Методическая статья

Создание генетически модифицированных эмбрионов с использованием редактирования генов и переноса ядер соматических клеток для получения моделей заболеваний человека на овцах

116 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72709

⸱

15 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah State University

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы описываем подход к получению генетически модифицированных эмбрионов с использованием редактирования генов CRISPR-Cas9 и переноса ядер соматических клеток для создания моделей заболеваний человека на овцах. Этот метод идеально подходит для точного редактирования генов в донорских клетках и получения клонированных эмбрионов без генетического мозаицизма.

Аннотация

Модели на крупных животных являются ценными инструментами для исследования заболеваний человека. Овцы, свиньи и козы часто лучше воспроизводят анатомию и физиологию органов человека, а также сложность человеческих заболеваний, что повышает их клиническую значимость по сравнению с грызунами. Технологии CRISPR-Cas9 и перенос ядер соматических клеток (SCNT) позволяют создавать модели на крупных животных с большей точностью, универсальностью и генетической однородностью. Основным преимуществом этого подхода по сравнению с микроинъекцией зиготы является возможность подтвердить in vitro наличие желаемой генетической модификации и потенциальных нецелевых мутаций в отредактированных клетках до получения животных. Кроме того, SCNT исключает вероятность генетического мозаицизма, который часто возникает при микроинъекции зиготы. В данной работе мы описываем получение генетически отредактированных клеток овец с помощью негомологичного соединения концов (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HDR) с последующим созданием клонированных эмбрионов, несущих интересующие мутации. Генетические модификации вводятся путем трансфекции культивируемых соматических клеток, обычно фетальных фибробластов, системой CRISPR-Cas9. Эффективность мутагенеза в пуле клеток оценивается с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) и секвенирования по Сэнгеру отредактированных генов и анализируется с помощью программного обеспечения Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE)/Tracking of Insertions, Deletions, and Recombination events (TIDER). Для получения колоний, происходящих от одной клетки, проводится лимитирующее разведение пула клеток, которые затем скринируют с помощью PCR и секвенирования ДНК отредактированных генов. Донорские клетки с интересующей модификацией (модификациями) затем экспансируют и используют для получения эмбрионов методом SCNT. После лимитирующего разведения и скрининга клеток 2/14 (19,3%) колоний, модифицированных с помощью NHEJ, содержали нокаутные (KO) мутации, а 4/56 (7,1%) колоний, модифицированных с помощью HDR, содержали мутацию F508del. Из четырех колоний было создано в общей сложности 370 генетически модифицированных эмбрионов. Данные методы успешно применяются для точного редактирования генов в фетальных фибробластах и создания генно-инженерных эмбрионов для получения моделей человеческих заболеваний на овцах.

Введение

Модели на животных являются незаменимыми инструментами для понимания биологических механизмов заболеваний человека и разработки новых методов терапии. Модели in vitro, такие как культуры клеток или органоидов, не воспроизводят сложность клеточных субтипов и межклеточных взаимодействий, которые происходят in vivo в органах1,2. Таким образом, животные позволяют создавать модели целого организма с более детальным отображением взаимодействий на клеточном и системном уровнях, прогрессирования заболевания и безопасности терапевтических средств. Грызуны являются практическими модельными организмами благодаря их низкой стоимости, короткому времени смены поколений и всесторонней генетической характеристике. Однако модели заболеваний человека на грызунах ограничены физиологическими и анатомическими различиями с людьми, а также их более быстрым метаболизмом и более коротким сроком жизни3,4. Об этом свидетельствует высокая доля методов терапии, которые прошли испытания на животных моделях (большинство из которых — грызуны), но оказались неэффективными в клинических исследованиях5,6,7,8. Для создания моделей широкого спектра заболеваний человека использовали овец, свиней, коз, собак и приматов, что может помочь повысить показатель клинической трансляции новых методов терапии и лекарственных препаратов3,9,10,1,12. Эти виды также обладают многими преимуществами по сравнению с моделями на грызунах благодаря большему сходству с человеком. Таким образом, модели заболеваний человека на крупных животных обеспечивают наиболее точное из доступных моделирование и играют критическую роль в трансляции результатов исследований на животных в клиническую практику.

Система коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR)-Cas9 представляет собой универсальный и программируемый метод генетической модификации клеток животных и введения точных болезнетворных мутаций. Редактирование генов с помощью CRISPR-Cas9 использует направляющую РНК (гРНК), комплементарную целевому участку, что позволяет CRISPR-ассоциированному белку 9 (Cas9) создавать двухцепочечный разрыв (ДЦР) направленным образом13. Клеточное восстановление ДЦР происходит преимущественно по двум механизмам: негомологичному соединению концов (NHEJ) и гомологично-направленной репарации (HDR). Путь NHEJ восстанавливает ДЦР путем соединения концов ДНК; этот подверженный ошибкам механизм может привести к образованию случайных вставок или делеций (инделей) в месте разрыва14. Такие мутации могут привести к нокауту (KO) гена за счет создания мутации сдвига рамки считывания или преждевременного стоп-кодона, что нарушает функцию гена. HDR, происходящая в основном во время S- и G2-фаз клеточного цикла, представляет собой процесс восстановления клеткой ДЦР с использованием гомологичного аллеля в качестве матрицы репарации15,16. Внесение специфических вставок, делеций или замен, известных как нок-ин (KI), возможно путем введения синтетического одноцепочечного олигодезоксинуклеотида (ssODN) или другой матрицы ДНК с интересующим изменением, которую клетка может использовать для восстановления разрыва. CRISPR-Cas9 также может использоваться для мультиплексного редактирования с целью одновременного введения нескольких мутаций для моделирования мультигенных заболеваний3. По сравнению с предыдущими методами редактирования генов, такими как нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFNs) или нуклеазы TALEN (транскрипционные активаторы, подобные эффекторам), CRISPR-Cas9 гораздо проще и экономичнее в использовании в клетках крупных животных17. Разные локусы можно легко таргетировать путем разработки новой гРНК, что помогло ускорить создание новых моделей крупных животных с использованием CRISPR-Cas93,13. Тем не менее, сохраняется ряд ограничений, включая эффективность редактирования CRISPR-Cas9, которая может значительно варьироваться в зависимости от вида, клеточной среды и характера редактирования18,19. В частности, показатели HDR ниже, чем показатели NHEJ, и сильно зависят от типа клеток, геномных локусов и стадии клеточного цикла20,21. Кроме того, проблемой остается внесение непреднамеренных изменений в нецелевых (off-target) локусах или даже в целевых локусах2. Несмотря на это, CRISPR-Cas9 стала основной платформой редактирования генов для создания генетически модифицированных моделей крупных животных.

Перенос ядра соматической клетки (SCNT) позволяет с высокой точностью и однородностью создавать генетически модифицированные эмбрионы. Этот процесс, впервые успешно проведенный на млекопитающих в 197 году, заключается в переносе ядра клетки в энуклеированный ооцит23. SCNT обладает многими преимуществами по сравнению с другими методами, такими как микроинъекция в зиготу, при которой генетический материал или системы редактирования ДНК вводятся непосредственно в зиготу или ранний эмбрион24,25,26. Микроинъекция в зиготу несет в себе внутренний риск генетической гетерогенности, или мозаицизма, между клетками эмбриона, что может произойти, если репликация ДНК или деление клеток occur до генетической модификации27,28,29. Ценность таких мозаичных эмбрионов для создания животных моделей снижается из-за сложности генотипирования и фенотипической характеристики29. При SCNT редактирование генов отделено от производства эмбрионов; каждый клонированный эмбрион происходит из одной клетки, что исключает риск мозаицизма и гарантирует генетическую однородность эмбриона30,31,32. Кроме того, донорские клетки редактируются и тщательно проверяются in vitro для подтверждения клональности и наличия желаемой модификации перед процедурой SCNT, что экономит время и ресурсы25,26. Это особенно важно при введении специфических KIs. Скрининг клеток также позволяет выявить потенциальные мутации в нецелевых участках, тем самым снижая риск генетических нарушений в других локусах. Эти преимущества снимают многие опасения, связанные с CRISPR-Cas9. Таким образом, SCNT обеспечивает более строгий контроль над генетикой получаемых эмбрионов по сравнению с микроинъекцией в зиготу, особенно при более сложных модификациях, таких как мультиплексное редактирование, крупные вставки и гуманизированные аллели3. Хотя SCNT ограничен низкой эффективностью клонирования, техническими требованиями и аномальным эпигенетическим перепрограммированием (последнее из которых может привести к молекулярным и фенотипическим нарушениям в клонах, потенциально маскируя эффекты генетической модификации у животных-основателей), эти эпигенетические изменения не передаются потомству32,3. Несмотря на эти ограничения, сочетание SCNT с CRISPR-Cas9 позволяет осуществлять точную инженерию генома со строгим контролем генетики эмбриона, поддерживая надежное создание моделей заболеваний на крупных животных без мозаицизма. Здесь мы описываем детальный подход к генетической модификации фетальных фибробластов овец (SFF) с использованием NHEJ или HDR с последующим SCNT для получения клонированных эмбрионов с конечной целью создания моделей заболеваний человека на овцах. Этот подход в значительной степени применим и к другим видам сельскохозяйственных животных, хотя редактирование генов может потребовать оптимизации для различных типов клеток, и данный протокол может служить полезной отправной точкой.

Протокол

Все процедуры с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC: № 15508 и № 10089) Университета штата Юта и проведены в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH). В данном исследовании использовались домашние овцы породы Ромни (Ovis aries) использовались для выделения фибробластов плода овцы (Дополнительный файл 134). См. Рисунок 1 для ознакомления с общим описанием протокола.

Схема процесса редактирования генов: дизайн праймеров для ПЦР, трансфекция CRISPR, анализ редактирования генома, клонирование.
Рисунок 1: Обзор методов CRISPR-Cas9 и SCNT, используемых для получения генетически модифицированных эмбрионов. Представлено краткое описание каждого из семи основных этапов протокола. Создано в BioRender. Perisse, I. (2026). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Дизайн ПЦР-праймеров, гРНК и матрицы ssODN

  1. Откройте геномную область, подлежащую редактированию, в Benchling (https://www.benchling.com/academic).
  2. Спроектируйте ПЦР-праймеры для амплификации и секвенирования интересующей геномной области.
    1. Выделите целевой регион, который необходимо амплифицировать, добавив по 200 пар оснований выше и ниже целевого региона, чтобы обеспечить достаточное расстояние для качественного считывания трейсов и точного анализа эффективности мутации с помощью ПО TIDE.
    2. На панели навигации справа выберите Primers > Create Primers > Wizard.
    3. В разделе Region нажмите Use Selection. В разделе Amplicon соответствующим образом отрегулируйте Size и настройте любые другие параметры по желанию.
    4. Нажмите Generate Primers. Выберите для заказа одну или несколько пар праймеров с низкими показателями штрафов (penalty scores).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от вносимого изменения рекомендуется проектировать праймеры, которые будут связываться только с правильно отредактированной ДНК, что позволит ускорить скрининг положительных колоний.
  3. Спроектируйте гРНК для редактирования ДНК с помощью CRISPR-Cas9.
    1. В Benchling выделите целевой регион, подлежащий редактированию, затем на панели навигации справа выберите CRISPR > Design and analyze guides.
    2. Откройте выпадающее меню Genome и выберите или импортируйте геном модельного организма. Отрегулируйте любые другие параметры по желанию.
    3. Нажмите Finish > +.
    4. В разделе Genome Region нажмите No region set и выберите или введите геномную область, содержащую целевой сайт. Нажмите Set genome region.
    5. Для заказа выберите одну или несколько гидов с высокими показателями как специфичности к мишени (on-target), так и отсутствия нецелевого связывания (off-target).
  4. Если выполняется редактирование путем нокинга (KI), спроектируйте шаблон ssODN.
    1. На панели навигации справа выберите CRISPR > Design HR template (ssODN).
    2. Откройте выпадающее меню Genome и выберите или импортируйте геном модельного организма. Нажмите Create.
    3. Перейдите на вкладку SEQUENCE MAP, выделите основания, которые необходимо отредактировать, и создайте модифицированную версию последовательности ДНК, введя нужные изменения с клавиатуры. Вернитесь на вкладку DESIGN HR TEMPLATE и нажмите Next.
    4. Отрегулируйте Template region так, чтобы с каждой стороны от места редактирования было не менее 50 пар оснований плеч гомологии, затем нажмите Next.
    5. Введите последовательность гРНК, выбранную в пункте 1.3.5, в поле Guide, чтобы ввести бесшумные мутации, нарушающие PAM-последовательность (Protospacer Adjacent Motif). Нажмите Next.
    6. Нажмите Copy the template и закажите созданный шаблон ssODN.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности ПЦР-праймеров, гРНК CRISPR-Cas9 и шаблонов ssODN, разработанных в Benchling для создания модели муковисцидоза у овец с нокаутной (KO) мутацией или мутацией F508del, представлены в таблице 1.

2. Приготовление сред

  1. Приготовьте среду для культивирования клеток, добавив в модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen/Strep) (об/об). Перед использованием предварительно прогрейте среду на водяной бане при 37 °C.
  2. Приготовьте среду для замораживания, добавив в DMEM 45% FBS и 10% диметилсульфоксида (DMSO).
  3. Приготовьте среду для сбора ооцитов, добавив в среду M199 1% Pen/Strep, 0,3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) фракции V, 1% FBS и 0,06% соли натрия гепарина.
  4. Закажите среды для созревания in vitro (IVM) и культивирования in vitro (IVC), которые представляют собой коммерчески доступные бессывороточные среды, предназначенные соответственно для созревания ооцитов крупного рогатого скота и культивирования эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чашки для этапов после слияния и IVC подготавливают с семью каплями среды IVC по 40 µL каждая и покрывают минеральным маслом, протестированным на эмбрионах.
  5. Приготовьте среду для голодания клеток, добавив в DMEM с высоким содержанием глюкозы 0,5% FBS и 1% Pen/Strep (об/об). Перед использованием предварительно прогрейте среду на водяной бане при 37 °C.
  6. Приготовьте синтетическую жидкость яйцевода с добавлением HEPES (HSOF) согласно ранее описанному методу35.
  7. Приготовьте среду для энуклеации, добавив в 500 µL среды HSOF 4,5 mM сахарозы и 10 µg/mL цитохалазина B (CB).
  8. Приготовьте среды для инъекции, добавив в 500 µL среды HSOF 10 µg/mL цитохалазина B (CB).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среды для энуклеации и инъекции готовят свежими в день проведения SCNT. По одной капле (200 µL) каждой среды помещают в чашки диаметром 100 мм и покрывают минеральным маслом, протестированным на эмбрионах.
  9. Приготовьте среду для слияния согласно ранее описанному методу35. Извлеките 5–10 mL среды для слияния из температуры 4 °C и выдержите при комнатной температуре до использования.
  10. Приготовьте среду с CB, добавив в среду IVC 10 µg/mL CB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чашку с CB подготавливают с семью каплями среды с CB по 40 µL каждая и покрывают минеральным маслом, протестированным на эмбрионах.
  11. Приготовьте среду с иономицином, добавив в среду HSOF 5 µM соли кальция иономицина.
  12. Приготовьте среду для активации, добавив в среду IVC 2 mM 6-диметиламинопурина (DMAP) и 10 µg/mL циклогексимида (CHX).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чашку для активации подготавливают с семью каплями среды для активации по 40 µL каждая и покрывают минеральным маслом, протестированным на эмбрионах.

3. Трансфекция CRISPR-Cas9 в SFF

  1. (Условия) Все процедуры по культивированию клеток следует проводить в боксе биологической безопасности или в ламинарном шкафу. Культивируйте SFF в T-25 флаконе в среде для культивирования клеток при 37 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 до достижения примерно 70%–80% конфлюэнтности перед трансфекцией.
  2. Удалите всю среду из флакона и один раз промойте клетки 5 mL фосфатно-солевого буфера Дулбекко (DPBS). Инкубируйте с 1 mL трипсин-подобного фермента диссоциации в течение 5–10 мин до диссоциации клеток.
  3. Разбавьте трипсин-подобный фермент диссоциации равным объемом среды для культивирования клеток и центрифугируйте клетки при 200 × g в течение 5 мин.
  4. (Время) Подготовьте комплекс рибонуклеопротеина (RNP) гРНК:Cas9, инкубируя 2.5 µL гРНК (100 µM) с 2.5 µL белка Cas9 (5 µg/µL) в течение 10 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение Cas9 RNP:гРНК может потребовать оптимизации в зависимости от типа клеток, целевого гена и количества мишеней.
  5. Приготовьте раствор для нуклеофекции, смешав 82 µL раствора для нуклеофекции с 18 µL дополнительного раствора (supplement solution).
  6. Смешайте раствор для нуклеофекции с комплексом RNP, и если используется ssODN, добавьте 2 µL ssODN (200 µM), затем аккуратно перемешайте путем пипетирования.
  7. После центрифугирования осторожно слейте супернатант и переверните пробирку на безворсовую салфетку, чтобы удалить остатки среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки среды для культивирования могут повлиять на эффективность трансфекции и жизнеспособность клеток. Убедитесь, что избыток жидкости полностью удален перед ресуспендированием клеточного осадка в растворе для нуклеофекции.
  8. (Важно) Ресуспендируйте фибробласты в растворе для нуклеофекции, затем перенесите смесь в нуклеокуветту объемом 100 µL, избегая образования пузырьков. Аккуратно постучите нуклеокуветтой по твердой поверхности, чтобы смесь осела на дно куветты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха внутри нуклеокуветты могут помешать электропорации.
  9. (Соответствующая настройка) Проведите электропорацию клеток, используя программу EH-100 или согласно рекомендациям производителя. Дайте клеткам восстановиться в течение 10 мин при комнатной температуре.
  10. Перенесите электропорированные клетки с помощью переносной пипетки в 5 mL предварительно уравновешенной среды для культивирования клеток, дополненной HDR-энхансером до конечной концентрации 1–2 µM (для других типов клеток может потребоваться оптимизация).
  11. (Условия) Культивируйте клетки в среде для культивирования при 37 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение 48 ч перед выделением геномной ДНК.
  12. Удалите среду из культуры, один раз промойте DPBS и добавьте 1 mL трипсин-подобного фермента диссоциации.
  13. После открепления клеток добавьте 1 mL среды для культивирования клеток, чтобы разбавить трипсин-подобный фермент диссоциации.
  14. Распределите примерно две трети клеточной суспензии для криоконсервации и одну треть для экстракции геномной ДНК в маркированные пробирки объемом 1.5 mL. Центрифугируйте все пробирки при 200 × g в течение 5 мин.
  15. Ресуспендируйте клеточный осадок, предназначенный для криоконсервации, в 500 µL среды для замораживания. Перенесите ресуспендированные клетки в криопробирки и поместите их в контейнер для замораживания с контролируемой скоростью при -80 °C, минимизируя время пребывания клеток в среде для замораживания перед переносом при -80 °C.
  16. Ресуспендируйте клеточный осадок, предназначенный для экстракции ДНК, в 200 µL DPBS. Выделите геномную ДНК с помощью набора для очистки геномной ДНК согласно инструкциям производителя.

4. Анализ эффективности редактирования генома

  1. Проведите амплификацию целевых локусов из выделенной ДНК с использованием высокоточной ДНК-полимеразы и предварительно разработанных ПЦР-праймеров.
  2. Подтвердите амплификацию ПЦР с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с использованием маркера ДНК 1 kb.
  3. Очистите продукты ПЦР с помощью набора для очистки продуктов ПЦР и направьте их на секвенирование по Сэнгеру.
  4. Если был выполнен нокаут (KO), используйте программное обеспечение TIDE (https://apps.datacurators.nl/tide) для оценки эффективности редактирования36. Для точного анализа эффективности редактирования используйте высококачественные хроматограммы с минимальным фоновым сигналом.
    1. Откройте TIDE и укажите название образца в поле Title plot. В поле Guide sequence введите последовательность использованной гРНК.
    2. В разделе Control Sample Chromatogram нажмите Browse и загрузите хроматограмму нередактированного контрольного образца.
    3. В разделе Test Sample Chromatogram нажмите Browse и загрузите хроматограмму отредактированного тестового образца.
    4. Перейдите на вкладку Decomposition, чтобы просмотреть спектр инделей и эффективность мутации. Проверьте значение R2 в правом верхнем углу спектра инделей.
    5. Если значение R2 меньше 0,9, отметьте поле Advanced settings в разделе Parameters и отрегулируйте ползунки для окна выравнивания (alignment window), окна декомпозиции (decomposition window) и размера инделя (indel size) до тех пор, пока значение R2 не станет больше 0,9 и не будет достигнуто правильное выравнивание.
  5. Если был выполнен нокаин (KI), используйте программное обеспечение TIDER (https://apps.datacurators.nl/tider) для оценки эффективности редактирования37.
    1. Откройте TIDER. Укажите название образца в поле Title plot. В поле Guide sequence введите последовательность использованной гРНК.
    2. В разделе Control Sample Chromatogram нажмите Browse и загрузите хроматограмму нередактированного контрольного образца.
    3. В разделе Reference Chromatogram нажмите Browse и загрузите хроматограмму референсного образца с желаемым редактированием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если такая последовательность отсутствует, ее можно создать путем ПЦР-амплификации с использованием дополнительных праймеров, разработанных для внесения мутации в последовательность ДНК38.
    4. В разделе Test Sample Chromatogram нажмите Browse и загрузите хроматограмму отредактированного тестового образца.
    5. Перейдите на вкладку Decomposition, чтобы просмотреть спектр инделей, эффективность мутации и эффективность HDR. Проверьте значение R2 в правом верхнем углу спектра инделей.
    6. Если значение R2 меньше 0,9, отметьте поле Advanced settings в разделе Parameters и отрегулируйте ползунки для окна выравнивания (alignment window), окна декомпозиции (decomposition window), расстояния выше сайта разрыва (distance upstream from break site) и размера инделя (indel size) до тех пор, пока значение R2 не станет больше 0,9 и не будет достигнуто правильное выравнивание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (Критически важно) Если качество секвенирования в файле низкое, может потребоваться повторное секвенирование.

5. Изоляция и скрининг одноклеточных колоний

  1. (Условия) Разморозьте и культивируйте трансфицированные SFF в T-25 флаконе в течение ночи при 37 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 или до достижения клетками примерно 80% конфлюэнтности.
  2. Удалите среду, один раз промойте клетки 5 мл DPBS и диссоциируйте их с помощью 1 мл трипсиноподобного фермента для диссоциации.
  3. Добавьте питательную среду для разведения трипсиноподобного фермента и перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при 200 × g в течение 5 мин.
  4. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл питательной среды. Аккуратно, но тщательно перемешайте для получения гомогенной суспензии одиночных клеток.
  5. (Критический этап) Приготовьте разведение клеточной суспензии 1:10, затем подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и трипанового синего.
  6. Рассчитайте объем разведенной клеточной суспензии, необходимый для посева примерно одной клетки на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для пяти 96-луночных планшетов подготовьте примерно 500 клеток.
  7. Приготовьте по 10 мл питательной среды для каждого 96-луночного планшета в конической пробирке объемом 50 мл.
  8. Добавьте рассчитанный объем разведенной в 10 раз клеточной суспензии в питательную среду и хорошо перемешайте путем аккуратного пипетирования и инверсии.
  9. Перелейте разведенную клеточную суспензию в стерильный резервуар для реагентов.
  10. Раздайте по 100 µL клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета.
  11. (Условия) Инкубируйте планшеты при 37 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение 5 дней.
  12. Осмотрите каждую лунку под микроскопом и отметьте лунки, содержащие одну колонию. Исключите лунки, содержащие более одной колонии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии, произошедшие от одной клетки, обычно имеют округлую, компактную форму и морфологически однородны.
  13. Верните планшеты в инкубатор и культивируйте еще 2 дня при тех же условиях.
  14. После общего периода культивирования в 96-луночных планшетах в течение 7 дней удалите среду из лунок, содержащих одну растущую колонию. Один раз промойте каждую выбранную лунку DPBS.
  15. Добавьте 100 µL трипсиноподобного фермента для диссоциации в каждую выбранную лунку и инкубируйте до открепления клеток. Добавьте 100 µL питательной среды в каждую лунку, чтобы развести трипсиноподобный фермент.
  16. Перенесите весь объем из каждой лунки в одну лунку 24-луночного планшета.
  17. Промойте исходный 96-луночный планшет дополнительной питательной средой и перенесите промывочный раствор в соответствующую лунку 24-луночного планшета для максимального восстановления клеток. Доведите конечный объем в каждой лунке 24-луночного планшета до 500 µL с помощью питательной среды.
  18. (Условия) Инкубируйте 24-луночные планшеты при 37 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение 3 дней.
  19. Осмотрите лунки под микроскопом и выберите колонии, близкие к полной конфлюэнтности.
  20. Удалите среду из лунок, выбранных для сбора, один раз промойте DPBS и добавьте 500 µL трипсиноподобного фермента для диссоциации.
  21. После открепления клеток добавьте 1 мл питательной среды для разведения трипсиноподобного фермента.
  22. Заморозьте клетки и выделите геномную ДНК согласно этапам 3.14–3.16.
  23. Амплифицируйте целевые локусы методом ПЦР и подтвердите генотип с помощью секвенирования по Сэнгеру.
  24. Идентифицируйте колонии дикого типа, KO и KI на основании результатов секвенирования. Используйте анализ TIDE/TIDER, как описано на этапах 4.4 и 4.5, для оценки частоты HDR и спектра инделей с целью подтверждения правильного редактирования и выявления колоний, произошедших не от одной клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе также может быть проведен анализ нецелевого редактирования (Дополнительный файл 1).
  25. Экспондируйте только те колонии, которые имеют желаемый генотип и нормальную морфологию клеток, для последующих экспериментов по SCNT.

6. Сбор ооцитов овец и их созревание in vitro

  1. Соберите яичники овец на местном скотобойном предприятии и доставьте их в лабораторию в 0,9% физиологическом растворе при 25 °C в течение 4 ч после сбора.
  2. Проведите созревание ооцитов in vitro.
    1. Выделите комплексы кумулюс-ооцит (КОК) из яичников, надрезая поверхность яичника лезвием скальпеля при его погружении в среду для сбора ооцитов.
    2. (Время) Для IVM отберите КОК, имеющие не менее 1–3 слоев компактных клеток кумулюса и однородную цитоплазму. Промойте КОК в свежей среде для сбора ооцитов и культивируйте в предварительно уравновешенной среде для IVM (до 40 КОК на лунку с 500 µL среды для IVM в 4-луночном планшете) при инкубации при 38,5 °C и 5% CO2 в течение 21–22 ч.
  3. Проверьте созревание ооцитов.
    1. Перенесите необходимое количество КОК с помощью пипетки на 200 µL в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL, добавив в пробирку такой же объем (1:1) гиалуронидазы в концентрации 0,6 mg/mL.
    2. Пропипетируйте смесь несколько раз до полного удаления клеток кумулюса. Перенесите ооциты в каплю среды HSOF объемом 1 mL и промойте их, последовательно перенося через три дополнительные капли HSOF.
    3. Используя рот-пипетку или пипетку на 10 µL с наконечником, перекатывайте ооциты и отбирайте под стереомикроскопом те, у которых наблюдается полярное тельце. Допустимый уровень экструзии полярного тельца составляет 50%–80%.

7. Перенос ядер соматических клеток

  1. Подготовка донорских клеток перед SCNT.
    1. Разморозить криоконсервированные клетки за 3–5 дней до SCNT на водяной бане при 37 °C в течение 1–2 мин до полного исчезновения льда в пробирке.
    2. Перенести клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл, добавить равный объем среды для культивирования клеток и центрифугировать при 406 x g в течение 5 мин.
    3. Удалить супернатант и ресуспендировать клеточный осадок в 500 µL среды для культивирования клеток.
    4. (Условия) Рассеять клетки в различных концентрациях в 4-луночном планшете с конечным объемом 500 µL на лунку и культивировать при 37 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2.
    5. Заменять среду для культивирования клеток каждые 48 ч. После достижения клетками полной конфлюэнтности заменить среду на среду для голодания клеток за 24–48 ч до SCNT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Голодание клеток более 48 ч может увеличить долю апоптоза39,40.
  2. Подготовка донорских клеток (в день SCNT).
    1. Удалить среду для голодания из лунки и один раз промыть 500 µL DPBS (-).
    2. Добавить 250 µL трипсин-подобного фермента для диссоциации и инкубировать при 37 °C в течение 5 мин или до тех пор, пока клетки не открепятся от планшета.
    3. Добавить 500 µL среды для культивирования клеток для разведения трипсин-подобного фермента диссоциации.
    4. Перенести клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугировать при 406 x g в течение 5 мин.
    5. Удалить супернатант и ресуспендировать клетки в 60–80 µL среды HSOF, хранить при 4 °C до использования.
  3. Энуклеация ооцитов.
    1. Подготовить удерживающие пипетки, вытянув тонкостенные стеклянные капилляры с помощью вытягивателя микропипеток и придав им форму с помощью микрофоржа для получения внутреннего диаметра 30 µm и внешнего диаметра 100 µm.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обе пипетки также можно приобрести у коммерческих поставщиков.
    2. Подготовить инъекционные пипетки, вытянув тонкостенные стеклянные капилляры с помощью вытягивателя микропипеток, создав скос под углом 45° с помощью микрошлифовального станка и придав им форму с помощью микрофоржа для получения внутреннего диаметра 20–25 µm. Параметры вытягивателя микропипеток, микрофоржа и микрошлифовального станка приведены в предыдущем отчете41.
    3. Перенести ооциты на стадии метафазы II (MII), имеющие полярное тело, в каплю среды для энуклеации. Иммобилизовать ооцит с помощью удерживающей пипетки так, чтобы полярное тело находилось в положении «4–5 часов».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные операционные процедуры микроманипуляции можно найти в предыдущем отчете41.
    4. (Критический этап) С помощью скошенной инъекционной пипетки с острым кончиком проколоть zona pellucida и аспирировать полярное тело и 10%–20% цитоплазмы, расположенной под полярным телом.
    5. Вытолкнуть удаленную цитоплазму в каплю и освободить ооцит из удерживающей пипетки.
    6. Повторить шаги 7.3.2–7.3.4 для всех ооцитов до завершения энуклеации каждого из них. Вернуть энуклеированные ооциты в среду IVM и инкубировать при 38,5 °C и 5% CO2 в течение 30 мин.
  4. Инъекция донорских клеток в энуклеированные ооциты.
    1. Добавить подготовленную клеточную суспензию на дно капли среды для инъекций и перенести энуклеированные ооциты в эту же каплю.
    2. Отобрать 1–10 округлых здоровых клеток и аспирировать их в инъекционную пипетку.
    3. Используя удерживающую пипетку, иммобилизовать ооцит, а затем с помощью инъекционной пипетки проколоть zona pellucida и поместить одну клетку между zona и ооплазмой.
    4. Повторить шаги 7.4.2–7.4.3 для всех энуклеированных ооцитов и перед слиянием клеток перенести их в 2–3 мл среды HSOF в чашку диаметром 35 мм.
  5. Слияние энуклеированных ооцитов и донорских клеток.
    1. Подключить кабели генератора импульсов электрофузии к проводам камеры микрослайда (0,5 мм) и установить камеру на предметный столик микроскопа.
    2. Добавить в камеру 600 µL среды для слияния.
    3. (Критический/Важный параметр) Выровнять 4–6 пар цитоплазма-клетка между двумя проволоками камеры так, чтобы донорская клетка находилась в положении «6 или 12 часов». Приложить два импульса электрофузии постоянного тока силой 2,0 kV/cm продолжительностью 40 µs.
    4. Извлечь пары цитоплазма-клетка из камеры слияния и поместить их в новую чашку диаметром 35 мм, содержащую 2–3 мл среды HSOF.
    5. (Условия) Повторять шаги 7.5.3–7.5.4 до тех пор, пока все инъецированные ооциты не пройдут процесс слияния. Промыть полученные пары в чашке для послефузионной обработки и инкубировать при 38,5 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение 30 мин. Заменять среду для слияния в камере каждые 15–20 мин.
  6. Активация и культивирование эмбрионов.
    1. (Условия) Через 30 мин после слияния все слившиеся эмбрионы сначала инкубируют в среде CB при 38,5 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение 45 мин.
    2. После этого пары активируют в 5 µM иономицина, разведенного в HSOF, в течение 5 мин, с последующей инкубацией в среде для активации в течение 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среду с иономицином готовят непосредственно перед использованием. Для улучшения полноценного развития рекомендуется активация через 24–26 ч после созревания.
    3. (Условия) После активации реконструированные эмбрионы промывают и культивируют в среде IVC (максимум 40 эмбрионов на каплю 40 µL) при 38,5 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение ночи или до переноса эмбрионов.

Результаты

Основные этапы протокола обобщены на Рисунке 1. Мы использовали CRISPR-Cas9 и SCNT для создания модели муковисцидоза (МВ) у овец, содержащей либо KO-индельную мутацию, полученную путем NHEJ, либо мутацию F508del, полученную путем HDR. Часть этих результатов была опубликована ранее42,43. Мы разработали gRNA и ПЦР-праймеры для обеих стратегий с целью воздействия на экзон 11 гена регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR) на основе последовательности GenBank для овец (NC_019461.2.0). Также был разработан ssODN для KI-введения мутации F508del — делеции трех пар оснований, которая является наиболее распространенной мутацией, вызывающей МВ у людей. На Рисунке 2A показаны экзон 11 CFTR и обе стратегии таргетинга (KO и KI), включая относительное расположение gRNA, ПЦР-праймеров и мутаций. SFF были сначала выделены из плода самца и самки домашней овцы породы Ромни (O. aries) на 45-й день гестации. Затем была проведена трансфекция gRNA 1 для KO CFTR посредством электропорации плазмиды pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (плазмида Addgene 42230), как описано ранее43. Трансфекция комплексов RNP CRISPR-Cas9: gRNA с gRNA 2 и ssODN 1 была проведена методом электропорации для KI-введения мутации F508del. Анализ TIDE показал, что 46,9% клеток в пуле содержат делецию 3 нуклеотидов (nt) при R2 = 0,96. Спектр инделей и расчетная эффективность показаны на Рисунке 2B. Метод предельного разведения использовался для изоляции в общей сложности 170 колоний, полученных из единичных клеток, которые были проскринированы с помощью ПЦР и секвенирования по Сэнгеру. Было выделено 114 колоний после трансфекции без ssODN, из которых 22 (19,3%) содержали KO-мутации. Было получено 56 колоний путем трансфекции ssODN с мутацией F508del, четыре из которых (7,1%) были гомозиготны по F508del. Две колонии с KO-мутациями были отобраны и использованы в качестве донорских клеток для получения эмбрионов CFTR-/- с помощью SCNT. KO-мутации представляли собой делеции 2 и 7 nt соответственно. Результаты секвенирования по Сэнгеру для этих колоний показаны на Рисунке 2C. Для получения эмбрионов CFTRF508del/F508del  были отобраны две колонии с мутацией F508del, результаты их секвенирования по Сэнгеру представлены на Рисунке 2D. В общей сложности было получено 370 эмбрионов, из которых 233 содержали KO-мутацию и 137 — мутацию F508del (Таблица 2). При развитии in vitro частота образования бластоцист из эмбрионов овец, полученных методом SCNT, составила примерно 10%–15%. Данный протокол был успешно реализован для редактирования гена CFTR в SFF и получения эмбрионов для создания модели МВ у овец.

Схема стратегий редактирования гена с помощью CRISPR для CFTR F508del; диаграмма спектра инделей; результаты секвенирования.
Рисунок 2Получение CFTR (муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости) -/- и CFTRF508del/F508del клетки SFF. (A) Схематическое изображение экзона 11 CFTR участки гена и мишени CRISPR-Cas9, использованные для введения нокаут-мутаций (KO) посредством негомологичного присоединения концов (слева) и мутаций KI F508del посредством гомологично-направленной репарации (справа). Стрелками показаны прямой и обратный праймеры 1 (синий) и прямой и обратный праймеры 2 (розовый), использованные для амплификации экзона 11.B) График, отображающий спектр инделей и общую расчетную эффективность редактирования на основе данных секвенирования по Сенгеру пула клеток, трансфицированных Cas9: gRNA 2 и ssODN1 для введения мутации F508del. Частота делеций 3 нт в этих клетках составила 46,9%, что соответствует мутации F508del, при R2 0,96. (C) Результаты секвенирования по Сенгеру для колоний клеток CF19F и CF49, содержащих случайные биаллельные нокаутные мутации. В обеих колониях наблюдаются короткие делеции (CF19F, -2 нт; CF49, -7 нт). (D) Результаты секвенирования по Сэнгеру для клеточных колоний, содержащих мутацию F508del, с удаленным фрагментом «CTT». Создано в BioRender. Perisse, I. (2026) https://BioRender.com/v74agcd. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ИмяМутацияПоследовательность
Прямой праймер 1Нокаут (KO)GCATAGCAGCATACCCAA
Обратный праймер 1Нокаут (KO)GTAACCAAACCAGCCCAC
гРНК 1Нокаут (KO)GGGAGAATTGGAACCTTCAG
Прямой праймер 2F508delTGAACTCAGCACCCCATCTCTG
Обратный праймер 2F508delTGCAGGCTTCTTATAGCAGGGG
гРНК 2F508delATTAAAGATAACATCATCTT
одноцепочечный олигодезоксинуклеотид 1F508delT*G*CTCTCAGTATTCCTGGATCATG
CCTGGAACCATTAAAGATAACATCA
TTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGA
TATAGGAGTGTCATCAAAGCATG*C*C

Таблица 1: Последовательности разработанных олигонуклеотидов. Последовательности ПЦР-праймеров, гидовых РНК (gRNA) для CRISPR-Cas9 и шаблонных одноцепочечных олигодезоксинуклеотидов (ssODN), разработанных в Benchling и использованных для создания модели муковисцидоза у овец с KO-мутацией или мутацией F508del. Символ «*» обозначает фосфоротиоатную модификацию.

КолонияГенотипКоличество эмбрионов
CF19F-/-134
CF49-/-99
Fd78F508del/F508del110
Fd92F508del/F508del27
Итого370

Таблица 2: Сводные данные о колониях, использованных в качестве донорских клеток, и полученных эмбрионах. Всего было использовано четыре колонии для получения 370 эмбрионов с мутациями в гене CFTR. Две колонии содержали нокаутные (KO) мутации, и две содержали KI-мутацию F508del. Все колонии были получены из мужских клеток, за исключением CF19F, которая была получена из женской клеточной линии.

Дополнительный файл 1: Протокол выделения фетальных фибробластов овцы и анализ внецелевых эффектов.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В данной процедуре разработка эффективных праймеров, гРНК и ssODN имеет решающее значение для успешного редактирования генов. Плохое связывание этих молекул может затруднить редактирование генов и идентификацию подходящих колоний, что препятствует переходу к SCNT. Перед тем как приступить к изоляции колоний из единичных клеток, рекомендуется приобрести несколько вариантов каждой последовательности для тестирования и оптимизации. Трансфекция плазмид Cas9 для KO в фибробластах обычно приводит к субоптимальной эффективности редактирования, поэтому для достижения более высокой эффективности (70%–90%)4,45,46 рекомендуется использовать Cas9 RNP. Успешное разведение до единичных клеток должно привести к получению аналогичной доли колоний с KO. Ожидаемая эффективность редактирования для KI сильно зависит от типа вносимой модификации; по нашему опыту, делеции обычно протекают эффективнее, чем вставки или замены. Соответственно, доля колоний с мутацией KI после разведения до единичных клеток также будет варьироваться. В наших результатах частота колоний, содержащих мутацию F508del (7,1%), была намного ниже расчетного уровня редактирования (46,9%), что не является идеальным. Даже при низкой частоте правильных правок в колониях, полученных из единичных клеток, все еще можно получить множество эмбрионов. Однако чем выше доля полезных колоний, тем меньше времени и ресурсов требуется, что делает оптимизацию важным этапом. Для устранения причин низкой эффективности редактирования генов убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха в кювете во время электропорации, оптимизируйте соотношение Cas9:гРНК путем титрования, а также протестируйте альтернативные гРНК или ssODN. Кроме того, использование Cas9 RNP важно для эффективности редактирования, так как результаты показывают, что доставка плазмид приводит к редактированию с более низкой эффективностью43. При низкой жизнеспособности и плохом росте колоний во время разведения до единичных клеток рассмотрите возможность увеличения процента сыворотки в среде, добавления добавок факторов роста или корректировки плотности посева. Обеспечьте точный подсчет клеток перед посевом и тщательно перемешайте клеточную суспензию.

Метод SCNT является ценным инструментом для создания животных моделей, однако он включает несколько критических этапов, которые могут повлиять на результаты развития. Во-первых, на качество ооцитов обычно влияют возраст донора и сезон, поскольку большинство пород овец являются сезонными размножателями. Тем не менее, наши предыдущие результаты показали, что сезон не влиял на развитие эмбрионов in vitro, когда яичники/оциты собирали у допубертатных овец на бойнях47. Кроме того, при использовании ооцитов взрослых животных развитие in vivo было сопоставимо с развитием, наблюдавшимся при использовании допубертатных ооцитов35. Время активации эмбрионов овец, полученных методом SCNT, имеет решающее значение для развития до полного срока. Было показано, что ранняя активация в интервале 24–26 ч после созревания снижает вероятность ранней потери беременности и увеличивает долю развития до полного срока35. Это может быть связано со средой с высоким содержанием фактора, стимулирующего созревание (MPF), что характерно для ранней активации и способствует повышению скорости преждевременной конденсации хромосом (PCC) соматического ядра, что, как полагают, благоприятно сказывается на репрограммировании48.

Система CRISPR-Cas9 обладает множеством преимуществ перед другими методами редактирования генов благодаря своей универсальности, программируемости и простоте17. Несмотря на эти сильные стороны, существуют и определенные ограничения. Эффективность редактирования и нецелевая активность CRISPR-Cas9 могут варьироваться в зависимости от вида, типа клеток, геномного локуса, дизайна гРНК и вида вносимого изменения, при этом эффективность зачастую оптимизирована для клеток грызунов или человека18,49. Кроме того, не все участки могут быть доступны для редактирования с использованием традиционного PAM-последовательности NGG для SpCas9. Для преодоления этих ограничений существует множество стратегий, включая оптимизацию дизайна гРНК и доставку Cas9 в виде рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП)50. Были обнаружены или созданы методами генной инженерии многочисленные варианты нуклеаз Cas с более высокой активностью редактирования, повышенной точностью и более широким диапазоном мишеней. Более того, были разработаны несколько альтернативных систем редактирования генома, включая базовые редакторы, праймированные редакторы и редакторы на основе рекомбиназ, многие из которых опираются на белки с CRISPR-направлением50. Редактирование с помощью рекомбиназ особенно полезно для вставки крупных фрагментов ДНК. Любая из этих стратегий может быть потенциально применена для улучшения результатов редактирования в данном протоколе.

По сравнению с зиготической микроинъекцией, SCNT обеспечивает более точный контроль над генетикой эмбрионов благодаря возможности скрининга донорских клеток in vitro на клональность, а также на наличие целевых и внецелевых мутаций перед созданием эмбрионов. Это позволяет подтвердить желаемую генетическую модификацию и исключает риск мозаицизма в полученных эмбрионах24,25,26. Примечательно, что в условиях высокого уровня MPF ядра донорских клеток в фазе G0/G1 могут подвергаться PCC с более нормальной репликацией ДНК, тогда как ядра донорских клеток в S- и G2-фазах склонны к повреждениям ДНК и хромосомным аномалиям51,52. Следовательно, координация фаз клеточного цикла донорской и реципиентной клеток имеет решающее значение для успешного репрограммирования. Кроме того, среды для IVM и IVC могут влиять на развитие эмбрионов, полученных методом SCNT. Синдром крупного плода (LOS) часто встречается у эмбрионов крупного рогатого скота и овец, полученных путем оплодотворения in vitro и SCNT. Одним из возможных способствующих факторов является присутствие сыворотки в средах для созревания ооцитов и культивирования эмбрионов. Таким образом, использование безсывороточной среды может снизить частоту возникновения LOS при получении животных методом SCNT у овец и повысить общую эффективность SCNT. Метод SCNT по-прежнему ограничен низкой эффективностью, высокой стоимостью, необходимостью в специализированном оборудовании, техническом опыте манипуляций с эмбрионами и большом количестве реципиентов, хотя было разработано несколько стратегий по повышению эффективности клонирования путем регулирования эпигенетического репрограммирования53. Эти стратегии включают использование препаратов, модифицирующих эпигеном, или нокдаун эпигенетических регуляторов, контролирующих метилирование ДНК, модификации гистонов или инактивацию X-хромосомы. Несмотря на ограниченный успех при переносе этих результатов с мышей на виды сельскохозяйственных животных, несколько из этих методов были использованы для повышения эффективности клонирования у свиней и коз54,5,56,57.

Тем не менее, CRISPR-Cas9 и SCNT представляют собой эффективную комбинацию методов для получения генетически модифицированных эмбрионов. Система CRISPR-Cas9 проще и более программируема, чем ZFN или TALEN, что обусловило ее доминирующее положение в области редактирования генов. SCNT повышает точность получения эмбрионов, позволяя проводить генетический скрининг перед переносом ядер и исключая риск мозаицизма. Помимо создания моделей животных заболеваний, этот метод имеет широкое применение в сельском хозяйстве и биомедицине. В животноводстве его можно использовать для повышения устойчивости к болезням, толерантности к климатическим условиям и улучшения продуктивных признаков25,58. Кроме того, существует возможность выращивания в животных иммуноинженерных органов для ксенотрансплантации человеку или использования животных в качестве биореакторов для производства ценных антител, ферментов или терапевтических белков в медицинских или промышленных целях3,59. Таким образом, CRISPR-Cas9 и SCNT являются мощными подходами, которые обеспечивают точное и универсальное редактирование генома в сочетании со строгим контролем генетики эмбрионов для создания моделей заболеваний человека на крупных животных.

Раскрытие информации

Авторы использовали Grammarly (Grammarly Inc.) и ChatGPT (OpenAI) для улучшения языка и удобочитаемости рукописи в соответствии с правилами, принятыми в научных издательствах. Эти инструменты не использовались для создания оригинального текста, исследовательских концепций, данных, изображений или рисунков в данном предложении. После использования этих инструментов авторы проверили и при необходимости отредактировали содержимое и несут полную ответственность за данный контент.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Сельскохозяйственной экспериментальной станцией штата Юта (UTAO1328) и Фондом борьбы с муковисцидозом (грант POLEJA23PO).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Маркер молекулярной массы ДНК 1 kbThermo Fisher ScientificSM0313Маркер размера ДНК
Центрифужная пробирка 15 mLThermo Fisher Scientific12-565-269
Микроцентрифужная пробирка 1,5 mLThermo Fisher Scientific05-408-129
4D-Nucleofector Core UnitLonzaAAF-103B
4D-Nucleofector X UnitLonzaAAF-103X
4-луночный планшет (чашка)Nunc144
Центрифужная пробирка 50 mLThermo Fisher Scientific12-565-270
6-DMAPSigma-AldrichD2629
24-луночный планшетCorning3524Экспансия клеток
96-луночный планшетCorning3596Изоляция одноклеточных колоний
АгарозаThermo Fisher ScientificBP160-100Электрофорез в агарозном геле
Стакан (250 mL)Kimble140-250
Программное обеспечение BenchlingBenchlinghttps://www.benchling.com/academicВыравнивание и анализ последовательностей
Среда IVCIVF Bioscience7105
Среда IVMIVF Bioscience7101
BSAGold BioA-421-250
BTX ECMBTXECM-20Оборудование (снято с производства)
Микрослайдовая камера BTXBTX450103
Белок Cas9Integrated DNA TechnologiesCustomРедактирование генома CRISPR-Cas9
Глюконат хлоргексидина (2%)Aspen Vet11584915
CHXSigma-AldrichC7698
Программное обеспечение CRISPORCRISPORhttps://crispor.gi.ucsc.edu/ПО для прогнозирования нецелевых эффектов (off-target)
КриопробиркаThermo Fisher Scientific12-565-163N
Цитохалазин BSigma-AldrichC6762
ДиметилсульфоксидFisher ScientificBP231-10Реагент для криоконсервации
DMEM с высоким содержанием глюкозыCytivaSH3002Среда для культивирования фибробластов
Набор для очистки ДНКThermo Fisher ScientificK0781Очистка геномной ДНК из цельной крови
DPBS без Ca/MgCytivaSH30256Используется для промывки клеток и тканей
ЭтанолPharco1020CSGL
Фетальная бычья сывороткаCytivaSH30396Добавка для культивирования клеток
ПинцетSkylar6-612
Набор для очистки геномной ДНКQiagen69504Экстракция геномной ДНК
Раствор гентамицинаGibco15750-060Используется в промывочной среде
Гидовая РНКIntegrated DNA TechnologiesCustomГидовая РНК для CRISPR
HDR enhancerIntegrated DNA Technologies107921Усилитель гомологичной рекомбинации (HDR)
ГемоцитометрHausser Scientific02-671-10Подсчет клеток
Гемостатический зажимRoboz SurgicalRS-784
Гепарина натриевая сольSigma-AldrichH3149
Hot-Start ДНК-полимеразаPromegaM5123ПЦР-амплификация
ГиалуронидазаSigma-AldrichH3506
ИономицинSigma-AldrichI0634
Среда M19CytivaSH30253.01
Сетчатый экран (40 mesh)Sigma-AldrichS-070Размер ячейки 380 μm
MicroforgeNarishigeMF-9
МикроизмельчительNarishigeEG-4
Пуллер микропипетокSutter Instrument CoP-87
Минеральное маслоKitazato/Dibimed96014
Рот-пипеткаThermo Fisher Scientific13-678-20DОдноразовые пипетки Пастера
Контейнер для замораживания Mr. FrostyThermo Fisher Scientific15-350-50Контейнер для замораживания с контролируемой скоростью
НуклеокуветаLonzaV4XP-3032Кувета для электропорации
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit LLonzaV4XP-3024Включает раствор для нуклеофекции, раствор-добавку, нуклеокуветы и переносочные пипетки
Набор для очистки продуктов ПЦРQiagen2806Очистка продуктов ПЦР
Пенициллин-стрептомицинGibco15070-063Антибиотическая добавка
Чашка Петри (10 mm)Nunc172958
Чашка Петри (35 mm)Nunc150460
Резервуар для реагентовCELLTREAT3054-103
СкальпельMedBladesMB 2-2
НожницыRoboz SurgicalRS-6802
Одноцепочечный олигодезоксинуклеотидный донорский шаблонIntegrated DNA TechnologiesCustomДонорский шаблон для HDR
Хлорид натрияThermo Fisher ScientificBP358-212Для приготовления физиологического раствора
СахарозаSigma-AldrichS18
Хирургический лотокApproved Vendor74262
Краситель для ДНК-гелей SYBR SafeThermo Fisher ScientificS3102Краситель для ДНК-гелей
Флаконы T-25Thermo Fisher Scientific156367Флакон для культивирования клеток
Флакон T-75Corning430641UФлакон для культивирования клеток
Тонкостенный стеклянный капиллярWorld Precision InstrumentsTW10-6
Программное обеспечение TIDE/TIDERTIDE/TIDERhttps://tide.nki.nl/ПО для анализа редактирования генома
Трипановый синийCytivaSV30084
TrypLE ExpressGibco12605-010Трипсиноподобный фермент для диссоциации

Ссылки

  1. Chang MCJ, Grieder FB. The continued importance of animals in biomedical research. Lab Anim (NY). 2024;53(11):295-297.
  2. Bhaduri A, et al. Cell stress in cortical organoids impairs molecular subtype specification. Nature. 2020;578(7793):142-148.
  3. Lin Y, et al. Application of CRISPR/Cas9 system in establishing large animal models. Front Cell Dev Biol. 2022;10:919155.
  4. Seok J, et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(9):3507-3512.
  5. Ineichen BV, et al. Analysis of animal-to-human translation shows that only 5% of animal-tested therapeutic interventions obtain regulatory approval for human applications. PLoS Biol. 2024;22(6):e3002667.
  6. Schuh JCL. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicol Pathol. 2004;32(1):53-66.
  7. Mak IW, Evaniew N, Ghert M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. Am J Transl Res. 2014;6(2):114-118.
  8. Domínguez-Oliva A, et al. The importance of animal models in biomedical research: current insights and applications. Animals (Basel). 2023;13(7):1223.
  9. Li XJ, Lai L. A booming field of large animal model research. Zool Res. 2024;45(2):311-313.
  10. Pinnapureddy AR, et al. Large animal models of rare genetic disorders: sheep as phenotypically relevant models of human genetic disease. Orphanet J Rare Dis. 2015;10(1):107.
  11. Polejaeva IA, Rutigliano HM, Wells KD. Livestock in biomedical research: history, current status and future prospective. Reprod Fertil Dev. 2015;28(2):112-124.
  12. Kelly OM, et al. Towards clinical translation of nanomedicines: formulation scale-up and model systems. Adv Drug Deliv Rev. 2026;234:115862.
  13. Jinek M, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-821.
  14. Pfeiffer P, Vielmetter W. Joining of nonhomologous DNA double strand breaks in vitro. Nucleic Acids Res. 1988;16(3):907-924.
  15. Thomas KR, Capecchi MR. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 1987;51:503-512.
  16. Takata M, et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 1998;17(18):5497-5508.
  17. Jiang S, Shen QW. Principles of gene editing techniques and applications in animal husbandry. 3 Biotech. 2019;9(1):28.
  18. Javaid N, Choi S. CRISPR/Cas system and factors affecting its precision and efficiency. Front Cell Dev Biol. 2021;9:761709.
  19. Wang J, et al. Application of gene editing technology in livestock: progress, challenges, and future perspectives. Agriculture (Basel). 2025;15(20):2155.
  20. Saleh-Gohari N, Helleday T. Conservative homologous recombination preferentially repairs DNA double-strand breaks in the S phase of the cell cycle in human cells. Nucleic Acids Res. 2004;32(12):3683-3688.
  21. Miyaoka Y, et al. Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effects of locus, nuclease, and cell type on genome-editing. Sci Rep. 2016;6:23549.
  22. Wen W, Zhang XB. CRISPR-Cas9 gene editing induced complex on-target outcomes in human cells. Exp Hematol. 2022;110:13-19.
  23. Schnieke AE, et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science. 1997;278(5346):2130-2133.
  24. Tang L, González R, Dobrinski I. Germline modification of domestic animals. Anim Reprod. 2015;12(1):93-104.
  25. Perisse IV, et al. Improvements in gene editing technology boost its applications in livestock. Front Genet. 2021;11:614688.
  26. Kwon DH, Gim GM, Yum SY, Jang G. Current status and future of gene engineering in livestock. BMB Rep. 2024;57(1):50-59.
  27. Mehravar M, Shirazi A, Nazari M, Banan M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Dev Biol. 2019;445(2):156-162.
  28. Niu Y, et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 2014;156(4):836-843.
  29. Yen ST, et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Dev Biol. 2014;393(1):3-9.
  30. Ni W, et al. Efficient gene knockout in goats using CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 2014;9(9):e106718.
  31. Polejaeva IA. 25th anniversary of cloning by somatic cell nuclear transfer: generation of genetically engineered livestock using somatic cell nuclear transfer. Reproduction. 2021;162(1):F11-F22.
  32. Hodges CA, Stice SL. Generation of bovine transgenics using somatic cell nuclear transfer. Reprod Biol Endocrinol. 2003;1:81.
  33. Galli C. Current techniques of gene editing in pigs for xenotransplantation. Transpl Int. 2025;38:13807.
  34. Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1):W242-W245.
  35. Liu Y, et al. A retrospective analysis of sheep generated by somatic cell nuclear transfer. Theriogenology. 2024;227:102-111.
  36. Brinkman EK, Chen T, Amendola M, van Steensel B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 2014;42(22):e168.
  37. Brinkman EK, et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Res. 2018;46(10):e58.
  38. Brinkman EK, Van Steensel B. Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER. Methods Mol Biol. 2019;1961:29-44.
  39. Dalman A, et al. Synchronizing cell cycle of goat fibroblasts by serum starvation causes apoptosis. Reprod Domest Anim. 2010;45(5):e46-e53.
  40. Sadeghian-Nodoushan F, et al. Mimosine as well as serum starvation can be used for cell cycle synchronization of sheep granulosa cells. Chin J Biol. 2014;2014(1):851736.
  41. Page RL, Malcuit CM. Micromanipulation techniques for cloning. In: Principles of Cloning. Elsevier; 2014. p. 39-51.
  42. Viotti Perisse I, et al. Sheep models of F508del and G542X cystic fibrosis mutations show cellular responses to human therapeutics. FASEB Bioadv. 2021;3(10):841-854.
  43. Fan Z, et al. A sheep model of cystic fibrosis generated by CRISPR/Cas9 disruption of the CFTR gene. JCI Insight. 2018;3(19).
  44. Berthault C, et al. Highly efficient ex vivo correction of COL7A1 through ribonucleoprotein-based CRISPR/Cas9 and homology-directed repair to treat recessive dystrophic epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol. 2024;144(6):1322-1333.e13.
  45. Martufi M, et al. Single-step, high-efficiency CRISPR-Cas9 genome editing in primary human disease-derived fibroblasts. CRISPR J. 2019;2(1):31-40.
  46. Bloomer H, Khirallah J, Li Y, Xu Q. CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated genome and epigenome editing in mammalian cells. Adv Drug Deliv Rev. 2022;181:114087.
  47. Blocher R, et al. Effect of laparoscopic ovum pick-up on ovine in vitro oocyte maturation and somatic cell nuclear transfer embryo development. Anim Reprod Sci. 2026;292:108251.
  48. Campbell KH, Loi P, Otaegui PJ, Wilmut I. Cell cycle co-ordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev Reprod. 1996;1(1):40-46.
  49. Chen Y, Niu Y, Ji W. Genome editing in nonhuman primates: approach to generating human disease models. J Intern Med. 2016;280(3):246-251.
  50. Liu D, Cao D, Han R. Recent advances in therapeutic gene-editing technologies. Mol Ther. 2025;33(6):2619-2644.
  51. Campbell K, Alberio R. Reprogramming the genome: role of the cell cycle. Biosci Proc. 2019.
  52. Chia G, et al. Genomic instability during reprogramming by nuclear transfer is DNA replication dependent. Nat Cell Biol. 2017;19(4):282-291.
  53. Wang X, et al. Epigenetic reprogramming during somatic cell nuclear transfer: recent progress and future directions. Front Genet. 2020;11:205.
  54. Loi P, Iuso D, Czernik M, Ogura A. A new, dynamic era for somatic cell nuclear transfer? Trends Biotechnol. 2016;34(10):791-797.
  55. Zhao J, et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 2010;12(1):75-83.
  56. Huang J, et al. BIX-01294 increases pig cloning efficiency by improving epigenetic reprogramming of somatic cell nuclei. Reproduction. 2016;151(1):39-49.
  57. Han C, et al. Overexpression of TET3 in donor cells enhances goat somatic cell nuclear transfer efficiency. FEBS J. 2018;285(14):2708-2723.
  58. Wang S, et al. Application of gene editing technology in resistance breeding of livestock. Life (Basel). 2022;12(7):1070.
  59. Houdebine LM. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2009;32(2):107-121.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модели заболеваний на овцахCRISPR-Cas9фетальные фибробластынегомологичное соединение концовгомологичная репарациясеквенирование ДНКполимеразная цепная реакция

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.