Методическая статья

Создание генетически модифицированных эмбрионов с использованием редактирования генов и переноса ядер соматических клеток для получения моделей заболеваний человека на овцах

30 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72709

⸱

15 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah State University

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы описываем подход к получению генетически модифицированных эмбрионов с использованием редактирования генов CRISPR-Cas9 и переноса ядер соматических клеток для создания моделей заболеваний человека на овцах. Этот метод идеально подходит для точного редактирования генов в донорских клетках и получения клонированных эмбрионов без генетического мозаицизма.

Аннотация

Модели на крупных животных являются ценными инструментами для исследования заболеваний человека. Овцы, свиньи и козы часто лучше воспроизводят анатомию и физиологию органов человека, а также сложность человеческих заболеваний, что повышает их клиническую значимость по сравнению с грызунами. Технологии CRISPR-Cas9 и перенос ядер соматических клеток (SCNT) позволяют создавать модели на крупных животных с большей точностью, универсальностью и генетической однородностью. Основным преимуществом этого подхода по сравнению с микроинъекцией зиготы является возможность подтвердить in vitro наличие желаемой генетической модификации и потенциальных нецелевых мутаций в отредактированных клетках до получения животных. Кроме того, SCNT исключает вероятность генетического мозаицизма, который часто возникает при микроинъекции зиготы. В данной работе мы описываем получение генетически отредактированных клеток овец с помощью негомологичного соединения концов (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HDR) с последующим созданием клонированных эмбрионов, несущих интересующие мутации. Генетические модификации вводятся путем трансфекции культивируемых соматических клеток, обычно фетальных фибробластов, системой CRISPR-Cas9. Эффективность мутагенеза в пуле клеток оценивается с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) и секвенирования по Сэнгеру отредактированных генов и анализируется с помощью программного обеспечения Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE)/Tracking of Insertions, Deletions, and Recombination events (TIDER). Для получения колоний, происходящих от одной клетки, проводится лимитирующее разведение пула клеток, которые затем скринируют с помощью PCR и секвенирования ДНК отредактированных генов. Донорские клетки с интересующей модификацией (модификациями) затем экспансируют и используют для получения эмбрионов методом SCNT. После лимитирующего разведения и скрининга клеток 2/14 (19,3%) колоний, модифицированных с помощью NHEJ, содержали нокаутные (KO) мутации, а 4/56 (7,1%) колоний, модифицированных с помощью HDR, содержали мутацию F508del. Из четырех колоний было создано в общей сложности 370 генетически модифицированных эмбрионов. Данные методы успешно применяются для точного редактирования генов в фетальных фибробластах и создания генно-инженерных эмбрионов для получения моделей человеческих заболеваний на овцах.

Введение

Модели на животных являются незаменимыми инструментами для понимания биологических механизмов заболеваний человека и разработки новых методов терапии. Модели in vitro, такие как культуры клеток или органоидов, не воспроизводят сложность клеточных субтипов и межклеточных взаимодействий, которые происходят in vivo в органах1,2. Таким образом, животные позволяют создавать модели целого организма с более детальным отображением взаимодействий на клеточном и системном уровнях, прогрессирования заболевания и безопасности терапевтических средств. Грызуны являются практическими модельными организмами благодаря их низкой стоимости, короткому времени смены поколений и всесторонней генетической характеристике. Однако модели заболеваний человека на грызунах ограничены физиологическими и анатомическими различиями с людьми, а также их более быстрым метаболизмом и более коротким сроком жизни3,4. Об этом свидетельствует высокая доля методов терапии, которые прошли испытания на животных моделях (большинство из которых — грызуны), но оказались неэффективными в клинических исследованиях5,6,7,8. Для создания моделей широкого спектра заболеваний человека использовали овец, свиней, коз, собак и приматов, что может помочь повысить показатель клинической трансляции новых методов терапии и лекарственных препаратов3,9,10,1,12. Эти виды также обладают многими преимуществами по сравнению с моделями на грызунах благодаря большему сходству с человеком. Таким образом, модели заболеваний человека на крупных животных обеспечивают наиболее точное из доступных моделирование и играют критическую роль в трансляции результатов исследований на животных в клиническую практику.

Система коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR)-Cas9 представляет собой универсальный и программируемый метод генетической модификации клеток животных и введения точных болезнетворных мутаций. Редактирование генов с помощью CRISPR-Cas9 использует направляющую РНК (гРНК), комплементарную целевому участку, что позволяет CRISPR-ассоциированному белку 9 (Cas9) создавать двухцепочечный разрыв (ДЦР) направленным образом13. Клеточное восстановление ДЦР происходит преимущественно по двум механизмам: негомологичному соединению концов (NHEJ) и гомологично-направленной репарации (HDR). Путь NHEJ восстанавливает ДЦР путем соединения концов ДНК; этот подверженный ошибкам механизм может привести к образованию случайных вставок или делеций (инделей) в месте разрыва14. Такие мутации могут привести к нокауту (KO) гена за счет создания мутации сдвига рамки считывания или преждевременного стоп-кодона, что нарушает функцию гена. HDR, происходящая в основном во время S- и G2-фаз клеточного цикла, представляет собой процесс восстановления клеткой ДЦР с использованием гомологичного аллеля в качестве матрицы репарации15,16. Внесение специфических вставок, делеций или замен, известных как нок-ин (KI), возможно путем введения синтетического одноцепочечного олигодезоксинуклеотида (ssODN) или другой матрицы ДНК с интересующим изменением, которую клетка может использовать для восстановления разрыва. CRISPR-Cas9 также может использоваться для мультиплексного редактирования с целью одновременного введения нескольких мутаций для моделирования мультигенных заболеваний3. По сравнению с предыдущими методами редактирования генов, такими как нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFNs) или нуклеазы TALEN (транскрипционные активаторы, подобные эффекторам), CRISPR-Cas9 гораздо проще и экономичнее в использовании в клетках крупных животных17. Разные локусы можно легко таргетировать путем разработки новой гРНК, что помогло ускорить создание новых моделей крупных животных с использованием CRISPR-Cas93,13. Тем не менее, сохраняется ряд ограничений, включая эффективность редактирования CRISPR-Cas9, которая может значительно варьироваться в зависимости от вида, клеточной среды и характера редактирования18,19. В частности, показатели HDR ниже, чем показатели NHEJ, и сильно зависят от типа клеток, геномных локусов и стадии клеточного цикла20,21. Кроме того, проблемой остается внесение непреднамеренных изменений в нецелевых (off-target) локусах или даже в целевых локусах2. Несмотря на это, CRISPR-Cas9 стала основной платформой редактирования генов для создания генетически модифицированных моделей крупных животных.

Перенос ядра соматической клетки (SCNT) позволяет с высокой точностью и однородностью создавать генетически модифицированные эмбрионы. Этот процесс, впервые успешно проведенный на млекопитающих в 197 году, заключается в переносе ядра клетки в энуклеированный ооцит23. SCNT обладает многими преимуществами по сравнению с другими методами, такими как микроинъекция в зиготу, при которой генетический материал или системы редактирования ДНК вводятся непосредственно в зиготу или ранний эмбрион24,25,26. Микроинъекция в зиготу несет в себе внутренний риск генетической гетерогенности, или мозаицизма, между клетками эмбриона, что может произойти, если репликация ДНК или деление клеток occur до генетической модификации27,28,29. Ценность таких мозаичных эмбрионов для создания животных моделей снижается из-за сложности генотипирования и фенотипической характеристики29. При SCNT редактирование генов отделено от производства эмбрионов; каждый клонированный эмбрион происходит из одной клетки, что исключает риск мозаицизма и гарантирует генетическую однородность эмбриона30,31,32. Кроме того, донорские клетки редактируются и тщательно проверяются in vitro для подтверждения клональности и наличия желаемой модификации перед процедурой SCNT, что экономит время и ресурсы25,26. Это особенно важно при введении специфических KIs. Скрининг клеток также позволяет выявить потенциальные мутации в нецелевых участках, тем самым снижая риск генетических нарушений в других локусах. Эти преимущества снимают многие опасения, связанные с CRISPR-Cas9. Таким образом, SCNT обеспечивает более строгий контроль над генетикой получаемых эмбрионов по сравнению с микроинъекцией в зиготу, особенно при более сложных модификациях, таких как мультиплексное редактирование, крупные вставки и гуманизированные аллели3. Хотя SCNT ограничен низкой эффективностью клонирования, техническими требованиями и аномальным эпигенетическим перепрограммированием (последнее из которых может привести к молекулярным и фенотипическим нарушениям в клонах, потенциально маскируя эффекты генетической модификации у животных-основателей), эти эпигенетические изменения не передаются потомству32,3. Несмотря на эти ограничения, сочетание SCNT с CRISPR-Cas9 позволяет осуществлять точную инженерию генома со строгим контролем генетики эмбриона, поддерживая надежное создание моделей заболеваний на крупных животных без мозаицизма. Здесь мы описываем детальный подход к генетической модификации фетальных фибробластов овец (SFF) с использованием NHEJ или HDR с последующим SCNT для получения клонированных эмбрионов с конечной целью создания моделей заболеваний человека на овцах. Этот подход в значительной степени применим и к другим видам сельскохозяйственных животных, хотя редактирование генов может потребовать оптимизации для различных типов клеток, и данный протокол может служить полезной отправной точкой.

Протокол

Все процедуры с использованием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC: № 1508 и № 1089) Университета штата Юта и проведены в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH). В данном исследовании использовались домашние овцы породы Ромни (Ovis aries) использовались для выделения фибробластов плода овцы (Дополнительный файл 134). См. Рисунок 1 для ознакомления с обзором протокола.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Обзор методов CRISPR-Cas9 и SCNT, используемых для получения генетически модифицированных эмбрионов. Представлено краткое описание каждого из семи основных этапов протокола. Создано в BioRender. Perisse, I. (2026). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Дизайн ПЦР-праймеров, гРНК и шаблонной одноцепочечной олигодезоксирибонуклеотидной последовательности (ssODN)

  1. Откройте геномный регион, подлежащий редактированию, в Benchling (https://www.benchling.com/academic).
  2. Разработайте ПЦР-праймеры для амплификации и секвенирования интересующего геномного региона.
    1. Выделите целевой регион, который необходимо амплифицировать, добавив по 200 пар оснований выше и ниже целевого региона, чтобы обеспечить достаточное расстояние для качественного считывания электрофореграмм и точного анализа эффективности мутаций с помощью программного обеспечения TIDE.
    2. На панели навигации справа выберите Primers (Праймеры) > Create Primers (Создать праймеры) > Wizard (Мастер).
    3. В разделе Region (Регион) нажмите Use Selection (Использовать выделение). В разделе Amplicon (Ампликон) соответствующим образом настройте Size (Размер) и измените любые другие параметры по желанию.
    4. Нажмите Generate Primers (Сгенерировать праймеры). Для заказа выберите одну или несколько пар праймеров с низкими показателями штрафных баллов (penalty scores).
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от вносимого изменения рекомендуется разрабатывать праймеры, которые будут связываться только с правильно отредактированной ДНК, чтобы ускорить скрининг положительных колоний.
  3. Разработайте гРНК для редактирования ДНК с помощью CRISPR-Cas9.
    1. В Benchling выделите целевой регион для редактирования, затем на панели навигации справа выберите CRISPR > Design and analyze guides (Разработка и анализ гидов).
    2. Откройте выпадающее меню Genome (Геном) и выберите или импортируйте геном модельного организма. Настройте любые другие параметры по желанию.
    3. Нажмите Finish (Готово) > +.
    4. В разделе Genome Region (Геномный регион) нажмите No region set (Регион не установлен) и выберите или введите геномный регион, содержащий целевой сайт. Нажмите Set genome region (Установить геномный регион).
    5. Для заказа выберите один или несколько гидов с высокими показателями как специфичности к цели (on-target), так и отсутствия нецелевого воздействия (off-target).
  4. При выполнении редактирования методом нок-ина (KI) разработайте шаблон ssODN.
    1. На панели навигации справа выберите CRISPR > Design HR template (ssODN) (Разработка шаблона гомологичной рекомбинации (ssODN)).
    2. Откройте выпадающее меню Genome (Геном) и выберите или импортируйте геном модельного организма. Нажмите Create (Создать).
    3. Перейдите на вкладку SEQUENCE MAP (Карта последовательности), выделите основания, которые необходимо отредактировать, и создайте модифицированную версию последовательности ДНК, введя желаемые изменения с клавиатуры. Вернитесь на вкладку DESIGN HR TEMPLATE (Разработка шаблона HR) и нажмите Next (Далее).
    4. Настройте Template region (Регион шаблона) так, чтобы с каждой стороны от места редактирования было не менее 50 пар оснований плеч гомологии, затем нажмите Next (Далее).
    5. В поле Guide (Гид) введите последовательность гРНК, выбранную на этапе 1.3.5, чтобы ввести сайлентные мутации, нарушающие мотив прилегающей к протоспейсеру последовательности (PAM). Нажмите Next (Далее).
    6. Нажмите Copy the template (Копировать шаблон) и закажите сгенерированный шаблон ssODN.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности ПЦР-праймеров, гРНК для CRISPR-Cas9 и шаблонов ssODN, разработанных в Benchling для создания модели муковисцидоза у овец с нокаутом (KO) или мутацией F508del, представлены в Таблице 1.

2. Приготовление сред

  1. Приготовьте среду для культивирования клеток, добавив в модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen/Strep) (v/v). Перед использованием предварительно прогрейте среду на водяной бане при 37 °C.
  2. Приготовьте среду для замораживания, добавив в DMEM 45% FBS и 10% диметилсульфоксида (DMSO).
  3. Приготовьте среду для сбора ооцитов, добавив в среду M19 1% Pen/Strep, 0,3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) фракции V, 1% FBS и 0,06% гепарина натрия.
  4. Закажите среды для созревания in vitro (IVM) и культивирования in vitro (IVC) , которые представляют собой коммерчески доступные бессывороточные среды, предназначенные соответственно для созревания бычьих ооцитов и культивирования эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чашки для этапов после слияния и для IVC готовят, нанося семь капель среды IVC по 40 µL и покрывая их минеральным маслом, протестированным на эмбрионах.
  5. Приготовьте среду для голодания клеток, добавив в DMEM с высоким содержанием глюкозы 0,5% FBS и 1% Pen/Strep (v/v). Перед использованием предварительно прогрейте среду на водяной бане при 37 °C.
  6. Приготовьте синтетическую жидкость яйцевода с добавлением HEPES (HSOF) согласно ранее описанному методу35.
  7. Приготовьте среду для энуклеации, добавив в 50 µL среды HSOF 4,5 mM сахарозы и 10 µg/mL цитохалазина B (CB).
  8. Приготовьте среды для инъекций, добавив в 50 µL среды HSOF 10 µg/mL цитохалазина B (CB).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среды для энуклеации и инъекций готовят свежими в день проведения SCNT. Одну каплю (20 µL) каждой среды помещают в чашки диаметром 10 мм и покрывают минеральным маслом, протестированным на эмбрионах.
  9. Приготовьте среду для слияния согласно ранее описанному методу35. Извлеките 5–10 mL среды для слияния из температуры 4 °C и выдержите при комнатной температуре до использования.
  10. Приготовьте среду CB, добавив в среду IVC 10 µg/mL CB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чашку с CB готовят, нанося семь капель среды CB по 40 µL и покрывая их минеральным маслом, протестированным на эмбрионах.
  11. Приготовьте среду с иономицином, добавив в среду HSOF 5 µM соли кальция иономицина.
  12. Приготовьте среду для активации, добавив в среду IVC 2 mM 6-диметиламинопурина (DMAP) и 10 µg/mL циклогексимида (CHX).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чашку для активации готовят, нанося семь капель среды для активации по 40 µL и покрывая их минеральным маслом, протестированным на эмбрионах.

3. Трансфекция CRISPR-Cas9 в SFF

  1. (Условия) Все процедуры по культивированию клеток следует проводить в боксе биологической безопасности или в ламинарном шкафу. Культивируйте SFF в T-25 флаконе в среде для культур клеток при 37 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 до достижения примерно 70%–80% конфлюэнтности перед трансфекцией.
  2. Удалите всю среду из флакона и один раз промойте клетки 5 mL фосфатно-солевого буферного раствора Дульбекко (DPBS). Инкубируйте с 1 mL трипсин-подобного фермента для диссоциации в течение 5–10 мин до диссоциации клеток.
  3. Разведите трипсин-подобный фермент равным объемом среды для культур клеток и центрифугируйте клетки при 20 × g в течение 5 мин.
  4. (Сроки) Подготовьте комплекс рибонуклеопротеина (RNP) gRNA:Cas9, инкубируя 2.5 µL 10 µM gRNA с 2.5 µL 5 µg/µL белка Cas9 в течение 10 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение Cas9 RNP:gRNA может потребовать оптимизации в зависимости от типа клеток, целевого гена и количества мишеней.
  5. Приготовьте раствор для нуклеофекции, смешав 82 µL раствора для нуклеофекции с 18 µL раствора-добавки.
  6. Смешайте раствор для нуклеофекции с комплексом RNP и, если используется ssODN, добавьте 2 µL 20 µM ssODN, затем аккуратно перемешайте путем пипетирования.
  7. После центрифугирования осторожно удалите супернатант и переверните пробирку на безворсовую салфетку, чтобы удалить остатки среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки культуральной среды могут повлиять на эффективность трансфекции и жизнеспособность клеток. Убедитесь, что избыток жидкости полностью удален перед ресуспендированием клеточного осадка в растворе для нуклеофекции.
  8. (Критический этап) Ресуспендируйте фибробласты в растворе для нуклеофекции, затем перенесите смесь в нуклеокуветт объемом 10 µL, избегая образования пузырьков. Аккуратно постучите нуклеокуветт о твердую поверхность, чтобы смесь опустилась на дно куветты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха внутри нуклеокуветты могут помешать электропорации.
  9. (Соответствующая настройка) Проведите электропорацию клеток, используя программу EH-10 или в соответствии с рекомендациями производителя. Дайте клеткам восстановиться в течение 10 мин при комнатной температуре.
  10. С помощью переносной пипетки перенесите электропорированные клетки в 5 mL предварительно уравновешенной среды для культур клеток, дополненной усилителем HDR до конечной концентрации 1–2 µM (в других типах клеток может потребоваться оптимизация).
  11. (Условия) Культивируйте клетки в среде для культур клеток при 37 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение 48 ч перед выделением геномной ДНК.
  12. Удалите среду из культур, один раз промойте DPBS и добавьте 1 mL трипсин-подобного фермента для диссоциации.
  13. После открепления клеток добавьте 1 mL среды для культур клеток, чтобы развести трипсин-подобный фермент.
  14. Распределите примерно две трети клеточной суспензии для криоконсервации и одну треть для экстракции геномной ДНК в маркированные пробирки объемом 1.5 mL. Центрифугируйте все пробирки при 200 × g в течение 5 мин.
  15. Ресуспендируйте клеточный осадок, предназначенный для криоконсервации, в 50 µL среды для замораживания. Перенесите ресуспендированные клетки в криопробирки и поместите их в контейнер для замораживания с контролируемой скоростью при -80 °C, сводя к миниму время пребывания клеток в среде для замораживания перед переносом при -80 °C.
  16. Ресуспендируйте клеточный осадок, предназначенный для экстракции ДНК, в 20 µL DPBS. Выделите геномную ДНК, используя набор для очистки геномной ДНК в соответствии с инструкциями производителя.

4. Анализ эффективности редактирования генома

  1. Амплифицируйте целевые локусы из выделенной ДНК, используя высокоточную ДНК-полимеразу и ранее разработанные праймеры для ПЦР.
  2. Подтвердите ПЦР-амплификацию с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с использованием маркера ДНК 1 kb.
  3. Очистите продукты ПЦР с помощью набора для очистки продуктов ПЦР и направьте их на секвенирование по Сэнгеру.
  4. Если проводился нокаут (KO), используйте программное обеспечение TIDE (https://apps.datacurators.nl/tide) для оценки эффективности редактирования36. Для точного анализа эффективности редактирования используйте высококачественные хроматограммы с минимальным фоновым сигналом.
    1. Откройте TIDE и укажите название образца в поле Title plot. В поле Guide sequence введите последовательность использованной гРНК.
    2. В разделе Control Sample Chromatogram нажмите Browse и загрузите хроматограмму неотредактированного контрольного образца.
    3. В разделе Test Sample Chromatogram нажмите Browse и загрузите хроматограмму отредактированного тестового образца.
    4. Перейдите на вкладку Decomposition, чтобы просмотреть спектр инделей и эффективность мутации. Проверьте значение R2 в правом верхнем углу спектра инделей.
    5. Если значение R2 меньше 0,9, отметьте поле Advanced settings в разделе Parameters и отрегулируйте ползунки окна выравнивания, окна декомпозиции и размера инделя до тех пор, пока значение R2 не станет больше 0,9 и не будет достигнуто правильное выравнивание.
  5. Если проводился нокин (KI), используйте программное обеспечение TIDER (https://apps.datacurators.nl/tider) для оценки эффективности редактирования37.
    1. Откройте TIDER. Укажите название образца в поле Title plot. В поле Guide sequence введите последовательность использованной гРНК.
    2. В разделе Control Sample Chromatogram нажмите Browse и загрузите хроматограмму неотредактированного контрольного образца.
    3. В разделе Reference Chromatogram нажмите Browse и загрузите хроматограмму референсного образца, содержащего желаемую правку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если такая последовательность отсутствует, ее можно создать путем ПЦР-амплификации с использованием дополнительных праймеров, разработанных для внесения мутации в последовательность ДНК38.
    4. В разделе Test Sample Chromatogram нажмите Browse и загрузите хроматограмму отредактированного тестового образца.
    5. Перейдите на вкладку Decomposition, чтобы просмотреть спектр инделей, эффективность мутации и эффективность HDR. Проверьте значение R2 в правом верхнем углу спектра инделей.
    6. Если значение R2 меньше 0,9, отметьте поле Advanced settings в разделе Parameters и отрегулируйте ползунки окна выравнивания, окна декомпозиции, расстояния выше сайта разрыва и размера инделя до тех пор, пока значение R2 не станет больше 0,9 и не будет достигнуто правильное выравнивание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (Критически важно) В случае низкого качества файла секвенирования может потребоваться повторное секвенирование.

5. Изоляция и скрининг одноклеточных колоний

  1. (Условия) Разморозить и культивировать трансфицированные SFF в флаконе T-25 в течение ночи при 37 °C в атмосфере с 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 или до достижения клетками примерно 80% конфлюэнтности.
  2. Удалить среду, один раз промыть клетки 5 мл DPBS и диссоциировать клетки с помощью 1 мл трипсиноподобного фермента для диссоциации.
  3. Добавить питательную среду для разведения трипсиноподобного фермента и перенести клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугировать клетки при 20 × g в течение 5 мин.
  4. Удалить супернатант и ресуспендировать осадок клеток в 1 мл питательной среды. Аккуратно, но тщательно перемешать до получения гомогенной суспензии одиночных клеток.
  5. (Критически важно) Приготовить разведение клеточной суспензии 1:10, затем подсчитать количество клеток с помощью гемоцитометра и трипанового синего.
  6. Рассчитать объем разведенной клеточной суспензии, необходимый для посева примерно одной клетки на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для пяти 96-луночных планшетов подготовить примерно 50 клеток.
  7. В конической пробирке объемом 50 мл подготовить по 10 мл питательной среды на один 96-луночный планшет.
  8. Добавить рассчитанный объем разведенной клеточной суспензии (1:10) в питательную среду и хорошо перемешать путем осторожного пипетирования и инверсии.
  9. Перелить разведенную клеточную суспензию в стерильный резервуар для реагентов.
  10. Раздать по 100 µL клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета.
  11. (Условия) Инкубировать планшеты при 37 °C в атмосфере с 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение 5 дней.
  12. Осмотреть каждую лунку под микроскопом и отметить лунки, содержащие одну колонию. Исключить лунки, содержащие более одной колонии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии, производные от одной клетки, обычно имеют круглую, компактную форму и морфологически однородны.
  13. Вернуть планшеты в инкубатор и культивировать еще 2 дня при тех же условиях.
  14. После в общей сложности 7 дней культивирования в 96-луночных планшетах удалить среду из лунок, содержащих одну растущую колонию. Каждый выбранный лунку один раз промыть DPBS.
  15. Добавить по 100 µL трипсиноподобного фермента для диссоциации в каждую выбранную лунку и инкубировать до открепления клеток. Добавить по 10 µL питательной среды в каждую лунку для разведения трипсиноподобного фермента.
  16. Перенести весь объем из каждой лунки в одну лунку 24-луночного планшета.
  17. Промыть исходный 96-луночный планшет дополнительной питательной средой и перенести промывочный раствор в соответствующую лунку 24-луночного планшета для максимального восстановления клеток. Довести конечный объем в каждой лунке 24-луночного планшета до 500 µL питательной средой.
  18. (Условия) Инкубировать 24-луночные планшеты при 37 °C в атмосфере с 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение 3 дней.
  19. Осмотреть лунки под микроскопом и выбрать колонии, близкие к конфлюэнтности.
  20. Удалить среду из лунок, выбранных для сбора, один раз промыть DPBS и добавить 50 µL трипсиноподобного фермента для диссоциации.
  21. После открепления клеток добавить 1 мл питательной среды для разведения трипсиноподобного фермента.
  22. Заморозить клетки и выделить геномную ДНК согласно этапам 3.14–3.16.
  23. Амплифицировать целевые локусы с помощью ПЦР и подтвердить генотип методом секвенирования по Сэнгеру.
  24. Идентифицировать колонии дикого типа, KO и KI на основании результатов секвенирования. Использовать анализ TIDE/TIDER, как описано в этапах 4.4 и 4.5, для оценки частоты HDR и спектра инделей с целью подтверждения правильного редактирования и идентификации колоний, производных не от одной клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе также может быть проведен анализ внецелевой активности (Supplementary File 1).
  25. Экспансировать только колонии с желаемым генотипом и нормальной морфологией клеток для последующих экспериментов по SCNT.

6. Сбор ооцитов овец и их созревание in vitro

  1. Соберите яичники овец на местном абийноре и доставьте их в лабораторию в 0.9% физиологическом растворе при 25 °C в течение 4 ч после сбора.
  2. Проведите созревание ооцитов in vitro.
    1. Выделите кумулюс-оцитные комплексы (КОК) из яичников с помощью скальпеля, надрезая поверхность яичника, погруженного в среду для сбора ооцитов.
    2. (Сроки) Для IVM отберите КОК, имеющие как минимум 1–3 слоя компактных клеток кумулюса и однородную цитоплазму. Промойте КОК в свежей среде для сбора ооцитов и культивируйте в предварительно уравновешенной среде для IVM (до 40 КОК на лунку с 50 µL среды для IVM в 4-луночном планшете); инкубируйте при 38.5 °C с 5% CO2 в течение 21–2 ч.
  3. Проверьте созревание ооцитов.
    1. Перенесите необходимое количество КОК с помощью пипетки на 20 µL в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 mL, добавив в пробирку равный объем (1:1) гиалуронидазы в концентрации 0.6 mg/mL.
    2. Пипетируйте смешанный раствор вверх и вниз до полного удаления клеток кумулюса. Перенесите ооциты в каплю среды HSOF объемом 1 mL и промойте их, последовательно перенося через три дополнительные капли HSOF.
    3. С помощью ротового дозатора или пипетки на 10 µL с наконечником перекатывайте ооциты под стереомикроскопом и отберите те, у которых наблюдается полярное тельце. Приемлемый уровень экструзии полярного тельца составляет 50%–80%.

7. Перенос ядер соматических клеток

  1. Подготовка донорских клеток перед SCNT.
    1. Разморозьте криоконсервированные клетки за 3–5 дней до SCNT на водяной бане при 37 °C в течение 1–2 мин, пока в пробирке не исчезнет лед.
    2. Перенесите суспензию клеток и добавьте равный объем среды для культивирования клеток в центрифужную пробирку объемом 15 mL; центрифугируйте при 406 x g в течение 5 мин.
    3. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в 50 µL среды для культивирования клеток.
    4. (Условия) Рассейте клетки в различных концентрациях в 4-луночном планшете с конечным объемом 50 µL на лунку и культивируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2.
    5. Заменяйте среду для культивирования клеток каждые 48 ч. После достижения клетками полной конфлюэнтности замените ее на среду для голодания клеток за 24–48 ч до SCNT.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Голодание клеток более 48 ч может увеличить долю апоптоза39,40.
  2. Подготовка донорских клеток (в день SCNT).
    1. Удалите среду для голодания из лунки и один раз промойте 50 µL DPBS (-).
    2. Добавьте 250 µL трипсиноподобного фермента для диссоциации и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин или до тех пор, пока клетки не открепятся от планшета.
    3. Добавьте 500 µL среды для культивирования клеток, чтобы разбавить трипсиноподобный фермент для диссоциации.
    4. Перенесите клетки в центрифужную пробирку объемом 15 mL и центрифугируйте при 406 x g в течение 5 мин.
    5. Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 60–80 µL среды HSOF; храните при 4 °C до использования.
  3. Энуклеация ооцитов.
    1. Подготовьте удерживающие пипетки, вытягивая тонкостенные стеклянные капилляры с помощью пуллера микропипеток и формируя их на микрофорже для достижения внутреннего диаметра 30 µm и внешнего диаметра 10 µm.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обе пипетки также можно приобрести у коммерческих поставщиков.
    2. Подготовьте инъекционные пипетки, вытягивая тонкостенные стеклянные капилляры пуллером микропипеток, затачивая под углом 45° с помощью микрошлифовальной машины и формируя на микрофорже для достижения внутреннего диаметра 20–25 µm. Параметры пуллера микропипеток, микрофоржа и микрошлифовальной машины приведены в предыдущем отчете41.
    3. Перенесите ооциты в стадии метафазы II (MII), имеющие полярное тельце, в каплю среды для энуклеации. Иммобилизуйте ооцит с помощью удерживающей пипетки так, чтобы полярное тельце находилось в положении «на 4–5 часов».
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные рабочие процедуры микроманипуляций можно найти в предыдущем отчете41.
    4. (Критический этап) Используйте скошенную инъекционную пипетку с острым кончиком, чтобы проколоть zona pellucida и аспирировать полярное тельце и 10%–20% цитоплазмы под полярным тельцем.
    5. Вытолкните удаленную цитоплазму в каплю и освободите ооцит из удерживающей пипетки.
    6. Повторите шаги 7.3.2–7.3.4 для всех ооцитов до завершения энуклеации всех клеток. Перенесите энуклеированные ооциты в среду для IVM и инкубируйте при 38.5 °C и 5% CO2 в течение 30 мин.
  4. Инъекция донорских клеток в энуклеированные ооциты.
    1. Добавьте подготовленную суспензию клеток на дно капли среды для инъекций и перенесите энуклеированные ооциты в эту же каплю.
    2. Выберите 1–10 округлых здоровых клеток и аспирируйте их в инъекционную пипетку.
    3. Используя удерживающую пипетку, иммобилизуйте ооцит, а с помощью инъекционной пипетки проколите zona pellucida и поместите одну клетку между zona и ооплазмой.
    4. Повторите шаги 7.4.2–7.4.3 для всех энуклеированных ооцитов и перед слиянием клеток перенесите их в 2–3 mL среды HSOF в чашку диаметром 35 mm.
  5. Слияние энуклеированных ооцитов и донорских клеток.
    1. Подключите кабели генератора импульсов для электрофузии к проводам камеры микропрепарата (0.5 mm) и поместите камеру на предметный столик микроскопа.
    2. Добавьте в камеру 60 µL среды для слияния.
    3. (Критический этап/соответствующая настройка) Выровняйте 4–6 пар «цитоплазма-клетка» между двумя проводами камеры так, чтобы донорская клетка находилась в положении «на 6 или 12 часов». Подайте два импульса электрофузии постоянного тока 2.0 kV/cm в течение 40 µs.
    4. Извлеките пары «цитоплазма-клетка» из камеры для слияния и поместите их в новую чашку диаметром 35 mm, содержащую 2–3 mL среды HSOF.
    5. (Условия) Повторяйте шаги 7.5.3–7.5.4, пока все инъецированные ооциты не пройдут процесс слияния. Промойте полученные пары в чашке для постфузионной обработки и инкубируйте при 38.5 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение 30 мин. Заменяйте среду для слияния в камере каждые 15–20 мин.
  6. Активация и культивирование эмбрионов.
    1. (Условия) Через 30 мин после слияния все слитые эмбрионы сначала инкубируют в среде CB при 38.5 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение 45 мин.
    2. После этого пары активируют в 5 µM иономицина, разведенного в HSOF, в течение 5 мин, с последующей инкубацией в среде для активации в течение 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда с иономицином готовится непосредственно перед использованием. Для улучшения полноценного развития рекомендуется проводить активацию через 24–26 ч после созревания.
    3. (Условия) После активации реконструированные эмбрионы промывают и культивируют в среде для IVC (максимум 40 эмбрионов на каплю 40 µL) при 38.5 °C в атмосфере 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 в течение ночи или до переноса эмбрионов.

Результаты

Основные этапы протокола обобщены в Рисунок 1Мы использовали систему CRISPR-Cas9 и метод переноса ядер соматических клеток (SCNT) для создания модели муковисцидоза (CF) на овцах, содержащей либо нокаутную (KO) индельную мутацию, возникшую в результате негомологичного соединения концов (NHEJ), либо мутацию F508del, полученную посредством гомологичной рекомбинации (HDR). Часть этих результатов была опубликована ранее.42,43Мы разработали гРНК и ПЦР-праймеры для обеих стратегий с целью таргетирования экзона 1 регуляторного белка трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTRген на основе последовательности овцы из GenBank (NC_019461.2.0). Также был разработан одноцепочечный олигодезоксирибонуклеотид (ssODN) для нок-ин (KI) мутации F508del — делеции трех пар оснований, которая является наиболее распространенной мутацией, вызывающей муковисцидоз у людей. Рисунок 2A представляет экзон 1 CFTR а также стратегии таргетинга для нокаута (KO) и нок-ина (KI), включая относительное расположение гРНК, ПЦР-праймеров и мутаций. Спертозоальные фиброзные тельца (SFF) были впервые выделены из организма самца и самки домашней породы овец Ромни (О. aries) плод на 45-й день гестации. Трансфекция с gRNA 1 для нокаута (KO) CFTR затем была выполнена посредством электропорации плазмиды pX30-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (плазмида Addgene 4230), как описано ранее43Трансфекция РНП CRISPR-Cas9: комплексы gRNA с gRNA 2 и ssODN 1 были введены методом электропорации для нок-ин (KI) мутации F508del. Анализ TIDE показал, что 46,9% клеток в пуле содержат делецию 3 нуклеотидов (нт), при этом R2 составило 0,96. Спектр инделей и расчетная эффективность представлены на Рисунок 2BМетодом предельного разведения было изолировано в общей сложности 170 колоний, происходящих из одной клетки, которые были проанализированы с помощью ПЦР и секвенирования по Сэнгеру. Из трансфекции без использованием ssODN было изолировано 114 колоний, 2 из которых (19,3%) содержали нокаут-мутации (KO). При трансфекции ssODN с мутацией F508del было получено 56 колоний, четыре из которых (7,1%) были гомозиготными по F508del. Две колонии с KO-мутациями были отобраны и использованы в качестве донорских клеток для получения CFTR-/- эмбрионы методом SCNT. KO-мутации представляли собой делеции 2 и 7 нуклеотидов соответственно. Результаты секвенирования по Сэнгеру этих колоний представлены на Рисунок 2CДля получения продукции были отобраны две колонии с мутацией F508del. CFTRF508del/F508del эмбрионов, а результаты их секвенирования по Сэнгеру представлены в Рисунок 2DВсего было получено 370 эмбрионов, из которых 23 содержали нокаутную (KO) мутацию и 137 — мутацию F508del (Таблица 2). Для in vitro в ходе развития доля бластоцист среди эмбрионов овец, полученных методом SCNT, составила примерно 10–15%. Данный протокол был успешно применен для редактирования CFTR ген в SFF и получение эмбрионов для создания овечьей модели муковисцидоза.

figure-results-1
Рисунок 2Получение CFTR -/- и CFTRF508del/F508del Клетки SFF. (A) Схематическое изображение экзона 1 CFTR сайты-мишени гена и системы CRISPR-Cas9, использованные для введения нокаутных (KO) мутаций с помощью негомологичного соединения концов (слева) и нок-ин (KI) мутаций F508del с помощью гомологичной рекомбинации (справа). Стрелками indicated прямой и обратный праймеры 1 (синий) и прямой и обратный праймеры 2 (розовый), использованные для амплификации экзона 1.B) График, отображающий спектр инделей и общую расчетную эффективность редактирования на основе данных секвенирования по Сэнгеру пула клеток, трансфецированных Cas9: gRNA 2 и ssODN1 для введения мутации F508del. Частота делеций 3 нуклеотидов в этих клетках составила 46,9%, что соответствует мутации F508del, при этом R2 0,96. (СРезультаты секвенирования по Сэнгеру для колоний клеток CF19F и CF49, содержащих случайные биаллельные нокаутные мутации. В обеих колониях наблюдаются короткие делеции (CF19F, -2 нуклеотида; CF49, -7 нуклеотидов).D) Результаты секвенирования по Сенгеру для колоний клеток, содержащих мутацию F508del, с делецией «CTT». Создано в BioRender. Perisse, I. (2026) https://BioRender.com/v74agcd. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ИмяМутацияПоследовательность
Прямой праймер 1Нокаут (KO)GCATAGCAGCATACCCAA
Обратный праймер 1нокаутGTAACCAAACCAGCCCAC
гРНК 1Нокаут (KO)GGGAGAATTGGAACCTTCAG
Прямой праймер 2F508delTGAACTCAGCACCCCATCTCTG
Обратный праймер 2F508delTGCAGGCTTCTTATAGCAGGGG
гРНК 2F508delATTAAAGATAACATCATCTT
одноцепочечный олигодезоксинуклеотид (оцОДН) 1F508delT*G*CTCTCAGTATTCCTGGATCATG
CCTGGAACCATTAAAGATAACATCA
TTGGTGTTTCCTATGATGAATAGA
TATAGGAGTGTCATCAAAGCATG*C*C

Таблица 1: Последовательности сконструированных олигонуклеотидов. Последовательности ПЦР-праймеров, гидовых РНК (гРНК) CRISPR-Cas9 и матричных одноцепочечных олигодезоксинуклеотидов (ssODN), разработанных в Benchling и использованных для создания модели муковисцидоза у овец, содержащей либо нокаутную (KO) мутацию, либо мутацию F508del. Символ «*» обозначает фосфоротиоатную модификацию.

КолонияГенотипКоличество эмбрионов
CF19F-/-134
CF49-/-9
Fd78F508del/F508del10
Fd92F508del/F508del27
Итого370

Таблица 2: Сводные данные по колониям, использованным в качестве донорских клеток, и полученным эмбрионам.Всего было использовано четыре колонии для получения 370 эмбрионов с мутациями в гене CFTR. Две колонии содержали нокаутные (KO) мутации, и две содержали мутацию F508del по типу нок-ин (KI). Все колонии были получены из клеток самцов, за исключением CF19F, которая была получена из клеточной линии самки.

Дополнительный файл 1: Протокол выделения фибробластов плода овцы и анализ нецелевого воздействия.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В данной процедуре разработка эффективных праймеров, гРНК и ssODN имеет решающее значение для успешного редактирования генов. Плохое связывание этих молекул может затруднить редактирование генов и идентификацию подходящих колоний, что препятствует переходу к SCNT. Перед тем как приступить к изоляции колоний из единичных клеток, рекомендуется приобрести несколько вариантов каждой последовательности для тестирования и оптимизации. Трансфекция плазмид Cas9 для KO в фибробластах обычно приводит к субоптимальной эффективности редактирования, поэтому для достижения более высокой эффективности (70%–90%)4,45,46 рекомендуется использовать Cas9 RNP. Успешное разведение до единичных клеток должно привести к получению аналогичной доли колоний с KO. Ожидаемая эффективность редактирования для KI сильно зависит от типа вносимой модификации; по нашему опыту, делеции обычно протекают эффективнее, чем вставки или замены. Соответственно, доля колоний с мутацией KI после разведения до единичных клеток также будет варьироваться. В наших результатах частота колоний, содержащих мутацию F508del (7,1%), была намного ниже расчетного уровня редактирования (46,9%), что не является идеальным. Даже при низкой частоте правильных правок в колониях, полученных из единичных клеток, все еще можно получить множество эмбрионов. Однако чем выше доля полезных колоний, тем меньше времени и ресурсов требуется, что делает оптимизацию важным этапом. Для устранения причин низкой эффективности редактирования генов убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха в кювете во время электропорации, оптимизируйте соотношение Cas9:гРНК путем титрования, а также протестируйте альтернативные гРНК или ssODN. Кроме того, использование Cas9 RNP важно для эффективности редактирования, так как результаты показывают, что доставка плазмид приводит к редактированию с более низкой эффективностью43. При низкой жизнеспособности и плохом росте колоний во время разведения до единичных клеток рассмотрите возможность увеличения процента сыворотки в среде, добавления добавок факторов роста или корректировки плотности посева. Обеспечьте точный подсчет клеток перед посевом и тщательно перемешайте клеточную суспензию.

Метод SCNT является ценным инструментом для создания животных моделей, однако он включает несколько критических этапов, которые могут повлиять на результаты развития. Во-первых, на качество ооцитов обычно влияют возраст донора и сезон, поскольку большинство пород овец являются сезонными размножателями. Тем не менее, наши предыдущие результаты показали, что сезон не влиял на развитие эмбрионов in vitro, когда яичники/оциты собирали у допубертатных овец на бойнях47. Кроме того, при использовании ооцитов взрослых животных развитие in vivo было сопоставимо с развитием, наблюдавшимся при использовании допубертатных ооцитов35. Время активации эмбрионов овец, полученных методом SCNT, имеет решающее значение для развития до полного срока. Было показано, что ранняя активация в интервале 24–26 ч после созревания снижает вероятность ранней потери беременности и увеличивает долю развития до полного срока35. Это может быть связано со средой с высоким содержанием фактора, стимулирующего созревание (MPF), что характерно для ранней активации и способствует повышению скорости преждевременной конденсации хромосом (PCC) соматического ядра, что, как полагают, благоприятно сказывается на репрограммировании48.

Система CRISPR-Cas9 обладает множеством преимуществ перед другими методами редактирования генов благодаря своей универсальности, программируемости и простоте17. Несмотря на эти сильные стороны, существуют и определенные ограничения. Эффективность редактирования и нецелевая активность CRISPR-Cas9 могут варьироваться в зависимости от вида, типа клеток, геномного локуса, дизайна гРНК и вида вносимого изменения, при этом эффективность зачастую оптимизирована для клеток грызунов или человека18,49. Кроме того, не все участки могут быть доступны для редактирования с использованием традиционного PAM-последовательности NGG для SpCas9. Для преодоления этих ограничений существует множество стратегий, включая оптимизацию дизайна гРНК и доставку Cas9 в виде рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП)50. Были обнаружены или созданы методами генной инженерии многочисленные варианты нуклеаз Cas с более высокой активностью редактирования, повышенной точностью и более широким диапазоном мишеней. Более того, были разработаны несколько альтернативных систем редактирования генома, включая базовые редакторы, праймированные редакторы и редакторы на основе рекомбиназ, многие из которых опираются на белки с CRISPR-направлением50. Редактирование с помощью рекомбиназ особенно полезно для вставки крупных фрагментов ДНК. Любая из этих стратегий может быть потенциально применена для улучшения результатов редактирования в данном протоколе.

По сравнению с зиготической микроинъекцией, SCNT обеспечивает более точный контроль над генетикой эмбрионов благодаря возможности скрининга донорских клеток in vitro на клональность, а также на наличие целевых и внецелевых мутаций перед созданием эмбрионов. Это позволяет подтвердить желаемую генетическую модификацию и исключает риск мозаицизма в полученных эмбрионах24,25,26. Примечательно, что в условиях высокого уровня MPF ядра донорских клеток в фазе G0/G1 могут подвергаться PCC с более нормальной репликацией ДНК, тогда как ядра донорских клеток в S- и G2-фазах склонны к повреждениям ДНК и хромосомным аномалиям51,52. Следовательно, координация фаз клеточного цикла донорской и реципиентной клеток имеет решающее значение для успешного репрограммирования. Кроме того, среды для IVM и IVC могут влиять на развитие эмбрионов, полученных методом SCNT. Синдром крупного плода (LOS) часто встречается у эмбрионов крупного рогатого скота и овец, полученных путем оплодотворения in vitro и SCNT. Одним из возможных способствующих факторов является присутствие сыворотки в средах для созревания ооцитов и культивирования эмбрионов. Таким образом, использование безсывороточной среды может снизить частоту возникновения LOS при получении животных методом SCNT у овец и повысить общую эффективность SCNT. Метод SCNT по-прежнему ограничен низкой эффективностью, высокой стоимостью, необходимостью в специализированном оборудовании, техническом опыте манипуляций с эмбрионами и большом количестве реципиентов, хотя было разработано несколько стратегий по повышению эффективности клонирования путем регулирования эпигенетического репрограммирования53. Эти стратегии включают использование препаратов, модифицирующих эпигеном, или нокдаун эпигенетических регуляторов, контролирующих метилирование ДНК, модификации гистонов или инактивацию X-хромосомы. Несмотря на ограниченный успех при переносе этих результатов с мышей на виды сельскохозяйственных животных, несколько из этих методов были использованы для повышения эффективности клонирования у свиней и коз54,5,56,57.

Тем не менее, CRISPR-Cas9 и SCNT представляют собой эффективную комбинацию методов для получения генетически модифицированных эмбрионов. Система CRISPR-Cas9 проще и более программируема, чем ZFN или TALEN, что обусловило ее доминирующее положение в области редактирования генов. SCNT повышает точность получения эмбрионов, позволяя проводить генетический скрининг перед переносом ядер и исключая риск мозаицизма. Помимо создания моделей животных заболеваний, этот метод имеет широкое применение в сельском хозяйстве и биомедицине. В животноводстве его можно использовать для повышения устойчивости к болезням, толерантности к климатическим условиям и улучшения продуктивных признаков25,58. Кроме того, существует возможность выращивания в животных иммуноинженерных органов для ксенотрансплантации человеку или использования животных в качестве биореакторов для производства ценных антител, ферментов или терапевтических белков в медицинских или промышленных целях3,59. Таким образом, CRISPR-Cas9 и SCNT являются мощными подходами, которые обеспечивают точное и универсальное редактирование генома в сочетании со строгим контролем генетики эмбрионов для создания моделей заболеваний человека на крупных животных.

Раскрытие информации

Авторы использовали Grammarly (Grammarly Inc.) и ChatGPT (OpenAI) для улучшения языка и удобочитаемости рукописи в соответствии с правилами, принятыми в научных издательствах. Эти инструменты не использовались для создания оригинального текста, исследовательских концепций, данных, изображений или рисунков в данном предложении. После использования этих инструментов авторы проверили и при необходимости отредактировали содержимое и несут полную ответственность за данный контент.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Сельскохозяйственной экспериментальной станцией штата Юта (UTAO1328) и Фондом борьбы с муковисцидозом (грант POLEJA23PO).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Маркер молекулярной массы ДНК 1 kbThermo Fisher ScientificSM0313Маркер размера ДНК
Центрифужная пробирка 15 mLThermo Fisher Scientific12-565-269
Микроцентрифужная пробирка 1,5 mLThermo Fisher Scientific05-408-129
4D-Nucleofector Core UnitLonzaAAF-103B
4D-Nucleofector X UnitLonzaAAF-103X
4-луночный планшет (чашка)Nunc144
Центрифужная пробирка 50 mLThermo Fisher Scientific12-565-270
6-DMAPSigma-AldrichD2629
24-луночный планшетCorning3524Экспансия клеток
96-луночный планшетCorning3596Изоляция одноклеточных колоний
АгарозаThermo Fisher ScientificBP160-100Электрофорез в агарозном геле
Стакан (250 mL)Kimble140-250
Программное обеспечение BenchlingBenchlinghttps://www.benchling.com/academicВыравнивание и анализ последовательностей
Среда IVCIVF Bioscience7105
Среда IVMIVF Bioscience7101
BSAGold BioA-421-250
BTX ECMBTXECM-20Оборудование (снято с производства)
Микрослайдовая камера BTXBTX450103
Белок Cas9Integrated DNA TechnologiesCustomРедактирование генома CRISPR-Cas9
Глюконат хлоргексидина (2%)Aspen Vet11584915
CHXSigma-AldrichC7698
Программное обеспечение CRISPORCRISPORhttps://crispor.gi.ucsc.edu/ПО для прогнозирования нецелевых эффектов (off-target)
КриопробиркаThermo Fisher Scientific12-565-163N
Цитохалазин BSigma-AldrichC6762
ДиметилсульфоксидFisher ScientificBP231-10Реагент для криоконсервации
DMEM с высоким содержанием глюкозыCytivaSH3002Среда для культивирования фибробластов
Набор для очистки ДНКThermo Fisher ScientificK0781Очистка геномной ДНК из цельной крови
DPBS без Ca/MgCytivaSH30256Используется для промывки клеток и тканей
ЭтанолPharco1020CSGL
Фетальная бычья сывороткаCytivaSH30396Добавка для культивирования клеток
ПинцетSkylar6-612
Набор для очистки геномной ДНКQiagen69504Экстракция геномной ДНК
Раствор гентамицинаGibco15750-060Используется в промывочной среде
Гидовая РНКIntegrated DNA TechnologiesCustomГидовая РНК для CRISPR
HDR enhancerIntegrated DNA Technologies107921Усилитель гомологичной рекомбинации (HDR)
ГемоцитометрHausser Scientific02-671-10Подсчет клеток
Гемостатический зажимRoboz SurgicalRS-784
Гепарина натриевая сольSigma-AldrichH3149
Hot-Start ДНК-полимеразаPromegaM5123ПЦР-амплификация
ГиалуронидазаSigma-AldrichH3506
ИономицинSigma-AldrichI0634
Среда M19CytivaSH30253.01
Сетчатый экран (40 mesh)Sigma-AldrichS-070Размер ячейки 380 μm
MicroforgeNarishigeMF-9
МикроизмельчительNarishigeEG-4
Пуллер микропипетокSutter Instrument CoP-87
Минеральное маслоKitazato/Dibimed96014
Рот-пипеткаThermo Fisher Scientific13-678-20DОдноразовые пипетки Пастера
Контейнер для замораживания Mr. FrostyThermo Fisher Scientific15-350-50Контейнер для замораживания с контролируемой скоростью
НуклеокуветаLonzaV4XP-3032Кувета для электропорации
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit LLonzaV4XP-3024Включает раствор для нуклеофекции, раствор-добавку, нуклеокуветы и переносочные пипетки
Набор для очистки продуктов ПЦРQiagen2806Очистка продуктов ПЦР
Пенициллин-стрептомицинGibco15070-063Антибиотическая добавка
Чашка Петри (10 mm)Nunc172958
Чашка Петри (35 mm)Nunc150460
Резервуар для реагентовCELLTREAT3054-103
СкальпельMedBladesMB 2-2
НожницыRoboz SurgicalRS-6802
Одноцепочечный олигодезоксинуклеотидный донорский шаблонIntegrated DNA TechnologiesCustomДонорский шаблон для HDR
Хлорид натрияThermo Fisher ScientificBP358-212Для приготовления физиологического раствора
СахарозаSigma-AldrichS18
Хирургический лотокApproved Vendor74262
Краситель для ДНК-гелей SYBR SafeThermo Fisher ScientificS3102Краситель для ДНК-гелей
Флаконы T-25Thermo Fisher Scientific156367Флакон для культивирования клеток
Флакон T-75Corning430641UФлакон для культивирования клеток
Тонкостенный стеклянный капиллярWorld Precision InstrumentsTW10-6
Программное обеспечение TIDE/TIDERTIDE/TIDERhttps://tide.nki.nl/ПО для анализа редактирования генома
Трипановый синийCytivaSV30084
TrypLE ExpressGibco12605-010Трипсиноподобный фермент для диссоциации

Ссылки

  1. Chang MCJ, Grieder FB. The continued importance of animals in biomedical research. Lab Anim (NY). 2024;53(11):295-297.
  2. Bhaduri A, et al. Cell stress in cortical organoids impairs molecular subtype specification. Nature. 2020;578(7793):142-148.
  3. Lin Y, et al. Application of CRISPR/Cas9 system in establishing large animal models. Front Cell Dev Biol. 2022;10:919155.
  4. Seok J, et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(9):3507-3512.
  5. Ineichen BV, et al. Analysis of animal-to-human translation shows that only 5% of animal-tested therapeutic interventions obtain regulatory approval for human applications. PLoS Biol. 2024;22(6):e3002667.
  6. Schuh JCL. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicol Pathol. 2004;32(1):53-66.
  7. Mak IW, Evaniew N, Ghert M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. Am J Transl Res. 2014;6(2):114-118.
  8. Domínguez-Oliva A, et al. The importance of animal models in biomedical research: current insights and applications. Animals (Basel). 2023;13(7):1223.
  9. Li XJ, Lai L. A booming field of large animal model research. Zool Res. 2024;45(2):311-313.
  10. Pinnapureddy AR, et al. Large animal models of rare genetic disorders: sheep as phenotypically relevant models of human genetic disease. Orphanet J Rare Dis. 2015;10(1):107.
  11. Polejaeva IA, Rutigliano HM, Wells KD. Livestock in biomedical research: history, current status and future prospective. Reprod Fertil Dev. 2015;28(2):112-124.
  12. Kelly OM, et al. Towards clinical translation of nanomedicines: formulation scale-up and model systems. Adv Drug Deliv Rev. 2026;234:115862.
  13. Jinek M, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-821.
  14. Pfeiffer P, Vielmetter W. Joining of nonhomologous DNA double strand breaks in vitro. Nucleic Acids Res. 1988;16(3):907-924.
  15. Thomas KR, Capecchi MR. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 1987;51:503-512.
  16. Takata M, et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 1998;17(18):5497-5508.
  17. Jiang S, Shen QW. Principles of gene editing techniques and applications in animal husbandry. 3 Biotech. 2019;9(1):28.
  18. Javaid N, Choi S. CRISPR/Cas system and factors affecting its precision and efficiency. Front Cell Dev Biol. 2021;9:761709.
  19. Wang J, et al. Application of gene editing technology in livestock: progress, challenges, and future perspectives. Agriculture (Basel). 2025;15(20):2155.
  20. Saleh-Gohari N, Helleday T. Conservative homologous recombination preferentially repairs DNA double-strand breaks in the S phase of the cell cycle in human cells. Nucleic Acids Res. 2004;32(12):3683-3688.
  21. Miyaoka Y, et al. Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effects of locus, nuclease, and cell type on genome-editing. Sci Rep. 2016;6:23549.
  22. Wen W, Zhang XB. CRISPR-Cas9 gene editing induced complex on-target outcomes in human cells. Exp Hematol. 2022;110:13-19.
  23. Schnieke AE, et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science. 1997;278(5346):2130-2133.
  24. Tang L, González R, Dobrinski I. Germline modification of domestic animals. Anim Reprod. 2015;12(1):93-104.
  25. Perisse IV, et al. Improvements in gene editing technology boost its applications in livestock. Front Genet. 2021;11:614688.
  26. Kwon DH, Gim GM, Yum SY, Jang G. Current status and future of gene engineering in livestock. BMB Rep. 2024;57(1):50-59.
  27. Mehravar M, Shirazi A, Nazari M, Banan M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Dev Biol. 2019;445(2):156-162.
  28. Niu Y, et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 2014;156(4):836-843.
  29. Yen ST, et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Dev Biol. 2014;393(1):3-9.
  30. Ni W, et al. Efficient gene knockout in goats using CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 2014;9(9):e106718.
  31. Polejaeva IA. 25th anniversary of cloning by somatic cell nuclear transfer: generation of genetically engineered livestock using somatic cell nuclear transfer. Reproduction. 2021;162(1):F11-F22.
  32. Hodges CA, Stice SL. Generation of bovine transgenics using somatic cell nuclear transfer. Reprod Biol Endocrinol. 2003;1:81.
  33. Galli C. Current techniques of gene editing in pigs for xenotransplantation. Transpl Int. 2025;38:13807.
  34. Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1):W242-W245.
  35. Liu Y, et al. A retrospective analysis of sheep generated by somatic cell nuclear transfer. Theriogenology. 2024;227:102-111.
  36. Brinkman EK, Chen T, Amendola M, van Steensel B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 2014;42(22):e168.
  37. Brinkman EK, et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Res. 2018;46(10):e58.
  38. Brinkman EK, Van Steensel B. Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER. Methods Mol Biol. 2019;1961:29-44.
  39. Dalman A, et al. Synchronizing cell cycle of goat fibroblasts by serum starvation causes apoptosis. Reprod Domest Anim. 2010;45(5):e46-e53.
  40. Sadeghian-Nodoushan F, et al. Mimosine as well as serum starvation can be used for cell cycle synchronization of sheep granulosa cells. Chin J Biol. 2014;2014(1):851736.
  41. Page RL, Malcuit CM. Micromanipulation techniques for cloning. In: Principles of Cloning. Elsevier; 2014. p. 39-51.
  42. Viotti Perisse I, et al. Sheep models of F508del and G542X cystic fibrosis mutations show cellular responses to human therapeutics. FASEB Bioadv. 2021;3(10):841-854.
  43. Fan Z, et al. A sheep model of cystic fibrosis generated by CRISPR/Cas9 disruption of the CFTR gene. JCI Insight. 2018;3(19).
  44. Berthault C, et al. Highly efficient ex vivo correction of COL7A1 through ribonucleoprotein-based CRISPR/Cas9 and homology-directed repair to treat recessive dystrophic epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol. 2024;144(6):1322-1333.e13.
  45. Martufi M, et al. Single-step, high-efficiency CRISPR-Cas9 genome editing in primary human disease-derived fibroblasts. CRISPR J. 2019;2(1):31-40.
  46. Bloomer H, Khirallah J, Li Y, Xu Q. CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated genome and epigenome editing in mammalian cells. Adv Drug Deliv Rev. 2022;181:114087.
  47. Blocher R, et al. Effect of laparoscopic ovum pick-up on ovine in vitro oocyte maturation and somatic cell nuclear transfer embryo development. Anim Reprod Sci. 2026;292:108251.
  48. Campbell KH, Loi P, Otaegui PJ, Wilmut I. Cell cycle co-ordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev Reprod. 1996;1(1):40-46.
  49. Chen Y, Niu Y, Ji W. Genome editing in nonhuman primates: approach to generating human disease models. J Intern Med. 2016;280(3):246-251.
  50. Liu D, Cao D, Han R. Recent advances in therapeutic gene-editing technologies. Mol Ther. 2025;33(6):2619-2644.
  51. Campbell K, Alberio R. Reprogramming the genome: role of the cell cycle. Biosci Proc. 2019.
  52. Chia G, et al. Genomic instability during reprogramming by nuclear transfer is DNA replication dependent. Nat Cell Biol. 2017;19(4):282-291.
  53. Wang X, et al. Epigenetic reprogramming during somatic cell nuclear transfer: recent progress and future directions. Front Genet. 2020;11:205.
  54. Loi P, Iuso D, Czernik M, Ogura A. A new, dynamic era for somatic cell nuclear transfer? Trends Biotechnol. 2016;34(10):791-797.
  55. Zhao J, et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 2010;12(1):75-83.
  56. Huang J, et al. BIX-01294 increases pig cloning efficiency by improving epigenetic reprogramming of somatic cell nuclei. Reproduction. 2016;151(1):39-49.
  57. Han C, et al. Overexpression of TET3 in donor cells enhances goat somatic cell nuclear transfer efficiency. FEBS J. 2018;285(14):2708-2723.
  58. Wang S, et al. Application of gene editing technology in resistance breeding of livestock. Life (Basel). 2022;12(7):1070.
  59. Houdebine LM. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2009;32(2):107-121.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модели заболеваний на овцахCRISPR-Cas9фетальные фибробластынегомологичное соединение концовгомологичная репарациясеквенирование ДНКполимеразная цепная реакция

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.