Методическая статья

Механическая активация макрофагов, индуцированная перистальтикой

49 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72607

⸱

18 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе представлены установка и эксплуатация запатентованного биореактора для исследований в области механо-иммуномодуляции. С помощью специализированного биореактора, воспроизводящего физиологические силы, мы демонстрируем, что макрофаги вырабатывают отчетливый провоспалительный ответ на механическую стимуляцию.

Аннотация

Воспаление представляет собой сложный процесс, который способствует развитию как острых, так и хронических заболеваний. Оно модулируется каскадными биохимическими и биофизическими сигналами, приводящими к активации иммунных клеток. Макрофаги являются основным типом иммунных клеток, участвующих во многих воспалительных состояниях, включая рак, фиброз и аутоиммунные заболевания. Традиционные методы исследования активации макрофагов включают биохимическую стимуляцию определенными цитокинами или хемокинами, что переводит макрофаги в про- или противовоспалительное состояние. Новые данные свидетельствуют о том, что, помимо биохимических сигналов в тканях, роль в активации макрофагов играют и биофизические сигналы. Одним из таких распространенных механических сигналов является перистальтика, состоящая из многоосного растяжения и напряжения сдвига, которая происходит в желудочно-кишечном тракте, матке, развивающихся дыхательных путях и мочеточниках. В данной работе мы проверили гипотезу о том, что перистальтика может активировать макрофаги. В данном протоколе описывается использование перистальтического биореактора для исследования механической активации макрофагов. Мембраны из полидиметилсилоксана были покрыты фибронектином для улучшения адгезии макрофагов. Иммортализованные макрофаги костного мозга мыши (iBMDM) высевали на мембраны, покрытые фибронектином, и содержали в качестве статических контролей или подвергали воздействию перистальтики в течение 4 h. Перистальтика активировала макрофаги, что проявилось в значительных различиях в экспрессии генов Il6 (в 50,9 раза выше, чем в статических контролях; p < 0.0001, t-test) и Nos2 (в 19,8 раза выше, чем в статических контролях; p = 0.0046). Интересно, что по сравнению со статическими контролями не было наблюдаться значимых изменений в экспрессии Chil3 (в 1,22 раза выше, чем в статических контролях; p = 0.9726) или Mrc1 (в 1,16 раза выше, чем в статических контролях; p = 0.9810) , что указывает на то, что механическое воздействие в первую очередь вызывало провоспалительную активацию. Полученные результаты подтверждают концепцию механо-иммуномодуляции макрофагов, особенно в ответ на механику перистальтики, которая преобладает во многих тканях, состоящих из гладких мышц.

Введение

Макрофаги представляют собой клетки врожденного иммунитета, которые играют важную роль в защите организма, ремоделировании тканей и регуляции воспаления посредством фагоцитоза и секреции цитокинов1,2,3,4. В зависимости от стимулов в микросреде in vivo, недифференцированные макрофаги (M0) могут пластично поляризоваться в сторону провоспалительного (M1) или противовоспалительного/прорегенеративного (M2) фенотипов5,6. Модели in vitro обычно используются для изоляции этих различных стимулов, чтобы лучше понять сложные механизмы, определяющие поляризацию макрофагов. Классически активированные макрофаги M1 обычно индуцируют in vitro биохимическими стимулами, такими как липополисахарид (LPS) и интерферон гамма (IFN-γ), что приводит к повышенной экспрессии медиаторов воспаления, включая индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS), интерлейкин-6 (IL6) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α)7,8. Альтернативно активированные макрофаги M2 обычно индуцируются воздействием интерлейкина-4 (IL-4) и интерлейкина-13 (IL-13), что способствует ремоделированию тканей и заживлению ран8,9. Макрофаги M2 далее подразделяются на фенотипы M2a, M2b и M2c на основе различных путей активации и профилей экспрессии поверхностных маркеров10,11. В то время как биохимическая регуляция поляризации макрофагов была подробно охарактеризована как в системах in vivo, так и in vitro, макрофаги находятся в высокодинамичных микросредах, которые также содержат значительные биофизические стимулы12. Помимо растворимых цитокинов и хемокинов, макрофаги подвергаются воздействию внеклеточного матрикса и межклеточных взаимодействий, жесткости субстрата, напряжения сдвига жидкости, гидростатического давления и циклической деформации тканей12,13,14. Будучи механочувствительными клетками, макрофаги могут изменять свои воспалительные фенотипы в ответ на эти физические сигналы, что подчеркивает важность механобиологии в иммунной регуляции.

Растущее число публикаций демонстрирует, что изолированные механические стимулы in vitro могут существенно влиять на состояния активации макрофагов (Рисунок 1). Воздействие более жестких субстратов приводило к усилению поляризации по типу M1 и продукции воспалительных цитокинов по сравнению с более мягкими субстратами, которые индуцировали прорегенеративный фенотип15,16,17,18,19,20. Аналогичным образом, напряжение сдвига жидкости модулирует фенотип макрофагов в зависимости от его величины: низкие уровни интерстициального тока жидкости часто способствуют прорегенеративной активации21,22, тогда как более высокие напряжения сдвига, сопоставимые со значениями в артериях, могут индуцировать провоспалительные ответы23,24,25,26,27,28. Модели циклического растяжения in vitro, разработанные для имитации механики скелетно-мышечной, миокардиальной, легочной и кишечной тканей, также продемонстрировали повышенную экспрессию воспалительных медиаторов, хотя результаты варьируют в зависимости от величины, продолжительности, частоты и размерности приложенной силы29,30,31,32. Кроме того, механочувствительность макрофагов различается в зависимости от вида и источника клеток, что подчеркивает важность выбора подходящих экспериментальных моделей для исследований в области механобиологии13,14.

Схема активации макрофагов; биохимические, биофизические стимулы; фенотипические изменения; стрессовые факторы.
Рисунок 1Схема, иллюстрирующая in vitro биохимические и биофизические стимулы активации макрофагов в провоспалительное или прорегенераторное состояния. Макрофаги могут быть стимулированы для перехода в провоспалительное состояние in vitro путем добавления химических стимулов, таких как липополисахарид (ЛПС), интерферон γ (IFN-γ), или посредством воздействия механических стимулов, включая напряжение сдвига, повышенную жесткость, высокую циклическую и статическую деформацию при одноосном растяжении, сжатие и деформацию при многоосевом сжатии. Макрофаги могут быть стимулированы для перехода в прорегенеративное состояние с помощью in vitro добавление химических стимулов, интерлейкина-13 (IL-13) и IL-4. Они также могут приобретать прорегенеративный фенотип при воздействии механических стимулов в виде осциллирующего напряжения сдвига, интерстициального потока, мягких субстратов или низких уровней одноосного циклического растяжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Помимо независимого исследования отдельных механических стимулов, важно развивать эту работу, чтобы приступить к изучению воздействия совокупности физических сил, поскольку макрофаги in vivo обычно подвергаются воздействию комбинаций одновременных сил. Перистальтика представляет собой одну из таких сложных механических сред, состоящую из одновременного многоосного циклического растяжения и напряжения сдвига жидкости, возникающих при сокращении гладких мышц33. Такие механические процессы наблюдаются в нескольких системах органов, включая желудочно-кишечный тракт, развивающиеся дыхательные пути, сосудистую систему, матку и мочеточники34,35,36. Важно отметить, что перистальтическая функция часто нарушена при воспалительных заболеваниях, включая фиброз, воспалительные заболевания кишечника, рак и расстройства ремоделирования дыхательных путей, все из которых сопровождаются выраженным макрофаг-опосредованным воспалением33,37,38,39. Несмотря на признанную роль макрофагов при этих заболеваниях, остается критический пробел в понимании того, как механические силы перистальтики напрямую влияют на активацию макрофагов.

В данном протоколе описывается использование системы перистальтического биореактора для исследования механо-иммуномодуляции макрофагов в физиологически релевантных механических условиях. По сравнению с традиционными статическими системами культивирования или платформами для механической стимуляции одним видом воздействия, этот метод позволяет одновременно применять циклическое многоосевое растяжение и напряжение сдвига жидкости, что более точно воспроизводит механическую микросреду in vivo в тканях на основе гладких мышц. В настоящем протоколе бессмертные макрофаги костного мозга мыши (iBMDMs), культивируемые в биореакторах в условиях перистальтики, демонстрировали повышение маркеров активации M1 при отсутствии тенденций к активации M2. Эти результаты показывают, что перистальтическая механика способна модулировать воспалительное поведение макрофагов и подтверждает общую концепцию механо-иммуномодуляции в тканях, подвергающихся воздействию динамических сил, создаваемых гладкими мышцами. Данный метод особенно применим для исследователей, изучающих механобиологию, воспаление, тканевую инженерию, физиологию желудочно-кишечного тракта, развитие легких, фиброз и другие заболевания, при которых макрофаги подвергаются воздействию сложных механических микросред. При тщательной сборке, постоянной калибровке и непрерывном мониторинге пользователи могут обеспечить воспроизводимую работу биореактора и избежать распространенных ограничений данного метода.

Протокол

В протоколе описываются сборка и эксплуатация запатентованного40 система биореактора для исследований в области механо-иммуномодуляции. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблица материалов.

1. Культивирование клеток

  1. Культивируйте иммортализованные макрофаги костного мозга мыши (iBMDMs) в полной среде RPMI 1640 с добавлением 10% термоинактивированной FBS, 1% HEPES-буфера, 1% пирувата натрия и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 °C в атмосфере с 5% CO2.

2. Изготовление полидиметилсилоксана (ПДМС)

  1. Взвесьте и смешайте основу и отвердитель из набора силиконового эластомера в соотношении 10:1 (по массе).
  2. Перемешивайте смесь в течение 5 min для обеспечения однородности.
  3. Осторожно залейте смешанный PDMS в квадратную чашку Петри размером 100 mm x 15 mm, пока высота слоя PDMS не достигнет 3mm.
  4. Поместите чашки Петри с PDMS в эксикатор.
  5. Проведите дегазацию в вакууме в течение 1 h для удаления пузырьков воздуха.
  6. Извлеките PDMS из эксикатора и убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха.
  7. Перенесите неотвержденные мембраны из PDMS в предварительно разогретый до 60 ˚ C oven и отверждайте в течение 4 h.
  8. Извлеките мембраны из PDMS из oven и оставьте их охлаждаться на лабораторном столе на ночь.
  9. Через 18–24 h осторожно отделите отвержденные мембраны из PDMS от чашек Петри и вырежьте мембраны из PDMS размером 70 mm x 40 mm x 3 mm.

3. Стерилизация мембраны из ПДМС

  1. Внутри бокса биологической безопасности промойте мембраны из PDMS 70% этанолом и поместите их непосредственно на поверхность бокса биологической безопасности (БББ) (Дополнительная Рисунока 1).
  2. Стерилизуйте УФ-излучением в течение 10 min, затем перенесите мембрану из PDMS в чашку Петри диаметром 90 mm, не прошедшую специальную обработку для культивирования тканей, بحيث сторона, подвергавшаяся УФ-облучению, была обращена вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Берите мембрану из PDMS только за края и не перекрещивайте руки над мембраной из PDMS, чтобы снизить риск контаминации.
  3. Для экспериментов по перистальтике используйте мембраны из PDMS в их исходных размерах.
  4. Для условий статического культивирования разрежьте каждую мембрану из PDMS размером 70 mm x 40 mm на две равные половины по 35 mm x 40 mm.

4. Покрытие мембран из PDMS фибронектином

  1. Внутри БСК приготовьте достаточный объем стерильного раствора фибронектина в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) с концентрацией 0,5 mg/mL, чтобы добавить по 100 µL на каждую мембрану.
  2. Раздайте по 100 µL этого раствора для покрытия в центр каждой мембраны из PDMS, обеспечивая точное совпадение покрытой области с зоной контакта мембраны между PDMS и винтом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно распределить раствор тонким равномерным слоем.
  3. Оставьте покрытые мембраны из PDMS в культуральной чашке без крышки на 45 min для обеспечения адсорбции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите защитное стекло БСК открытым для поддержания непрерывного потока воздуха.
  4. Через 45 min аспирируйте остатки раствора фибронектина с каждой мембраны.
  5. Осторожно промойте мембраны 1 mL стерильного PBS.

5. Посев клеток iBMDM на мембрану из ПДМС

  1. При достижении конфлюэнтности 70%–80% обработайте трипсином клетки iBMDM, культивируемые в флаконе T25, чтобы отделить их от поверхности.
  2. Определите концентрацию клеток с помощью гемоцитометра и подготовьте суспензию клеток в среде с плотностью 100,000 cells/mL.
  3. На каждую мембрану из PDMS, покрытую фибронектином, нанесите по 1 mL подготовленной клеточной суспензии.
  4. Для каждого эксперимента используйте как минимум одну статическую мембрану и одну мембрану с перистальтическим воздействием, чтобы обеспечить параллельное сравнение условий.
  5. Поместите мембраны из PDMS с нанесенными клетками в увлажненный инкубатор при 37 °C с 5% CO2 минимум на 24 ч для обеспечения адгезии клеток как в статических, так и в перистальтических условиях (Дополнительный рисунок 1B).

6. Биореактор

  1. Изготовьте биореактор, используя файлы компьютерного проектирования (CAD) и спецификации, представленные в патенте на биореактор (US12522795)40, или приобретите предварительно собранный блок у авторов.

7. Сборка и калибровка схемы Arduino

  1. Сборка схемы
    1. Соберите схему управления на макетной плате, используя потенциометры, резисторы, транзисторы и токопроводящие провода, как показано на Дополнительном рисунке 2.
    2. Установите Arduino IDE на компьютер и создайте новый скетч.
    3. Установите скорость двигателя на 5 оборотов в минуту (RPM), а скорость перистальтического насоса — на 28 mL/min.
    4. Подключите плату Arduino к компьютеру через USB и загрузите код, представленный в Дополнительном файле 1, нажав кнопку Upload в IDE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Светодиод Arduino станет оранжевым во время загрузки и снова станет зеленым, когда будет готов к работе. После завершения загрузки Arduino автоматически запустит программу при подаче питания.
  2. Калибровка двигателя
    1. Запустите двигатель и подсчитайте количество оборотов за 1 min с помощью секундомера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте параметр скорости двигателя в коде Arduino, чтобы достичь 5 RPM.
    2. Повторно загружайте код после каждой корректировки до достижения требуемой скорости.
  3. Калибровка насоса
    1. Запустите насос на 30 s и измерьте массу собранной жидкости, чтобы подтвердить скорость потока 28 mL/min (~14 g за 30 s).
    2. Отрегулируйте потенциометр и повторите процедуру до тех пор, пока объем выработки за 30 s стабильно не приблизится к 14 g.
  4. После калибровки двигателя и насоса соедините их с блоком биореактора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Откалиброванный узел «двигатель–насос–биореактор» теперь готов к экспериментальному использованию (Рисунок 2).

Схема биореактора для культивирования макрофагов; визуализация и ПЦР-анализ результатов исследования клеток.
Рисунок 2: Схема сборки перистальтического биореактора и последующего анализа. Клетки iBMDM высевают на покрытую фибронектином мембрану из PDMS, которая размещается внутри биореактора. После 4 ч воздействия перистальтики или содержания в качестве статического контроля клетки собирают для последующего анализа, включая qPCR, иммунофлуоресцентное окрашивание и визуализацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

8. Сборка и настройка перистальтического биореактора

  1. Подготовка компонентов
    1. Соберите все необходимые компоненты, включая флакон со средой, крышку флакона, напечатанную на 3D-принтере верхнюю часть флакона, напечатанную на 3D-принтере верхнюю часть биореактора, напечатанное на 3D-принтере основание биореактора, напечатанный на 3D-принтере винтовой привод, стяжки (по три на один биореактор), переставные клещи, бокорезы, чашки для культивирования тканей диаметром 150 mm, силиконовую смазку и напечатанную на 3D-принтере опору для мотора. Перед помещением в бокс биологической безопасности (БББ) обработайте каждый предмет 70% этанолом.
    2. Поместите двигатель постоянного тока, перистальтический насос и дополнительный отрезок трубки насоса внутрь БББ.
    3. Закройте крышку БББ и включите УФ-излучение на 10 min для стерилизации всех компонентов (Supplementary Figure 1C).
  2. Проверка прикрепления и жизнеспособности клеток
    1. Осмотрите под микроскопом обе PDMS-мембраны (статическую и подвергнутую перистальтике) с посевом клеток. Подтвердите прикрепление >80% клеток на поверхностях PDMS, покрытых фибронектином, и оцените морфологию клеток для подтверждения их жизнеспособности.
    2. При необходимости сделайте репрезентативные снимки клеток перед сборкой.
  3. Подготовка статических контролей
    1. Аспирируйте 1 mL полной среды RPMI с каждой статической мембраны.
    2. Добавьте по 1 mL свежей полной среды RPMI к каждой мембране.
    3. Маркируйте чашки как «статические» и верните их в инкубатор.
  4. Сборка перистальтического биореактора
    1. Добавьте по 15 mL среды в каждый флакон, предназначенный для использования в биореакторе.
    2. Закройте флаконы со средой крышками, в которые вставлены напечатанные на 3D-принтере верхние части (содержащие входные/выходные порты). Отложите их в сторону (Supplementary Figure 1D).
    3. Соберите основание биореактора.
      1. Вставьте напечатанный на 3D-принтере винтовой привод в центральное отверстие основания биореактора.
      2. Установите двигатель постоянного тока в слот для мотора на основании биореактора.
      3. Убедитесь, что приводной вал мотора надежно зафиксирован в центральном отверстии напечатанного на 3D-принтере винтового привода.
      4. Установите держатель мотора в нужное положение для стабилизации двигателя.
  5. Поместите частично собранный биореактор в чашку для культивирования тканей диаметром 150 mm, чтобы облегчить перенос из БББ в инкубатор после завершения сборки (Supplementary Figure 1E).
  6. Нанесите тонкий слой силиконовой смазки на желобки винтового привода в местах контакта с PDMS-мембраной. Это обеспечит легкое вращение винта и снизит трение.
  7. Установка PDMS-мембраны с посевом клеток
    1. Осторожно перенесите PDMS-мембраны с посевом клеток для перистальтического режима из инкубатора в БББ.
    2. Аспирируйте среду с каждой мембраны и поместите мембрану в биореактор поверхностью с клетками вверх, напротив смазанного интерфейса винтового привода.
    3. Установите верхнюю часть биореактора так, чтобы выемка камеры для клеток совпадала с PDMS-мембраной. Вставьте верхнюю часть в направляющие желобки основания биореактора.
  8. Фиксация биореактора
    1. Зафиксируйте верхнюю и нижнюю части биореактора с помощью стяжек и бокорезов.
    2. Обрежьте излишки стяжек с помощью бокорезов.
  9. Подключение жидкостной системы и настройка установки
    1. Расположите перистальтический насос так, чтобы его металлический разъем был направлен в ту же сторону, что и разъем мотора.
    2. Подсоедините трубку насоса, ближайшую к биореактору, к входному порту на верхней части биореактора, расположенному ближе всего к мотору. Плотно наденьте трубку на входной патрубок.
    3. Погрузите противоположный конец этой трубки во флакон со средой.
    4. Используя дополнительный отрезок трубки насоса, подсоедините один конец к выходному патрубку верхней части биореактора, а другой конец поместите во флакон со средой выше уровня жидкости, чтобы обеспечить рециркуляцию без обратного потока (Supplementary Figure 1F).
  10. Инкубация и эксплуатация
    1. Поместите всю сборку биореактора (в чашке 150 mm) в инкубатор (Supplementary Figure 1G), оставив печатную плату/Arduino снаружи с подключением к сети питания.
    2. Подключите зажимы-«крокодилы»:
      1. Насос: «плюс» к «плюсу», «минус» к «минусу».
      2. Мотор: измените полярность в соответствии со схемой цепи.
    3. Поместите пустые стерильные чашки Петри в инкубатор для последующего сбора образцов.
    4. Дайте системе перистальтического биореактора проработать в течение 4 h (или в течение заданного времени) (Supplementary Figure 1H) при стандартных условиях культивирования в инкубаторе.

9. Демонтаж биореактора

  1. Откройте инкубатор и приподнимите входную трубку из флакона со средой, чтобы воздух мог попасть в систему и остатки среды полностью слились из биореактора.
  2. После прекращения потока среды отсоедините провода двигателя и/или насоса от печатной платы, чтобы остановить механическое движение.
  3. Перенесите всю сборку биореактора в ламинарный шкаф (BSC), снимите трубки, перережьте стяжки и снимите верхнюю часть биореактора.
  4. Аспирируйте остатки среды с мембраны из PDMS и перенесите мембрану обратно в ту же чашку Петри, которая использовалась при подготовке.
  5. Проверьте прикрепление и жизнеспособность клеток, оценив морфометрию клеток под микроскопом для культур клеток, затем при необходимости приступайте к последующим анализам.

10. Последующий анализ

  1. Сбор образцов для qPCR
    1. Внутри БСК промаркируйте микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 mL идентификаторами образцов, включая тип клеток и условия эксперимента.
    2. С помощью микроскопа для исследования культур клеток убедитесь в наличии клеток на PDMS как для статических условий, так и для условий перистальтики.
    3. Аспирируйте остатки среды с каждой мембраны PDMS.
    4. Свежеприготовьте буфер для лизиса РНК, добавив β-меркаптоэтанол в буфер RLT в соотношении 1:100.
    5. Добавьте 370 µL буфера RLT + β-меркаптоэтанола к каждой мембране PDMS для лизиса клеток.
    6. Используя стерильный скребок для клеток, осторожно, но плотно соскребите клетки с области посева на PDMS, чтобы отделить все клетки.
    7. Перенесите ~350 µL лизата в соответствующую пробирку объемом 1,5 mL.
    8. Приступите к экстракции РНК или храните образцы при -80 °C до дальнейшего использования.
    9. Проведите дезинфекцию БСК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с буфером RLT и β-меркаптоэтанолом должна осуществляться в соответствии с их соответствующими паспортами безопасности (SDS), а утилизация — в надлежащие контейнеры для отходов.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
    1. Добавьте 1 mL 4% параформальдегида (PFA) к каждой мембране и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 min.
    2. Аспирируйте PFA и утилизируйте его в специальный контейнер для опасных отходов.
    3. Добавьте 1 mL PBS к каждой мембране, чтобы удалить остатки фиксатора.
    4. Продолжите выполнение протокола иммунофлуоресцентного окрашивания, соответствующего целевым маркерам.

11. Очистка биореакторов и сопутствующих компонентов

  1. Обработайте спреем с 70% этанолом все компоненты биореактора, которые контактируют со средой, клетками или мембранами из PDMS, включая входные и выходные порты биореактора.
  2. Отососите остатки среды из флакона, затем промойте внутреннюю поверхность, обильно распылив 70% этанол и снова выполнив аспирацию.
  3. Извлеките все санитарно обработанные компоненты из бокса биологической безопасности (BSC) и поместите их в специально отведенную чистую зону.
  4. Для флаконов со средой:
    1. Очистите 20% раствором гипохлорита натрия, перемешайте круговыми движениями и слейте содержимое в раковину при включенной воде.
    2. Протрите разбавленным уксусом (1:10), вымойте с мылом и ультрачистой водой, затем ополосните 70% этанолом и высушите в перевернутом виде.
    3. Очистите крышки флаконов и вставки насоса 70% этанолом.
  5. Очистка перистальтических насосов
    1. Подготовьте стаканы объемом 250 mL с (1) 70% этанолом, (2) ультрачистой водой или (3) пустой емкостью для отходов.
    2. Подключите насос с трубками в замкнутом контуре подачи и подайте питание через плату управления Arduino.
    3. Запустите насос с 70% этанолом на 1 min, затем с ультрачистой водой на 1 min, сливая жидкость в пустой стакан для отходов.

Результаты

В данном протоколе представлена воспроизводимая методика определения того, как перистальтические механические силы непосредственно модулируют активацию макрофагов. До проведения экспериментов с биореактором подтверждали способность iBMDM надлежащим образом поляризоваться в ответ на стандартные биохимические стимулирующие условия. Следуя этому протоколу, мембраны из PDMS покрывали фибронектином и засевали iBMDM. Клеткам позволяли прикрепиться в течение 24 ч, после чего проводили визуальную проверку для подтверждения успешной адгезии, равномерного распределения по поверхности мембраны и жизнеспособности, о чём свидетельствовала неправильная морфология «жареного яйца», указанная в описании производителя (Рисунок 3A,B). Мембраны с плохой адгезией, неравномерным засевом или признаками отслоения клеток исключали из эксперимента, поскольку такие условия могут привести к нестабильной механической стимуляции и изменчивой последующей сигнализации. Успешно засеянные мембраны либо устанавливали в систему биореактора для подвержения перистальтической стимуляции, либо оставляли в качестве статических контрольных образцов. После 4 ч культивирования образцы повторно оценивали, чтобы подтвердить, что клетки остались прикреплёнными после механической стимуляции (Рисунок 3C,D). После подтверждения сохранения клеток во всех условиях проводили оценку активации макрофагов с помощью ОТ-ПЦР и иммунофлуоресцентного окрашивания.

Анализ qPCR был проведен для оценки изменений в экспрессии генов, ассоциированных с провоспалительным фенотипом М1, Il6, Nos2 и Cd40, а также генов, ассоциированных с фенотипом М2, Chil3 и Mrc1 (Таблица 1). Эти результаты показали, что перистальтическая стимуляция способствует активации макрофагов в направлении провоспалительного фенотипа. Перистальтическая культура значительно увеличила экспрессию Il6 в 50,9 раза по сравнению с неподвижными контролями (p < 0,0001, непарный t-тест) и экспрессию Nos2 в 19,8 раза (p = 0,0046, непарный t-тест) (Рисунок 4A). Экспрессия Cd40 также увеличилась в 7,7 раза, однако это изменение не было значимым (p = 0,1106, непарный t-тест) (Рисунок 4A). Напротив, значимых изменений в экспрессии Chil3 (1,22-кратное увеличение по сравнению с неподвижными контролями; p = 0,9726, непарный t-тест) или Mrc1 (1,16-кратное увеличение по сравнению с неподвижными контролями; p = 0,9810, непарный t-тест) не наблюдалось (Рисунок 4B). В совокупности эти данные указывают на то, что приложенные перистальтические силы избирательно способствуют провоспалительной активации макрофагов, а не альтернативным путям активации.

Для дальнейшей оценки поляризации макрофагов была проведена иммунофлюоресцентная окраска с использованием антител к пан-маркеру макрофагов F4/80 и либо к маркеру, ассоциированному с фенотипом М1, CD40 (Рисунок 5A), либо к маркеру, ассоциированному с фенотипом М2, YM1/YM2 (Рисунок 5B). Образцы дополнительно окрашивали DAPI и анализировали при одинаковых условиях регистрации изображений, чтобы обеспечить сопоставимость между различными условиями. Среднюю флуоресцентную интенсивность (MFI) количественно определяли для каждого маркера и нормализовали по соответствующему сигналу F4/80 в том же изображении. Перистальтические макрофаги показали нормализованную MFI CD40, равную 1,74 ± 0,72, что соответствует увеличению на 64,80% по сравнению со статическими контролями, хотя это увеличение не было статистически значимым (Рисунок 5C). Согласно данным qPCR, существенных изменений в нормализованной экспрессии YM1/YM2 после перистальтической стимуляции обнаружено не было, увеличение составило лишь 5% по сравнению со статическими контролями (Рисунок 5D). Эти типичные результаты демонстрируют, что данный протокол воспроизводимо индуцирует преимущественно провоспалительный ответ макрофагов исключительно за счёт механической стимуляции.

Сравнение дисперсии клеток в статических условиях и при перистальтике в 0 ч и 4 ч; анализ изображений под микроскопом.
Рисунок 3Светлопольные изображения демонстрируют визуальное подтверждение адгезии клеток до и после перистальтики. Светлое поле изображений клеток на мембранах из ПДМС в статических условиях (A,C) и перистальтика (Б, Dусловия до начала эксперимента в биореакторе (t = 0 ч) и после его завершения (t = 4 ч). Масштабные бары = 200 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Гистограмма экспрессии генов; кратность изменения в М1 и М2 при статических и перистальтических условиях
Рисунок 4Анализ экспрессии генов показывает провоспалительную активацию макрофагов через перистальтическая стимуляция Изменение экспрессии генов в разы для (Aмаркеры М1 Il6, Nos2 и Cd40, и (B) маркеры М2 Chil3 и Mrc1. *p < 0.05, ****p < 0,0001, ns = несущественно. Все данные представлены как среднее ± СО; n = 3 для каждой группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эксперимент по поляризации макрофагов; маркеры CD40, YM1/2, флуоресцентная микроскопия, диаграмма анализа данных.
Рисунок 5: Иммунофлуоресцентное окрашивание подтверждает провоспалительную активацию макрофагов после активации перистальтики. Представительные иммунофлуоресцентные изображения макрофагов, окрашенных на общий маркер макрофагов F4/80 (зелёный) и либо (A) маркеры M1 CD40 (розовый), либо (B) маркеры M2 YM1/YM2 (красный). Масштабные бары = 20 µм. (C) Количественная оценка средней флуоресцентной интенсивности (MFI) CD40, нормализованная к F4/80. (D) Количественная оценка MFI YM1/YM2, нормализованная к F4/80. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение; n = 3 для каждой группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ГенПраймерПоследовательность (5′–3′)
GapdhФAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GapdhРGGGGTCGTTGATGGCAACA
Chil3ФCAG GTC TGG CAA TTC TTC TGA A
Chil3РGTC TTG CTC ATG TGT GTA AGT GA
Nos2ФGGA GTG ACG GCA AAC ATG ACT
Nos2RTCG ATG CAC AAC TGG GTG AAC
Mrc1ФЦТЦ ТГТ ТЦА ГЦТ АТТ ГГА ЦГЦ
Mrc1RТГГ ЦАЦ ТЦЦ ЦАА АЦА ТАА ТТТ ГА
ИЛ-6ФТЦТАТАККАКТТЦАКААГТЦГГА
ИЛ-6РGAA TTG CCA TTG CAC AAC TCT TT
CD40ФTTGTTGACAGCGGTCCATCTA
CD40RGCCATCGTGGAGGTACTGTTT

Таблица 1: Последовательности праймеров для генов, анализируемых с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени.

Дополнительный рисунок 1: Рабочий процесс приготовления ПДМС, сборки биореактора и настройки перфузии. (А) Приготовление ПДМС в боксе биологической безопасности. (Б) Засевание клеток. (В) УФ-стерилизация компонентов биореактора. (Г) Сборка биореактора. (Д) Закреплённый биореактор. (Е) Подключение насоса. (Ж) Настройка инкубатора в момент 0 ч. (З) Настройка инкубатора через 4 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Схема биореактора с макетной платой, насосом, двигателем и проводкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Код Arduino для биореактора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Современные представления о том, как перистальтические силы влияют на функцию макрофагов, остаются ограниченными, несмотря на распространенность нарушений перистальтики при воспалительных заболеваниях. Хотя известно, что отдельные механические стимулы, такие как напряжение сдвига и циклическая деформация, модулируют активацию макрофагов, эффекты одновременного воздействия многоосевой деформации и потока жидкости, которые в совокупности составляют перистальтику, не были подробно изучены в контексте механобиологии макрофагов. Описанный здесь протокол предоставляет воспроизводимую платформу для изучения того, как эти комбинированные механические силы регулируют воспалительное поведение макрофагов в физиологически релевантных условиях. С помощью этой системы было продемонстрировано, что воздействие перистальтической стимуляции в течение 4 h способствует формированию преимущественно провоспалительного фенотипа макрофагов, характеризующегося значительно повышенной экспрессией Il6 и Nos2.

Важно отметить, что механочувствительность макрофагов сильно зависит от величины, частоты и продолжительности прилагаемого воздействия12,13,14. Предыдущие исследования изолированных механических стимулов показали, что состояния активации макрофагов существенно различаются в зависимости от этих параметров. Следовательно, в будущих исследованиях следует изучить более широкий диапазон условий перистальтики, включая измененные деформации и напряжения сдвига, а также увеличенное время механической стимуляции, чтобы точнее определить спектр ответов макрофагов, индуцированных механикой перистальтики. Кроме того, данное исследование было ограничено тем, что мы решили сосредоточиться на перистальтике как механическом воздействии, а не на напряжении сдвига жидкости или циклической деформации в отдельности. В будущих работах можно использовать эту платформу биореактора для изучения активации макрофагов в зависимости от различных механических воздействий с применением единого строгого подхода. Расширение этих исследований может помочь определить механические пороги, которые способствуют развитию либо воспалительного, либо прорегенераторного фенотипа в различных тканевых контекстах.

Механочувствительность макрофагов также сильно зависит от жесткости и топографии субстрата. Важно отметить, что жесткость PDMS, выбранного для данного исследования, может влиять на активацию макрофагов независимо от воздействия перистальтических сил15,16,17,18,19. Чтобы исключить влияние жесткости как переменной, мы сравнили макрофаги, подвергшиеся воздействию перистальтики, с макрофагами на PDMS аналогичной жесткости в статических условиях. В будущих исследованиях влияние жесткости можно будет контролировать еще более точно, изменяя соотношение компонентов PDMS, используя другие материалы для субстрата или культивируя макрофаги в стандартных чашках для 2D-культуры тканей для сравнения. Кроме того, хотя в данной работе мы не изменяли топографию PDMS, наше устройство позволяет изучать эту переменную в последующих исследованиях.

Основным преимуществом данного протокола является его адаптивность к широкому спектру исследований воспаления. Несмотря на то, что в данной работе используются иммортализованные макрофаги, полученные из костного мозга (iBMDMs), систему можно легко модифицировать для использования первичных макрофагов, моноцитов, резидентных макрофагов тканей или многоклеточных систем кокультивирования. Например, для более точного воспроизведения клеточного микроокружения желудочно-кишечного тракта, матки или мочеточников можно добавить эпителиальные, стромальные клетки или клетки гладких мышц. Кроме того, состав внеклеточного матрикса можно адаптировать под интересующую ткань, изменяя покрытие мембраны из PDMS. В данном исследовании фибронектин был необходим для поддержания адгезии iBMDM при перистальтической стимуляции, тогда как покрытия из коллагена I и коллагена IV приводили к существенному откреплению клеток. Однако оптимальные матриксовые покрытия могут различаться в зависимости от источника макрофагов или конфигурации кокультивирования. Следовательно, тщательная проверка адгезии клеток в рекомендованных контрольных точках имеет решающее значение для обеспечения воспроизводимости механической стимуляции и последующего анализа.

Для успешной реализации данного протокола крайне важен ряд технических аспектов, включая регулярное техническое обслуживание, которое помогает предотвратить наиболее распространенные сбои. Особое значение имеет правильная сборка и герметизация биореактора с помощью кабельных стяжек, так как недостаточная герметичность может привести к утечке среды, изменению профилей напряжения сдвига и деформации, риску контаминации или потере жизнеспособности клеток. Кроме того, насосы и двигатели требуют стабильной калибровки для обеспечения воспроизводимой перистальтической стимуляции, а регулярная промывка трубок насоса этанолом и ультрачистой водой предотвращает накопление остатков веществ. Наконец, перед помещением в биореактор необходимо проверить клетки, высеянные на мембраны из PDMS, на предмет надлежащей адгезии и достижения 80% конфлюэнтности. В совокупности эти меры по устранению неполадок и системные ограничения подчеркивают необходимость тщательной сборки, постоянной калибровки и непрерывного мониторинга для обеспечения воспроизводимой работы биореактора.

В целом, данный протокол представляет собой универсальную и физиологически релевантную платформу для изучения механо-иммуномодуляции в условиях сложных динамических механических воздействий. Обеспечивая одновременное приложение циклического многоосного растяжения и напряжения сдвига жидкости, эта система расширяет возможности традиционных моделей in vitro с воздействием одной силы и служит ценным инструментом для изучения воспаления в тканях, сокращение которых обеспечивается гладкими мышцами. Этот подход может найти широкое применение в исследованиях заболеваний желудочно-кишечного тракта, фиброза, рака и других патологий, при которых макрофаги подвергаются воздействию динамических механических микроокружений.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Национальным научным фондом (National Science Foundation), грант № 2440798. Рисунок 1 и Рисунок 2 были созданы с использованием лицензионной версии BioRender.com.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсин-ЭДТАFisher25200056
микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 млUSA Scientific1615-5510
чашки Петри 100 мм x 15 ммFisher50-190-0276
культуральные чашки диаметром 150 ммFisherFB012925
4% параформальдегидSanta Cruzsc-281692
культуральные чашки диаметром 90 ммFisherFB012923
антитела к F4/80, конъюгированные с Alexa Fluor 488Abcamab204266
антитело к CD40, конъюгированное с Alexa Fluor 647Abcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
Макетная платаAmazon
Буфер RLTQiagen79216
Клеточный скребокFisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
ЭксикаторMilliporeSigmaZ119008
БокорезыAmazon
Фетальная бычья сывороткаInnovative Biosciences11-01-500
ФибронектинMilliporeSigmaF1141-1MG
буфер HEPESFisher (Gibco)15630080
имБМДМ (иммунизированные костномозговые макрофаги мыши)Applied Biological Materials Inc. (abm)T0673
Двигатель RobotshopFT-SPARK16-360
антитело PE Anti-Ym-1 + Ym-2Abcamab211621
Пенициллин-стрептомицинФишер15140122
Перистальтический насосDigiKey1150
Фосфатно-солевой буферный растворFisher14190250
Филамент из ПЛАAmazonB0D7ZYCVTY
Потенциометр B1K 1 кОмAmazon‎B0CZ747F6F
RPMI 1640Fisher11875085
Силиконовая смазкаAmazonB000XBH9HI
Переставные клещиAmazon
Пируват натрияCytiva HycloneSH3023901
Набор силиконового эластомера Sylgard 184FisherNC9285739
культуральный флакон T-25Fisher229331
ТранзисторDigiKeyIRF520NPBF-ND
Провода/зажимы «крокодил»Amazon
Стяжки кабельные 18 дюймовAmazon
β-меркаптоэтанолFisherAC125472500

Ссылки

  1. Mass E, Nimmerjahn F, Kierdorf K, Schlitzer A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 2023;23(9):563-579.
  2. Kumar V, Kumar V. Macrophages: the potent immunoregulatory innate immune cells. In: Macrophage Activation - Biology and Disease. London: IntechOpen; 2019. doi:10.5772/intechopen.88013.
  3. Ross EA, Devitt A, Johnson JR. Macrophages: the good, the bad, and the gluttony. Front Immunol. 2021;12:708186.
  4. Sreejit G, Fleetwood AJ, Murphy AJ, Nagareddy PR. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 2020;9(12):e1222.
  5. Locati M, et al. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annu Rev Pathol. 2020;15:123-147.
  6. Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008;8(12):958-969.
  7. Boutilier AJ, Elsawa SF. Macrophage polarization states in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6995.
  8. Orecchioni M, Ghosheh Y, Pramod AB, Ley K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) versus classically and M2 (LPS−) versus alternatively activated macrophages. Front Immunol. 2019;10:1084.
  9. Huang X, Li Y, Fu M, Xin HB. Polarizing macrophages in vitro. Methods Mol Biol. 2018;1784:119-126.
  10. Gharavi AT, et al. The role of macrophage subtypes and exosomes in immunomodulation. Cell Mol Biol Lett. 2022;27(1):83.
  11. Peng Y, et al. Regulatory mechanism of M1/M2 macrophage polarization in the development of autoimmune diseases. Mediators Inflamm. 2023;2023:8821610.
  12. Clevenger AJ, Jha A, Moore E, Raghavan SA. Manipulating immune activity of macrophages: a materials and mechanics perspective. Trends Biotechnol. 2025;43(1):33-49.
  13. Khanmohammadi M, Mirzaalikhan Y, Baratchi S. Immunity in motion: the role of mechanics in macrophage biology. Cell Chem Biol. 2025;32(12). doi:10.1016/j.chembiol.2025.11.004.
  14. Adams S, et al. Mechano-immunomodulation: mechanoresponsive changes in macrophage activity and polarization. Ann Biomed Eng. 2019;47(11):2213-2231.
  15. Meizlish ML, et al. Mechanosensing regulates tissue repair program in macrophages. Sci Adv. 2024;10(11):adk6906.
  16. Lee M, Du H, Winer DA, Clemente-Casares X, Tsai S. Mechanosensing in macrophages and dendritic cells in steady-state and disease. Front Cell Dev Biol. 2022;10:1044729.
  17. Chen M, et al. Substrate stiffness modulates bone marrow-derived macrophage polarization through NF-κB signaling pathway. Bioact Mater. 2020;5(4):880-890.
  18. Blakney AK, Swartzlander MD, Bryant SJ. The effects of substrate stiffness on the in vitro activation of macrophages and in vivo host response to poly(ethylene glycol)-based hydrogels. J Biomed Mater Res A. 2012;100A(6):1375-1386.
  19. Sridharan R, Cavanagh B, Cameron AR, Kelly DJ, O'Brien FJ. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 2019;89:47-59.
  20. Previtera ML, Sengupta A. Substrate stiffness regulates proinflammatory mediator production through TLR4 activity in macrophages. PLoS One. 2015;10(12):e0145813.
  21. Song C, et al. Microfluidic three-dimensional biomimetic tumor model for studying breast cancer cell migration and invasion in the presence of interstitial flow. Chin Chem Lett. 2019;30(5):1038-1042.
  22. Li R, et al. Interstitial flow promotes macrophage polarization toward an M2 phenotype. Mol Biol Cell. 2018;29(16):1927-1940.
  23. Son H, et al. Shear stress induces monocyte/macrophage-mediated inflammation by upregulating cell-surface expression of heat shock proteins. Biomed Pharmacother. 2023;161:114566.
  24. Zhou H, Scatena M, Tu LN, Giachelli CM, Nigam V. Monocyte adhesion to and transmigration through endothelium following cardiopulmonary bypass shearing is mediated by IL-8 signaling. Front Cardiovasc Med. 2024;11:1454302.
  25. Jui E, et al. Shear stress induces a time-dependent inflammatory response in human monocyte-derived macrophages. Ann Biomed Eng. 2024;52(11):2690-2705.
  26. Castro-Núñez L, Dienava-Verdooold I, Herczenik E, Mertens K, Meijer AB. Shear stress is required for the endocytic uptake of the factor VIII-von Willebrand factor complex by macrophages. J Thromb Haemost. 2012;10(9):1929-1937.
  27. Cheng C, et al. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 2006;113(23):2744-2753.
  28. Seneviratne AN, et al. Low shear stress induces M1 macrophage polarization in murine thin-cap atherosclerotic plaques. J Mol Cell Cardiol. 2015;89(Pt B):168-172.
  29. Bonito V, de Kort BJ, Bouten CVC, Smits AIPM. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Eng Part A. 2019;25(17-18):1312-1325.
  30. Ballotta V, Driessen-Mol A, Bouten CVC, Baaijens FPT. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 2014;35(18):4919-4928.
  31. Dziki JL, et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Eng Part A. 2018;24(1-2):128-139.
  32. Wehner S, et al. Mechanical strain and TLR4 synergistically induce cell-specific inflammatory gene expression in intestinal smooth muscle cells and peritoneal macrophages. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010;299(5):G1187-G1197.
  33. Clevenger AJ, et al. Rapid prototypable biomimetic peristalsis bioreactor capable of concurrent shear and multiaxial strain. Cells Tissues Organs. 2023;212(1):57-72.
  34. Huizinga JD. Gastrointestinal peristalsis: joint action of enteric nerves, smooth muscle, and interstitial cells of Cajal. Microsc Res Tech. 1999;47(4):239-247.
  35. Kunz G, Leyendecker G. Uterine peristaltic activity during the menstrual cycle: characterization, regulation, function and dysfunction. Reprod Biomed Online. 2002;4(Suppl 3):5-9.
  36. Hosseini G, et al. A computational model of ureteral peristalsis and an investigation into ureteral reflux. Biomed Eng Lett. 2018;8(1):91-101.
  37. Clevenger AJ, et al. Peristalsis-associated mechanotransduction drives malignant progression of colorectal cancer. Cell Mol Bioeng. 2023;16(4):315-330.
  38. Leyendecker G, Kunz G, Wildt L, Beil D, Deininger H. Uterine hyperperistalsis and dysperistalsis as dysfunctions of the mechanism of rapid sperm transport in patients with endometriosis and infertility. Hum Reprod. 1996;11(7):1542-1551.
  39. Iwakiri K, et al. Mechanisms underlying excessive esophageal acid exposure in patients with gastroesophageal reflux disease. Esophagus. 2017;14(3):213-218.
  40. Raghavan S, Crawford LZ. 3D rapid prototypable tunable peristalsis bioreactor. United States patent. 2022: US12522795.

Перепечатки и разрешения

Теги

Bioengineeringperistalsismacrophagesinnate immunitymechanobiology
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.