Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Микрофлюидная платформа для изучения роли механического сжатия в взаимодействии опухолевых и иммунных клеток в трехмерном внеклеточном матриксе

121 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72929

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол использования микрофлюидной платформы для моделирования взаимодействий между опухолью и иммунными клетками в трехмерной (3D) среде. Наши результаты показали, что натуральные киллеры (NK-клетки) сохраняли свою противоопухолевую активность в условиях механического сжатия.

Аннотация

Механические силы существенно влияют на способность иммунных клеток уничтожать опухолевые клетки в контексте клеточной иммунотерапии. Чтобы убить опухолевые клетки, иммунные клетки должны воздействовать силой на клетку-мишень и сформировать иммунный синапс, через который доставляются цитотоксические молекулы, включая granzyme B. Несмотря на их важность, механизмы использования механических стимулов для усиления иммуноопосредованного уничтожения остаются малоизученными. Этот пробел в знаниях частично обусловлен отсутствием инструментов, способных обеспечивать контролируемый механический стресс клеточных культур в физиологически реалистичной среде. В данной работе мы описываем микрофлюидное устройство для компрессии, которое позволяет прикладывать статическое или динамическое сжатие к опухолевым сфероидам, встроенным во внеклеточный матрикс (ECM), обеспечивая при этом визуализацию взаимодействий между опухолевыми и иммунными клетками в режиме реального времени с помощью оптической микроскопии.

Микрофлюидная платформа состоит из 12 отсеков (6 контрольных и 6 функциональных). Каждый отсек содержит камеру для клеток, расположенную непосредственно под блоком управления давлением. Сфероиды, внедренные в внеклеточный матрикс (ВКМ), помещают в камеру для клеток. С помощью этой платформы мы исследовали эффективность уничтожения опухолевых сфероидов молочной железы (MCF-7) натуральными киллерами (NK-клетками) в условиях заданного механического сжатия. Результаты показали, что NK-клетки оставались основным фактором гибели опухолевых сфероидов независимо от механического сжатия в коллагене концентрацией 1.5 mg/mL. Это позволяет предположить, что NK-клетки способны сохранять свою противоопухолевую активность в условиях компрессионного стресса. Данные результаты демонстрируют полезность этой платформы для изучения роли механических сил во взаимодействии опухоли и иммунной системы. Текущие исследования направлены на выявление молекулярных механизмов, позволяющих иммунным клеткам адаптироваться к компрессионному стрессу. Данные, полученные в ходе этих исследований, могут открыть перспективное направление для терапии.

Введение

Клеточная иммунотерапия рака представляет собой терапевтический подход, при котором для воздействия на раковые клетки используются иммунные клетки1. Эта стратегия продемонстрировала значительный успех в лечении гемобластозов2,3,4. Однако уровень успеха, наблюдаемый при лечении рака крови, пока не был в полной мере перенесен на лечение солидных опухолей5,6,7. Одной из основных причин этого ограничения является иммуносупрессивное микроокружение опухоли (TME), характерное для солидных опухолей.

ОМС характеризуется особыми механическими сигналами, которые могут регулировать поведение клеток. Эффективное уничтожение опухолевых клеток иммунными клетками требует от последних воздействия силы на клетки-мишени и формирования иммунного синапса, через который доставляются цитотоксические молекулы8. Следовательно, понимание того, как механические силы влияют на функцию иммунных клеток, может открыть новые терапевтические стратегии для повышения эффективности клеточной иммунотерапии солидных опухолей.

Определяющей механической особенностью солидного TME является компрессионное напряжение, которое микроокружение опухоли оказывает на растущую опухоль9,10. На сегодняшний день большинство исследований сжатия были сосредоточены на эффектах, влияющих на поведение опухолевых клеток10,11. Только недавно внимание переключилось на понимание того, как компрессия влияет на иммунные клетки внутри TME12. В результате механизмы, посредством которых компрессионное напряжение влияет на миграцию NK-клеток (натуральных киллеров), формирование иммунного синапса и цитотоксическую активность, остаются плохо изученными и недостаточно количественно определенными. Этот пробел представляет собой критическое ограничение в нашем понимании того, как механические сигналы внутри TME могут быть использованы для усиления иммунного воздействия на солидные опухоли.

Основным препятствием для решения этого вопроса является отсутствие экспериментальных платформ, способных обеспечивать контролируемое и количественно измеримое сжатие в физиологически релевантных трехмерных микросредах, одновременно позволяя проводить визуализацию взаимодействий между опухолью и иммунными клетками в режиме реального времени. Ранние экспериментальные подходы к изучению компрессионного стресса заключались в встраивании сфероидов в агарозные гели13. Хотя этот метод эффективно имитировал физическое ограничение, он исключал естественные взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом (ВКМ). Dolega et al. применяли осмотическое давление для создания компрессионного стресса; однако сфероиды находились в суспензии в культуральной среде и, следовательно, были лишены взаимодействий с ВКМ9. Pandey et al. использовали вставки transwell и грузы для сжатия сфероидов, встроенных в коллаген, что позволило сохранить взаимодействия между клетками и ВКМ, но ограничило возможности визуализации с высоким разрешением, необходимым для количественной оценки подвижности и цитотоксической активности иммунных клеток14. В совокупности эти ограничения подчеркивают необходимость создания экспериментальных платформ, позволяющих в режиме реального времени визуализировать морфологические ответы клеток на сжатие внутри микроокружения опухоли (TME).

В данной работе мы представляем протокол использования микрофлюидного устройства для компрессии15, которое позволяет контролируемо прикладывать компрессионное напряжение, сохраняя при этом физиологически значимые взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом (ECM), а также обеспечивая возможность высокоразрешающей визуализации живых клеток в процессе изучения динамики взаимодействия иммунных клеток и опухоли. Протокол включает подготовку компонентов устройства (Раздел 1), сборку устройства (Раздел 2) и визуализацию взаимодействий между опухолевыми и иммунными клетками (Раздел 3). Мы демонстрируем рабочий процесс на примере анализа киллер-активности NK-клеток в отношении опухолевых сфероидов, меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP). Помимо данного применения, платформа может быть легко адаптирована для исследования влияния механических сил на широкий спектр типов клеток и клеточных взаимодействий в трехмерных микросредах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка компонентов устройства

  1. Активация поверхности камеры загрузки образца
    1. Поместите маску на камеру для загрузки образцов (слой 1, L1) таким образом, чтобы были открыты только лунки.
    2. Подвергните замаскированный слой 1 воздействию кислородной плазмы в течение 15 с, используя режим высокой мощности (45 Вт).
    3. Поместите Слой 1 в чашку Петри, затем выполните следующие действия в боксе биологической безопасности.
    4. Обработайте каждую лунку с помощью 10 µL 1% полиэтиленимина (PEI) в течение 10 мин.
    5. Удалите ПЭИ из лунок с помощью вакуумной аспирации из четырех углов каждой лунки, чтобы избежать появления царапин на стеклянной поверхности.
    6. Промойте лунки следующиеми... 10 µL фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), затем удалите промывочный раствор с помощью вакуумного аспиратора сбоку.
    7. Обработайте лунки с помощью 10 µL 0,1% глутаральдегидом в течение 30 мин, затем удалите глутаральдегид с помощью вакуумной аспирации из углов.
    8. Промойте лунки с PBS трижды, удаляя промывочный раствор из углов после каждого этапа промывки.
    9. Оберните фольгой чашку Петри с первым слоем и оставьте ее в шкафу биологической безопасности на ночь.
  2. Стерилизация металлического каркаса
    1. Погрузите 38-мм × Металлическую рамку размером 88 мм и двенадцать винтов с полусферической головкой M2.5 вымачивали в 70% этаноле в течение ночи.
  3. Праймирование блока регулирования давления
    1. Обработайте блок управления давлением кислородной плазмой в течение 30 с, используя режим высокой мощности (45 Вт).
    2. Погрузите блок управления давлением элементами вниз в деионизированную (ДИ) воду на ночь, чтобы заполнить каналы и камеры блока управления давлением.
    3. На следующий день извлеките блок управления давлением из деионизированной воды, в которой он был погружен.
    4. Заполните микрофлюидный резервуар 50 мл деионизированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидный резервуар представляет собой коническую пробирку объемом 50 мл, оснащенную специальной крышкой с двумя патрубками: линией пневматического трубопровода и линией подачи жидкости.
    5. Подсоедините шприц, заполненный воздухом, к пневматической трубке.
    6. Медленно нажмите на поршень шприца, чтобы создать давление в резервуаре и пропустить деионизированную воду через трубку подачи жидкости до полного заполнения трубки и появления капель воды на ее конце.
    7. Подсоедините предварительно заполненную, капающую трубку подачи жидкости через поликарбонатный коллектор к входному отверстию диаметром 1,5 мм, расположенному на задней панели блока управления давлением.
    8. Дайте блоку управления давлением и коллектору высохнуть на воздухе в течение 2 ч. После полного высыхания блок управления давлением и коллектор готовы к следующему этапу.

2. Сборка устройства

  1. Приготовление коллагена с инкапсулированными клетками
    1. Извлеките металлический каркас и винты из 70% этанола и просушите их.
    2. В шкафу с биологической защитой разместите три 600 µL микропробирки на льду. Промаркируйте пробирки следующим образом: "N" (нейтрализация), "Поскольку вы предоставили только аббревиатуру «sp», которая в биологическом и таксономическом контексте обычно означает «вид» (от латинского *species*), я не могу выполнить полноценный перевод без основного текста. Если «sp» является частью латинского названия вида (например, *Homo sp.*), то согласно правилам научной трансляции и международным стандартам, эта аббревиатура **оставляется без изменений** (на латыни), так как она указывает на неопределенный вид данного рода. Если же это часть другого текста, пожалуйста, предоставьте полный исходный материал для перевода." (сфероиды MCF-7) и "sp+NK" (Сфероиды MCF-7 с NK-клетками).
    3. Приготовьте нейтрализующую смесь, добавив 10× необходимый объем среды 199 (M199) и гидроксида натрия (NaOH) в... "N" пробирка
    4. Перенесите соответствующий объем смеси M199:NaOH в "sp" и "sp+NK" пробирки для достижения конечной концентрации 1× концентрация
    5. Соберите сфероиды опухоли и центрифугируйте при 141 × г в течение 3 мин, чтобы сфероиды осели на дно пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды опухоли примерно 200 µm диаметром были созданы с использованием ранее описанной платформы с агарозными микролунками16Кратко, 3 × 106 Клетки MCF-7 высевали в 36-луночный × матрица из 36 агарозных микролунок, состоящая из лунок 200 µm в диаметре и 200 µm вглубь, затем культивировали в течение 7 дней для получения опухолевых сфероидов, использованных в экспериментах.
    6. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируйте сфероиды в 200 µL 50:50 complete medium MCF-7/NK (Таблица 1 и Таблица 2).
    7. Соберите NK-клетки в коническую пробирку объемом 50 мл, центрифугируйте при 141 × г в течение 4 мин, затем подсчитайте количество клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность NK-клеток должна быть >85% в день проведения эксперимента.
    8. Ресуспендируйте полученный осадок в 200 µL полной среды для NK-клеток.
    9. Добавьте соответствующий объем исходного раствора коллагена в каждую микроцентрифужную пробирку.
    10. Добавьте в каждую пробирку соответствующий объем клеточной суспензии, чтобы получить конечный объем 200 µL содержащий 1,5 мг/мл коллагена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: "Поскольку вы не предоставили исходный текст для перевода, пожалуйста, отправьте контент, который необходимо перевести на русский язык. Я готов приступить к работе в соответствии с вашими инструкциями по академическому стилю и научной точности." суспензия содержит только опухолевые сфероиды, в то время как "sp+NK" суспензия содержит опухолевые сфероиды и 1,5 × 106 NK-клетки.
    11. Осторожно перемешайте содержимое, используя дозатор, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток и коллагена, сводя к минимуму образование пузырьков.
  2. Сборка устройства и загрузка клеток
    1. Поместите слой 1 внутрь высушенной металлической рамки.
    2. Загрузка 9 µL коллагеновой смеси в каждую лунку.
    3. С помощью микроскопа совместите блок управления давлением и коллектор с камерами ячеек на уровне Layer 1.
    4. Вставьте высушенные винты через коллектор в металлический каркас, закрепив блок регулировки давления и первый слой (Layer 1) между коллектором и металлическим каркасом.
    5. Поместите собранное устройство в 37 °C, 5% CO2₂ выдержите в инкубаторе в течение 45 мин для полимеризации коллагена.
    6. Добавьте через четыре порта для среды полную питательную среду для культур клеток MCF-7/NK в соотношении 50:50.

3. Визуализация опухолево-иммунных взаимодействий

  1. Поместите собранное устройство внутрь предметного инкубатора, установленного на инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе для визуализации живых клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всего периода визуализации в предметном инкубаторе поддерживалась температура 37 °C и влажность примерно 50%.
  2. Накройте собранное устройство дополнительным защитным коробом для поддержания внутренней среды при температуре 37 °C, влажности 100% и содержании CO₂ 5% на протяжении всего периода визуализации.
  3. Подключите устройство к контроллеру давления с помощью пневматического трубопровода.
  4. Получите изображения опухолевых сфероидов в светлом поле и в канале GFP до приложения компрессии, чтобы иметь возможность оценить деформацию сфероидов после сжатия.
  5. Поддерживайте постоянное давление 120 mbar на протяжении всего периода визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение контроллера давления позволяет пользователю определять профиль и величину давления, прикладываемого во время эксперимента. На Дополнительном рисунке 1 представлена схема системы контроля давления.
  6. Начните таймлапс-визуализацию, получая изображения в светлом поле и в канале GFP каждые 10 min в течение 18 h.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения регистрировались в центральной Z-плоскости каждого опухолевого сфероида с использованием объектива 20× на инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе. Изображения в светлом поле и флуоресцентные изображения GFP были получены с временем экспозиции 200.1 ms и 298.9 ms соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для следующих экспериментов использовалось микрофлюидное устройство сжатия15 для моделирования взаимодействий между опухолью и иммунной системой в физиологически релевантной 3D-микросреде, позволяющее одновременно применять статическое и динамическое сжатие к опухолевым сфероидам (Рисунок 1). Компоненты устройства (Рисунок 1A1) и порядок их сборки (Рисунок 1A2) показаны на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данном методе описывается использование микрофлюидного устройства для компрессии с целью изучения влияния сжимающего стресса на взаимодействия между опухолью и иммунными клетками. Эта система позволяет осуществлять контролируемое механическое сжатие опухолевых сфероидов, встроенных в трехмерный коллагеновый матрикс. Стеклянная подложка, образующая основание клеточной камеры (L1), обеспечивает визуализацию живых клеток с высоким разрешением, что делает данную платформу подходящей для исследований, направленных на количе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

Данная работа поддерживается грантом Национального института рака (Grant R01CA221346), стипендией имени Лэнса Р. Коллинза от Инженерного колледжа Корнеллского университета, предоставленной FM, а также Фондом обеспечения устойчивости исследований проректора Корнелла, предоставленным FM. Часть этой работы была выполнена в Центре наноразмерных технологий Корнелла (Cornell NanoScale Facility), который является участником Национальной скоординированной инфраструктуры нанотехнологий (NNCI) и поддерживается Национальным научным фондом (Grant NNCI-2025233).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 н. NaOHSigma-Aldrich797247 µL
10× среда M199Sigma-AldrichM0650200 µL
2-меркаптоэтанолThermoFisher313500100
Воздушный компрессорElveflowКомпрессор Jun-Air модель 3
Автоматизированный предметный столик микроскопа с перемещением по осям X-YПрикладное научное приборостроениеMS-2000
ПЗС-камераHamamatsu PhotonicsORCA-R2
Фетальная бычья сыворотка (FBS)GeminiBioS11150
Трубки для подачи жидкостиEleveflowЗапасной рулон ПТФЭ-трубок1/16 дюйма по внешнему диаметру
Источник флуоресцентного светаExcelitas Technologies Блок управления ПК серии X-Cite 120
Фолиевая кислотаSigmaF7876
Глутаровый альдегидЭлектронная микроскопия в науке 160190.10%
Плазменный очиститель HarrickHarrick PlasmaPDC-001-HPВысокая мощность (45 Вт)
сыворотка лошади (HS)ThermoFisher16050-122
Инвертированный эпифлуоресцентный микроскопOlympusIX81объектив с 20-кратным увеличением (NA = 0,25), управляемый с помощью программного обеспечения Olympus CellSens
МаскаArtusАлюминиевые прокладки (листы) 10 шт.Толщина составляет 0,0125" (0,75 мм)
Стабильная клеточная линия MCF-7/GFP (пуромицин)GenTarget IncSC050-G
Металлическая рамаИзготовлено на заказ Изготовлено на заказ 
Микрофлюидный резервуарEleveflowмикрофлюидный резервуар объемом 50 мл 
Микроскоп OlympusCKX41объектив с 4-кратным увеличением              (NA = 0,1)
Мио-инозитолСигмаI7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
Пенициллин/стрептомицинGibco 15140122
Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) ThermoFisher 10010072
Пневматическая трубкаEleveflowвходная прозрачная трубка из полиэфирного полиуретана (PUR)4" внешний диаметр, мм
Полиэтиленимин (ПЭИ)Sigma-AldrichP31431%
Контроллер давленияElveflowOB1 NK4Управление осуществляется с помощью программного обеспечения Elveflow Smart Interface
Коллаген I типа из хвоста крысы Corning35424931.3 µL из стокового раствора коллагена с концентрацией 9,6 мг/мл
ВинтыФиллипсВинт M2.5 с полукруглой головкой12 винтов
Инкубатор для предметного столикаПрецизионный пластикИзготовленный на заказ
ШприцBecton Dickinson303134В паре с соединителем Luer-lock с интегрированным замком (папа) на 3/32" OD Barb от Eleveflow
αсреда MEMThermoFisher12561056

Ссылки

  1. Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.
  2. Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.
  3. Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.
  4. Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.
  5. Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.
  6. Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.
  7. Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.
  8. Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.
  9. Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.
  10. Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.
  11. Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.
  12. Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.
  13. Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.
  14. Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.
  15. Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.
  16. Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.
  17. Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.
  18. Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Взаимодействия опухолевых и иммунных клетокиммунный синапсопухолевые сфероидынатуральные киллерывизуализация в реальном времениоптическая микроскопияколлагеновый матрикс

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.