В данном исследовании оптимизируется метод петлевой изотермической амплификации (LAMP) с использованием активированного угля и бентонита для обнаружения патогенных видов Vibrio в морепродуктах. Такая предварительная подготовка эффективно удаляет ингибиторы реакции, обеспечивая значительно более быструю, чувствительную и экономически эффективную диагностику по сравнению с традиционными методами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Повышение чувствительности петлевой амплификации с использованием активированного угля и бентонита для обнаружения Vibrio spp. в рыбопродуктах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Род Vibrio включает более 100 видов, из которых 12 считаются патогенными для человека; наиболее часто выделяемыми в пищевых продуктах видами являются V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus и V. alginolyticus. Основной проблемой их идентификации с помощью традиционных микробиологических методов являются высокая стоимость и длительность диагностики. Для идентификации V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus и V. alginolyticus была использована петлевая изотермическая амплификация (LAMP). Для удаления ингибиторов и повышения чувствительности анализа применяли активированный уголь с бентонитом (ACB); были протестированы значения pH 6, 7 и 9, а также различные времена контакта образца с ACB. Чувствительность метода LAMP повышалась при использовании активированного угля и бентонита для удаления ингибиторов реакции в образцах креветок, рыбы и устриц. Чувствительность LAMP, прогностическая значимость отрицательного результата, прогностическая значимость положительного результата и специфичность LAMP составили 90% или более для всех протестированных образцов. Метод LAMP может стать альтернативой для идентификации V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus и V. alginolyticus в рыбопродуктах благодаря более быстрому применению, более высокой чувствительности и меньшей стоимости по сравнению со стандартным методом.
Введение
Виды рода Vibrio широко распространены в морской среде и могут быть ассоциированы с рыбами, моллюсками или ракообразными, проявляя при этом как патогенные, так и комменсальные свойства. Сообщается, что 12 видов могут быть патогенными для человека, при этом Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus и V. alginolyticus чаще всего выделяются из продукции рыболовства. По оценкам органов здравоохранения США, виды Vibrio вызывают более 80 000 инфекций в год1,2,3,4,5. Выделение Vibrio spp. осуществляется традиционными методами, которые включают предварительное обогащение, культивирование на селективных средах и подтверждение с помощью биохимических и серологических тестов6,7. Применение этих традиционных методов ограничено длительным временем, необходимым для выделения патогена (до 5 дней), а также их недостаточной разрешающей способностью, что часто не позволяет точно дифференцировать близкородственные виды рода Vibrio из-за схожих фенотипических и биохимических профилей6,7,8.
В качестве альтернативы в качестве быстрого, точного и недорогого молекулярного метода идентификации патогенов была описана петлевая изотермическая амплификация (LAMP)9,10. Этот метод отличается высокой экономической эффективностью и протекает быстрее, чем традиционная ПЦР, так как не требует сложного оборудования, такого как амплификаторы9. Метод LAMP позволяет за один этап обнаружить целевой ген по появлению помутнения в реакционной пробирке, вызванного выпадением в осадок пирофосфата магния, который является стабильным продуктом реакции при 65 °C (температуре, используемой в методе LAMP); таким образом, увеличение мутности коррелирует с количеством синтезированной ДНК, что позволяет избежать использования агарозных гелей и трансиллюминаторов11,12,13,14,15.
Чувствительность обнаружения этих патогенов может быть повышена за счет удаления ингибиторов реакции, таких как протеазы, ионы кальция, гликоген и липиды, которые могут ингибировать Bst-полимеразу или связываться с целевой ДНК, препятствуя амплификации13,16,17,18,19,20. Было сообщено, что комбинация активированного угля с бентонитом (ACB) обладает высокой эффективностью в удалении ингибиторов амплификации, что повышает чувствительность обнаружения Escherichia coli в образцах устриц и снижает затраты, поскольку ACB дешевле коммерческих наборов21.
В данной работе мы предлагаем оптимизировать метод LAMP, используя активированный уголь и бентонит для повышения чувствительности при идентификации V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus и V. alginolyticus непосредственно в продуктах рыболовства. Этот оптимизированный метод служит практическим руководством для рутинного мониторинга и контроля качества в пищевой промышленности и может быть широко применен для экспресс-диагностики патогенов, позволяя избежать длительных этапов предварительного обогащения. Что касается ожидаемых показателей, метод демонстрирует отличную чувствительность (более 98%) и специфичность (100%) в таких матрицах, как рыба и креветки. Однако ключевым ограничением является то, что в сильно загрязненных исходных образцах, таких как устрицы, система ACB не может полностью удалить все мешающие органические вещества, что может несколько снизить чувствительность анализа (94%–98%).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Данное исследование не предусматривало участия людей или позвоночных животных, поэтому одобрение этического комитета учреждения не потребовалось. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.
1. Используемые бактериальные штаммы и экстракция ДНК
Штаммы Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 и V. alginolyticus ATCC 17749 выращивали в бульоне BHI (инфузионный бульон из мозга и сердца) с 2% NaCl при 37 °C в течение 24 ч. Штаммы Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 и Salmonella Typhimurium ATCC 14028 культивировали в бульоне BHI без хлорида натрия при 37 °C в течение 24 ч для использования в качестве отрицательных контролей в тестах. Для экстракции ДНК ночную культуру центрифугировали при 16,000 x g в течение 6 мин при 25 °C. Супернатант аккуратно сливали, чтобы не потревожить осадок клеток, а затем осадок тщательно ресуспендировали путем пипетирования в 500 μL раствора ТАЕ-буфера (Трис-уксусная кислота-ЭДТА, pH 8). Суспензию кипятили в течение 6 мин для лизиса клеток, после чего немедленно охлаждали на льду в течение 5 мин. Проводили финальное центрифугирование для осаждения клеточного дебриса, в результате чего был получен прозрачный супернатант, содержащий экстрагированную ДНК, которая в дальнейшем использовалась в качестве матрицы для амплификации методом LAMP22,23.
2. Процедура LAMP
Праймеры, использованные в LAMP (Таблица 1), были протестированы для подтверждения специфичности идентификации V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus и V. alginolyticus. Идентификация каждого вида Vibrio с помощью LAMP проводилась в реакционных пробирках путем подготовки смеси с конечным объемом 25 μL, содержащей: 1.6 μM каждого из праймеров, 1.4 mM смеси dNTP, 6 mM MgSO4, 800 mM бетаина, 8 U ДНК-полимеразы Bst и 5 μL матричной ДНК. Реакционную смесь осторожно перемешивали и инкубировали на водяной бане при 65 °C в течение 60 мин. После завершения инкубации продукты амплификации разделяли в 1.5% агарозном геле. Затем продукты амплификации окрашивали, используя 1 μL флуоресцентного красителя ДНК, разведенного 1:100, и визуализировали с помощью транслюминатора синего света. Другой метод определения положительного результата идентификации патогена заключался в добавлении 4 μL гидроксинафтолового синего (HNB, 125 μM) в реакционные пробирки и наблюдении изменения цвета невооруженным глазом. Положительный тест характеризовался появлением синего цвета, а отрицательный — фиолетового24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 и Salmonella Typhimurium ATCC 14028 использовались в качестве отрицательных контролей для метода LAMP. Продукты амплификации, полученные с помощью LAMP, разделяли в агарозном геле и наблюдали с помощью транслюминатора. Полученные изображения регистрировали и оцифровывали с помощью программного обеспечения MS 1D Analysis Software.
3. Обработка образцов устриц, креветок и рыбы для элиминации Vibrio spp., естественно присутствующих в образцах
Были получены десять образцов устриц, 10 образцов креветок и 10 образцов рыбы с приблизительным весом 200 g каждый. Для удаления клеток Vibrio, присутствующих в природе, использовали ранее опубликованную методику21. Пятьдесят граммов (50 g) каждого образца взвешивали и подвергали механической гомогенизации в лопастном блендере при 260 rpm в течение 1 min до получения однородной суспензии тканей, которую затем хранили при -70 °C в течение 72 h. После этого образцы полностью размораживали на водяной бане при 40 °C и промывали 300 mL фосфатно-солевого буферного раствора (0,85% NaCl, pH 9). Чтобы убедиться в успешном удалении Vibrio из образцов в ходе предыдущей процедуры, проводили предварительное обогащение согласно методике, изложенной в главе 9 Бактериологического аналитического руководства Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA)7. Солевой раствор, содержащий образец, заменяли 450 mL щелочной пептонной воды (APW, pH 9). Затем в APW тщательно готовили серийные разведения до 10⁻3 и инкубировали в течение 24 h. Наконец, аликвоту из каждой пробирки высевали на селективную среду — тиосульфат-цитрат-желчно-сахарозный (TCBS) агар — и инкубировали в течение 24 h при 37 °C для визуального подтверждения отсутствия характерных колоний Vibrio. Все тесты проводились в трех повторностях.
4. Приготовление активированного угля с бентонитом (ACB) и оценка восстановления клеток
Для определения условий, при которых ACB наиболее эффективно поглощает ингибиторы, присутствующие в образцах рыбной продукции, при минимальном поглощении целевых клеток, для установления оптимального pH и времени контакта между ACB и образцами пищевых продуктов использовали опубликованную методику21. Активированный уголь тщательно промывали дистиллированной водой и сушили при 55 °C. Затем 32.6 g активированного угля смешивали с 3.04 g бентонита, непрерывно перемешивали при 150 rpm в течение 24 h для обеспечения равномерного распределения, сушили при 55 °C и стерилизовали, в результате чего был получен тонкодисперсный гомогенный сухой порошок ACB. Чтобы оценить степень восстановления клеток после смешивания клеток Vibrio с смесью активированного угля и бентонита (ACB), штаммы выращивали раздельно в бульоне BHI с 2% NaCl до достижения плотности клеток 1.5 x 104 CFU/mL. Затем 1 mL каждого штамма Vibrio инокулировали раздельно в 100 mL фосфатного буфера (PBS, 0.85% NaCl, доведенного до pH 4, 6 и 9). Бактериальную суспензию затем объединяли с 4.6 g предварительно подготовленного ACB и перемешивали при 150 rpm в течение 15, 30 и 60 min для обеспечения контакта. После каждого заданного времени контакта осторожно отделяли аликвоту 0.1 mL, высевали ее методом посева на поверхность на агар TCBS и инкубировали при 37 °C в течение 24 h перед подсчетом колоний.
5. Оценка предела обнаружения V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus и V. alginolyticus в образцах устриц, креветок и рыбы, обработанных активированным углем и бентонитом
Каждый из видов Vibrio, использованных в данном исследовании, выращивали в бульоне BHI, после чего плотность клеток точно доводили до 1.5 x 104, 7.5 x 103, 3.8 x 103, 1.5 x 103, 7.5 x 102, 3 x 102, 1.5 x 102 и 76 CFU/mL (A600 nm ~0.25), что было измерено с помощью спектрофотометра. Затем 1 mL каждой культуры Vibrio использовали для инокуляции 50 g каждого образца (устриц, рыбы, креветок), которые предварительно подвергли обработке для удаления любых присутствующих Vibrio. Инокулированные образцы гомогенизировали в лопастном блендере при 360 rpm в течение 30 s и разбавляли 450 mL APW (pH 6). Затем смесь центрифугировали при 260 x g в течение 5 min при 4 °C для отделения крупных частиц дебриса. Полученный супернатант переливали в колбы, содержащие 23 g ACB, перемешивали при 150 rpm в течение 15 min для абсорбции ингибиторов и фильтровали через фильтровальную бумагу, получая прозрачный элюат без крупных частиц. Затем этот элюат центрифугировали при 16,000 x g в течение 10 min при 4 °C, в результате чего на дне пробирки образовался видимый осадок клеток, который впоследствии использовали для экстракции ДНК. Каждый вид Vibrio идентифицировали методом LAMP. Отрицательные контроли представляли собой образцы, инокулированные штаммами Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 и Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Реакционную смесь инкубировали на водяной бане при 65 °C в течение 60 min. После завершения инкубации продукты амплификации разделяли в 1.5% агарозном геле и окрашивали флуоресцентным красителем для ДНК. Гели визуализировали на транслюминаторе синего света. Наконец, в каждую пробирку добавляли 4 μL гидроксинафтолового синего (125 μM) для визуального обнаружения24.
6. Определение прогностической значимости положительного результата, прогностической значимости отрицательного результата, специфичности и чувствительности метода LAMP
Чувствительность, специфичность и прогностическая значимость метода LAMP были определены с использованием 30 образцов (10 образцов креветок, 10 образцов устриц и 10 образцов рыбы). Каждый образец был инокулирован минимальной детектируемой концентрацией, установленной для каждого вида Vibrio. Для определения процента чувствительности и специфичности, а также отрицательной прогностической ценности (NPV) и положительной прогностической ценности25 использовалась таблица сопряженности для обобщения истинно положительных (TP), истинно отрицательных (TN), ложноположительных (FP) и ложноотрицательных (FN) результатов, полученных в ходе экспериментов. (Таблица 2). На основе этих данных применялись следующие формулы:
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используемые бактериальные штаммы и экстракция ДНК
ДНК была успешно экстрагирована из всех патогенных штаммов и штаммов отрицательного контроля для использования в качестве матриц в последующих анализах LAMP.
Процедура LAMP
Праймеры, использованные в данной работе, были специфичны для амплификации молекулярной мишени каждого вида Vibrio. Продукты амплификации, полученные методом LAMP при использовании штаммов Vibrio, продемонстрировал...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данном исследовании устанавливаются оптимизированные условия для повышения чувствительности петлевой изотермической амплификации (LAMP) при выявлении V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus и V. vulnificus в загрязненных образцах морепродуктов. Благодаря исключению традиционного этапа предварительного обогащения время диагностики значительно сокращается, что обеспечивает высокоэффективный и быстрый подход к прямому выявлению патогенов в продукции рыболовства.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Активированный уголь | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Бентонит | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Бетаин | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Трансиллюминатор систем Bio-Image | Системы биовизуализации | MBE-CP-01 | |
| ДНК-полимераза Bst | New England Biolabs | M0374 | |
| Центрифуга (модель J2-HS) | Beckman Coulter | <ссылка на"https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri Центрифуга высокого скоростного режима Beckman J2-HS">https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri Центрифуга высокого быстродействия Beckman J2 HS, 1273g | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| смесь dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Гидроксинафтол синий | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| Программное обеспечение для одномерного анализа МС | Основные науки | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Спектрофотометр (модель 6300) | Jenway | 630531 | |
| Гомогенизатор Stomacher Circulator (модель 400) | Сьюард | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae не-O1 | КТ с контрастированием | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| бумага Whatman | Whatman | 1001-055 |
Ссылки
- Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
- Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
- CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
- Robert-Pillot A et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2014;189:75-81.
- Brands DA et al. Prevalence of Salmonella spp. in oysters in the United States. Appl Environ Microbiol. 2005;71(2):893-897.
- Gxalo O et al. Virulence and antibiotic resistance characteristics of Vibrio isolates from rustic environmental freshwaters. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:732001.
- De Paola A, Kaysner CA. Bacteriological Analytical Manual, Vibrio. Food and Drug ENTER
- Chahorm K, Prakitchaiwattana C. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods. Int J Food Microbiol. 2018;264:46-52.
- Anupama KP et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichment. Mol Biol Rep. 2021;48(1):1009-1016.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Sridapan T et al. Rapid detection of Clostridium perfringens in food by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow biosensor. PLoS One. 2021;16(1):e0245144.
- Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
- Yamazaki W, Ishibashi M, Kawahara R, Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008;8:163.
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229.
- Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(1):150-154.
- Yamazaki W et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species. Appl Environ Microbiol. 2010;76(3):820-828.
- Di H et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with enrichment culture for rapid detection of very low numbers of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples. Biol Pharm Bull. 2015;38(1):82-87.
- Cai SH et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish. Lett Appl Microbiol. 2010;50(5):480-485.
- Han F, Ge B. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis. 2008;5(3):311-320.
- Zhang L et al. Rapid, specific and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification targeted to vvhA gene. Hai Yang Xue Bao. 2018;37(4):83-88.
- Luan C, Levin RE. Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of PCR detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue. J Microbiol Methods. 2008;72(1):67-72.
- Ren C-H, Hu C-Q, Luo P, Wang Q-B. Sensitive and rapid identification of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Res. 2009;164(5):514–21.
- Srisuk C et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW: Detection of Vibrio cholerae by LAMP. Lett Appl Microbiol. 2010;50(1):36-42.
- Goto M et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009;46(3):167-172.
- Parikh R et al. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45-50.
- Yung CM et al. Insensitivity of diverse and temporally variable particle-associated microbial communities to bulk seawater environmental parameters. Appl Environ Microbiol. 2016;82(11):3431-3437.
- Abolmaaty A, Gu W, Witkowsky R, Levin RE. The use of activated charcoal for the removal of PCR inhibitors from oyster samples. J Microbiol Methods. 2007;68(2):349-352.
- Lee JL, Levin RE. Detection of 5 CFU/g of Escherichia coli O157:H7 on lettuce using activated charcoal and real-time PCR without enrichment. Food Microbiol. 2011;28(3):562-567.
- Tian CD et al. Study on detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of loop-mediated isothermal amplification method: V. Parahaemolyticus in shellfish. J Food Saf. 2011;31(3):371-378.
- Niessen L, Luo J, Denschlag C, Vogel RF. The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Microbiol. 2013;36(2):191-206.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.