µm.
  6. Создайте входной и выходной резервуары, обеспечивающие удобное введение иглы. При необходимости используйте резервуары ромбовидной формы для эффективного направления жидкости к входу в сосуд, минимизируя турбулентность при входе (Рисунок 2).
  7. Включите резервуары в первый слой печати, чтобы они оставались смежными с сосудом. Добавьте 5–9 слоев над базовым слоем, чтобы обеспечить достаточный объем для размещения входной и выходной игл. Для проектирования в G-коде важны следующие детали:
    1. Если доступен температурный контроль, установите температуру печатающей головки и платформы на 37°C с помощью программного обеспечения принтера или соответствующих команд G-кода в начале файла печати.
    2. Если доступно несколько печатающих головок, укажите печатающую головку или экструдер в G-коде. Настройте G-код на использование абсолютных координат и расстояний экструзии.
    3. Отрегулируйте высоту слоя в зависимости от размера и формы иглы, давления потока чернил и скорости печатающей головки. Для приведенных здесь примеров используйте высоту слоя 200µm для каждого слоя резервуара над первым слоем.
    4. Для резервуаров используйте противодавление 14–17psi и скорость печатающей головки 6mm/s (G-код: F360). Для сосуда увеличьте скорость печатающей головки до 15mm/s (G-код: F900).
  8. Протестируйте каждый новый дизайн сосуда на предметном стекле без камеры перед печатью окончательного сосуда.

2. Приготовление жертвенных чернил

  1. Добавьте 2.1g полиэтиленоксида (PEO) в 60mL холодной стерильной воды для приготовления 3.5% (масса/объем) раствора в стерильном закрытом контейнере со стерильным магнитным перемешивателем. Перемешивайте при 4°C не менее 48ч, периодически проверяя полное растворение порошка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните раствор PEO в герметичном контейнере при 4°C до 1 месяца.
  2. Добавьте 17.5g Pluronic F-127 в 50mL холодной стерильной воды для приготовления 35% раствора в стерильном закрытом контейнере со стерильным магнитным перемешивателем. Перемешивайте при 4°C не менее 48ч, периодически проверяя полное растворение порошка.
  3. Смешайте 11.4mL холодного 3.5% раствора PEO и 28.6mL холодного 35% раствора Pluronic F-127 в стерильной конической пробирке объемом 50mL. Перемешивайте в течение не менее 24ч при 4°C на ротационном миксере.
  4. Поместите пробирку вертикально при 4°C на ночь, чтобы пузырьки воздуха вышли из раствора.
  5. Поместите коническую пробирку с чернилами в водяную баню и инкубируйте при 63°C в течение 3ч. Во время нагревания оставьте крышку слегка приоткрытой, чтобы расширяющийся воздух мог выходить.
  6. Извлеките пробирку из водяной бани и дайте ей постепенно остыть до комнатной температуры. Плотно закройте крышку после охлаждения раствора.
  7. Поместите пастеризованные чернила на лед на 2 минуты, периодически осторожно перемешивая, чтобы не создавать пузырьков.
  8. Извлеките поршень шприца, закройте отверстие для иглы колпачком и заполните шприц на 60%–70% его объема. Вставьте поршень, переверните шприц, снимите колпачок с отверстия для иглы и удалите весь попавший внутрь воздух.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните заполненные шприцы при комнатной температуре до 1 месяца.

3. Изготовление камеры Роуза и подготовка гидравлической системы

  1. Изготовьте верхнюю и нижнюю зажимные пластины из алюминия или распечатайте их на 3D-принтере, используя прилагаемые CAD/STL-файлы (Рисунок 2). Предусмотрите достаточно большое скошенное нижнее отверстие для доступа объектива с высокой числовой апертурой, а также опорный бортик для винтов, которые надежно прижимают покровные стекла к прокладке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Алюминий обеспечивает лучший теплоперенос при микроскопии на подогреваемом столике. Детали из PLA-пластика или армированного углеволокном пластика, напечатанные на 3D-принтере, подходят для прототипирования, но могут обладать худшим теплопереносом и деформироваться при многократном нагреве.
  2. Вырежьте силиконовый лист по размеру зажимных пластин 38mm × 51mm. Создайте центральное смотровое окно с помощью пробойника диаметром 18mm.
  3. Просверлите отверстия, соответствующие выбранному диаметру винтов. Тщательно промойте готовую прокладку водой, чтобы удалить остатки силиконовой стружки.
  4. Автоклавируйте металлические зажимные пластины, винты, гайки и силиконовые прокладки в закрытом пакете из алюминиевой фольги, используя 20-минутный цикл сушки.
  5. Погрузите напечатанные на 3D-принтере пластины в 70% этанол на 1min. Высушите пластины в стерильных условиях.
  6. Подготовьте отрезки трубок длиной 10–30cm с коннекторами Luer-lock и встроенными зажимами для трубок, подходящие трубки для перистальтического насоса, трехходовой кран, демпфер пульсаций и двухпортовый резервуар для среды (Рисунок 3).
  7. Стерилизуйте термостойкие трубки и компоненты резервуара путем автоклавирования. Стерилизуйте компоненты, которые нельзя автоклавировать, путем обработки этанолом.

4. Приготовление реагентов для внеклеточного матрикса

  1. Добавьте 12.5mL подогретого до 37°C PBS к 1g фибриногена плазмы человека для приготовления стокового раствора с концентрацией 80mg/mL. Инкубируйте при 37°C, периодически аккуратно перемешивая без использования вортекса.
  2. Дайте фибриногену раствориться в течение 1–2h до получения мутного раствора. Разлейте раствор по стерильным пробиркам (аликвотируйте) и храните при −20°C до 3 месяцев.
  3. Добавьте 22.5g желатина к 135mL стерильного PBS в стерильный флакон с магнитным перемешивателем. Перемешивайте в течение 16h при 70°C, периодически встряхивая флакон для обеспечения полного растворения.
  4. Доведите pH раствора желатина до 7.5, используя 1M NaOH. Профильтруйте раствор в горячем состоянии через вакуумный фильтр, разлейте по аликвотам и храните при 4°C до 6 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед фильтрацией дайте желатину набухнуть в течение не менее 16h. Во время вакуумной фильтрации поддерживайте раствор и фильтровальный аппарат при 37°C, чтобы минимизировать засорение фильтра.
  5. Растворите тромбин плазмы человека в стерильном PBS до концентрации 1,000 U/mL. Аккуратно перемешайте, разлейте по аликвотам и храните при −20 °C до 1 года.
  6. Растворите 300mg трансглутаминазы в 5 mL PBS и инкубируйте при 37°C в течение 1 h, периодически перемешивая. Пропустите раствор через стерильный фильтр в новую пробирку и храните при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте раствор трансглутаминазы ежедневно. Храните порошкообразную трансглутаминазу в сухом виде при 4°C.
  7. Растворите хлорид кальция в воде для приготовления 1M раствора. Профильтруйте раствор через стерильный фильтр и храните при комнатной температуре до 1 года.

5. Подготовка и активация покровных стекол

  1. Погрузите чистые покровные стекла в этанол, затем осторожно проведите ими над пламенем горелки Бунзена, чтобы испарить этанол.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Этанол легко воспламеняется. Держите запасы этанола вдали от открытого огня и проводите стерилизацию пламенем в соответствии с правилами пожарной безопасности в лаборатории.
  2. Поместите покровные стекла в штатив из нержавеющей стали, избегая раскалывания или появления сколов на стекле.
  3. Погрузите покровные стекла в 0.5% раствор (3-аминопропил)триметоксисилана, разведенного в воде, на 30–60 мин при комнатной температуре. В течение инкубации обеспечьте осторожное перемешивание.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с (3-аминопропил)триметоксисиланом используйте соответствующие средства химической защиты и средства инженерного контроля.
  4. Промойте покровные стекла, шесть раз заменяя воду, при осторожном перемешивании. Следите за тем, чтобы стекла не сместились при перемещении штатива.
  5. Извлеките штатив из воды, удалите излишки воды промакиванием и высушите при 50°C в течение 30 мин.
  6. Дайте покровным стеклам остыть до комнатной температуры, подготавливая 0.5% раствор глутарового альдегида в PBS.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Глутаровый альдегид токсичен и вызывает раздражение. Готовьте и используйте раствор в подходящем вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты.
  7. Инкубируйте покровные стекла в 0.5% растворе глутарового альдегида в течение 60 мин при осторожном перемешивании, чтобы минимизировать скопление пузырьков и обеспечить равномерную активацию.
  8. Промойте покровные стекла, три раза заменяя стерильную воду, и дайте им высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните активированные покровные стекла в вакуумном эксикаторе до 2 месяцев.

6. Покрытие покровных стекол базовым слоем внеклеточного матрикса

  1. Подогрейте 1× PBS, стоковый раствор желатина и стоковый раствор фибриногена до 37°C в течение 30–60 мин.
  2. Выстелите стерильную чашку Петри диаметром 15 см чистой парафильмом, распылите на поверхность 70% этанол, слейте излишки и дайте поверхности высохнуть на воздухе в шкафу с биологической безопасностью.
  3. Последовательно добавьте в коническую пробирку объемом 15 мл 1,68 mL подогретого PBS, 2,5 mL стокового раствора желатина, 12,5 µL 1M CaCl₂, 625 µL стокового раствора фибриногена и 167 µL раствора трансглутаминазы.
  4. Поместите смесь ЭКМ в водяную баню при 37°C на 30 мин.
  5. Подготовьте для каждого покровного стекла одну пробирку объемом 1,7 мл, содержащую 5 µL стокового раствора тромбина.
  6. Добавьте 400 µL препарата ЭКМ в пробирку с тромбином и перемешайте, один раз пропипетировав смесь, стараясь минимизировать образование пузырьков.
  7. Немедленно нанесите 200 µL смеси на стерильную парафильм и с помощью пинцета поместите одну активированную покровную стеклышку на каплю. Слегка прижмите для обеспечения полного покрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг примерно в течение 20 с после смешивания смеси ЭКМ с тромбином.
  8. Накройте чашку Петри и инкубируйте покрытые покровные стекла в течение 10 мин при комнатной температуре, затем в течение 2 ч при 37°C в увлажненном инкубаторе.
  9. Осторожно отделите каждое покровное стекло от парафильма, отгибая парафильм в сторону от стекла.
  10. Поместите свежепокрытые покровные стекла гелевой стороной вверх в чистую чашку Петри в увлажненном инкубаторе и используйте в течение 1 суток.
  11. В качестве альтернативы инкубируйте покрытые покровные стекла в неувлажненном инкубаторе в течение ночи и используйте в течение 2 суток.

7. Биопечать жертвенными чернилами и инкапсуляция в ВКМ

  1. Выполните тестовую печать перед печатью сосуда, чтобы подтвердить, что чернила и параметры печати обеспечивают получение нужных размеров сосуда. Загрузите файл печати в программное обеспечение принтера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коническая дозирующая игла 32 G с чернилами из 25% Pluronic F127/1% PEO надежно обеспечивает диаметр сосудов примерно до 150µm при условиях, описанных здесь. Оптимизируйте скорость печатающей головки и противодавление, используя печать простых линий на стекле.
  2. Соберите нижнюю зажимную пластину, покровное стекло с покрытием из ECM, силиконовую прокладку, верхнюю зажимную пластину без верхнего покровного стекла и два винта. Поместите сборку в закрытую чашку Петри диаметром 100 mm и выдержите при 37 °C до использования в тот же день.
  3. Присоедините иглу для печати к шприцу с чернилами и установите шприц в пневматический экструзионный принтер. Предварительно разогрейте платформу принтера, печатающую головку и прилегающую нагревательную пластину до 37 °C.
  4. Подготовьте матрикс ECM, как описано в Разделе 6, и выдержите его в водяной бане при 37 °C. Готовьте матрикс порциями по 5 mL, рассчитывая по 1.5 mL на одну камеру Роуза.
  5. Поместите 5 µL стокового раствора тромбина в стерильную пробирку объемом 1.7 или 2 mL для каждой камеры. Держите дополнительные активированные непокрытые покровные стекла в боксе биологической безопасности.
  6. Поместите камеру с покровным стеклом, покрытым ECM, на платформу принтера и отцентрируйте ее по началу координат XY. Опустите иглу до соприкосновения с ECM или стеклянной поверхностью в центре окна камеры и определите это положение как начало координат XYZ.
  7. Поднимите иглу и приложите максимальное давление, чтобы полностью заполнить ее чернилами и удалить все видимые пузырьки. Протрите кончик иглы стерильной лабораторной салфеткой.
  8. Распечатайте геометрию сосуда и резервуара, используя загруженный G-код. Сразу после печати поднимите иглу и извлеките камеру.
  9. Осмотрите распечатанный сосуд на наличие пузырьков и разрывов. Отбракуйте и распечатайте заново любую структуру, содержащую любой из этих дефектов.
  10. Поместите камеру на нагревательную пластину при 37 °C, снимите винты и верхнюю зажимную пластину, затем смешайте 1 mL подготовленного матрикса ECM с аликвотой тромбина путем однократного пипетирования.
  11. Перенесите активированную смесь ECM в камеру сосуда, не допуская появления пузырьков, и немедленно положите активированное покровное стекло лицевой стороной вниз на ECM. Установите верхнюю зажимную пластину и затяните винты до плотного прилегания, не перетягивая их.
  12. Поместите готовую камеру в закрытую чашку Петри диаметром 100 mm и инкубируйте при 37 °C в течение 2 h.

8. Создание аневризмы с помощью проволочного шаблона

  1. Вставьте иглы 21-го калибра через противоположные стороны силиконовой прокладки и совместите их.
  2. Обработайте ультразвуком медицинский стержень из нержавеющей стали марки 304 диаметром 0,0190 дюйма в PBS, содержащем 1% BSA, в конической пробирке объемом 15 мл. Извлеките стержень и дайте ему высохнуть на воздухе в стерильной чашке Петри внутри бокса биологической безопасности.
  3. Проденьте стержень с покрытием из BSA через обе иглы в прокладке (Рисунок 2). Слегка согните один выступающий конец, чтобы облегчить последующее вращение.
  4. Автоклавируйте прокладку, иглы, стержень и зажимную пластину в сборе в фольгированном пакете.
  5. Разместите узел из игл и прокладки над активированным покровным стеклом с покрытием из ECM.
  6. Прикрепите иглу 21 G к шприцу, содержащему пастеризованные чернила Pluronic/PEO.
  7. Нанесите небольшую каплю жертвенных чернил на боковую сторону стержня в центре камеры. Нанесите небольшую каплю чернил в каждое место соединения иглы и стержня для создания герметизирующего слоя.
  8. Приготовьте смесь ECM и соберите камеру, как описано в разделах 7.10–7.12.
  9. После гелеобразования ECM осторожно поверните согнутый конец стержня, чтобы высвободить его из ECM и жертвенных чернил. Медленно извлеките стержень из устройства.
  10. Заполните входную иглу PBS с помощью дозатора на 200 µL и дайте PBS стечь через просвет. Повторите процедуру один раз и перейдите к разделу 9.

9. Промойте камеру сосуда от жертвенных чернил

  1. Подсоедините трубку к резервуару с холодным (4 °C) PBS, содержащим антибиотики; установите трехходовой кран и зафиксируйте конец трубки с помощью соединителя Luer-lock «папа» и стерильной иглы 23 G.
  2. Заполните подающую трубку холодным PBS с помощью шприца через кран до тех пор, пока PBS не начнет выходить из просвета иглы. Пережмите трубку зажимом.
  3. Заполните второй отрезок трубки PBS и установите на конце иглу 23 G. Пережмите трубку зажимом и извлеките шприц для заполнения.
  4. Введите подающую иглу через прокладку во входной резервуар, а дренажную иглу — в выходной резервуар. Подтвердите правильность установки с помощью инвертированного или стереомикроскопа.
  5. Перенесите установку при температуре 4 °C и расположите резервуар для подачи на высоте 30 cm над входом. Расположите выходную иглу на 5–10 cm ниже выходного отверстия сосуда над контейнером для отходов.
  6. Снимите зажимы и промойте камеру не менее чем 250 mL холодного PBS. Во время промывки проверьте систему на наличие утечек и пузырьков воздуха.

10. Покрытие и предварительная обработка просвета сосуда дополнительными компонентами ВКМ

  1. Разведите фибронектин до концентрации 20 µg/mL, ламинин до 10 µg/mL или матрикс базальной мембраны в соотношении 1:30 в 3 mL PBS.
  2. Добавьте свежеприготовленную трансглутаминазу в разведенный реагент ВКМ.
  3. Оставьте трубки, расположенные непосредственно перед сосудом, подключенными к входу и выходу.
  4. Медленно введите раствор ВКМ/трансглутаминазы в сосуд с помощью шприца объемом 1 mL. Повторяйте процедуру, пока через сосуд не пройдут все 3 mL раствора.
  5. Зажмите соединители, закройте вход и выход стерильными колпачками Luer и инкубируйте при 37 °C от 1 ч до ночи.
  6. Промойте сосуд 100 mL полной эндотелиальной среды, содержащей пенициллин/стрептомицин. Зажмите соединители трубок и закройте выходные отверстия колпачками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните заполненный средой сосуд при 4 °C не более 1 недели. Убедитесь, что в просвете отсутствуют пузырьки воздуха.

11. Посев клеток в сосуд

  1. Инкубируйте камеру, содержащую шаблон сосуда из внеклеточного матрикса (ECM), при 37 °C в течение 2 ч. Подогрейте полную среду для эндотелиальных клеток, содержащую пенициллин/стрептомицин, до 37 °C.
  2. Проведите трипсинизацию эндотелиальных клеток из одной 10-см культуральной чашки или одного флакона T75, затем нейтрализуйте трипсин полной средой. Перенесите суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и отберите аликвоту для подсчета клеток.
  3. Центрифугируйте клетки при 1,000 × g в течение 5 мин. Ресуспендируйте осадок, чтобы подготовить 150 µL клеточной суспензии с концентрацией 5 × 106 клеток/мл.
  4. Подсоедините выходную трубку к стерильному резервуару для отходов и держите зажим трубки закрытым.
  5. Отсоедините входную трубку и удалите остатки среды из основания входной иглы. Держите сосуд вертикально и с помощью пипетки введите клеточную суспензию в основание иглы.
  6. Освободите зажим на выходе, чтобы клеточная суспензия поступила в сосуд. Снова зажмите выход после того, как вся суспензия попадет в просвет.
  7. Добавьте подогретую полную среду в основание входной иглы, затем закройте его стерильным колпачком Luer. Отсоедините и закройте колпачком выход.
  8. Инкубируйте камеру в перевернутом положении (правой стороной вверх) при 37 °C в течение 3 ч.
  9. Повторите этапы 11.5–11.8 и инкубируйте камеру в перевернутом положении (верхней стороной вниз) при 37 °C в течение 3 ч.
  10. Осторожно промойте сосуд 1 мл полной среды и инкубируйте при 37 °C в течение 3 ч.
  11. Подтвердите прикрепление эндотелия с помощью микроскопии, аккуратно удалите оставшиеся неприкрепившиеся клетки свежей средой и инкубируйте при 37 °C в течение 12–24 ч.

12. Культивирование в сосуде в условиях потока

  1. Подогрейте 200 mL полной среды в течение 1 ч и дегазируйте ее под вакуумом, используя стерильный фильтрующий блок. Снова подогрейте среду в увлажненном CO₂-инкубаторе.
  2. В стерильном боксе биологической безопасности последовательно соедините выход резервуара со средой, трехходовой кран, трубки насоса, гаситель пульсаций, дополнительную ловушку для пузырьков, входные трубки, камеру сосуда, выходные трубки и трубку возврата в резервуар со средой (Рисунок 3).
  3. Заполните весь контур потока средой и убедитесь в отсутствии пузырьков или воздушных прослоек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед повторным соединением заполните жидкостью коннекторы и основание игл. Попадание пузырьков воздуха в клеточный сосуд может привести к потере эндотелиальных клеток из-за резких сил сдвига.
  4. Перенесите установку в инкубатор при 37 °C и установите скорость потока, создающую напряжение сдвига 1 dyn/cm2 в сосуде. Поддерживайте такой поток в течение 12 ч.
  5. Увеличьте поток до достижения 12–16 dyn/cm2 и поддерживайте его в течение 18–24 ч перед проведением последующих анализов. Чтобы рассчитать скорость потока, необходимую для вашего сосуда, определите длину напечатанного сосуда и его средний диаметр. Используя онлайн-калькулятор, введите определенные параметры, выбрав круглое поперечное сечение, среду с 10% сыворотки и пренебрежимо малое сопротивление трубок (диаметр трубок значительно больше диаметра напечатанного сосуда).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сосуд как можно скорее после кондиционирования потоком. Культивирование более 1 недели может привести к появлению зазоров между эндотелиальными клетками, что может быть связано с потерей клеток или модификацией внеклеточного матрикса эндотелиальными протеазами.

13. Проведение анализа сосудистой проницаемости

  1. Добавьте BSA, меченный Alexa 647, или декстран 10 kDa, меченный Alexa 647, в 35 mL полной среды до достижения конечной концентрации 5 mg/mL. Подогрейте раствор до 37 °C.
  2. Проведите преинкубацию сосуда с исследуемым агентом, например TNFα в концентрации 250 ng/mL, в течение 1–2 ч; также добавьте этот же агент в assay medium.
  3. Подготовьте водяную баню при 37 °C и расположите насос рядом с микроскопом. Включите микроскоп, программное обеспечение для сбора данных и систему подогрева предметного столика; выдержите столик при 37 °C в течение 30 min перед началом визуализации.
  4. Остановите поток в инкубаторе, отсоедините резервуар с культуральной средой и перенесите камеру вместе с подключенными трубками на предварительно подогретый столик микроскопа.
  5. Подключите насос к трубке длиной около 20 cm, оснащенной стеклянной микропипеткой с немеченой средой. Вставьте трубку микропипетки в среду с флуоресцентным репортером, а выходную трубку поместите в приемную емкость.
  6. Установите на насосе скорость потока 0.2 mL/min; не запускайте поток до полной готовности к визуализации.
  7. Сфокусируйтесь на средней линии сосуда, используя фазово-контрастную микроскопию, и переключитесь на канал флуоресценции 647. Запустите поток со скоростью, установленной в разделе 13.6, и делайте снимки каждые 1–5 min в зависимости от ожидаемого времени отклика.
  8. Постройте кимограммы на основе полученных изображений и определите линейный наклон для значений интенсивности с учетом порога. Рассчитайте утечку как расстояние в µm, пройденное репортером от внешней поверхности сосуда за одну минуту.

14. Картирование потока жидкости

  1. Перемешайте 10 µm флуоресцентные микросферы на вортексе в течение 1 мин, затем обработайте их в ультразвуковой бане в течение 1 мин. Разведите микросферы до концентрации 1.8 × 105beads/mL в 10 mL полной среды.
  2. Настройте систему потока на предметном столике микроскопа, как описано в Разделе 13 для анализа сосудистой утечки. Установите приемный сосуд для оттока и задайте скорость потока 0.2 mL/min.
  3. Сфокусируйтесь на центральной плоскости сосуда, используя объектив с соответствующим рабочим расстоянием. Получайте изображения с максимально возможной частотой, ограниченной временем экспозиции, чувствительностью детектора, интенсивностью возбуждения и эффективностью сбора света.
  4. Проанализируйте серию изображений, полученных в режиме таймлапс, с помощью программного обеспечения для цифровой трассерной велоциметрии (PIV).

15. Фиксация и иммуноокрашивание эндотелизированного сосуда

  1. Приготовьте 40 mL 4% раствора параформальдегида в PBS, содержащем 10 mM CaCl₂ и 10 mM MgCl₂.
    ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Параформальдегид токсичен. Готовьте и используйте растворы, содержащие параформальдегид, в соответствующем химическом вытяжном шкафу, используя подходящие средства индивидуальной защиты.
  2. Остановите поток, пережмите входную трубку, отсоедините её от насоса и подсоедините к заборной трубке, использовавшейся для анализа сосудистой проницаемости. Поместите заборную трубку в фиксатор и пропустите 35 mL раствора через сосуд самотеком.
  3. Пережмите трубку и инкубируйте сосуд в фиксаторе при комнатной температуре в течение 30 min.
  4. Промойте сосуд самотеком 25 mL буфера для пермеабилизации, содержащего 0.4% Triton, 20 mM PIPES при pH 6.1, 138 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM EGTA и 5.5 mM глюкозы. Пережмите трубку и инкубируйте в течение 10 min при комнатной температуре.
  5. Промойте сосуд блокирующим буфером, содержащим 1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Tris при pH 7.4, 140 mM NaCl и 5 mM KCl. Инкубируйте в течение 2 h при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.
  6. Разведите выбранную первичную антитело в соотношении 1:50–1:500 в 100–500 µL блокирующего буфера. Снимите входную трубку и введите раствор антител, используя процедуру, описанную в разделе 11 для посева клеток.
  7. Инкубируйте сосуд в течение ночи при 4 °C.
  8. Снова подсоедините входную трубку и промойте сосуд 20 mL PBS.
  9. Разведите соответствующие вторичные антитела в соотношении 1:200–1:1,000 в блокирующем буфере и, при необходимости, добавьте флуоресцентный фаллоидин в соотношении 1:250. Введите раствор, используя процедуру, описанную в разделе 15.6, и инкубируйте в течение 2 h при комнатной температуре.
  10. Промойте сосуд 40 mL PBS, закройте зажимы на трубках и заглушите трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните окрашенный сосуд при 4 °C и проведите визуализацию в течение 2 недель.
  11. Окрасьте F-актин флуоресцентным фаллоидином, аппарат Гольджи — антителами к GM130, а ядра — DAPI.
  12. Проанализируйте изображения фаллоидина с помощью FibrilTool74 для определения средней ориентации стресс-фибрилл F-актина.
  13. Определите ось между центрами масс каждого ядра и аппарата Гольджи. Проанализируйте и постройте график полученных ориентаций в программном обеспечении для численных вычислений, как было описано ранее75.

Результаты

Использование жертвенных чернил для печати различных трубчатых тканей было хорошо изучено несколькими группами, в частности лабораторией Льюиса, которая создала почечные канальцы вместе с кровеносными сосудами67,76. Аналогичные подходы применялись для печати альвеолярных структур77 и васкуляризированных опухолей78. В данной работе эти подходы были адаптированы для создания геометрии сосудов с целью исследования эндотелиальных реакций в условиях физиологического тока жидкости (Рисунок 2). Геометрия сосудов была преобразована из изображения сосудов в карту координат и впоследствии в G-код для определения траектории печати (Рисунок 2A–C). Полученный подход позволил изготовить шаблоны сосудов для изучения того, как извилистость сосудов и аневризмы изменяют функцию эндотелия и организацию цитоскелета (Рисунок 2D–G). Также была внедрена подходящая для 3D-печати конструкция камеры Роуза, чтобы исключить необходимость обращения к услугам станочников (Рисунок 2H). Пример файла G-кода для печати сосудов представлен в Дополнительном файле 1, а соответствующие CAD-файлы камеры Роуза и крепления предметного столика представлены в Дополнительном файле 2 и Дополнительном файле 3 соответственно. Печать на основе STL может потребовать нескольких проходов печатной головки, что приводит к созданию плетеных геометрий сосудов с разделенными просветами (Дополнительный рисунок 1). Полученная платформа была разработана таким образом, чтобы быть доступной для биологов, изучающих сосудистые клетки, при минимальном опыте в области биоинженерии, обеспечивая при этом поддержку физиологического давления и скоростей потока, а также доступ к микроскопии высокого разрешения (Рисунок 2I).

После изготовления сосуда и его целлюляризации устройство с сосудом было интегрировано в перфузионную систему с замкнутым контуром для обеспечения контролируемой циркуляции среды (Рисунок 3). Система состояла из перистальтического насоса, трехходового крана, подключенного к шприцу для заполнения, ловушки для пузырьков, демпфера пульсаций, устройства с сосудом и резервуара для среды, расположенных последовательно в контуре потока (Рисунок 3A). Такая конфигурация позволяла среде непрерывно циркулировать через сконструированный сосуд, включая компоненты для заполнения системы, удаления пузырьков и гашения пульсаций, создаваемых перистальтическим насосом. Собранная система могла эксплуатироваться с устройством с сосудом, размещенным в экспериментальной установке, как показано на Рисунке 3B, что обеспечивало практическую конфигурацию для последующей перфузии целлюляризованных сосудов в условиях контролируемого потока.

Одним из модификаций ранее описанных подходов с использованием жертвенных чернил была пастеризация чернил перед печатью. Эта модификация была необходима, так как применение опубликованных протоколов приготовления чернил приводило к загрязнению культур плесенью. Как и другие чернила на основе Pluronic, используемые для данной цели, чернила состава 25% Pluronic F127/1% PEO остаются жидкими при низких температурах и переходят в состояние плотного мицеллярного геля при повышении температуры. Температура перехода данной формуляции составляет 15°C, что удобно для создания шаблонов структур при температуре инкубатора и удаления чернил при 4°C. Подобно чистому Pluronic, этот материал также проявляет значительное сдвиговое разжижение при температуре печати (Рисунок 4A). Однако даже при низких температурах чернила слишком вязкие для стерилизации через фильтр с использованием стандартных фильтров для культур тканей и вакуума. Хотя чернила можно стерилизовать путем пастеризации при 70°C или выше в течение 20 с, такие температуры необратимо изменяют свойства чернил и снижают их вязкость при температуре печати (данные не представлены). Низкотемпературная пастеризация с более длительной выдержкой при 63°C в течение >1 ч снижает загрязнение грибками и другими микроорганизмами, не изменяя комплексную вязкость чернил при температурах, подходящих для печати. Реологическая характеристика с использованием реометра, оснащенного конусно-плоской геометрией 25 мм, показала, что исходные и пастеризованные чернила имели схожую вязкость в диапазоне скоростей деформации при температурах печати (Рисунок 4B), что доказывает, что пастеризация не ухудшает пригодность к печати. Пастеризованные чернила также позволяют осуществлять более длительное культивирование сосудов без необходимости использования антимикотических препаратов, которые могут изменять функцию эндотелия.

После заселения сосуда конфлюэнтные эндотелиальные клетки должны покрывать весь сосуд, как показано на Рисунке 5 (проекция максимальной интенсивности на Рисунке 5A и поперечный срез на Рисунке 5B). Затем скорость потока среды можно увеличить до физиологических значений скорости сдвига, которые для приблизительно круглых сосудов можно оценить с помощью уравнения Гагена-Пуазейля79. На практике скорость потока, необходимая для достижения желаемого напряжения сдвига, можно оценить, учитывая вязкость среды и микрофлюидное сопротивление. В типичной 2D-культуре in vitro поток среды при 12 dyn/cm2 заставляет большинство типов эндотелиальных клеток ориентироваться вдоль оси потока. Этот ответ можно визуализировать с помощью флуоресцентного окрашивания F-актина фаллоидином (Рисунок 5D,E) или путем анализа оси Гольджи-ядро (Рисунок 5D,F); оба метода демонстрируют анизотропную ориентацию, соответствующую поляризации эндотелия, как описано ранее18. Хотя in vivo возникают напряжения сдвига, превышающие 40 dyn/cm2, такие условия в данной работе не моделировались.

Основным следствием изменения геометрии сосудов является изменение тока жидкости, на которое эндотелиальные клетки реагируют через несколько сигнальных путей80,81. Существует несколько методов мониторинга скорости кровотока, включая 4D-доплеровское ультразвуковое исследование82, 4D-МРТ-ангиографию потока83 и лазерную спекл-визуализацию84. Несмотря на то что эти методы обладают важными преимуществами для исследований in vivo, разрешение локальных различий потока в пределах одного сосуда может быть затруднительным. Высокая числовая апертура визуализации данной платформы позволяет осуществлять прямой трекинг флуоресцентных частиц (Рисунок 6B) и картирование аномалий потока, вызванных кривизной сосудов, с высоким пространственным разрешением с помощью цифровой трассеометрии частиц (Рисунок 6C). Например, вдоль внутренней стороны изгиба сосуда наблюдается более медленный поток, чем вдоль внешней стороны (Рисунок 6C), что может способствовать изменению реакций эндотелия85.

После формирования сплошного слоя клеток проходимость и барьерная функция сосуда могут быть оценены путем перфузии через просвет флуоресцентно меченных макромолекул, таких как декстраны или белки. Проходимые сосуды, выстланные HUVECs, препятствуют прохождению флуоресцентно меченных декстранов (Рисунок 6D,F). Напротив, воздействие стимулов, нарушающих барьерную функцию, таких как TNFα, увеличивает утечку из сосуда (Рисунок 6H, J). Локальную скорость утечки можно визуализировать с помощью кимографового анализа (Рисунок 6E,G,I,K). Поскольку кимограф представляет расстояние по оси X и время по оси Y, относительные скорости утечки можно сравнить путем количественного определения наклона линий, построенных по сегментированной интенсивности флуоресценции (Рисунок 6E,G,I,K). Эти анализы позволяют оценить, как локальная геометрия сосуда влияет на барьерную функцию эндотелия в ответ на определенные стимулы.

Ключевым преимуществом данной платформы является улучшенный микроскопический доступ по сравнению с тем, что возможно in vivo. Система также облегчает иммуногистохимический анализ молекулярной организации эндотелия, в частности актинового цитоскелета. Эндотелиальные клетки очень тонкие и in vivo окружены гладкомышечными клетками, что может затруднить локализацию структур цитоскелета непосредственно внутри эндотелия. Данная платформа позволяет проводить простое окрашивание и визуализацию молекул адгезии и филаментозного актина в эндотелиальных клетках (Рисунок 5) и поддерживает многокомпонентный анализ, который затруднителен in vivo, включая оценку поляризации и деления эндотелия в условиях физиологического потока (Рисунок 5D–F). Объединение этих анализов на одной платформе позволяет напрямую исследовать взаимосвязи между геометрией сосудов, измененным потоком, барьерной функцией, молекулярной организацией эндотелия и межклеточной адгезией.

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс печати и использования 3D-моделей кровеносных сосудов на чипе. Блок-схема протоколов создания и использования 3D-моделей кровеносных сосудов на чипе. Черные круги указывают соответствующие номера протоколов. Цвета блоков обозначают температуру, при которой выполняется каждый протокол или инкубируется образец. Рабочий процесс включает моделирование формы сосудов, приготовление чернил, приготовление внеклеточного матрикса (ВКМ), подготовку камеры, печать сосудов, промывку и покрытие сосудов, целлюляризацию, перфузионное культивирование, функциональные анализы и гистологический анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Печать сосудов и конструкция камеры. Сосуды могут быть спроектированы на основе изображений сосудов in vivo для воспроизведения специфичной для конкретного пациента геометрии сосудистой сети. (A) Малый коронарный сосуд, визуализированный с помощью компьютерной томографии (КТ) с контрастным усилением, воспроизведено с разрешения Parekh et al.86 Масштабная линейка = 2 mm. (B) Координатная карта реперных точек участка сосуда, показанного на панели A, созданная путем записи точек в FIJI. (C) G-код, сформированный на основе координатной карты с помощью программного обеспечения для управления принтером. Координаты X, Y и Z указаны в правом нижнем углу. (D) Схема камеры Роуза, содержащей биопринтированный сосуд. Конструкция с верхними накидными гайками совместима с камерой из полилактида (PLA), напечатанной на 3D-принтере. (E) Камера Роуза, содержащая сосуд и резервуары, напечатанные с использованием жертвенных биочернил на покровном стекле с покрытием из ECM. Масштабная линейка = 9 mm. (F) Схема камеры Роуза, сконфигурированной для модели аневризмы. Проволока, пропущенная через входную и выходную иглы, служит шаблоном сосуда, а жертвенные биочернила, нанесенные на проволоку, служат шаблоном аневризмы. (G) Камера Роуза, содержащая шаблон из проволоки и жертвенных биочернил на покровном стекле с покрытием из ECM. (H) Адаптер предметного столика микроскопа (слева) и камера Роуза (справа), напечатанные из PLA на 3D-принтере, представляющие альтернативу компонентам из обработанного алюминия. Металлические зажимы на адаптере столика закреплены на адаптерной пластине. Масштабная линейка = 30 mm. (I) Напечатанный и промытый сосуд в алюминиевой камере Роуза, установленной на предметном столике микроскопа, с подключенными входной и выходной иглами и трубками. Масштабная линейка = 20 mm. Сокращения: CT = компьютерная томография; ECM = внеклеточный матрикс; PLA = полилактид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Система потока жидкости для клеточного сосуда в камере Роуза. (A) Схема конфигурации трубок, используемых для создания потока жидкости через камеру Роуза, содержащую клеточный сосуд. Стрелки указывают направление потока. Пронумерованные компоненты: (1) перистальтический насос, (2) трехходовой кран со шприцем для заполнения системы, (3) ловушка для пузырьков, (4) демпфер пульсаций, (5) устройство с сосудом и (6) резервуар со средой. Все компоненты, контактирующие с культуральной средой, стерилизуют перед использованием. (B>) Система потока жидкости, содержащая клеточный сосуд в камере Роуза, помещенная в инкубатор для культур тканей. Цифры соответствуют компонентам, показанным на панели A. Входная и выходная иглы закреплены лентой для обеспечения стабильности. Масштабная линейка = 40 mm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Реологическая характеристика жертвенных биочернил. (A) Динамическая вязкость непастеризованных чернил состава 25% Pluronic F127/1% полиэтиленоксида (PEO) в зависимости от скорости сдвига при 5 °C, 10 °C, 14,4 °C, 15 °C и 23 °C. (B) Комплексная вязкость в зависимости от угловой частоты для непастеризованных и пастеризованных чернил Pluronic F127/PEO при 25 °C и 37 °C. Сокращение: PEO = полиэтиленоксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Визуализация и количественный анализ фиксированных и окрашенных эндотелизированных сосудов. (A) Проекция максимальной интенсивности спин-дисковых конфокальных флуоресцентных изображений полностью клеточного сосуда после первоначального посева и культивирования при низком напряжении сдвига (1 dyn/cm2). Сосуд был окрашен на VE-cadherin (зеленый), F-actin (красный) и ДНК с помощью DAPI (синий). Масштабная линейка = 50 µm. (B) Реконструированный xz-срез z-стека спин-дисковых конфокальных флуоресцентных изображений полностью клеточного сосуда, окрашенного флуоресцентным фаллоидином для маркировки F-actin (красный). Масштабная линейка = 50 µm. (C) Проекция максимальной интенсивности z-стека спин-дисковых конфокальных флуоресцентных изображений полностью клеточного сосуда после 24 ч потока при 12 dyn/cm2. F-actin был маркирован флуоресцентным фаллоидином (красный). Масштабная линейка = 100 µm. (D) Спин-дисковое конфокальное флуоресцентное изображение участка сосуда после 24 ч культивирования при напряжении сдвига 16 dyn/cm2. Сосуд был окрашен на VE-cadherin (желтый), F-actin (пурпурный), маркер аппарата Гольджи GM130 (зеленый) и ДНК с помощью DAPI (синий). Стрелка указывает направление потока. Масштабная линейка = 30 µm. (E) Репрезентативная количественная оценка средней ориентации стресс-фибрилл по каналу F-actin на панели D с использованием FibrilTool74. Была проанализирована сетка из 45 областей площадью 1,600 µm2 каждая; средняя ориентация волокон представлена в виде радиальной гистограммы относительно направления потока. (F) Репрезентативная количественная оценка оси ядро-Гольджи по панели D как показатель поляризации эндотелиальных клеток. Векторы от центра каждого ядра до центра соответствующего аппарата Гольджи представлены в виде радиальной гистограммы относительно направления потока; n = 75 векторов. Сокращение: DAPI = 4′,6-диамидино-2-фенилинол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Анализ потока жидкости и сосудистой проницаемости. (A) Схема геометрии сосуда, использованной для анализов на панелях B–K. Буквы обозначают приблизительные области сосуда, соответствующие соответствующим панелям. (B) Цветовая временная проекция последовательности снимков, полученных с помощью спиннинговой дисковой конфокальной флуоресцентной микроскопии в режиме тайм-лапс, демонстрирующая движение флуоресцентных микросфер в потоке через изогнутый участок сосуда. Цвет указывает номер кадра от 1 до 100; отмечены внешняя и внутренняя кривизна. (C) Анализ методом цифровой трассерной визуализации (PIV), показывающий относительную скорость потока в изогнутом участке сосуда. Цвета представляют относительную скорость, а стрелки указывают направление и величину потока. Масштабный отрезок = 50 µm. (D–G) Репрезентативный анализ сосудистого барьера необработанного сосуда, перфузированного декстраном 10 kDa, меченным Alexa 647. (D,D′,D″) Снимки прямого участка сосуда, полученные через 0, 70 и 150 min соответственно. Белая линия указывает область, использованную для построения кимографа на панели E. (E) Кимограф прямого участка на панели D, показывающий скорость утечки 0,39 µm/min, что соответствует наклону пунктирной линии. (F,F′,F″) Снимки изогнутого участка сосуда, полученные через 0, 70 и 150 min. Белая линия указывает область, использованную для построения кимографа на панели G. Масштабный отрезок = 150 µm. (G) Кимограф изогнутого участка на панели F, показывающий скорость утечки 1,01 µm/min, что соответствует наклону пунктирной линии. (H–K) Репрезентативный анализ сосудистого барьера после преинкубации с 250 ng/mL фактора некроза опухоли альфа (TNFα). (H,H′,H″) Снимки прямого участка сосуда, полученные через 0, 200 и 400 min соответственно. Белая линия указывает область, использованную для построения кимографа на панели I. Масштабный отрезок = 250 µm. (I) Кимографический анализ прямого участка сосуда на панели H показывает скорость утечки 2,1 µm/min, что соответствует наклону пунктирной линии. (J,J′,J″) Снимки изогнутого участка сосуда, полученные через 0, 200 и 400 min. Белая линия указывает область, использованную для построения кимографа на панели K. Масштабный отрезок = 250 µm. (K) Кимографический анализ изогнутого участка сосуда на панели J показывает скорость утечки 6,7 µm/min, что соответствует наклону пунктирной линии. Звездочки на панелях D–K обозначают соответствующие концы линий, использованных для генерации кимографов. Сокращения: PIV = цифровая трассерная визуализация (particle image velocimetry); TNFα = фактор некроза опухоли альфа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Печать сосудов с использованием программирования принтера на основе STL. (A) Изображение напечатанного сосуда, полученного с помощью программирования принтера на основе STL, при котором печатающая головка совершает два прохода, создавая плетеную структуру сосуда (дифференциально-интерференционный контраст). Масштабная линейка = 250 µm. (B) 3D-визуализация промытого плетеного сосуда, заполненного бычьим сывороточным альбумином (BSA), меченным Alexa 647. Между просветами двух плетеных нитей виден зазор. Масштабная линейка = 100 µm. Сокращения: BSA = бычий сывороточный альбумин; STL = стандартный язык тесселяции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: G-код для печати сосудов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: CAD-чертеж камеры Роуза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: CAD-чертеж адаптера для крепления к предметному столику. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Описана надежная система моделирования геометрии сосудов, связанных с нарушением тока крови, включая извитые сосуды, аневризмы и точки ветвления. Метод поддерживает визуализацию с высоким разрешением, картирование потока и оценку функции сосудистого барьера на платформе, доступной клеточным биологам с ограниченным опытом в области биоинженерии. Хотя основной подход требует использования биопринтера, коммерчески доступные экструзионные принтеры варьируются от систем с открытым исходным кодом до более сложных платформ с несколькими печатными головками. Ключевые возможности принтера включают управление температурой печатной головки и чернил, точное регулирование давления и температуру печатного стола. Помимо биопечатных извитых и разветвленных сосудов, метод также включает модель аневризмы, которая может быть создана без использования биопринтера. В совокупности эти подходы облегчают исследование функций эндотелиальных клеток в извитых сосудах с помощью методов микроскопии, обычно доступных в лабораториях клеточной биологии.

Многочисленные in vitro для изучения функций сосудов доступны модельные системы87,88, каждая из которых обладает своими преимуществами и ограничениями. Описанная здесь система, адаптированная на основе предыдущих работ54,67,69особенно хорошо подходит для изучения влияния извитости сосудов на эндотелиальную функцию, поскольку позволяет осуществлять прямое моделирование геометрии сосудов пациентов и систематически изменять кривизну сосудов в рамках одного устройства. В других подходах для моделирования коронарных сосудов пациентов использовался фотополимеризуемый желатин-метакрилат для создания уменьшенных структур сосудов в условиях физиологического кровотока60Такие системы обеспечивают точное моделирование сосудов, анализ потока и возможность включения слоев медии (tunica media). Однако их общий размер и необходимость в стеклянной поддержке могут ограничивать возможность визуализации с высоким разрешением и проведение локальных тестов на утечку. Напротив, более компактные системы, основанные на самосборке эндотелиальных клеток, полученных из иПСК, позволяют выполнять визуализацию с высоким разрешением и могут включать как эндотелиальные клетки, так и гладкомышечные клетки сосудов.89Однако эти модели обеспечивают меньший контроль над геометрией сосудов, а создание высоких скоростей потока и сдвига может быть затруднительным. Таким образом, представленная система представляет собой практический промежуточный подход, сочетающий определенную геометрию сосудов с получением изображений извитости сосудов с высоким разрешением.

Основным преимуществом данной платформы является возможность создания сосудов, содержащих как изогнутые, так и прямые участки, что позволяет напрямую сравнивать локальную геометрию сосудов в пределах одного и того же образца при неизменности других экспериментальных переменных, как показано на Рисунке 6. Другим преимуществом является возможность использования изображений сосудов пациентов, полученных с помощью ангиографии или КТ с контрастным усилением. Основным ограничением при воспроизведении сосудов пациентов является размер. Сосуды диаметром менее 150µm трудно печатать воспроизводимо, в то время как сегменты сосудов длиной более нескольких сантиметров требуют более крупных монтажных камер. Сегменты сосудов также должны оставаться относительно плоскими в третьем измерении, чтобы их можно было напечатать на базовом матричном слое и удерживать в пределах рабочего расстояния объектива при микроскопической визуализации.

В будущих работах описанная здесь система может быть дополнительно модифицирована для моделирования таких заболеваний, как атеросклероз, при которых геометрия сосудов может вносить вклад в патофизиологию. Для повышения физиологической сложности могут быть включены генетически модифицированные эндотелиальные клетки или дополнительные типы клеток, включая гладкомышечные и иммунные клетки. Внедрение гладкомышечных клеток под эндотелиальный слой, как это было продемонстрировано в более простых системах, может дать дополнительные сведения о взаимодействиях между гладкими мышцами и эндотелием при извитости сосудов и заболеваниях90. Дополнительные модификации могут включать опухолевые клетки для исследования интравазации68,91 и влияния извитости на этот процесс. Платформа также может быть использована для изучения того, как нарушенный кровоток изменяет воспалительные реакции92,93 и потенциально способствует развитию сосудистых осложнений, связанных с такими инфекциями, как COVID-1994. Учитывая широкую роль сосудистой системы в здоровье и болезнях человека, доступные системы, подобные данной, могут облегчить дальнейшее исследование функции эндотелия в различных контекстах заболеваний.

Раскрытие информации

Содержание материалов лежит исключительно на ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здоровья. Авторы заявляют об отсутствии конфликта финансовых интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность сотрудникам лаборатории Дженнифер Льюис в Гарвардском университете за консультации на начальных этапах этой работы, а также сотрудникам лаборатории Уотермана за отзывы и рекомендации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(3-Аминопропил)триметоксисилан (APTMS), 97%Sigma-Aldrich281778Используется для силанизации и активации стеклянных покровных стекол перед прикреплением внеклеточного матрикса.
стерильный шприц объемом 1 млFisher Scientific14-823-434Используется для подачи реагентов, покрытия стенок сосудов и перемещения жидкостей.
1xфосфатно-солевой буферный раствор (PBS)Thermo Fisher ScientificJ61196.APИспользуется для приготовления реагентов, промывки и ополаскивания сосудов.
стерильный шприц объемом 10 млFisher Scientific14-955-459Используется для приготовления реагентов и переноса жидкостей.
конические пробирки объемом 15 мл с крышкойFisher Scientific05-538-59AИспользуется для приготовления реагентов, работы с клетками и хранения растворов.
полистироловая чашка Петри диаметром 150 ммFisher ScientificFB0875714Используется в качестве стерильного рабочего или инкубационного контейнера.
игла 21GFisher Scientific14-817-227Используется для подготовки шаблона сосуда и доступа к камере.
игла 23GFisher Scientific14-817-237Используется для соединений на входе и выходе из сосуда во время промывки и перфузии.
прозрачная коническая дозирующая игла 27GNordson7018417Используется для экструзии жертвенных чернил и визуализации пузырьков воздуха в процессе печати.
стерильный шприц объемом 3 млFisher Scientific14-955-459Используется для переноса жидкостей и подачи реагентов. Уточните номер по каталогу, так как указанный номер также присвоен шприцу объемом 10 мл.
медицинский мандрен из нержавеющей стали марки 304, диаметром 0,0190 дюймаПоставка компонентовGWX-0190-36Используется в качестве съемного шаблона для создания прямого просвета в модели аневризмы на основе проволоки.
Конические пробирки объемом 50 мл с крышкойFisher Scientific05-526BИспользуется для приготовления, перемешивания, пастеризации и хранения реагентов.
вторичные антитела против мыши, конъюгированные с Alexa 488Thermo Fisher ScientificA32723TRФлуоресцентное вторичное антитело, используемое для иммуноокрашивания.
вторичное антитело к кролику с Alexa 555Thermo Fisher ScientificA-21428Флуоресцентное вторичное антитело, используемое для иммуноокрашивания.
бычий сывороточный альбумин, меченный Alexa 647Thermo Fisher ScientificA34785Флуоресцентный макромолекулярный маркер, используемый для анализа проницаемости и утечки через сосудистый барьер.
Декстран с меткой Alexa 647, 10 кДаThermo Fisher ScientificD22914Флуоресцентный маркер, используемый для оценки функции эндотелиального барьера и сосудистой проницаемости.
Alexa 647-фаллоидинThermo Fisher ScientificA22287Используется для флуоресцентного мечения F-актина для визуализации цитоскелета и анализа ориентации.
Альбумин сыворотки быка, фракция V, без жирных кислотSigma-Aldrich126575-10GMИспользуется для блокировки и подготовки белковых растворов.
Антибиотик-антимикотик, 100xThermo Fisher Scientific15240062Дополнительная противомикробная добавка для среды ECM и культуральной среды (опционально).
Антитело к GM130, клон 4A3Sigma-AldrichMABT1363Первичные антитела, используемые для маркировки аппарата Гольджи при анализе полярности эндотелия.
Кроличьи моноклональные антитела к VE-кадгерину, D87F2Abcam65707Первичные антитела, используемые для визуализации межклеточных контактов эндотелиальных клеток.
Хлорид кальцияSigma-AldrichC7902Используется в буферах для подготовки и фиксации внеклеточного матрикса (ВКМ). Убедитесь, какой именно реагент требуется: безводный или гидратированный хлорид кальция.
Комплект соединителейWorld Precision Instruments504954Разъемы «Люэра» для подключения трубок, используемые для сборки контура микрофлюидной перфузии.
Стойка для окрашивания покровных стеколМетоды электронной микроскопии72240Используется для удержания покровных стекол во время очистки, силанизации, активации и промывки.
D-(+)-глюкозаSigma-AldrichG7021-100GКомпонент буфера для пермеабилизации, используемый при иммуноокрашивании.
DAPIThermo Fisher Scientific62248Флуоресцентный краситель для ядер, используемый для визуализации клеток и анализа полярности.
Цифровая нагревательная плиткаFisher Scientific11-475-028Используется для поддержания температуры камеры сосуда и реагентов на уровне приблизительно 37 °C в процессе сборки.
тетранатриевая соль ЭГТАSigma-AldrichE8145-10GХелатирующий агент, используемый в буфере для пермеабилизации.
Разъем Люэра с елочкой (мама) для трубок с внутренним диаметром 1/16 дюймаScientific Commodities Inc.BB330AИспользуется для соединения трубок внутри микрофлюидной системы.
Разъем Люэ (мама) с штуцером с внутренним диаметром 1/16 дюйма, CrystalVu QCFisher Scientific01-000-123Используется для соединений трубок и камер сосудов.
ФибриногенSigma-AldrichF8630Компонент ВКМ, используемый совместно с желатином и тромбином для формирования поддерживающего сосуды гидрогеля. Проверить источник: в рукописи указан фибриноген плазмы человека, тогда как в прилагаемой таблице указана плазма быка.
Гидравлический демпфер пульсацийDarwin MicrofluidicsSE-D1606-3NB-PC-31Используется для снижения пульсаций, создаваемых перистальтическим насосом.
Высокотемпературная силиконовая резиновая лента для пищевой промышленностиMcMaster-Carr8417K51Используется для изготовления прокладки для камеры Роуза.
Желатин из свиной кожи, сила геля 300, тип ASigma-AldrichG2500Основной компонент внеклеточного матрикса, используемый для формирования гидрогеля вокруг просвета сосуда.
Стеклянный покровный стекла, № 1,5VWREN-MAS-25X25-1-5-CSПодложка для микроскопии высокого разрешения и поверхность камеры.
Глутаровый альдегид, 25%Electron Microscopy Sciences16220Разведен для активации покровных стекол перед прикреплением внеклеточного матрикса (ВКМ).
Набор для выращивания BBEATCCPCS-100-040Комплект добавок, используемый с базальной средой для сосудистых клеток для культивирования эндотелиальных клеток.
Набор для стимуляции роста VEGFATCCPCS-100-041Добавка для роста эндотелия, используемая с базовой средой для сосудистых клеток при необходимости.
Фибронектин плазмы крови человекаSigma-AldrichFC010Опциональное покрытие просвета внеклеточным матриксом (ВКМ), используемое для улучшения адгезии эндотелия.
Зажим для трубок системы подачиSigma-AldrichZ503371-1ПАКИспользуется для остановки и регулирования потока через трубки во время манипуляций с камерой и инкубации.
перистальтический насос Ismatec Reglo DigitalMasterflex78018-12Используется для создания контролируемого потока жидкости через целлюляризированные сосуды.
ЛамининSigma-AldrichL2020-1MGОпциональное покрытие просвета внеклеточным матриксом для модификации адгезии и поляризации эндотелия.
Набор адаптеров с разъемом Люэра для трубокWorld Precision Instruments504954Используется для соединения трубок, шприцев, а также входных и выходных компонентов камеры. Дубликат каталожного номера комплекта соединителей; если записи идентичны, оставить одну.
Гексагидрат хлорида магнияSigma-AldrichM2393-100GСостав буферов для фиксации и пермеабилизации.
Разъем Люера с внешней резьбой и конусом для трубки с внутренним диаметром 1/16 дюймаScientific Commodities Inc.BB329AИспользуется для соединений микрофлюидных трубок.
Разъем Люэра (папа), внутренний диаметр 1/16 дюймаWorld Precision Instruments13160-100Используется для соединения трубок со шприцами и компонентами камеры.
MatrigelSigma-AldrichCLS356234-1EAОпциональное покрытие просвета внеклеточным матриксом (ВКМ), используемое для прикрепления эндотелия.
Крышки для флаконов с питательными средамиFisher Scientific05-719-310Двухпортовые крышки, используемые для создания стерильных резервуаров с культуральной средой для контура потока.
Силиконовая трубка фармацевтического класса Nalgene, внутренний диаметр 1/16 дюймаThermo Fisher Scientific8600-0020Гибкие трубки, используемые в контурах микрофлюидной перфузии и промывки.
ParafilmМетоды электронной микроскопии70990-125Используется в качестве неадгезивной поверхности при полимеризации покрытий из внеклеточного матрикса (ВКМ) на покровных стеклах.
ФСБ, 10x, pH 7,4Thermo Fisher Scientific70011044Концентрированный буфер, используемый для приготовления рабочих растворов PBS.
Пенициллин/стрептомицинThermo Fisher Scientific15140122Антибиотическая добавка, используемая в среде для культивирования эндотелия и в промывных растворах.
ПИПЕС (PIPES)Sigma-AldrichP1851-25GБуферный компонент раствора для пермеабилизации.
Плюроник F-127Sigma-AldrichP2443Термочувствительный компонент жертвенных чернил для печати.
Трехходовой поликарбонатный кран с мужским разъемом ЛюэраFisher ScientificNC9593742Используется для заполнения, переключения и управления путями потока жидкости в контуре перфузии.
Полиэтиленоксид (ПЭО)Sigma-Aldrich372781Полимерный компонент состава жертвенных чернил.
Ротационный смесительFisher Scientific88861050Используется для перемешивания жертвенных чернил на основе PEO/Pluronic при 4 °C.
Лоток для окрашивания предметных стеколMSE SuppliesDWK90020Используется для промывки покровных стекол, окрашивания или инкубации с реагентами.
Квадратное покровное стекло, № 2, 25 мм x 25 ммSigma-AldrichCLS285525-1000EAПокрывающее стекло для камеры; более толстое стекло № 2 обладает повышенной устойчивостью к breakage и совместимо с подходящими воздушными или иммерсионными объективами.
Тупоконечная раздаточная игла из нержавеющей стали, 21 G, 1 дюймПоставка компонентовNE-212PLИспользуется для подачи жидкости или создания модели сосуда на основе проволочного шаблона.
Вакуумные фильтрующие устройства SteriflipMilliporeSigmaSE1M179M6Используется для стерилизующей фильтрации теплого желатина и других совместимых растворов.
Стерильные пластиковые шприцы объемом 5 млОблегчениеPSYR5-SИспользуется для загрузки жертвенных чернил для пневматической экструзионной печати.
Тромбин, плазма человека, высокая активностьSigma-Aldrich605195Используется для инициирования полимеризации фибрина в процессе формирования геля ВКМ.
ТрансглутаминазаMoo Gloo1201Сшивающий фермент, используемый при подготовке и модификации внеклеточного матрикса (ВКМ) из желатина/фибрина.
Triton X-100Sigma-Aldrich648466Детергент, используемый для пермеабилизации эндотелиальных клеток перед иммуноокрашиванием.
Фермент TrypLE Express, 1x, с феноловым краснымThermo Fisher Scientific12605010Реагент для диссоциации клеток, используемый для сбора эндотелиальных клеток перед засевом сосудов.
Tween 20Sigma-Aldrich11332465001Детергентный компонент блокирующего буфера для иммуноокрашивания.
Базальная среда для культурации сосудистых клетокATCCPCS-100-030Базальная среда, используемая для культивирования эндотелиальных клеток и экспериментов по перфузии.

Ссылки

  1. Franken R, et al. Increased aortic tortuosity indicates a more severe aortic phenotype in adults with Marfan syndrome. Int J Cardiol. 2015;194:7-12.
  2. Morris SA, et al. Vertebral artery tortuosity in Turner syndrome: is tortuosity a component of the aortopathy phenotype J Cardiovasc Magn Reson. 2014;16(Suppl 1):P115.
  3. Morris SA. Arterial tortuosity in genetic arteriopathies. Curr Opin Cardiol. 2015;30(6):587-593.
  4. Ciurică S, et al. Arterial tortuosity. Hypertension. 2019;73(5):951-960.
  5. Penta R, Ambrosi D. The role of the microvascular tortuosity in tumor transport phenomena. J Theor Biol. 2015;364:80-97.
  6. Bullitt E, et al. Abnormal vessel tortuosity as a marker of treatment response of malignant gliomas: preliminary report. Technol Cancer Res Treat. 2004;3(6):577-584.
  7. Fattahi M, et al. Influence of parent vessel feature on the risk of internal carotid artery aneurysm rupture via computational method. Sci Rep. 2023;13(1):1-12.
  8. Kawsara A, et al. Management of coronary artery aneurysms. JACC Cardiovasc Interv. 2018;11(13):1211-1223.
  9. Sokhal BS, Ma Y, Rajagopalan S. Femoral artery aneurysms. Br J Hosp Med. 2022;83(12).
  10. Golledge J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nat Rev Cardiol. 2019;16(4):225-242.
  11. Toader C, et al. Cerebral aneurysm: filling the gap between pathophysiology and nanocarriers. Int J Mol Sci. 2024;25(22):11874.
  12. Wei F, et al. Arterial tortuosity: an imaging biomarker of childhood stroke pathogenesis Stroke. 2016;47(5):1265-1270.
  13. Moceri P, et al. Arterial tortuosity syndrome: early diagnosis and association with venous tortuosity. J Am Coll Cardiol. 2013;61(7):783.
  14. Zhang X, et al. The relationship between retinal vascular tortuosity and retinal vasculitis. J Ophthalmic Inflamm Infect. 2025;15:65.
  15. Cuhlmann S, et al. Disturbed blood flow induces RelA expression via c-Jun N-terminal kinase 1: a novel mode of NF-κB regulation that promotes arterial inflammation. Circ Res. 2011;108(8):950-959.
  16. Sunderland K, Jiang J, Zhao F. Disturbed flow's impact on cellular changes indicative of vascular aneurysm initiation, expansion, and rupture: a pathological and methodological review. J Cell Physiol. 2022;237(1):278-300.
  17. Luu V, et al. Role of endothelial primary cilia as fluid mechanosensors on vascular health. Atherosclerosis. 2018;275.
  18. Vion AC, et al. Endothelial cell orientation and polarity are controlled by shear stress and VEGF through distinct signaling pathways. Front Physiol. 2021;11:623769.
  19. Petzold T, et al. Focal adhesion kinase modulates activation of NF-kappaB by flow in endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;297(4):C814-C822.
  20. Thodeti CK, et al. TRPV4 channels mediate cyclic strain-induced endothelial cell reorientation through integrin-to-integrin signaling. Circ Res. 2009;104(9):1123-1130.
  21. Beech DJ. PIEZO force sensing in vascular biology: an explosion of new knowledge, concepts and opportunity. Adv Sci (Weinh). 2025;12(41):e11774.
  22. Tamargo IA, et al. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023;20(11):738-753.
  23. Chiu JJ, Chien S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol Rev. 2011;91(1):327-387.
  24. Nakajima H, Mochizuki N. Flow pattern-dependent endothelial cell responses through transcriptional regulation. Cell Cycle. 2017;16(20):1893-1901.
  25. Zhao Y, et al. Small rodent models of atherosclerosis. Biomed Pharmacother. 2020;129:110426.
  26. Curry-Koski T, Curtin LP, Esfandiarei M, Thomas TC. Cerebral microvascular density, blood-brain barrier permeability, and support for neuroinflammation indicate early aging in a Marfan syndrome mouse model. Front Physiol. 2024;15:1457034.
  27. Thompson JW, et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurg Focus. 2019;47(1).
  28. Golledge J, Krishna SM, Wang Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. Br J Pharmacol. 2022;179(5):792-810.
  29. Noval Rivas M, Arditi M. Kawasaki disease: pathophysiology and insights from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 2020;16(7):391-405.
  30. He L, et al. Endothelial shear stress signal transduction and atherogenesis: from mechanisms to therapeutics. Pharmacol Ther. 2022;235:108152.
  31. Wang X, et al. Endothelial mechanobiology in atherosclerosis. Cardiovasc Res. 2023;119(8):1656-1675.
  32. Humphrey JD, Schwartz MA. Vascular mechanobiology: homeostasis, adaptation, and disease. Annu Rev Biomed Eng. 2021;23:1-27.
  33. Wang C, Lu H, Schwartz MA. A novel in vitro flow system for changing flow direction on endothelial cells. J Biomech. 2012;45(7):1212-1218.
  34. Sedlak J, Clyne A. Application of shear stress to endothelial cells using a parallel plate flow chamber. Methods Mol Biol. 2023;2600:81-90.
  35. Zhu J, et al. Advances in tissue engineering of vasculature through three-dimensional bioprinting. Dev Dyn. 2021;250(12):1717-1738.
  36. Kinstlinger IS, Miller JS. 3D-printed fluidic networks as vasculature for engineered tissue. Lab Chip. 2016;16(11):2025-2043.
  37. Werschler N, Quintard C, Nguyen S, Penninger J. Engineering next generation vascularized organoids. Atherosclerosis. 2024;398:118529.
  38. Shakeri A, et al. Engineering organ-on-a-chip systems for vascular diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023;43(12):2241-2255.
  39. Xie X, et al. Customizable microfluidic origami liver-on-a-chip (oLOC). Adv Mater Technol. 2022;7(5):2100677.
  40. Kawakita S, et al. Organ-on-a-chip models of the blood-brain barrier: recent advances and future prospects. Small. 2022;18(39):e2201401.
  41. Bai H, Ingber DE. What can an organ-on-a-chip teach us about human lung pathophysiology Physiology. 2022;37(5).
  42. Seghir R, Arscott S. Extended PDMS stiffness range for flexible systems. Sens Actuators A Phys. 2015;230:33-39.
  43. Hasler J, et al. Development and characterization of a tunable PDMS substrate model for investigating elastic properties and mechanical stretching in intervertebral disc cells. JOR Spine. 2025;8(4):e70140.
  44. Uroz M, et al. Differential stiffness between brain vasculature and parenchyma promotes metastatic infiltration through vessel co-option. Nat Cell Biol. 2024;26(12):2144-2153.
  45. Wood JA, Liliensiek SJ, Russell P, Nealey PF, Murphy CJ. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 2010;3(3):1620-1639.
  46. Peloquin J, Huynh J, Williams RM, Reinhart-King CA. Indentation measurements of the subendothelial matrix in bovine carotid arteries. J Biomech. 2011;44(5):815-821.
  47. McQueen A, Warboys CM. Mechanosignalling pathways that regulate endothelial barrier function. Curr Opin Cell Biol. 2023;84:102213.
  48. Hahn C, Orr AW, Sanders JM, Jhaveri KA, Schwartz MA. The subendothelial extracellular matrix modulates JNK activation by flow. Circ Res. 2009;104(8):995-1003.
  49. Xu Z, et al. Matrix stiffness, endothelial dysfunction and atherosclerosis. Mol Biol Rep. 2023;50(8):7027-7041.
  50. Lemarié CA, Tharaux PL, Lehoux S. Extracellular matrix alterations in hypertensive vascular remodeling. J Mol Cell Cardiol. 2010;48(3):433-439.
  51. Huveneers S, Daemen MJAP, Hordijk PL. Between Rho(k) and a hard place: the relation between vessel wall stiffness, endothelial contractility, and cardiovascular disease. Circ Res. 2015;116(5):895-908.
  52. Stankey PP, et al. Embedding biomimetic vascular networks via coaxial sacrificial writing into functional tissue. Adv Mater. 2024;36(36):e2401528.
  53. Sundaram S, et al. Sacrificial capillary pumps to engineer multiscalar biological forms. Nature. 2024;636(8042):361-367.
  54. Kroll KT, et al. A perfusable, vascularized kidney organoid-on-chip model. Biofabrication. 2024;16(4).
  55. Strobel HA, Moss SM, Hoying JB. Vascularized tissue organoids. Bioengineering. 2023;10(2):124.
  56. Servais B, et al. Engineering brain-on-a-chip platforms. Nat Rev Bioeng. 2024;2(8):691-709.
  57. Osaki T, Sivathanu V, Kamm RD. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 2018;8(1):5168.
  58. Maharjan S, Cecen B, Zhang YS. 3D immunocompetent organ-on-a-chip models. Small Methods. 2020;4(9):2000235.
  59. Fang JS, et al. A microphysiological system HHT-on-a-chip platform recapitulates patient vascular lesions. Nat Commun. 2026.
  60. Catano JA, et al. A patient-specific 3D printed carotid artery model integrating vascular structure, flow, and endothelium responses. Adv Healthc Mater. 2026;15(4):e02478.
  61. Li Z, Hui J, Yang P, Mao H. Microfluidic organ-on-a-chip system for disease modeling and drug development. Biosensors. 2022;12(6):370.
  62. Leung CM, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2(1):33.
  63. Campisi M, et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  64. Miller JS, et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nat Mater. 2012;11(9):768-774.
  65. Kong Z, Wang X. Bioprinting technologies and bioinks for vascular model establishment. Int J Mol Sci. 2023;24(1):891.
  66. Kolesky DB, et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 2014;26(19):3124-3130.
  67. Lin NYC, et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(12):5399-5404.
  68. Park W, et al. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 2023;14(1):7696.
  69. Kolesky DB, Homan KA, Skylar-Scott MA, Lewis JA. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(12):3179-3184.
  70. Xiao Y, Liu Q, Han HC. Buckling reduces eNOS production and stimulates extracellular matrix remodeling in arteries in organ culture. Ann Biomed Eng. 2016;44(9):2840-2850.
  71. Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Benton G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 2009;12(3):267-274.
  72. Qiu Y, et al. Microvasculature-on-a-chip for the long-term study of endothelial barrier dysfunction and microvascular obstruction in disease. Nat Biomed Eng. 2018;2(6):453-463.
  73. Rose GG, Pomerat CM, Shindler TO, Trunnell JB. A cellophane-strip technique for culturing tissue in multipurpose culture chambers. J Biophys Biochem Cytol. 1958;4(6):761-764.
  74. Boudaoud A, et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 2014;9(2):457-463.
  75. Fischer RS, et al. Contractility, focal adhesion orientation, and stress fiber orientation drive cancer cell polarity and migration along wavy ECM substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(22):e2021135118.
  76. Wolf KJ, et al. Perfusable 3D models of ureteric bud and collecting duct tubules. Cell Biomater. 2026;2(3):100297.
  77. Ren B, et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Appl Phys Rev. 2022;9(1).
  78. Hynes WF, et al. Examining metastatic behavior within 3D bioprinted vasculature for the validation of a 3D computational flow model. Sci Adv. 2020;6(35):eabb3308.
  79. Pisano A. From tubes and catheters to the basis of hemodynamics: viscosity and Hagen-Poiseuille equation. In: Physics for Anesthesiologists and Intensivists: From Daily Life to Clinical Practice. Springer; 2021:89-98.
  80. Gerhardt H, Betsholtz C. How do endothelial cells orientate EXS. 2005;(94):3-15.
  81. Baeyens N, et al. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. J Clin Invest. 2016;126(3):821-828.
  82. Lee J. Hemodynamics in Doppler ultrasonography. Ultrasonography. 2024;43(6):413.
  83. Kamada H, et al. Blood flow analysis with computational fluid dynamics and 4D-flow MRI for vascular diseases. J Cardiol. 2022;80(5):386-396.
  84. Postnov DD, Tuchin VV, Sosnovtseva O. Estimation of vessel diameter and blood flow dynamics from laser speckle images. Biomed Opt Express. 2016;7(7):2759.
  85. Dessalles CA, Leclech C, Castagnino A, Barakat AI. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 2021;4:764.
  86. Parekh P, Agrawal N, Vasavada A, Vinchurkar M. Extreme coronary artery tortuosity in association with tortuosity of the systemic arteries: a rare and challenging situation for the interventionist. BMJ Case Rep. 2014;2014:bcr2014204725.
  87. Vetter J, Palagi I, Waisman A, Blaeser A. Recent advances in blood-brain barrier-on-a-chip models. Acta Biomater. 2025;197:1-28.
  88. Liu Y, Lin L, Qiao L. Recent developments in organ-on-a-chip technology for cardiovascular disease research. Anal Bioanal Chem. 2023;415(18):3911-3925.
  89. Cuenca MV, et al. Engineered 3D vessel-on-chip using hiPSC-derived endothelial- and vascular smooth muscle cells. Stem Cell Reports. 2021;16(9):2159-2168.
  90. van Engeland NCA, et al. A biomimetic microfluidic model to study signalling between endothelial and vascular smooth muscle cells under hemodynamic conditions. Lab Chip. 2018;18(11):1607-1620.
  91. Sobrino A, et al. A tissue-engineered 3D microvessel model reveals the dynamics of mosaic vessel formation in breast cancer. Cancer Res. 2020;80(19).
  92. Riddle RB, Jennbacken K, Hansson KM, Harper MT. A multicellular vessel-on-a-chip model reveals context-dependent roles for platelets in inflammation and inflammatory hemostasis. Blood Vessels Thromb Hemost. 2024;1(2):100007.
  93. Rickman M, et al. Disturbed flow increases endothelial inflammation and permeability via a Frizzled-4-β-catenin-dependent pathway. J Cell Sci. 2023;136(6):jcs260449.
  94. Shevchuk O, et al. Vessel-on-a-chip: a powerful tool for investigating endothelial COVID-19 fingerprints. Cells. 2023;12(9):1297.

Перепечатки и разрешения

Теги

vesselsнапечатанные на 3D-принтереизвитость сосудованевризмы сосудоворган на чипепроницаемость сосудовфизиологическая скорость сдвигасветовая микроскопия
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.