Подавление LINC0707 облегчает воспаление и окислительный стресс в микроглии BV2, стимулированной LPS, через ось miR-145-5p/TRAF6 при травме спинного мозга

Xiaona Wang; Dawei Wang; Yingshuang Wu; Mingli Liu; Pei Hu; Jia Zhang; Yi Luo; Sina Qi

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Подавление LINC0707 облегчает воспаление и окислительный стресс в микроглии BV2, стимулированной LPS, через ось miR-145-5p/TRAF6 при травме спинного мозга

140 просмотров

⸱

11 сентября 2026 г.

Xiaona Wang^*¹ , Dawei Wang^*² , Yingshuang Wu³ , Mingli Liu¹ , Pei Hu² , Jia Zhang² , Yi Luo² , Sina Qi¹

¹Department of Nursing, Zhangjiakou First Hospital, ²Department of Orthopedics, Zhangjiakou First Hospital, ³Department of Pediatrics, Zhangjiakou First Hospital

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Экспрессия LINC0707 в плазме повышена при травме спинного мозга и способствует развитию микроглия-опосредованного воспаления и окислительного стресса через сигнальную ось miR-145-5p/TRAF6. Сайленсинг LINC00707 ослабляет эти патологические реакции, что подчеркивает его потенциал в качестве терапевтической мишени.

Аннотация

Травма спинного мозга (ТСМ) приводит к пожизненной инвалидности, значительно снижает качество жизни и ложится тяжелым социально-экономическим бременем. В данном исследовании изучалась роль LINC0707 при ТСМ посредством регуляции сигнальной оси miR-145-5p/TRAF6. В образцах плазмы 30 здоровых добровольцев и 75 пациентов с ТСМ методом RT-qPCR анализировали экспрессию LINC0707, miR-145-5p и TRAF6. У пациентов с ТСМ оценивали взаимосвязь между уровнями LINC0707 в плазме и провоспалительными факторами. Микроглиальные клетки BV2 подвергали воздействию LPS в концентрации 10 ng/mL, после чего измеряли показатели воспаления и окислительного стресса. Молекулярные взаимодействия оценивали с помощью двухлюциферазного репортерного анализа. Для выявления факторов, связанных с экспрессией LINC0707, использовали логистический регрессионный анализ. У пациентов с ТСМ уровни LINC0707 и TRAF6 в плазме были повышены, тогда как уровни miR-145-5p были снижены. Уровни LINC0707 в плазме положительно коррелировали с уровнями воспалительных факторов в плазме. LINC0707 действовал как молекулярная губка для miR-145-5p, а TRAF6 был мишенью miR-145-5p. Ингибирование LINC00707 приводило к снижению уровней воспалительных факторов, веществ, вызывающих окислительный стресс, и мРНК TRAF6 в клетках BV2. Ингибирование miR-145-5p вызывало противоположные эффекты. Эти результаты свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия LINC0707 связана с тяжестью ТСМ, и что нокдаун LINC0707 может облегчить опосредованное микроглией воспаление и окислительный стресс путем регуляции сигнальной оси miR-145-5p/TRAF6.

Введение

Травма спинного мозга (ТСМ) представляет собой травматическое состояние, приводящее к повреждению спинного мозга, который является критически важным компонентом центральной нервной системы. ТСМ напрямую нарушает пути нейронной проводимости между спинным мозгом и головным мозгом, что вызывает серьезные нарушения двигательных, сенсорных и вегетативных функций¹^,². Эпидемиологические исследования сообщают о ежегодной заболеваемости примерно 5 случаев на 10 0 человек, при этом смертность, связанная с заболеванием, достигает 16,7%³^,⁴. Согласно канадскому опросу, пожизненные затраты на реабилитацию каждого пациента с ТСМ могут достигать 336 0 долларов США⁵. Высокая заболеваемость, смертность и значительные расходы, связанные с диагностикой, лечением и реабилитацией, делают ТСМ серьезной клинической проблемой, требующей разработки более эффективных терапевтических стратегий.

Патологическое прогрессирование травмы спинного мозга (ТСМ) состоит из двух стадий: первичного и вторичного повреждения. Первичное повреждение возникает в результате травматического механического сдавления или разрыва тканей спинного мозга, тогда как вторичное повреждение опосредовано патологическими процессами, включая воспаление и окислительный стресс⁶^,⁷. В физиологических условиях нейровоспаление, опосредованное микроглией, способствует гомеостазу центральной нервной системы⁸^,⁹^,¹⁰. Однако после ТСМ микроглия становится чрезмерно активированной и высвобождает большое количество провоспалительных медиаторов¹^,¹². Эти медиаторы вызывают избыточную выработку активных форм кислорода (АФК), что приводит к повреждению и гибели нейронов и усугубляет вторичное повреждение спинного мозга¹³^,¹⁴. Таким образом, подавление избыточной активации микроглии и прерывание воспалительного каскада представляют собой перспективные терапевтические стратегии для стимуляции неврологического восстановления и улучшения исходов после ТСМ.

Длинные некодирующие РНК (днКРНК) представляют собой класс некодирующих РНК длиной более 20 нуклеотидов, которые не обладают потенциалом к кодированию белков¹⁵. Первоначально рассматриваемые как транскрипционный «шум», днКРНК в настоящее время признаны важными регуляторами различных физиологических и патологических процессов¹⁶. Недавние исследования показали, что днКРНК играют критическую роль при повреждениях нервной системы. Длинная межгенная некодирующая РНК 707 (LINC0707) оказалась важным регулятором расстройств нервной системы. В предыдущих работах сообщалось, что LINC0707 усугубляет последствия черепно-мозговой травмы, усиливая опосредованное микроглией воспаление¹⁷. Кроме того, Zhu et al. продемонстрировали, что сайленсинг LINC0707 значительно ослабляет индуцированное липополисахаридом (ЛПС) воспаление и апоптоз в клетках PC12¹⁸. Эти данные обеспечивают предварительную теоретическую базу для изучения роли LINC00707 при травмах спинного мозга (ТСМ). Однако вопрос о том, регулирует ли LINC0707 опосредованное микроглией воспаление при ТСМ, все еще остается открытым.

Длинные некодирующие РНК (lncRNA) действуют как молекулярные губки посредством механизма конкурентных эндогенных РНК (ceRNA), секвестрируя микроРНК (miRNA) и регулируя экспрессию нижележащих генов-мишеней¹⁹. Эта регуляторная модель широко задействована в патогенезе различных заболеваний. В частности, экспрессия miR-145-5p значительно снижена в тканях при травме спинного мозга (SCI)²⁰, а также при повреждении, индуцированном LPS²¹, и ее гиперэкспрессия эффективно ослабляет воспалительные ответы и окислительный стресс в микроглии²². Фактор 6, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли (TRAF6), также играет ключевую роль в патологии SCI²³^,²⁴^,²⁵. Тем не менее, остается выяснить, осуществляют ли LINC0707, miR-145-5p и TRAF6 скоординированные регуляторные функции при SCI.

В настоящем исследовании было обнаружено, что экспрессия LINC0707 значительно повышается в микроглиальных клетках, стимулированных LPS. В связи с этим мы выдвинули гипотезу, согласно которой LINC0707 может выступать в качестве провоспалительного регулятора в микроглии, а его нокдаун может ослабить нейровоспалительный ответ, тем самым замедляя патологическое прогрессирование ТСП. В данной работе изучалось, регулирует ли LINC0707 воспалительные реакции микроглии и вносит ли он вклад в патогенез ТСП.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Первой больницы Чжанцзякоу (номер одобрения 2024-KY-18). Все участники были проинформированы о целях исследования и потенциальных рисках и предоставили письменное информированное согласие перед включением в исследование. Образцы венозной крови собирали у здоровых добровольцев группы контроля во время плановых медицинских осмотров и у пациентов с SCI сразу после поступления в стационар. Лабораторные измерения проводились в клинической лаборатории больницы. Инструменты исследования, использованные в данном протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Испытуемые
В период с января 2023 года по январь 2025 года на базе Первой больницы города Чжанцзякоу было отобрано в общей сложности 75 пациентов с ТСП. Критерии включения: подтвержденная с помощью компьютерной томографии (КТ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ) ТСП и время от момента получения травмы до госпитализации ≤ 12 h. Критерии исключения: травмы или хирургические вмешательства на спинном или головном мозге в течение предыдущих 6 месяцев; тяжелые сердечно-сосудистые заболевания, включая инфаркт миокарда или аритмию; беременность или лактация; злокачественные новообразования, нарушение функций печени или почек, тяжелые цереброваскулярные заболевания или инфекционные заболевания.

Согласно стандартам неврологической классификации Американской ассоциации спинальных травм (ASIA)²⁶, 75 пациентов с ТСП были разделены на группы с нормальной неврологической функцией (n = 21), неполным повреждением спинного мозга (n = 36) и полным повреждением спинного мозга (n = 18). Распределение локализации повреждений было следующим: шейный отдел — 36,0%; грудной отдел — 30,7%; поясничный отдел — 3,3%. Для формирования контрольной группы были случайным образом отобраны 30 здоровых добровольцев, соответствующих характеристикам исследуемой популяции. Для всех участников были собраны исходные клинические данные. Критерии включения для здоровых лиц включали: отсутствие в анамнезе травм спинного или головного мозга, операций или неврологических расстройств; отсутствие хронических воспалительных заболеваний, аутоиммунных расстройств или злокачественных новообразований; отсутствие тяжелых сердечно-сосудистых, печеночных или почечных заболеваний; отсутствие острых или хронических инфекций в течение последних 4 недель; отсутствие беременности или лактации; соответствие группе с ТСП по возрасту и полу.

Для оценки функциональной независимости в повседневной деятельности использовалась Мера функциональной независимости (FIM). Максимальный балл по шкале FIM составляет 126. Для оценки сенсорных и моторных функций использовались показатели тактильной чувствительности, акместизии и моторные показатели. Максимальные баллы за тактильную чувствительность и акместизию составили 12, а максимальный моторный балл — 10. Более низкие баллы указывают на более тяжелое неврологическое нарушение.

2. Культивирование клеток, создание модели и трансфекция
Иммортализованные клетки микроглии мыши линии BV2 были получены из Центра клеточных ресурсов Шанхайского института биотехнологии. Клетки культивировали в среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллином (10 U/mL) и стрептомицином (10 U/mL). Клетки содержали при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO₂.

Для построения модели клетки BV2 стимулировали липополисахаридом (LPS) в концентрациях 0, 10, 20, 50, 10, 150 или 20 ng/mL в течение 24 h. Оптимальная концентрация LPS была выбрана на основании полученных экспериментальных результатов.

Для трансфекции клетки BV2 высевали в 6-луночные планшеты и трансфецировали по достижении соответствующей конфлюэнтности. Реагент для трансфекции использовали в объеме 1.5 µL на лунку согласно инструкции производителя. Через 6 ч культуральную среду заменяли свежей, после чего клетки культивировали еще 24 ч. Конструкт для нокдауна LINC0707, соответствующий отрицательный контроль, олигонуклеотид miR-145-5p и соответствующий контрольный олигонуклеотид использовали в концентрации 50 nM на лунку. Все эксперименты по трансфекции повторяли независимо не менее 5 раз, с 3 параллельными повторностями в каждом независимом эксперименте. Статистический анализ данных проводили на основе результатов не менее 5 независимых экспериментов.

3. ИФА
Супернатанты культур трансфицированных и стимулированных LPS клеток BV2 собирали путем центрифугирования при 12,0 × g в течение 10 мин, после чего уровни интерлейкина-1β (IL-1β), IL-6 и фактора некроза опухоли-α (TNF-α) измеряли с помощью соответствующих наборов для ИФА. Вкратце, анализ проводили путем последовательной инкубации с биотинилированным антителом, конъюгатом HRP-стрептавидина и субстратом TMB в соответствии с инструкциями производителя. Оптическую плотность регистрировали при 450 nm с помощью микропланшетного ридера. Уровни цитокинов определяли по стандартным кривым. Каждый образец измеряли в трех повторностях, всего было проведено 6 независимых экспериментов.

4. Измерение АФК
Уровни внутриклеточных АФК в клетках BV2, стимулированных LPS, измеряли с помощью набора для анализа активных форм кислорода. Вкратце, клетки инкубировали с 10 µmol/L DCFH-DA при 37 °C в течение 20 мин. После инкубации супернатант удаляли, а клетки промывали 3 раза фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) для удаления избытка внеклеточного зонда. Интенсивность флуоресценции измеряли на микропланшетном ридере при длинах волн возбуждения и эмиссии 48 nm и 525 nm соответственно. Относительные уровни АФК рассчитывали на основе интенсивности флуоресценции. Все образцы анализировали в трех повторностях, и весь эксперимент независимо повторяли не менее 5 раз.

5. Определение уровней малонового диальдегида, супероксиддисмутазы и глутатиона
Обработанные клетки BV2 собирали и готовили гомогенаты клеток. Образцы центрифугировали при 12,0 × g в течение 10 мин при 4 °C для получения супернатанта. Для определения уровней малонового диальдегида (MDA), супероксиддисмутазы (SOD) и глутатиона (GSH) в супернатантах клеток использовали коммерческие наборы для анализа согласно инструкциям производителя. Все образцы анализировали в трех повторностях, и весь эксперимент независимо повторяли не менее 5 раз.

6. Двойной люциферазный репортерный анализ
Фрагменты 3'-нетранслируемой области (3' UTR) LINC0707 и TRAF6, содержащие predicted сайты связывания miR-145-5p, вместе с соответствующими мутантными последовательностями, были клонированы в люциферазный репортерный вектор pmirGLO для создания репортерных конструкций дикого типа (WT-LINC0707 и WT-TRAF6) и мутантных конструкций (MUT-LINC0707 и MUT-TRAF6). Клетки BV2 подвергли ко-трансфекции репортерными конструкциями и олигонуклеотидами miR-145-5p, после чего культивировали в течение 24 h. Затем клетки собирали и измеряли активность люцифераз светлячка и Renilla с помощью планшетного ридера.

7. ОТ-ПЦР в реальном времени
Общая РНК была экстрагирована с использованием реагента для экстракции РНК. Качество РНК оценивали по показателю оптической плотности (OD).₂₆₀/OD₂₈₀ коэффициент, при этом значения от 1,8 до 2,0 считаются приемлемыми. Примерно 1 µg общей РНК была проведена обратная транскрипция в кДНК с использованием набора для обратной транскрипции. Экспрессия генов была количественно определена методом ОТ-кПЦР с использованием мастер-микса для ПЦР с SYBR Green. Обратную транскрипцию проводили при 42 °C в течение 15 мин, после чего следует инактивация обратной транскриптазы при 95 °C в течение 3 мин. Синтезированную кДНК хранили при −20 °C до проведения анализа. Количественную ПЦР в реальном времени проводили с предварительной денатурацией при 95 °C в течение 1 мин, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 5 с, затем отжиг и элонгация при 60 °C в течение 15 с. Сигналы флуоресценции регистрировали по окончании каждого этапа отжига и элонгации. Анализ кривых плавления проводили при 95 °C в течение 15 с, затем 60 °C в течение 1 мин. Относительные уровни экспрессии рассчитывали с использованием метода 2-⁻^ΔΔCt метод. В качестве внутреннего контроля для нормализации экспрессии генов использовали GAPDH или 5S. Последовательности праймеров были следующими: LINC0707, прямой 5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3' и обратный 5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'; miR-145-5p, прямой 5'-GCCGAGGTCCAGTTCCCA-3' и обратный 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'; TRAF6, прямой 5'-ATTACAACTGAGGTGCTTCT-3' и обратный 5'-GCATCTGGTTCTGTTATAGGA-3'; GAPDH, прямой 5'-ATCCCATCACCATCTTCCAGG-3' и обратный 5'-CGCCCCACTTGATTTTGG-3'; и 5S, прямой 5'-TCGTCTGATCTCGGAAGCTAA-3' и обратный 5'-AAGCCTACAGCACCCGGTAT-3'.

8. Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием специализированного программного обеспечения. Нормальность распределения данных оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка; значение P > 0.05 свидетельствовало о нормальном распределении. Данные с нормальным распределением представляли в виде среднего значения ± SD, а данные с ненормальным распределением — в виде медианы (P25, P75). Для непрерывных переменных с нормальным распределением сравнение двух групп проводили с помощью t-критерия Стьюдента, а сравнение нескольких групп — с помощью однофакторного ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки. Для данных с ненормальным распределением при сравнении двух групп использовали U-критерий Манна-Уитни, а при сравнении нескольких групп — критерий Краскела-Уоллиса. Для анализа категориальных переменных между группами использовали критерий хи-квадрат. Для оценки клинических факторов, связанных с экспрессией LINC0707, применяли одномерный и многомерный логистический регрессионный анализ. Непрерывные переменные дихотомизировали по медиане когорты (группа с высоким значением = 1; группа с низким значением = 0). Переменные, при которых P < 0.05 в одномерном логистическом регрессионном анализе, включали в многомерный логистический регрессионный анализ. Результаты представляли в виде отношения шансов (ORs) с 95% доверительными интервалами (CIs), где OR > 1 указывало на положительную связь, а OR < 1 — на отрицательную связь. Все эксперименты по изучению фенотипа клеток включали не менее 4 независимых биологических повторностей с 3 техническими повторностями для каждой биологической повторности. Значение P < 0.05 считали статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Уровни LINC0707 в плазме крови были повышены у пациентов с ССП
Были проанализированы исходные клинические характеристики 30 здоровых добровольцев и 75 пациентов с ССП. По сравнению со здоровыми добровольцами, у пациентов с ССП наблюдались заметно более низкие показатели тактильной чувствительности, акместезии, двигательной функции и показатели по шкале функциональной независимости (FIM), что указывает на нарушение сенсорной и моторной функций. Кроме того, уровни провоспалительных цитокинов в сыворотк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Травма спинного мозга (ТСМ) представляет собой тяжелое травматическое поражение центральной нервной системы, которое приводит к нарушению или полной потере нервной проводимости через спинной мозг, что влечет за собой пожизненную моторную, сенсорную и вегетативную дисфункцию, а также глубокие физиологические и психологические последствия²⁹˒³⁰. Степень тяжести этих нарушений обычно возрастает по мере увеличения масштаба ТСМ. В настоящем исследовании экспрессия LINC0707 в плаз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана в рамках Научно-исследовательского проекта в области медицины провинции Хэбэй (грант № 20251479).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 мл	KIRGEN	KG211	Полипропиленовая пробирка с защелкивающейся крышкой, без ДНКаз/РНКаз, непирогенная, максимальная центрифужная сила 20 00 × g, для центрифугирования и хранения образцов РНК/белков.
6-луночный планшет для культивирования клеток	Corning	3516	стерильный полистирольный планшет с плоским дном, обработанный для культивирования клеток (TC-treated), в индивидуальной упаковке; объем лунки составляет 16,8 мл, площадь поверхности для роста — 9,5 см²
Игла для забора крови	Becton, Dickinson and Company	367283	Одноразовая игла для забора крови BD Vacutainer. Двусторонняя конструкция иглы: один конец предназначен для венепункции, а другой соединяется с держателем и вакуумной пробиркой для забора крови в несколько пробирок. Силиконовое покрытие для минимизации дискомфорта пациента при введении.
Пробирки для забора крови	Becton, Dickinson and Company	367605	Вакуумные пробирки для забора крови BD Vacutainer. Разные цвета крышек указывают на наличие различных добавок, соответствующих конкретным лабораторным исследованиям.
иммортализованная линия микроглиальных клеток мыши BV2	Центр клеточных ресурсов Шанхайского института биотехнологии	RRID: CVCL_0182	Иммортализованная линия клеток микроглии мыши, стабильно экспрессирующая специфические маркеры микроглии (Iba1, CD1b, F4/80). При стимуляции LPS клетки BV2 секретируют провоспалительные цитокины (IL-1β, ИЛ-6, ФНО-α) и накапливают внутриклеточные АФК, МДА для имитации воспалительной активации микроглии in vivo после повреждения спинного мозга. Клетки культивируют в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% FBS и 1× пенициллин-стрептомицин, выдерживаемый при 37 °C с 5% CO₂ увлажненный инкубатор; пассаж при достижении 70% конфлюэнтности–конфлюэнтность 80% во избежание гиперактивации.
Набор для анализа содержания малонового диальдегида (МДА) в клетках	Нанкинский институт биоинженерии Цзяньчэн	A03-4-2	Колориметрический набор на основе микропланшетов для количественного определения клеточного малонового диальдегида, маркера перекисного окисления липидов. MDA при нагревании реагирует с тиобарбитуровой кислотой (TBA) с образованием красных аддуктов; абсорбция регистрируется при 532 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра. Набор оптимизирован для образцов клеточных лизатов, обеспечивает высокопроизводительный анализ в 96-луночном формате, а линейный диапазон количественного определения охватывает низкие и умеренные уровни окисления липидов в микроглии.
CO₂ инкубатор	Thermo Scientific	3111	Увлажненный CO2 с водяной рубашкой₂ инкубатор с внутренним объемом 184 л, ИК-контроль CO2₂ датчик, система фильтрации воздуха HEPA для минимизации микробиологического загрязнения. Поддерживает стабильную среду культивирования при 37 °C, 5% CO₂₂ и насыщенная влажность для длительного культивирования адгезивных клеток.
Набор для анализа активности репортерных генов с использованием двойной люциферазы	Beyotime Biotechnology	RG028	Данный набор для двойного люциферазного анализа позволяет проводить последовательное количественное определение люциферазы светлячка и люциферазы Renilla в клеточных лизатах. Сначала измеряют сигнал люциферазы светлячка с использованием субстрата люциферина; последующий реагент для детектирования Renilla содержит мощный гаситель, который устраняет >9,9% остаточной люминесценции светлячка, что обеспечивает чистоту считывания сигнала Renilla при использовании субстрата целентеразина. Набор включает специальный буфер для лизиса адгезивных клеток, совместимый с люминометром для 96-луночных микропланшетов. Реагент для светлячка представляет собой готовую жидкую смесь для непосредственного использования; значения люминесценции светлячка и Renilla регистрируются последовательно для расчета нормализованной относительной люциферазной активности (отношение Firefly/Renilla) с целью валидации мишеней цеРНК.
Модифицированная среда Игла-Дулбекко	Gibco	11995065	DMEM представляет собой широко используемую базальную среду для поддержания роста многих различных типов клеток млекопитающих. Данный состав содержит высокую концентрацию глюкозы, L-глутамин, феноловый красный и пируват натрия. Среда требует добавления вспомогательных компонентов, обычно 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 5–10% CO₂ среда для поддержания физиологического значения pH.
Фетальная бычья сыворотка	ВСЕ ЗЕЛЕНОЕ	13011-8611	FBS премиум-класса, с низким содержанием эндотоксинов и без микоплазмы & отрицательный по бактериофагам, добавляемый в DMEM в концентрации 10% по объему для поддержания роста клеток.
GraphPad Prism версии 9	GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США	Н/Д	Программное обеспечение для построения научных графиков и статистического анализа, специализированное для данных экспериментов с клетками in vitro. Все необработанные значения абсорбции qPCR, ELISA, окислительного стресса и люминесценции в двойном люциферазном анализе были импортированы в Prism 9 для проверки нормальности распределения, проведения параметрических/непараметрических сравнений групп, построения всех количественных рисунков и расчета среднего значения ± СО, точные значения P и 95% ДИ, а также экспорт рисунков с высоким разрешением (30 dpi), соответствующих стандартам журнальных публикаций. Исходные файлы проектов .prism для всех графиков размещены в общедоступном репозитории данных в соответствии с требованиями.
IBM SPSS Statistics версия 26.0	IBM Corporation, Армонк, штат Нью-Йорк, США	Н/Д	Комплексный пакет статистического программного обеспечения, используемый для сортировки исходных данных клинических образцов, проверки распределения на нормальность (критерий Шапиро-Уилка), проведения независимого/непарного t-критерия, однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с поправкой Тьюки’с поправкой на множественные сравнения, непараметрическим U-критерием Манна — Уитни, а также расчетом точных значений P и 95% доверительных интервалов для всех количественных наборов данных по человеку и клеточным культурам. Все клинические демографические и лабораторные данные пациентов обрабатывались и анализировались на этой платформе.
ИЛ-1β Набор для ИФА SimpleStep	Abcam	ab25730	Данный набор для проведения однократного сэндвич-колориметрического ИФА основан на запатентованной технологии SimpleStep, позволяющей выполнить всю процедуру анализа в течение 90 минут. Набор предназначен для количественного определения интерлейкина-1 крысы.β в супернатанте клеточных культур, сыворотке, образцах плазмы с ЭДТА/цитратом/гепарином. Чувствительность обнаружения достигает 26,58 пг/мл при линейном диапазоне количественного определения 54,69–350 пг/мл. В комплект входит предварительно покрытый разломный 8-луночный стрип-микропланшет. Сигналы абсорбции регистрируются при 450 нм с помощью микропланшетного ридера для расчета концентрации IL-1β концентрация
Набор для SimpleStep ELISA на ИЛ-6	Abcam	ab234570	Набор для сэндвич-колориметрического SimpleStep-ELISA, оптимизированный для количественного определения интерлейкина-6 (IL-6) крысы в супернатанте культур клеток, сыворотке, а также в образцах плазмы с цитратом, ЭДТА или гепарином. В наборе используется одноэтапная инкубация и однократная промывка, что сокращает общее время анализа до 90 минут; чувствительность обнаружения составляет 43 пг/мл, а диапазон линейного количественного определения — от 125 пг/мл до 80 пг/мл. В комплект входит предварительно покрытый разломный 8-луночный стрип-микропланшет; для окончательного расчета концентрации IL-6 значения оптической плотности измеряются при 450 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра.
Многолуночный планшет LightCycler на 96 лунок, белый	Roche LifeScience, Швейцария	4729692001	Белые полипропиленовые 96-луночные реакционные планшеты с полуюбкой, специально оптимизированные для системы ПЦР в реальном времени LightCycler 96. Белые стенки лунок снижают фоновые помехи флуоресценции и усиливают отражение сигнала, что повышает чувствительность детектирования транскриптов с низким уровнем экспрессии. Однородная конструкция с тонкими стенками гарантирует стабильную теплопроводность во всех лунках; планшеты совместимы с объемами реакционной смеси от 10 до 50 μLНе содержит ДНКаз/РНказ и пирогенов; подходит для анализов по амплификации кДНК, полученной из РНК.
Реагент для трансфекции LipofectamineTM 30	Thermo Fisher Scientific	L30015	Реагент для трансфекции на основе липидных наночастиц в сочетании с усилителем P30 обеспечивает высокоэффективную трансфекцию микроглии BV2 с помощью siRNA или плазмид при низкой цитоксичности.
Набор для синтеза первой цепи кДНК длинных некодирующих РНК lnRcute lncRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit	TIANGEN	KR202-02	Данный набор специально оптимизирован для обратной транскрипции длинных некодирующих РНК (днкРНК) с низкой экспрессией, вариабельным содержанием ГЦ-пар и сложной вторичной структурой. В состав набора входит отдельный буфер для удаления гДНК, позволяющий устранить контаминацию геномной ДНК перед обратной транскрипцией, а также специализированная смесь праймеров lnR-RT для обогащения полноразмерными матрицами днкРНК. Модифицированная обратная транскриптаза обеспечивает эффективный синтез длинных цепей кДНК из общего количества РНК в диапазоне от 10 нг до 2 нг.
Набор для количественной ПЦР-детекции длинных некодирующих РНК lnRcute lncRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green)	TIANGEN	FP402	Специализированная смесь для количественной ПЦР на основе SYBR Green для количественного определения днкРНК. ДНК-полимераза с «горячим стартом», опосредованным антителами, обеспечивает высокую специфичность амплификации; компоненты H-конкурента устраняют влияние вторичных структур высоко-ГЦ-содержащих матриц днкРНК. Смесь совместима с кДНК, полученной с помощью набора для обратной транскрипции днкРНК lnRcute, и подходит для количественного определения относительной экспрессии низкопийных днкРНК.
олигонуклеотиды miR-145-5p	Generalbiol (Ухань, Китай)	Нет данных	Синтетический мимик miR-145-5p, ингибитор и соответствующие олигонуклеотиды отрицательного контроля, использованные для модуляции активности miR-145-5p в клетках BV2. Применялись в анализах экспрессии, воспаления, окислительного стресса и в двухлюциферазном репортерном анализе.
Набор для синтеза первой цепи кДНК микроРНК miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	TIANGEN	KR21-02	Для упрощения рабочего процесса используется однопробирочная реакция, сочетающая полиаденилирование и обратную транскрипцию. Смесь ферментов содержит поли(А)-полимеразу E. coli, обратную транскриптазу, дефицитную по РНказе H, и ингибитор РНказы, что обеспечивает специфическое воздействие на зрелые одноцепочечные миРНК и позволяет избежать интерференции при амплификации пре-миРНК, имеющих структуру «шпильки». Метод подходит для миРНК, экстрагированных из клеточного лизата, плазмы и образцов тканей.
Набор для qPCR-детекции микроРНК miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green)	TIANGEN	FP41	Готовый состав (премикс) SYBR Green, оптимизированный для количественного определения зрелых микроРНК и полностью совместимый с продуктами обратной транскрипции miRcute. Буферная система повышает эффективность отжига праймеров для коротких ампликонов микроРНК, обеспечивает стабильные флуоресцентные сигналы и высокую чувствительность при детектировании слабо экспрессируемых микроРНК. Для нормализации в качестве внутреннего контроля обычно используется малая ядерная РНК U6 (U6 snRNA).
Раствор пенициллина и стрептомицина (10×)	Beyotime Biotechnology	C022	Стерильно отфильтрованная смесь, содержащая 10 00 ЕД/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина; рабочий разведение 1:10 в культуральной среде для предотвращения бактериальной контаминации.
Набор для анализа активных форм кислорода с разбавителем	Beyotime Biotechnology	S034M	В данном наборе используется флуоресцентный зонд DCFH-DA для количественного определения внутриклеточных активных форм кислорода (АФК). DCFH-DA проникает через клеточную мембрану и гидролизуется внутриклеточными эстеразами до DCFH, который окисляется АФК с образованием флуоресцентного DCF. Набор совместим с 96-луночными микропланшетами и флуоресцентными планшетными ридерами для высокопроизводительного анализа (Ex = 48 нм, Em = 525 нм). В комплект входят специальный разбавитель зонда и реагент положительного контроля Rosup для стабилизации сигналов окрашивания; набор подходит для определения окислительного стресса в адгезивных микроглиях BV2 без лизиса клеток.
Набор для анализа восстановленного глутатиона (GSH)	Нанкинский институт биоинженерии Цзяньчэн	A06-1-2	Колориметрический набор для микропланшетов для определения восстановленного глутатиона (GSH), основного внутриклеточного антиоксиданта. GSH реагирует с дитионитробензойной кислотой (DTNB) с образованием желтого хромогенного продукта, абсорбция которого регистрируется при 405 нм на микропланшетном ридере. Набор адаптирует стандартный протокол для пробирок под высокопроизводительный анализ в 96-луночном микропланшете для исследования антиоксидантов в клеточных лизатах.
si-LINC0707	GenePharma (Шанхай, Китай)	Нет данных	Малая интерферирующая РНК, разработанная для снижения экспрессии LINC0707 в клетках BV2. Используется в экспериментах по потере функции для оценки влияния нокдауна LINC00707 на воспалительные реакции, окислительный стресс, экспрессию miR-145-5p и экспрессию TRAF6.
si-LINC0707 NC	GenePharma (Шанхай, Китай)	Нет данных	Нетаргетная малая интерферирующая РНК, используемая в качестве отрицательного контроля при трансфекции si-LINC0707. Применяется для контроля неспецифических эффектов процедуры трансфекции и воздействия siRNA.
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	TIANGEN	4992777	Универсальная смесь для количественной ПЦР с SYBR Green для относительного количественного определения мРНК, содержащая Taq-полимеразу с «горячим стартом», дНТФ, SYBR Green I и референсный краситель ROX для нормализации флуоресценции. Характеризуется низким уровнем неспецифической амплификации и стабильной эффективностью амплификации; широко применяется для количественного определения целевых генов мРНК (TRAF6, GAPDH и др.).
Малая настольная центрифуга Thermo ScientificTM SorvallTM ST 8	Thermo Scientific	75200709	Классический выбор для клинических лабораторий, позволяющий обрабатывать до 24 × 5/7 мл пробирок для сбора крови за один цикл. Серия R представляет собой охлаждаемую версию, которая обеспечивает более надежную защиту образцов, требующих центрифугирования при низких температурах.
Набор для синтеза первой цепи кДНК TIANScript II	TIANGEN	GKR107-02	Разработан для общей обратной транскрипции мРНК с целью получения длинных кДНК размером до 12 т.п.н. Препарат укомплектован праймерами Oligo (dT) 15 и случайными гексамерами для гибкого выбора стратегии праймирования. Модифицированная обратная транскриптаза M-MLV эффективно синтезирует цепь через участки с высоким содержанием ГЦ-пар и сложные вторичные структуры мРНК, обеспечивая широкую совместимость с последующей амплификацией мРНК методом кПЦР.
ФНО-α Набор для SimpleStep ELISA	Abcam	ab236712	Набор для проведения экспресс-анализа SimpleStep методом сэндвич-ИФА с одним этапом промывки, оптимизированный для количественного определения фактора некроза опухоли крысы-α (ФНО-α) в супернатанте клеточной культуры, сыворотке и различных образцах плазмы. Общая продолжительность анализа составляет 90 мин, при этом сверхвысокая чувствительность достигает 1,04 пг/мл, а линейный диапазон детектирования составляет от 15,63 пг/мл до 100 пг/мл. Оснащен съемными 8×предварительно покрытая планшетка на 12 лунок; значения оптической плотности при 450 нм регистрируют для конечного определения TNF-α количественный расчет
Набор для определения общей супероксиддисмутазы (T-SOD)	Нанкинский институт биоинженерии Цзяньчэн	A01-3-2	Набор для хромогенного микропланшетного анализа WST-1 для определения общей ферментативной активности СОД. СОД устраняет супероксид-анионные радикалы и ингибирует реакцию восстановления WST-1. Для расчета активности регистрируют оптическую плотность при 450 нм с помощью микропланшетного ридера. Подходит для анализа гомогенатов клеток, сыворотки и образцов тканей; характеризуется стабильным развитием окраски и высокой воспроизводимостью для оценки антиоксидантной способности.
реагент TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018	Однофазный фенол-гуанидин-изотиоцианатный реагент для одноэтапного выделения тотальной РНК из культивируемых клеток микроглии; позволяет одновременно экстрагировать ДНК и белок из идентичных образцов.

Ссылки

Trueblood CT, Singh A, Cusimano MA, Hou S. Autonomic dysreflexia in spinal cord injury: mechanisms and prospective therapeutic targets. Neuroscientist. 2024;30(5):597-611.
Anderson MA, Squair JW, Gautier M, Hutson TH, Kathe C, Barraud Q, et al. Natural and targeted circuit reorganization after spinal cord injury. Nat Neurosci. 2022;25(12):1584-96.
Liu Y, Yang X, He Z, Li J, Li Y, Wu Y, et al. Spinal cord injury: global burden from 1990 to 2019 and projections up to 2030 using Bayesian age-period-cohort analysis. Front Neurol. 2023;14:1304153. doi:10.3389/fneur.2023.1304153.
Sekhon LH, Fehlings MG. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 2001;26(24 Suppl):S2-12.
Chan BC, Cadarette SM, Wodchis WP, Krahn MD, Mittmann N. The lifetime cost of spinal cord injury in Ontario, Canada: a population-based study from the perspective of the public health care payer. J Spinal Cord Med. 2019;42(2):184-93.
Van Broeckhoven J, Sommer D, Dooley D, Hendrix S, Franssen A. Macrophage phagocytosis after spinal cord injury: when friends become foes. Brain. 2021;144(10):2933-45.
Xiao S, Zhong N, Yang Q, Li A, Tong W, Zhang Y, et al. Aucubin promoted neuron functional recovery by suppressing inflammation and neuronal apoptosis in a spinal cord injury model. Int Immunopharmacol. 2022;111:109163. doi:10.1016/j.intimp.2022.109163.
Li F, Wang Y, Zheng K. Microglial mitophagy integrates the microbiota-gut-brain axis to restrain neuroinflammation during neurotropic herpesvirus infection. Autophagy. 2023;19(2):734-6.
Beattie MS. Inflammation and apoptosis: linked therapeutic targets in spinal cord injury. Trends Mol Med. 2004;10(12):580-3.
Brennan FH, Li Y, Wang C, Ma A, Guo Q, Li Y, et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 2022;13(1):4096. doi:10.1038/s41467-022-31797-0.
Kwon HS, Koh SH. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Transl Neurodegener. 2020;9(1):42. doi:10.1186/s40035-020-00221-2.
Zhong J, Qiu X, Yu Q, Chen H, Yan C. A novel polysaccharide from Acorus tatarinowii protects against LPS-induced neuroinflammation and neurotoxicity by inhibiting TLR4-mediated MyD88/NF-κB and PI3K/Akt signaling pathways. Int J Biol Macromol. 2020;163:464-75.
Han X, Xu T, Fang Q, Zhang H, Yue L, Hu G, et al. Quercetin hinders microglial activation to alleviate neurotoxicity via .the interplay between NLRP3 inflammasome and mitophagy. Redox Biol. 2021;44:102010. doi:10.1016/j.redox.2021.102010.
Simpson DSA, Oliver PL. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants (Basel). 2020;9(8):743. doi:10.3390/antiox9080743.
Onoguchi-Mizutani R, Akimitsu N. Long noncoding RNA and phase separation in cellular stress response. J Biochem. 2022;171(3):269-76.
Zhang Y. LncRNA-encoded peptides in cancer. J Hematol Oncol. 2024;17(1):66. doi:10.1186/s13045-024-01591-0.
Hu W, Zhou J, Jiang Y, Bao Z, Hu X. Silencing of LINC00707 alleviates brain injury by targeting miR-30a-5p to regulate microglia inflammation and apoptosis. Neurochem Res. 2024;49(1):222-33.
Zhu S, Zhou Z, Li Z, Shao J, Jiao G, Huang YE, et al. Suppression of LINC00707 alleviates lipopolysaccharide-induced inflammation and apoptosis in PC-12 cells by regulating miR-30a-5p/Neurod1. Biosci Biotechnol Biochem. 2019;83(11):2049-56.
Long J, Lan W, Shen B, Liao F, Cai H, Li J, et al. LncRNA-miRNA-mRNA network in schizophrenia. J Mol Neurosci. 2025;75(3):104.
De Gasperi R, Graham ZA, Harlow LM, Bauman WA, Qin W, Cardozo CP. The signature of microRNA dysregulation in muscle paralyzed by spinal cord injury includes downregulation of microRNAs that target myostatin signaling. PLoS One. 2016;11(12):e0166189.
Lin Y, Liu L, Lin Y, Yang R, Liao S, Xu M, et al. MiR-145 alleviates sepsis-induced inflammatory responses and organ injury by targeting ADAM17. Front Biosci (Landmark Ed). 2024;29(1):44. doi:10.31083/j.fbl2901044.
Wang C, Gu L, Yang Z, Su J, Wen X. Mume Fructus total flavonoids modulate miR-145-3p expression to inhibit lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine production in BV2 cells. Comb Chem High Throughput Screen. 2026;29. doi:http://dx.doi.org/10.2174/0113862073447531260414195911
Chen S, Wei J, Huang L, Feng B, Guo W. MiRNA-194-5p inhibits inflammatory response after spinal cord injury via .regulating TRAF6. Minerva Med. 2020;111(6):603-6.
Lu Y, Jiang BC, Cao DL, Zhang ZJ, Zhang X, Ji RR, et al. TRAF6 upregulation in spinal astrocytes maintains neuropathic pain by integrating TNF-α and IL-1β signaling. Pain. 2014;155(12):2618-29.
Zhao Y, Li T, Zhang L, Yang J, Zhao F, Wang Y, et al. TRAF6 promotes spinal microglial M1 polarization to aggravate neuropathic pain by activating the c-JUN/NF-κB signaling pathway. Cell Biol Toxicol. 2024;40(1):54. doi:10.1007/s10565-024-09900-6.
Kirshblum SC, Memmo P, Kim N, Campagnolo D, Millis S, American Spinal Injury Association. Comparison of the revised 2000 American Spinal Injury Association classification standards with the 1996 guidelines. Am J Phys Med Rehabil. 2002;81(7):502-5.
Xue MT, Sheng WJ, Song X, Shi YJ, Geng ZJ, Shen L, et al. Atractylenolide III ameliorates spinal cord injury in rats by modulating microglial/macrophage polarization. CNS Neurosci Ther. 2022;28(7):1059-71.
Zhang H, Xiang L, Yuan H, Yu H. PTPRO inhibition ameliorates spinal cord injury through shifting microglial M1/M2 polarization via .the NF-κB/STAT6 signaling pathway. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2024;1870(5):167141. doi:10.1016/j.bbadis.2024.167141.
Eli I, Lerner DP, Ghogawala Z. Acute traumatic spinal cord injury. Neurol Clin. 2021;39(2):471-88.
Brouwers E, van der Meent H, Curt A, Maier DD, Abel RF, Weidner N, et al. Recovery after traumatic thoracic and lumbar spinal cord injury: the neurological level of injury matters. Spinal Cord. 2020;58(9):980-7.
Yao Q, Li Z, Chen D. Review of LINC00707: a novel lncRNA and promising biomarker for human diseases. Front Cell Dev Biol. 2022;10:813963. doi:10.3389/fcell.2022.813963.
Chen L, Chen Y, Huang J, Zhang J. LncRNA LINC00707 serves as a sponge of miR-382-5p to alleviate lipopolysaccharide-induced WI-38 cell injury through upregulating NKAP in infantile pneumonia. Autoimmunity. 2022;55(5):328-38.
Zou X, Gao C, Shang R, Chen H, Wang B. Knockdown of lncRNA LINC00707 alleviates LPS-induced injury in MRC-5 cells by acting as a ceRNA of miR-223-5p. Biosci Biotechnol Biochem. 2021;85(2):315-23.
Ma T, Ma H, Zou Z, He X, Liu Y, Shuai Y, et al. The long intergenic noncoding RNA 00707 promotes lung adenocarcinoma cell proliferation and migration by regulating Cdc42. Cell Physiol Biochem. 2018;45(4):1566-80.
Li H, Liu Q, Hu Y, Yin C, Zhang Y, Gao P. LINC00707 regulates autophagy and promotes the progression of triple-negative breast cancer by activation of the PI3K/AKT/mTOR pathway. Cell Death Discov. 2024;10(1):138. doi:10.1038/s41420-024-01906-7.
Fang F, Guo C, Zheng W, Li Q. LINC00707 promotes cell proliferation in cervical cancer via .the miR-374c-5p/SDC4 axis. Biomed Res Int. 2022;2022:5793912. doi:10.1155/2022/5793912.
Wei M, Lu L, Ma J, Luo Z, Tan X, Wang J. LINC00707 impairs natural killer cell antitumor activity in hepatocellular carcinoma by decreasing YTHDF2 stability. J Cell Mol Med. 2024;28(5):e18106.
Liu J, Wu M, Feng G, Li R, Wang Y, Jiao J. Downregulation of LINC00707 promotes osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by regulating DKK1 via .targeting miR-103a-3p. Int J Mol Med. 2020;46(3):1029-38.
Zhao W, Huang G, Ye J. LINC00707 inhibits myocardial fibrosis and immune disorder in rheumatic heart disease by regulating miR-145-5p/S1PR1. Biotechnol Genet Eng Rev. 2024;40(4):3073-86.
Gao T, Ji Y. Long noncoding RNA LINC00707 accelerates tumorigenesis and progression of bladder cancer via .targeting the miR-145/CDCA3 regulatory loop. Urol Int. 2021;105(9–10):891-905.
Cai WL, Zeng W, Liu HH, Zhu BY, Liu JL, Liu Y. LncRNA LINC00707 promotes osteogenic differentiation of hBMSCs through the Wnt/β-catenin pathway activated by the LINC00707/miR-145/LRP5 axis. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(1):18-28.
Jiang L, Wei ZC, Xu LL, Yu SY, Li C. Inhibition of miR-145-5p reduces spinal cord injury-induced inflammatory and oxidative stress responses via .affecting the Nurr1-TNF-α signaling axis. Cell Biochem Biophys. 2021;79(4):791-9.
Jiang Z, Zhang J. Mesenchymal stem cell-derived exosomes containing miR-145-5p reduce inflammation in spinal cord injury by regulating the TLR4/NF-κB signaling pathway. Cell Cycle. 2021;20(10):993-1009.
Park AJ, Fandl HK, Garcia VP, Coombs GB, DeSouza NM, Greiner JJ, et al. Differential expression of vascular-related microRNA in circulating endothelial microvesicles in adults with spinal cord injury: a pilot study. Top Spinal Cord Inj Rehabil. 2023;29(2):34-42. doi:10.46292/sci22-00032.
Gao C, Yin F, Li R, Ruan Q, Meng C, Zhao K, et al. MicroRNA-145-mediated KDM6A downregulation enhances neural repair after spinal cord injury via .the NOTCH2/Abcb1a axis. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:2580619. doi:10.1155/2021/2580619.
Dou Y, Tian X, Zhang J, Wang Z, Chen G. Roles of TRAF6 in the central nervous system. Curr Neuropharmacol. 2018;16(9):1306-13.
Huang T, Jia Z, Fang L, Cheng Z, Qian J, Xiong F, et al. Extracellular vesicle-derived miR-511-3p from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells ameliorates spinal cord injury through the TRAF6/S1P axis. Brain Res Bull. 2022;180:73-85.
Wei J, Wang J, Zhou Y, Yan S, Li K, Lin H. MicroRNA-146a contributes to SCI recovery via .regulating TRAF6 and IRAK1 expression. Biomed Res Int. 2016;2016:4013487.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Регуляция воспаления ОТ-ПЦР двухлюциферазный репортерный анализ активация микроглии