Методическая статья

Измерение восстановления двухцепочечных разрывов ДНК с помощью анализа DR-white у Drosophila melanogaster

58 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72635

⸱

14 августа 2026 г.

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

В этой статье

Краткое содержание

Анализ DR-white представляет собой универсальный генетический репортерный анализ для определения результатов репарации двухцепочечных разрывов ДНК у многоклеточного организма Drosophila melanogaster.

Аннотация

Традиционные исследования репарации двухцепочечных разрывов (DSB) ДНК часто ограничиваются биохимическими исследованиями или одноклеточными системами (например, культурами клеток или дрожжами). Для облегчения изучения репарации DSB в многоклеточном организме мы используем анализ DR-white на Drosophila melanogaster. Анализ DR-white представляет собой простой, но универсальный репортерный анализ репарации DSB, содержащий одну последовательность распознавания I-SceI, которая может быть расщеплена при экспрессии мегануклеазы I-SceI. Экспрессия I-SceI может индуцироваться конститутивно, посредством теплового шока или под контролем других промоторов, что позволяет исследовать репарацию, специфичную для конкретных тканей или стадий развития. Основным преимуществом данного анализа является способность различать результаты репарации, включающие гомологичную рекомбинацию (HR), негомологичное соединение концов (NHEJ) и отжиг одноцепочечных участков (SSA). В данной статье приводится подробный протокол установленного анализа DR-white, включая пошаговый рабочий процесс индуцирования DSB в премейотической зародышевой линии и фенотипического анализа событий репарации путем подсчета потомства. Также описывается молекулярный анализ событий репарации с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), секвенирования и R-скрипта Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). Данный протокол предоставляет полезный инструмент для изучения генетических и молекулярных механизмов репарации ДНК на организменной модели.

Введение

Геномная целостность часто нарушается повреждениями ДНК, среди которых особенно токсичны двухцепочечные разрывы (DSBs). Если эти разрывы остаются невосстановленными, они могут привести к потере генетического материала, хромосомным перестройкам и гибели клеток1. Таким образом, в клетках развилось несколько путей репарации DSBs. Негомологичное соединение концов (NHEJ) напрямую лигирует два конца DSB, что может привести к возникновению инделей в месте разрыва; одноцепочечный отжиг (SSA) использует комплементарные последовательности, фланкирующие место разрыва, для репарации, что приводит к делециям в месте разрыва; в то время как гомологичная рекомбинация (HR) использует гомологичную последовательность в качестве матрицы для репарации2,3.

Исторически исследования репарации двухцепочечных разрывов (DSB) ограничивались биохимическими анализами4 или одноклеточными системами, такими как бактерии5,6, дрожжи7,8 и культуры клеток млекопитающих9,10. Хотя эти модели сыграли важную роль в идентификации основных белков репарации и механизмов их действия, им не хватает биологической сложности многоклеточного организма. Drosophila melanogaster стала популярной многоклеточной модельной системой для изучения репарации ДНК. Однако многие современные методы анализа адаптированы под конкретные пути репарации11, используют крупные хромосомные aberrations, такие как эксцизия P-элемента12, или требуют длительного молекулярного анализа13. Тест DR-white решает эти проблемы, предоставляя простой генетический репортер репарации ДНК у Drosophila14. Данная работа представляет полный, практический и детальный пошаговый протокол проведения генетических и молекулярных анализов для измерения репарации DSB ДНК с использованием общепринятого теста DR-white.

В данном анализе используются два прямых повтора Дрозофила белый (вген, который обеспечивает красный цвет глаз дикого типа (Рисунок 1). Обе копии нефункциональны: первая, Sce.whiteсодержит вставку, которая несет последовательность распознавания мегануклеазы I-SceI в сайте дикого типа SacI и вводит преждевременный стоп-кодон; второй iwhiteобрезан с обоих концов (5’- и 3’-концов) и служит матрицей для гомологичной рекомбинации (HR). А Drosophila желтый трансген (у+), который обеспечивает коричневый цвет тела дикого типа, присутствует между двумя белый повторы. Поскольку DR-белый кассета интегрирована в y w мутантный фон, DR-белый мухи имеют фенотип дикого типа по цвету тела (коричневый) и являются мутантами по цвету глаз (белые).

Двуцепочечные разрывы (DSBs) могут быть индуцированы в Sce.white путем скрещивания мух DR-white с мухами, несущими трансген I-SceI. Репарацию DSBs в премейотической зародышевой линии можно измерить путем анализа потомства при тестовом скрещивании. Репарация путем негомологичного соединения концов (NHEJ) приводит к родительскому фенотипу с коричневым телом и белыми глазами (Рисунок 1A), тогда как репарация путем гомологичной рекомбинации (HR) восстанавливает последовательность white дикого типа и приводит к появлению потомства с коричневым телом и красными глазами (Рисунок 1B). Репарация DSB путем одноцепочечного отжига (SSA) или митотический кроссинговер приводят к потере интервенционного трансгена yellow, в результате чего получаются мухи с желтым телом и белыми глазами (Рисунок 1C). Для анализа результатов репарации в соматических клетках мы адаптировали алгоритм Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) специально для обнаружения NHEJ с процессингом и репарации HR в анализе DR-white15,16.

Анализ DR-white обладает несколькими преимуществами по сравнению с ранее разработанными методами анализа репарации ДНК у Drosophila. Поскольку разрывы возникают и восстанавливаются в зародышевой линии, результаты репарации можно легко определить с помощью фенотипического анализа. В то же время этот метод чрезвычайно универсален. Хотя анализ в первую очередь предназначен для измерения гомологичной рекомбинации (ГР), он позволяет обнаружить все три пути репарации. Нами также были разработаны два дополнительных функциональных шаблона для репарации (Рисунок 2). Шаблон iwhite.mu содержит 28 молчащих однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и приводит к появлению потомства с красными глазами (Рисунок 2A), что облегчает изучение длины тракта генной конверсии (GCT) и ГР-репарации между дивергировавшими последовательностями14. Шаблон iwhiteΔ9 содержит делецию в девять пар оснований в сайте рестрикции SacI дикого типа, что приводит к появлению потомства с оранжевыми глазами (Рисунок 2B). Эта особенность позволяет исследователям отслеживать ГР-репарацию с различных шаблонов, что является уникальной характеристикой анализа DR-white15.

Протокол

1. Анализ DR-white

  1. Генетические скрещивания (Рисунок 3A)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные протоколы культивирования и генетики Drosophila приведены в работе "Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics" автора Ralph J. Greenspan17. Информация о генотипах линий представлена в Таблице материалов.
    1. Содержите мух при 25 °C с 12-часовыми циклами свет/темнота на стандартном корме для Drosophila, посыпанном активными дрожжами.
    2. Подготовьте пять пробирок для теплового шока, скрестив 8–10 девственных самок DR-white с 3–5 самцами, несущими трансген I-SceI (Скрещивание 1, Рисунок 3A), в каждой пробирке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целей можно использовать различные трансгены I-SceI. В данном протоколе для индукции тепловым шоком использовался трансген hsp70-I-SceI11. Чтобы предотвратить «подтекающую» экспрессию I-SceI в предыдущих поколениях, важно следить за тем, чтобы DR-white и трансгены I-SceI объединялись в одной мухе только в этом поколении.
    3. В тот же день подготовьте флаконы для наращивания линии y w. Они будут служить тестерными мухами. Трех флаконов достаточно примерно для 60–80 тестерных скрещиваний.
    4. Культивируйте пробирки для теплового шока и флаконы для наращивания y w при 25 °C в течение 3 дней.
    5. На третий день пересадите мух из пробирок для теплового шока и флаконов y w на свежий корм для создания резервного набора.
  2. Тепловой шок / индукция DSB
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если не используется индуцибельный тепловым шоком трансген I-SceI, перейдите к шагу 1.2.5, который обычно выполняется через 3 дня после шага 1.1.5.
    1. Выдержите пробирки для теплового шока в течение 3 ч при 25 °C, чтобы все потомство прошло через материнско-зиготический переход.
    2. Подвергните оригинальные пробирки тепловому шоку в водяной бане при 38 °C в течение 1 ч. Убедитесь, что уровень воды как минимум достигает нижней части ватного тампона, чтобы личинки не могли выбраться выше уровня воды.
    3. Контролируйте температуру водяной бани каждые 15 мин и поддерживайте ее в пределах 38 ± 0.5 °C, так как результаты индукции и репарации зависят от продолжительности и температуры теплового шока.
    4. Верните пробирки при 25 °C.
    5. На следующий день добавьте в корм 1/3 сложенной лабораторной салфетки для поглощения избыточной влаги. Если корм сухой, добавьте на салфетку примерно 100 µL воды. Добавьте ватный тампон во флаконы для наращивания y w.
    6. Культивируйте пробирки после теплового шока еще 6 дней при 25 °C или до начала вылета мух.
    7. Очистите резервные пробирки и флаконы для наращивания через 3 дня после пересадки. Добавьте ватный тампон в резервные флаконы y w примерно через 4 дня после очистки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости резервные пробирки можно подвергнуть тепловому шоку, как описано в шагах 1.2.1–1.2.6, и обработать далее согласно инструкции.
  3. Тестерные скрещивания
    1. Соберите мух после теплового шока, несущих трансгены DR-white и I-SceI, в течение 4–5 дней после начала вылета, чтобы уменьшить смещение, связанное со стадией развития.
      ПРИМЕЧАНИЕ: У успешно подвергнутых тепловому шоку мух, несущих DR-white и трансген I-SceI, наблюдаются мозаичные глаза из-за событий репарации на эмбриональной и личиночной стадиях, которые перешли в ткани взрослой особи. Степень мозаичности не всегда коррелирует с событиями репарации в зародышевой линии, поэтому она не должна быть определяющим фактором при выборе экспериментальных мух для тестерных скрещиваний (шаг 1.3.3).
    2. Соберите девственных самок y w в течение 5 дней. Собирайте по 5 девственных самок на каждое ожидаемое количество образцов. Собирайте их из резервных флаконов для наращивания сразу после начала вылета.
    3. Подготовьте тестерные пробирки, скрестив одного самца после теплового шока с 4–5 девственными самками y w (Скрещивание 2; Рисунок 3A). Выбирайте самцов случайным образом из общего сбора, полученного на шаге 1.3.1, чтобы уменьшить смещение, связанное со стадией развития. Культивируйте тестерные скрещивания при 25 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать кроссинговера между DR-white и I-SceI, чаще всего анализируют зародышевую линию самцов; однако можно анализировать и женское потомство. При анализе женского потомства тестерные пробирки Скрещивания 2 подготавливают в соотношении самок к самцам y w как 2:5 и культивируют в течение 5–6 дней (следующий шаг) для обеспечения продуктивности.
    4. Проверьте продуктивность через 4 дня после подготовки тестерных пробирок, чтобы определить время их очистки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что отложено достаточно яиц, чтобы получить не менее 20 пригодных для подсчета особей потомства, но не допускайте чрезмерного разрастания культур, иначе мухи могут застрять в корме.
    5. Когда тестерные пробирки будут готовы (через 4–5 дней после установления тестерных скрещиваний), удалите мух и добавьте в корм 1/3 сложенной лабораторной салфетки для поглощения избыточной влаги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно собрать самцов, если требуется дальнейший анализ (например, молекулярное генотипирование).
    6. Культивируйте тестерные пробирки еще 5–6 дней при 25 °C.
  4. Подсчет и оценка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого условия в каждом генетическом эксперименте (например, гомозиготные мутанты и гетерозиготные контроли) подготавливают примерно 25 тестерных пробирок. Каждый генетический эксперимент повторяют 2–3 раза, а данные по отдельным пробиркам объединяют.
    1. Проведите оценку потомства Скрещивания 2 (Рисунок 3A) в течение примерно 9 дней после появления первых вылетевших мух.
    2. Анестезируйте мух с помощью CO2 или путем переноса мух в пустую пробирку без корма и замораживания при -20 °C в течение не менее 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мухи заморожены, их можно оценивать в течение нескольких дней.
    3. Поместите мух на планшет для мух и оцените соответствующие фенотипы (Рисунок 3A). В набор данных включайте только те пробирки, в которых было оценено не менее 20 мух.
      1. Для оценки сначала отберите мух, несущих кассету DR-white (используя флуоресценцию красного флуоресцентного белка [RFP+] в качестве маркера), затем оцените цвет глаз и тела.
      2. Трансген y+, связанный с кассетой DR-white, приводит к промежуточному коричневому цвету тела, который не является полностью диким типом. Чтобы отличить отсутствие DSB/NHEJ (коричневое тело;  y+ w-) от SSA (желтое тело;  y- w-), сравните мух с потомством y w, не имеющим хромосомы DR-white (RFP-). События SSA будут иметь такой же желтый окрас, как и эти мухи. Мух, которые темнее (более коричневые), чем эти, оценивайте как «отсутствие DSB/NHEJ».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отклонения от фенотипов, описанных на Рисунке 3A , могут указывать на контаминацию, и такая пробирка не должна оцениваться. Хотя можно оценивать целых мертвых мух, поврежденных мух следует отбрасывать, если невозможно определить фенотип.

2. Анализ TIDE (Рисунок 4)

  1. Экстракция геномной ДНК (гДНК)18
    1. Соберите подвергнутых тепловому шоку мух (или личинок), несущих обе DR-белый и I-SceI трансген, например, у потомства Скрещивания 1 (Рисунок 3A).
    2. Поместите по одной мухе в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и подвергните быстрому замораживанию (например, в бане с сухим льдом и этанолом или в жидком азоте).
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с сухим льдом, жидким азотом, этанолом, изопропанолом и другими химическими веществами используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и соблюдайте установленные в учреждении правила техники безопасности.
      ТОЧКА ПРИОСТАНОВКИ:  Образцы можно хранить при температуре -80 °C °С и при необходимости обработать позже. При анализе мух или личинок используйте одну муху или личинку на пробу. При анализе более мелких тканей (например, головного мозга, имагинальных дисков) объединяйте образцы для увеличения выхода ДНК.
    3. Гомогенизируйте каждый образец в 50 µл буфера А (100 мМ Tris-Cl, pH 7,5; 100 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА]; 100 мМ хлорида натрия; 0,5% додецилсульфата натрия [SDS]) с использованием электрического гомогенизатора.
    4. Инкубируйте образцы на водяной бане при 65°C °инкубировать при температуре C в течение 30 мин.
    5. Добавьте 100 µл буфера B (1,4 М ацетата калия, 4,3 М хлорида лития) в каждый образец и осторожно перемешайте, переворачивая пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании целых мух для полной гомогенизации образцов могут потребоваться бóльшие объемы. В этом случае соблюдайте объемное соотношение буфера А к буферу Б как 1:2.
    6. Инкубируйте образцы на льду не менее 30 минут.
    7. Центрифугируйте образцы при ускорении приблизительно 16 000 x г в течение 15 мин при 4°C °С.
    8. Перенос 125 µл осветленного супернатанта в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Избегайте попадания любого осадка.
    9. Добавить 100 µл 100% изопропанола комнатной температуры на каждые 125 µл супернатанта и осторожно перемешайте, переворачивая пробирки.
    10. Центрифугируйте образцы при ускорении примерно 16 000 x г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    11. Отоберите супернатант, стараясь не повредить осадок ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе осадок ДНК может быть не виден. Запомните положение пробирок при их установке в микроцентрифугу и производите аспирацию с противоположной стороны от предполагаемого местоположения осадка.
    12. Промойте осадки 250 мкл µмл ледяного 70% этанола, затем осторожно перемешайте, несколько раз перевернув пробирки.
    13. Центрифугируйте образцы при ускорении приблизительно 16 000 x г в течение 5 мин при 4°C °C.
    14. Аспирируйте супернатант, стараясь не задеть осадок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осадок может стать более заметным после промывки этанолом. Если это не так, см. Примечание для этапа 2.1.11.
    15. Оставьте пробирки открытыми при комнатной температуре для испарения остатков этанола. Избегайте чрезмерного высушивания осадка, иначе он может раствориться не полностью.
    16. Добавьте 20 µл воды, свободной от нуклеаз, и оставить осадки для реконституции на ночь при 4 °C °С.
      МОМЕНТ ОСТАНОВКИ: Если осадок ДНК растворился не полностью, можно добавить дополнительное количество воды.
    17. На следующий день осторожно переверните пробирки и измерьте концентрацию ДНК. Храните образцы при температуре -20°C. °Хранить при температуре -80°C, если образцы не будут обработаны немедленно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При экстракции из одной мухи выход обычно составляет приблизительно 100 нг/µL. Важное значение имеет высокое качество образцов. A260/A280 оптическая плотность должна находиться в пределах от 1,7 до 2,0. Значения вне этого диапазона указывают на наличие таких загрязнений, как белки. A260/A230 значение должно находиться в пределах от 2,0 до 2,2. Значения вне этого диапазона указывают на наличие таких загрязнений, как этанол и соли буфера. Образцы с низким выходом и плохим качеством могут привести к плохой амплификации при ПЦР.
  2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
    1. Амплифицировать по всей длине Sce.white методом ПЦР с использованием 100 нг гДНК и праймеров DR-белый_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) и DR-белый_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) в соответствии с инструкциями производителя. Включите DR-белый контрольный образец мух (т. е. DR-белый родительское стадо, без I-SceI трансген присутствует). Используйте следующие условия циклирования: 94 °С в течение 3 мин; {94 °С в течение 30 с; тачдаун при 66 °C (-0,5 °°C / цикл) в течение 30 с; 72 °C в течение 30 с} x 16 циклов; {94 °центрифугирование в течение 30 с; 58 °центрифугирование в течение 30 с; 72 °°C в течение 30 с} x 20 циклов; 72 °С в течение 5 мин; выдержка при 12 °С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другого реагента может потребоваться корректировка условий циклирования.
    2. Запустите приблизительно 2 µл ПЦР-продукта в 1% трис-ацетат-ЭДТА (TAE)-агарозном диагностическом геле для подтверждения амплификации Sce.белыйОжидаемый размер ампликона составляет приблизительно 1,7 т.п.н.
    3. Очистка продуктов ПЦР Sce.white ампликоны и измерить концентрацию ДНК.
    4. Проведите секвенирование очищенного ПЦР-продукта с использованием праймера DR-белый_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы секвенируем 40 нг очищенного ПЦР-продукта, однако это количество может варьироваться в соответствии с инструкциями сервиса по секвенированию.
  3. Анализ TIDE
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство ошибок, возникающих при использовании R-скрипта TIDE, обусловлены неправильным форматированием кода.
    1. Загрузите необходимые пакеты R (а именно sangerseqR и Biostrings) с сайта Bioconductor.org. Используйте строку поиска, чтобы найти последние версии каждого пакета.
    2. Проанализируйте хроматограммы последовательностей, чтобы убедиться в их высоком качестве. Анализируйте только те хроматограммы, на которых отсутствует или минимально выражен фоновый шум перед сайтом разрыва.
    3. Загрузите файлы трасс секвенирования (с расширением .ab1) и поместите их в одну папку на компьютере. Максимально упростите названия файлов (например, F1, Het2, Hom3), чтобы облегчить редактирование скрипта на последующих этапах.
    4. Откройте скрипт TIDE на языке R (Дополнительный файл 1) в интегрированной среде разработки (IDE) RStudio (см. Таблица материалов). В области «Источник» (Source) найдите строку, начинающуюся со слова Control <- (Дополнительный файл 2А) и введите имя файла контрольной последовательности точно так же, как оно было сохранено, включая расширение .ab1, в кавычках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: «контрольная последовательность» — это последовательность ПЦР родительской линии DR-белый сток без I-SceI трансген или индукция.
    5. Найдите строку, начинающуюся с samplename <- введите c( и перечислите имена файлов последовательностей для каждого образца внутри скобок (Дополнительный файл 2A). Укажите расширение .ab1, заключите каждое имя файла в отдельные кавычки и разделите имена файлов запятыми.
    6. Сохраните отредактированный файл R-скрипта TIDE в ту же папку, где находятся последовательности для анализа. Используйте простое имя файла, чтобы избежать ошибок на последующих этапах.
    7. В IDE перейдите в папку TIDE с помощью вкладки Files в области Output (Дополнительный файл 2B).
    8. Нажмите на Подробнее разверните список и выберите Открыть новый терминал здесь (Дополнительный файл 2C). В области консоли (внизу слева) откроется новый терминал.
    9. В только что открытом терминале введите «R» и нажмите Введите (Дополнительный файл 2D).
    10. После запуска R в терминале выполните R-скрипт TIDE, введя команду source("TIDE_анализ.R") и нажмите Введите (Дополнительный файл 2E). Терминал запустит скрипт и создаст графическое представление (Дополнительный файл 2F) и файл в формате .csv, содержащий необработанные данные для каждого образца (Дополнительный файл 2G и Дополнительный файл 3). Выходные файлы сохраняются в той же папке, что и R-скрипт и файлы последовательностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При повторном запуске того же R-скрипта любые созданные новые файлы .csv перезапишут старые. Если вы проводите несколько анализов с использованием одних и тех же файлов, создайте копию папки.
    11. Проанализируйте данные, открыв каждый файл формата .csv.
      1. Интерпретируйте необработанные данные как доли инделей в исследуемой последовательности. Гомологичная рекомбинация (генная конверсия) из последовательности распознавания I-SceI в последовательность дикого типа SacI приводит к канонической делеции 23 п.н.; скрипт выводит это значение HR в отдельной строке в нижней части результатов (Дополнительный файл 2G). Значение «0-индель» соответствует отсутствию двухцепочечного разрыва (ДЦР) или протеканию негомологичного соединения концов (НСК) без образования инделей. Сложите все остальные значения инделей, чтобы определить количество НСК с переработкой концов. Сумма НСК с переработкой концов и гомологичной рекомбинации (ГР) представляет собой общее число регистрируемых событий репарации ДЦР.
      2. Рассчитайте доли путей репарации среди детектируемых событий репарации двухцепочечных разрывов (ДЦР), используя следующие уравнения:
        Доля NHEJ с процессингом = (NHEJ с процессингом) / (NHEJ с процессингом + HR)
        Доля HR = (HR) / (NHEJ с процессингом + HR)
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого условия в каждом генетическом эксперименте (например, для гомозиготных мутантов и гетерозиготных контролей) используется примерно 10–15 образцов. Каждый генетический эксперимент повторяют 2–3 раза, после чего индивидуальные данные объединяют.

Результаты

Drosophila необходимость Rad51 для репарации путем гомологичной рекомбинации

Успешные эксперименты по анализу зародышевой линии дают ожидаемые фенотипические классы, показанные на Рисунке 3A, и не менее 20 оцениваемых потомков на пробирку. Неожиданные фенотипы или наличие менее 20 оцениваемых потомков указывают на контаминацию или недостаточную продуктивность; такие образцы следует исключить, как указано в шаге 1.4.3. Для анализа TIDE успешные образцы дают ампликон размером примерно 1,7 kb и хроматограммы с минимальным фоном до сайта разрыва; ДНК с низким выходом или контаминацией, а также зашумленные хроматограммы являются субоптимальными и не подлежат анализу.

При использовании анализа DR-white с теплошоковым индуцибельным источником I-SceI частота репарации путем гомологичной рекомбинации (ГР) у мух дикого типа составляет 38,5 ± 1,2% (среднее ± SEM), тогда как синтез-зависимый от одноцепочечного отжига (SSA) происходит примерно в 3,2 ± 0,35% случаев (Рисунок 3B и Дополнительный файл 4). Rad51 (кодируемый гомологом spnA у Drosophila) необходим для этапа инвазии цепи при гомологичной рекомбинации14,19. Таким образом, потеря Rad51 должна привести к неэффективности ГР. Действительно, на фоне DmRad51-/- репарация путем ГР снижается до 1,3 ± 0,4% с сопутствующим увеличением репарации путем SSA (34,5 ± 1,8%; Рисунок 3B и Дополнительный файл 4)14. Вероятнее всего, это связано с тем, что события репарации, предназначенные для гомологичной рекомбинации, альтернативно восстанавливаются путем одноцепочечного отжига повторяющихся последовательностей white.

Drosophila вклад CtIP в эффективную репарацию посредством гомологичной рекомбинации в соматических тканях

Алгоритм TIDE позволяет измерить выбор пути репарации в соматических клетках. В отсутствие мутаций NHEJ с процессингом происходит в 59,0% детектируемых событий репарации, а HR — в 41,0% (Рисунок 4B и Дополнительный файл 4). CtIP играет важную роль в инициации HR-репарации, стимулируя резекцию концов ДНК20. Соответственно, на фоне DmCtIP-/- выбор пути HR в соматических клетках заметно снижается: с 41,0% в гетерозиготных контролях до 10,9% в гомозиготных мутантах (Рисунок 4B и Дополнительный файл 4)16. Это позволяет предположить, что у Drosophila CtIP способствует HR-репарации, но не является для нее незаменимым.

Схема анализа DR-white, демонстрирующая пути репарации ДНК; методы HR, NHEJ, SSA с элементами гена Sce.white.
Рисунок 1: Репортерный анализ DSB DR-white и результаты репарации. Анализ Direct Repeat of white содержит две нефункциональные копии гена white: Sce.white (с вставкой 23 bp, содержащей сайт распознавания I-SceI и вводящей преждевременный стоп-кодон) и iwhite (5′- и 3′-усеченная донорная последовательность). Скрещивание мух, несущих DR-white и трансген I-SceI, приводит к возникновению сайт-специфического DSB, который можно анализировать фенотипически или молекулярно. Полученные фенотипы: (A) потомство с белыми глазами (y+ w−), что указывает на отсутствие DSB, интерсестерную HR или NHEJ; (B) потомство с красными глазами (y+ w+), что указывает на интрахромосомную HR, восстанавливающую последовательность SacI дикого типа из донора iwhite; и (C) потомство с желтым телом и белыми глазами (y− w−), что указывает на SSA или митотический CO. Рисунок адаптирован из Do et al.14. Сокращения: CO = кроссинговер; DR-white = Direct Repeat of white; DSB = двухцепочечный разрыв; HR = гомологичная рекомбинация; NHEJ = негомологичное соединение концов; SSA = одноцепочечный отжиг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема редактирования генов: гомологичная рекомбинация, расщепление I-SceI, DR-white.mu, ДНК, iwihiteΔ9, сайты SacI.
Рисунок 2: Производные анализа DR-white. (A) Анализ DR-white.mu содержит 28 синонимичных SNP в донорной последовательности iwhite.mu, что создает расхождение последовательностей в 1,4% между прямыми повторами. Конверсия генов отдельных полиморфизмов варьирует между событиями HR и может быть определена путем секвенирования. (B) DR-white с донором iwhiteΔ9 позволяет отличить межгомологичную рекомбинацию от внутрихромосомной. HR с внутрихромосомного донора iwhite восстанавливает последовательность дикого типа SacI и приводит к появлению потомства с красными глазами. HR с межгомологичного донора iwhiteΔ9 приводит к появлению потомства с оранжевыми глазами, так как делеция в 9 bp снижает экспрессию white. Рисунок адаптирован из работ Do et al.14 и Fernandez et al.15. Сокращения: DSB = двуцепочечный разрыв; HR = гомологичная рекомбинация; SNP = однонуклеотидный полиморфизм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Пути репарации генов Drosophila, диаграмма генетических скрещиваний, анализ распределения потомства на столбчатой диаграмме.
Рисунок 3: Экспериментальный рабочий процесс для определения результатов репарации DSB в премейотической зародышевой линии. (A) Скрещивание 1 объединяет репортер DR-white (или его производное) с трансгеном I-SceI (в данном примере — во второй хромосоме). Потомство, содержащее как тест DR-white, так и трансген I-SceI, сохраняет события репарации в зародышевой линии и соматических тканях. Для анализа отдельных событий репарации в премейотической зародышевой линии потомство, несущее оба трансгена, скрещивают с тестерными мухами y w (Скрещивание 2), и потомство оценивают, как описано на Рисунке 1. (B) Отдельные события репарации DSB в зародышевой линии у мух дикого типа (n = 106 зародышевых линий) и гомозиготных мутантов по DmRad51 (n = 46 зародышевых линий). **P < 0.01; ****P < 0.0001 по результатам двухфакторного ANOVA с последующим множественным сравнением по тесту Сидака. Столбцы представляют средние значения; планки погрешностей представляют SEM. Данные были повторно проанализированы из работы Do et al.14. Сокращения: ANOVA = дисперсионный анализ; CO = кроссинговер; DSB = двухцепочечный разрыв; HR = гомологичная рекомбинация; NHEJ = негомологичное соединение концов; SEM = стандартная ошибка среднего; SSA = отжиг одной цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Процесс редактирования генов с помощью секвенирования по Сэнгеру и анализа TIDE; включает диаграмму сравнения методов репарации.
Рисунок 4: Экспериментальный рабочий процесс для определения результатов репарации DSB с использованием метода Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). (A) Мухи, несущие DR-white и индуцированный трансген I-SceI, анализируются путем экстракции gDNA, ПЦР-амплификации участка DSB, секвенирования по Сэнгеру и TIDE-анализа с помощью R-скрипта. (B) Репрезентативные данные для мутантов DmCtIP-/- (n = 23) и гетерозиготных контролей DmCtIP+/-  (n = 31). Общее количество регистрируемых событий репарации рассчитывается как сумма HR и NHEJ с переработкой концов, исключая случаи отсутствия DSB или NHEJ без инделей. ****P < 0.0001 по двухфакторному ANOVA с последующим множественным тестом Сидака. Столбцы соответствуют средним значениям; планки погрешностей соответствуют SEM. Данные были повторно проанализированы из работы Thomas et al.16. Сокращения: ANOVA = дисперсионный анализ; DSB = двухцепочечный разрыв; gDNA = геномная ДНК; HR = гомологичная рекомбинация; NHEJ = негомологичное соединение концов; PCR = полимеразная цепная реакция; SEM = стандартная ошибка среднего; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: R-скрипт TIDE для идентификации инсерций и делеций в хроматограммах последовательностей относительно контрольного образца без DSB. Редактируемое пользователем имя файла контроля, имена файлов образцов и целевая последовательность I-SceI отмечены в конце скрипта. Необходимые входные данные, выходные файлы и интерпретация результатов описаны в разделе 2.3. Требуется установка пакетов sangerseqR и Biostrings.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Пошаговое руководство по рабочему процессу скрипта TIDE в среде R со скриншотами. На панелях показаны действия в программном обеспечении, описанные в разделе 2.3.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: Пример выходных данных TIDE и расчеты событий репарации. Значение «0-indel» соответствует отсутствию DSB или NHEJ без инделей; отдельная строка HR представляет канонический продукт делеции 23 bp; все остальные проценты инделей суммируются как NHEJ с процессингом. Общий уровень детектируемой репарации рассчитывается как сумма HR и NHEJ с процессингом.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4: Исходные данные, лежащие в основе рисунка 3B и рисунка 4B, организованные в отдельных редактируемых рабочих листах. Эти данные были повторно проанализированы на основе ранее опубликованных исследований, указанных в соответствующих подписях к рисункам.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Универсальность системы DR-white является критическим фактором, определяющим ее влияние на область исследования репарации ДНК в прошлом и будущем. Во-первых, последовательность интеграции attB в составе репортерной конструкции DR-white позволяет исследователям направлять репортер в многочисленные локусы генома Drosophila21, при этом несколько таргетных линий уже доступны22. Во-вторых, наличие различных трансгенов I-SceI, таких как экспрессия под действием теплового шока через промотор hsp70 (данное исследование), конститутивная экспрессия через промотор ubiquitin23 и премейотическая экспрессия в зародышевой линии через промотор Bam24, обеспечивает множество условий развития и тканеспецифических контекстов для изучения репарации DSB. Независимо от используемого трансгена  I-SceI, генетические скрещивания должны быть тщательно спланированы, чтобы трансген I-SceI был введен только в финальном скрещивании для обеспечения надлежащей индукции DSB. Важно отметить, что частота репарации может существенно варьироваться в зависимости от геномного расположения DR-white и/или используемого трансгена I-SceI . В будущих экспериментах можно будет дополнительно сравнить геномные локусы и трансгены I-SceI, чтобы определить, что именно — геномный контекст или тканеспецифичность — определяет репарацию DSB.

Особым преимуществом анализа DR-white и его производных является то, что они позволяют идентифицировать репарацию DSB посредством гомологичной рекомбинации, NHEJ с процессингом и, в большинстве случаев, SSA. Хотя система была разработана для фенотипического обнаружения событий репарации в зародышевой линии, она также позволяет проводить анализ соматических тканей с помощью алгоритмического анализа TIDE. Несмотря на эти преимущества, существуют некоторые ограничения данного анализа, которые необходимо учитывать. Стоит отметить, что анализ DR-white может недооценивать частоту HR. Как и в других генетических репортерных анализах, использующих индуцированные нуклеазой DSB, репарация посредством HR с использованием сестринской хроматиды (интерсестринская HR) неотличима от события без DSB или от NHEJ без процессинга. Таким образом, по крайней мере часть класса No DSB/NHEJ может представлять собой события HR. С учетом этого ограничения следует с осторожностью интерпретировать результаты сравнения генетических факторов (например, мутантных линий). Другие ограничения анализа включают невозможность оценки премейотических событий, которые не привели к появлению жизнеспособного потомства. Например, события DSB, которые могли не быть репарированы и привели к гибели клеток, не будут учтены в потомстве. Хотя общая фертильность может служить качественным показателем гибели клеток зародышевой линии, могут потребоваться клеточные анализы (такие как TUNEL). Кроме того, анализ с помощью R-скрипта TIDE дает только долю обнаруживаемых событий в популяции клеток. Для определения конкретных последовательностей индель-исходов требуется секвенирование отдельных событий репарации с использованием мультиплексного секвенирования ДНК.

Анализ DR-white уже оказал значительное влияние на изучение репарации DSB. Его применение позволило выявить факторы, влияющие на репарацию DSB в многоклеточных организмах, включая возраст25, пол26, локализацию DSB22,26, локализацию донорной последовательности15, клеточный цикл и тип ткани26. Кроме того, мы использовали данный анализ для идентификации нескольких белков, которые также определяют выбор пути репарации и/или репарацию дивергентных последовательностей у Drosophila, включая Msh627, Blm28, Rif116 и CtIP16,29. Действительно, общепринятое использование Drosophila в качестве генетической модельной системы с консервативными белками репарации ДНК предоставляет простую многоклеточную систему для исследования генетических, клеточных и организменных факторов, способствующих репарации DSB в сложных биологических контекстах.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о наличии финансовых или нефинансовых конфликтов интересов.

Благодарности

Данный метод был разработан в период, когда J.R.L. являлся получателем исследовательского гранта AFAR от Американской федерации исследований старения (American Federation for Aging Research). Эта работа также была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук (National Institute of General Medical Sciences, гранты 1R15GM110454 и 1R15GM129628), предоставленными J.R.L. Рисунки были созданы с помощью BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
пестики объемом 0,5 мл, свободные от РНКаз/ДНКазFisher Scientific12141363Для гомогенизации образцов при экстракции гДНК
Ватные тампоныGenesee Scientific51-101для стандартного культивирования Drosophila
Охлаждаемый инкубатор для Drosophila с элементами ПельтьеЛаборатория ШелаSRI6PFдля стандартного культивирования Drosophila
Линия Drosophila: y[1] w[1]Bloomington Drosophila  Центр ресурсов (Stock Center)RRID:BDSC 1495
Линия Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} Лаборатория ЛаРок (LaRocque Lab)Применимо/не применимосоздано в лаборатории LaRocque путем стандартной рекомбинации стока RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) из Центра стоков Drosophila Блумингтона; предоставляется по запросу автору для корреспонденции
Линия Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]Лаборатория ЛаРокНет данныханализ DR-white, интегрированный в стоковую линию RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); предоставляются по запросу автору для корреспонденции
Линия Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]Лаборатория ЛаРоккДанные отсутствуютанализ DR-white.mu, интегрированный в сток RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); предоставляется по запросу автору, ответственному за переписку
Линия Drosophila: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]Лаборатория ЛаРок (LaRocque Lab)Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.iwhiteΔ9 донорских линий, интегрированных в сток RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); предоставляется по запросу автору для корреспонденции
Пробки для флаконов Drosophila от FlugsGenesee Scientific49-100для стандартного культивирования Drosophila
Флуоресцентный стереомикроскоп (RFP)TriTech ResearchSMT1-FLдля стандартных Drosophila "перенос мух (fly pushing)" и сортировка на основе флуоресценции
Планшет для работы с мушками Drosophila от FlyStuffGenesee Scientific59-172для стандартных Drosophila "перенос мух (fly pushing)"
салфетки KimwipesKimberly-Clarke06-666A
Водяная баня MyBath объемом 4 лMidwest ScientificMB-2000-4для  тепловой шок
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYдля количественного определения ДНК
Питательная среда Bloomington для мух Nutri-flyGenesee Scientific66-121для стандартного культивирования Drosophila
Беспроводной моторизованный гомогенизатор с пестиком для осадкаDWK Life SciencesK749540-0000Для гомогенизации образцов при экстракции гДНК
Полипропиленовые флаконыGenesee Scientific32-130для стандартного культивирования Drosophila
Полистироловые флаконыGenesee Scientific32-116для стандартного культивирования Drosophila, включая тепловой шок
Праймер/олигонуклеотид DR-white_8fне применимо; достаточно любого сервиса по синтезу олигонуклеотидовПоскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст для перевода.5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
Праймер/олигонуклеотид DR-white_8aН/П; подойдет любой сервис по синтезу олигонуклеотидовНет данных5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
Праймер/олигонуклеотид DR-white_9fН/Д; достаточно любого сервиса по синтезу олигонуклеотидовПоскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R StudioПостулироватьВерсия 2023.06.1+524Бесплатная версия, доступная для скачивания; допустима любая версия R Studio, хотя представленные данные были проанализированы с использованием  версия 2023.06.1+524
Пакеты R Studio: BiostringsBioconductor.org (версия 3.24)Версия 2.76.0Скрипт R предложит пользователю установить этот пакет
Пакеты R Studio: sangerseqRBioconductor.org (версия 3.24)Версия 1.44.0Скрипт R предложит пользователю установить этот пакет
Быстрая ПЦР SapphireAMPTakaraRR350B
СтереомикроскопLeicaM60для стандартных Drosophila "перекрестное скрещивание мух"
Очистка ПЦР-продуктов и выделение из геля с помощью набора Wizard SV Gel and PCR Clean up PromegaA9281

Ссылки

  1. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.
  2. Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.
  3. Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.
  4. Figueroa-González G, Pérez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.
  5. Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.
  6. Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.
  7. Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.
  8. Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.
  9. Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.
  10. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.
  11. Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.
  12. Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.
  13. Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.
  14. Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.
  15. Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.
  16. Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.
  17. Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.
  18. Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.
  19. McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.
  20. Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.
  21. Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.
  22. Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.
  23. Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.
  24. Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.
  25. Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.
  26. Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.
  27. Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.
  28. Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.
  29. Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.

Перепечатки и разрешения

Теги

I SceITIDE
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.