Данное исследование было проведено в соответствии с этическими стандартами Четвертой народной больницы Шанхая Медицинского факультета Университета Тунцзи и было одобрено Институциональным наблюдательным советом (номер одобрения 2026013-01). Экстрагированные человеческие зубы, использованные в этом исследовании, были получены от пациентов, перенесших удаление зубов по ортодонтическим или пародонтологическим показаниям. До сбора образцов от всех участников было получено письменное информированное согласие. Дополнительных клинических вмешательств в целях данного исследования не проводилось. Исследование было проведено в соответствии с требованиями учреждения по использованию экстрагированных человеческих зубов.
Подготовка образцов и критерии отбора
В общей сложности 141 однокорневой постоянный зуб (нижние резцы и премоляры), недавно удаленный, был получен из отделения стоматологии при Четвертой народной больнице Шанхая, аффилированной с Университетом Тунцзи. Все зубы были удалены по ортодонтическим или пародонтологическим показаниям. От каждого пациента было получено информированное согласие. В исследование были включены зубы с длиной корня не менее десяти миллиметров (определено с помощью пародонтологического зонда), целые зубы без кариозных поражений или трещин, с полностью сформированным корнем и искривлением корня менее десяти градусов по методу Шнайдера. Из исследования были исключены зубы с несколькими каналами, кальцификацией канала, внутренней резорбцией или перенесенным ранее эндодонтическим лечением. После экстракции все видимые зубные отложения и остатки мягких тканей удаляли с помощью пародонтологического кюрета. Затем зубы хранили в 0,9% физиологическом растворе при 4°C до использования для предотвращения дегидратации; все эксперименты проводились в течение трех месяцев после экстракции. Образцы распределяли по экспериментальным группам с использованием заранее определенной последовательности попеременного распределения. В частности, образцы последовательно и попеременно распределяли в каждую группу до достижения необходимого размера выборки для каждой группы. Формальный расчет мощности a priori не проводился. Размер выборки был определен на основе предыдущих сопоставимых исследований ex vivo, количества оцениваемых комбинаций параметров облучения и доступности подходящих экстрагированных зубов.
Подготовка и стерилизация корневых каналов
Коронка каждого зуба удалялась на уровне цементно-эмалевого соединения с помощью низкоскоростной алмазной пилы при постоянном водяном охлаждении для получения стандартизированного сегмента корня длиной 10 mm. Рабочая длина определялась с помощью K-файла размера 10 на 1 mm короче апикального отверстия. Препарирование корневых каналов проводили с использованием никель-титановой роторной системы ProTaper Universal в соответствии с инструкциями производителя, соблюдая последовательность S1, S2, F1, F2 и F3 до достижения размера апикального расширения F3. В процессе инструментальной обработки каналы ирригировали примерно 2 mL 5.25% гипохлорита натрия после использования каждого роторного файла, что в сумме составило около 10 mL ирригационного раствора на один канал. Заключительное промывание выполняли с использованием 5 mL 17% EDTA в течение 1 min, после чего использовали 5 mL стерильного физиологического раствора. Апикальное отверстие запечатывали текучим композитом для создания закрытой системы каналов. Подготовленные корни стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 20 min, хранили в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) при 4°C и инокулировали бактериями в течение 24 h после стерилизации.
Бактериальный штамм и условия культивирования
E. faecalis ATCC 29212 использовали для создания модели инфицированного корневого канала. Штамм культивировали на агаре с сердечно-мозговым настоем (BHI) при 37°C в течение 24 ч в аэробных условиях. Отдельную колонию переносили в бульон BHI и инкубировали при 37°C в течение 18–24 ч. Концентрацию бактериальной суспензии доводили примерно до 1.5 × 108 CFU/mL, что соответствует стандарту 0.5 по МакФарланду, используя значение оптической плотности при 60 нм (OD60) от 0.08 до 0.10.
Создание E. faecalis Модель инфицированного корневого канала
Для создания модели биопленки в инфицированном корневом канале внешнюю поверхность каждого стерилизованного корня покрывали двумя слоями бесцветного лака для ногтей, чтобы предотвратить проникновение бактерий через цемент. Апикальную область покрывали лаком после герметизации апикального отверстия текучим композитом, в то время как устье канала оставляли непокрытым для проведения бактериальной инокуляции. С помощью стерильного микропипеточного дозатора 10 µL из E. faecalis суспензию переносили в каждый отдельный корневой канал, чтобы заполнить всю длину канала, избегая перелива. Затем инокулированные образцы индивидуально помещали в стерильные 24-луночные культуральные планшеты, добавляя в каждую лунку 1,5 мл бульона BHI. Образцы культивировали при 37°C в аэробных условиях в течение 21 дня. Каждые 2 дня питательную среду удаляли и заменяли свежим стерильным бульоном BHI для обеспечения питательных веществ для дальнейшего роста бактерий и удаления накопившегося клеточного дебриса. Дополнительного инокулирования E. faecalis при замене среды не проводили. По завершении периода инкубации все жизнеспособные образцы один раз промывали раствором PBS для удаления слабо прикрепленных планктонных бактерий перед проведением экспериментальных тестов. Два случайно выбранных образца были использованы для визуализации формирования зрелой биопленки и проникновения бактерий в дентинные канальцы с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Образцы фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде при 4°C в течение 24 ч, трижды промывали в PBS, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации (30%, 50%, 70%, 80%, 90% и 10%) по 10 мин на каждом этапе, затем разделяли продольным разрезом, высушивали на воздухе, фиксировали на алюминиевых держателях, покрывали золотом методом магнетронного распыления и исследовали с помощью СЭМ.
Экспериментальные группы и протоколы лазерного облучения
135 образцов инфицированных корней были разделены на три основные экспериментальные группы в зависимости от используемой лазерной системы: группу диодного лазера 808 nm, группу тулиевого лазера 1940 nm и группу эрбиевого лазера 2940 nm. В каждой лазерной группе было по 45 образцов, которые были далее разделены в зависимости от параметров облучения. Диодный лазер работал при средней мощности 1.0, 1.5 или 2.0 W, и каждая установка мощности применялась в течение 10, 20 или 30 s, что привело к образованию девяти подгрупп по три образца в каждой. Тулиевый лазер работал при средней мощности 1.5, 2.5 или 3.5 W, и каждая установка мощности также применялась в течение 10, 20 или 30 s, что привело к образованию девяти подгрупп по три образца в каждой. Эрбиевый лазер работал в режиме сверхкоротких импульсов при фиксированной частоте 15 Hz. Энергия импульса 10, 20 или 30 mJ применялась в течение 10, 20 или 30 s, что позволило сформировать девять подгрупп по три образца в каждой. И диодный лазер 808 nm, и тулиевый лазер 1940 nm работали в режиме непрерывного излучения.
В общей сложности было включено шесть дополнительных образцов, по три из которых были распределены в группы отрицательного и положительного контроля. Группа отрицательного контроля обрабатывалась стерильным физиологическим раствором, в то время как группа положительного контроля обрабатывалась 5.25% гипохлоритом натрия (NaOCl) в течение 30 s.
Для групп лазерного воздействия применяли стандартизированный протокол облучения. Оптическое волокно вводили в корневой канал до рабочей длины и перемещали медленным непрерывным спиралевидным движением от апикального к корональному направлению на протяжении всего периода облучения. Вместо одного взаимозаменяемого волокна использовали специализированные лазерные световоды или наконечники. Излучение диодного лазера 808 nm подавали через торцевое волокно 200 µm, тулиевого лазера 1940 nm — через торцевое волокно 20 µm, а эрбиевого лазера 2940 nm — через радиальный наконечник 40 µm. Световод или наконечник извлекали со скоростью примерно 1 mm/s. После достижения устья канала его снова вводили до рабочей длины, и спиралевидное движение от апекса к коронке повторяли до завершения установленного времени облучения.
Для лазеров на тулии и эрбии каналы во время облучения поддерживали заполненными стерильным физиологическим раствором для имитации лазерной активации с помощью воды. Перед облучением в каждый канал вводили примерно 10 µL стерильного физиологического раствора, чтобы заполнить его до уровня устья. При необходимости раствор доливали перед каждым циклом облучения, чтобы на протяжении всего лечения канал оставался заполненным жидкостью. В группе с диодным лазером перед облучением каналы высушивали стерильными бумажными штифтами, поскольку диодный лазер с длиной волны 808 nm имеет относительно низкое поглощение в воде и использовался для создания прямого фототермического антибактериального эффекта внутри канала. Напротив, лазеры на тулии с длиной волны 1940 nm и на эрбии с длиной волны 2940 nm обладают значительно более высоким поглощением в воде, поэтому их применяли в заполненных раствором каналах для обеспечения опосредованных водой фототермических и фотомеханических эффектов. Лазерную обработку повторяли один раз в день в течение трех дней подряд.
Измерение температуры внешней поверхности корня
Изменения температуры на внешней поверхности корня в режиме реального времени измеряли в течение первого дня лазерного облучения. Каждый образец корня закрепляли вертикально на штативе при комнатной температуре (2°C ± 1°C). Термопару K-типа, подключенную к цифровому термометру, плотно прижимали к средней трети внешней поверхности корня перпендикулярно его продольной оси. Зонд термопары позиционировали с помощью регулируемого зажима и фиксировали на поверхности корня термостойкой клейкой лентой для обеспечения плотного и стабильного контакта на протяжении всего измерения. Зонд термопары калибровали перед каждой сессией измерений с использованием кипящей воды (10°C) и смеси льда с водой (0°C). Показания температуры регистрировали с интервалом 50 ms в течение всего периода облучения (10, 20 или 30 s). Для каждого образца измеряли как исходную температуру, так и максимальную температуру, зафиксированную во время или сразу после лазерного облучения. Прирост температуры от исходного до пикового значения рассчитывали как ΔT. Значение ΔT, превышающее 10°C, считали порогом потенциального повреждения тканей периодонта.
Микробиологическая оценка: подсчет колоний и степень ингибирования
Для определения антибактериального эффекта лазерного воздействия после каждой процедуры проводили отбор проб. Канал высушивали стерильными бумажными штифтами. Для каждого образца использовали новый стерильный файл Хедстрёма (Hedström) размера 40 для получения опилок дентина со стенок канала, что позволило предотвратить перекрестное загрязнение между образцами. Каждую порцию опилок дентина переносили в отдельную микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 mL стерильного PBS. Пробирки интенсивно перемешивали на вортексе в течение 30 s для высвобождения бактерий из опилок дентина. Готовили серию десятикратных разведений от 10−1 до 10−6, перенося 10 µL бактериальной суспензии в 90 µL стерильного PBS на каждом этапе разведения. Аликвоты (30 µL) каждого разведения высевали на отдельные чашки с агаром BHI (brain heart infusion), которые инкубировали при 37°C в течение 24 h. Колонии подсчитывали и регистрировали как колониеобразующие единицы (КОЕ). Каждое разведение высевали в трех повторностях, и для анализа использовали среднее количество колоний по трем чашкам. Перед подсчетом чашки кодировали; исследователь, проводивший подсчет колоний, не знал о распределении образцов по группам воздействия.

Здесь C — среднее количество КОЕ в группе отрицательного контроля (физраствор), а T — среднее количество КОЕ в экспериментальной группе.
Анализ кривой роста бактерий
Влияние различных видов лазерного воздействия на кинетику роста бактерий исследовали путем построения кривых роста. На 3-й день после последнего лазерного воздействия каналы промывали 5 мл стерильного физиологического раствора. Содержимое каналов собирали с помощью стерильных бумажных штифтов, которые затем переносили в центрифужную пробирку, содержащую 5 мл бульона BHI. Пробирку перемешивали на вортексе для суспендирования бактерий в бульоне. Концентрацию бактериальной суспензии доводили до 1 × 106 КОЕ/мл. Концентрация бактерий была скорректирована на основании значения OD600 измерения с использованием ранее построенного калибровочного графика для *E. faecalis* ATCC 29212, что впоследствии было подтверждено путем подсчета жизнеспособных колоний. Аликвота 200 µL суспензии добавляли в каждую лунку стерильного 96-луночного микропланшета. Кроме того, 20 µL в каждую лунку добавляли стерильное минеральное масло для минимизации испарения. Микропланшет помещали в спектрофотометр-инкубатор, поддерживаемый при 37°Cи ОП (оптическая плотность)600 измерения проводили каждый час в течение 24 ч. Перед каждым измерением OD60 микропланшет подвергали орбитальному перемешиванию при частоте примерно 300 об/мин в течение 10 с для обеспечения гомогенности бактериальной суспензии. Каждый образец тестировали в пяти повторностях (лунках).
Статистический анализ
Все числовые данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили с помощью программы SPSS версии 26.0. Распределение данных оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения более чем двух групп использовали дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим применением теста Тьюки (HSD) для попарных сравнений. Сравнение двух групп проводили с помощью t-критерия для независимых выборок. Перед применением параметрических тестов однородность дисперсии оценивали с помощью критерия Ливена. В случаях нарушения условия однородности дисперсии, при необходимости, применяли поправку Уэлча. Статистическая значимость определялась при P < 0.05. Графики строили с помощью программы GraphPad Prism версии 9.0.