Методическая статья

Микрофлюидная платформа для изучения роли механического сжатия в взаимодействии опухолевых и иммунных клеток в трехмерном внеклеточном матриксе

26 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72929

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол использования микрофлюидной платформы для моделирования взаимодействий между опухолью и иммунными клетками в трехмерной (3D) среде. Наши результаты показали, что натуральные киллеры (NK-клетки) сохраняли свою противоопухолевую активность в условиях механического сжатия.

Аннотация

Механические силы существенно влияют на способность иммунных клеток уничтожать опухолевые клетки в контексте клеточной иммунотерапии. Чтобы убить опухолевые клетки, иммунные клетки должны воздействовать силой на клетку-мишень и сформировать иммунный синапс, через который доставляются цитотоксические молекулы, включая granzyme B. Несмотря на их важность, механизмы использования механических стимулов для усиления иммуноопосредованного уничтожения остаются малоизученными. Этот пробел в знаниях частично обусловлен отсутствием инструментов, способных обеспечивать контролируемый механический стресс клеточных культур в физиологически реалистичной среде. В данной работе мы описываем микрофлюидное устройство для компрессии, которое позволяет прикладывать статическое или динамическое сжатие к опухолевым сфероидам, встроенным во внеклеточный матрикс (ECM), обеспечивая при этом визуализацию взаимодействий между опухолевыми и иммунными клетками в режиме реального времени с помощью оптической микроскопии.

Микрофлюидная платформа состоит из 12 отсеков (6 контрольных и 6 функциональных). Каждый отсек содержит камеру для клеток, расположенную непосредственно под блоком управления давлением. Сфероиды, внедренные в внеклеточный матрикс (ВКМ), помещают в камеру для клеток. С помощью этой платформы мы исследовали эффективность уничтожения опухолевых сфероидов молочной железы (MCF-7) натуральными киллерами (NK-клетками) в условиях заданного механического сжатия. Результаты показали, что NK-клетки оставались основным фактором гибели опухолевых сфероидов независимо от механического сжатия в коллагене концентрацией 1.5 mg/mL. Это позволяет предположить, что NK-клетки способны сохранять свою противоопухолевую активность в условиях компрессионного стресса. Данные результаты демонстрируют полезность этой платформы для изучения роли механических сил во взаимодействии опухоли и иммунной системы. Текущие исследования направлены на выявление молекулярных механизмов, позволяющих иммунным клеткам адаптироваться к компрессионному стрессу. Данные, полученные в ходе этих исследований, могут открыть перспективное направление для терапии.

Введение

Клеточная иммунотерапия рака представляет собой терапевтический подход, при котором для воздействия на раковые клетки используются иммунные клетки1. Эта стратегия продемонстрировала значительный успех в лечении гемобластозов2,3,4. Однако уровень успеха, наблюдаемый при лечении рака крови, пока не был в полной мере перенесен на лечение солидных опухолей5,6,7. Одной из основных причин этого ограничения является иммуносупрессивное микроокружение опухоли (TME), характерное для солидных опухолей.

ОМС характеризуется особыми механическими сигналами, которые могут регулировать поведение клеток. Эффективное уничтожение опухолевых клеток иммунными клетками требует от последних воздействия силы на клетки-мишени и формирования иммунного синапса, через который доставляются цитотоксические молекулы8. Следовательно, понимание того, как механические силы влияют на функцию иммунных клеток, может открыть новые терапевтические стратегии для повышения эффективности клеточной иммунотерапии солидных опухолей.

Определяющей механической особенностью солидного TME является компрессионное напряжение, которое микроокружение опухоли оказывает на растущую опухоль9,10. На сегодняшний день большинство исследований сжатия были сосредоточены на эффектах, влияющих на поведение опухолевых клеток10,11. Только недавно внимание переключилось на понимание того, как компрессия влияет на иммунные клетки внутри TME12. В результате механизмы, посредством которых компрессионное напряжение влияет на миграцию NK-клеток (натуральных киллеров), формирование иммунного синапса и цитотоксическую активность, остаются плохо изученными и недостаточно количественно определенными. Этот пробел представляет собой критическое ограничение в нашем понимании того, как механические сигналы внутри TME могут быть использованы для усиления иммунного воздействия на солидные опухоли.

Основным препятствием для решения этого вопроса является отсутствие экспериментальных платформ, способных обеспечивать контролируемое и количественно измеримое сжатие в физиологически релевантных трехмерных микросредах, одновременно позволяя проводить визуализацию взаимодействий между опухолью и иммунными клетками в режиме реального времени. Ранние экспериментальные подходы к изучению компрессионного стресса заключались в встраивании сфероидов в агарозные гели13. Хотя этот метод эффективно имитировал физическое ограничение, он исключал естественные взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом (ВКМ). Dolega et al. применяли осмотическое давление для создания компрессионного стресса; однако сфероиды находились в суспензии в культуральной среде и, следовательно, были лишены взаимодействий с ВКМ9. Pandey et al. использовали вставки transwell и грузы для сжатия сфероидов, встроенных в коллаген, что позволило сохранить взаимодействия между клетками и ВКМ, но ограничило возможности визуализации с высоким разрешением, необходимым для количественной оценки подвижности и цитотоксической активности иммунных клеток14. В совокупности эти ограничения подчеркивают необходимость создания экспериментальных платформ, позволяющих в режиме реального времени визуализировать морфологические ответы клеток на сжатие внутри микроокружения опухоли (TME).

В данной работе мы представляем протокол использования микрофлюидного устройства для компрессии15, которое позволяет контролируемо прикладывать компрессионное напряжение, сохраняя при этом физиологически значимые взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом (ECM), а также обеспечивая возможность высокоразрешающей визуализации живых клеток в процессе изучения динамики взаимодействия иммунных клеток и опухоли. Протокол включает подготовку компонентов устройства (Раздел 1), сборку устройства (Раздел 2) и визуализацию взаимодействий между опухолевыми и иммунными клетками (Раздел 3). Мы демонстрируем рабочий процесс на примере анализа киллер-активности NK-клеток в отношении опухолевых сфероидов, меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP). Помимо данного применения, платформа может быть легко адаптирована для исследования влияния механических сил на широкий спектр типов клеток и клеточных взаимодействий в трехмерных микросредах.

Протокол

1. Подготовка компонентов устройства

  1. Активация поверхности камеры загрузки образца
    1. Поместите маску на камеру для загрузки образцов (слой 1, L1) таким образом, чтобы были открыты только лунки.
    2. Подвергните замаскированный слой 1 воздействию кислородной плазмы в течение 15 с, используя режим высокой мощности (45 Вт).
    3. Поместите Слой 1 в чашку Петри, затем выполните следующие действия в боксе биологической безопасности.
    4. Обработайте каждую лунку с помощью 10 µL 1% полиэтиленимина (PEI) в течение 10 мин.
    5. Удалите ПЭИ из лунок с помощью вакуумной аспирации из четырех углов каждой лунки, чтобы избежать появления царапин на стеклянной поверхности.
    6. Промойте лунки следующиеми... 10 µL фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), затем удалите промывочный раствор с помощью вакуумного аспиратора сбоку.
    7. Обработайте лунки с помощью 10 µL 0,1% глутаральдегидом в течение 30 мин, затем удалите глутаральдегид с помощью вакуумной аспирации из углов.
    8. Промойте лунки с PBS трижды, удаляя промывочный раствор из углов после каждого этапа промывки.
    9. Оберните фольгой чашку Петри с первым слоем и оставьте ее в шкафу биологической безопасности на ночь.
  2. Стерилизация металлического каркаса
    1. Погрузите 38-мм × Металлическую рамку размером 88 мм и двенадцать винтов с полусферической головкой M2.5 вымачивали в 70% этаноле в течение ночи.
  3. Праймирование блока регулирования давления
    1. Обработайте блок управления давлением кислородной плазмой в течение 30 с, используя режим высокой мощности (45 Вт).
    2. Погрузите блок управления давлением элементами вниз в деионизированную (ДИ) воду на ночь, чтобы заполнить каналы и камеры блока управления давлением.
    3. На следующий день извлеките блок управления давлением из деионизированной воды, в которой он был погружен.
    4. Заполните микрофлюидный резервуар 50 мл деионизированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидный резервуар представляет собой коническую пробирку объемом 50 мл, оснащенную специальной крышкой с двумя патрубками: линией пневматического трубопровода и линией подачи жидкости.
    5. Подсоедините шприц, заполненный воздухом, к пневматической трубке.
    6. Медленно нажмите на поршень шприца, чтобы создать давление в резервуаре и пропустить деионизированную воду через трубку подачи жидкости до полного заполнения трубки и появления капель воды на ее конце.
    7. Подсоедините предварительно заполненную, капающую трубку подачи жидкости через поликарбонатный коллектор к входному отверстию диаметром 1,5 мм, расположенному на задней панели блока управления давлением.
    8. Дайте блоку управления давлением и коллектору высохнуть на воздухе в течение 2 ч. После полного высыхания блок управления давлением и коллектор готовы к следующему этапу.

2. Сборка устройства

  1. Приготовление коллагена с инкапсулированными клетками
    1. Извлеките металлический каркас и винты из 70% этанола и просушите их.
    2. В шкафу с биологической защитой разместите три 600 µL микропробирки на льду. Промаркируйте пробирки следующим образом: "N" (нейтрализация), "Поскольку вы предоставили только аббревиатуру «sp», которая в биологическом и таксономическом контексте обычно означает «вид» (от латинского *species*), я не могу выполнить полноценный перевод без основного текста. Если «sp» является частью латинского названия вида (например, *Homo sp.*), то согласно правилам научной трансляции и международным стандартам, эта аббревиатура **оставляется без изменений** (на латыни), так как она указывает на неопределенный вид данного рода. Если же это часть другого текста, пожалуйста, предоставьте полный исходный материал для перевода." (сфероиды MCF-7) и "sp+NK" (Сфероиды MCF-7 с NK-клетками).
    3. Приготовьте нейтрализующую смесь, добавив 10× необходимый объем среды 199 (M199) и гидроксида натрия (NaOH) в... "N" пробирка
    4. Перенесите соответствующий объем смеси M199:NaOH в "sp" и "sp+NK" пробирки для достижения конечной концентрации 1× концентрация
    5. Соберите сфероиды опухоли и центрифугируйте при 141 × г в течение 3 мин, чтобы сфероиды осели на дно пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды опухоли примерно 200 µm диаметром были созданы с использованием ранее описанной платформы с агарозными микролунками16Кратко, 3 × 106 Клетки MCF-7 высевали в 36-луночный × матрица из 36 агарозных микролунок, состоящая из лунок 200 µm в диаметре и 200 µm вглубь, затем культивировали в течение 7 дней для получения опухолевых сфероидов, использованных в экспериментах.
    6. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируйте сфероиды в 200 µL 50:50 complete medium MCF-7/NK (Таблица 1 и Таблица 2).
    7. Соберите NK-клетки в коническую пробирку объемом 50 мл, центрифугируйте при 141 × г в течение 4 мин, затем подсчитайте количество клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность NK-клеток должна быть >85% в день проведения эксперимента.
    8. Ресуспендируйте полученный осадок в 200 µL полной среды для NK-клеток.
    9. Добавьте соответствующий объем исходного раствора коллагена в каждую микроцентрифужную пробирку.
    10. Добавьте в каждую пробирку соответствующий объем клеточной суспензии, чтобы получить конечный объем 200 µL содержащий 1,5 мг/мл коллагена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: "Поскольку вы не предоставили исходный текст для перевода, пожалуйста, отправьте контент, который необходимо перевести на русский язык. Я готов приступить к работе в соответствии с вашими инструкциями по академическому стилю и научной точности." суспензия содержит только опухолевые сфероиды, в то время как "sp+NK" суспензия содержит опухолевые сфероиды и 1,5 × 106 NK-клетки.
    11. Осторожно перемешайте содержимое, используя дозатор, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток и коллагена, сводя к минимуму образование пузырьков.
  2. Сборка устройства и загрузка клеток
    1. Поместите слой 1 внутрь высушенной металлической рамки.
    2. Загрузка 9 µL коллагеновой смеси в каждую лунку.
    3. С помощью микроскопа совместите блок управления давлением и коллектор с камерами ячеек на уровне Layer 1.
    4. Вставьте высушенные винты через коллектор в металлический каркас, закрепив блок регулировки давления и первый слой (Layer 1) между коллектором и металлическим каркасом.
    5. Поместите собранное устройство в 37 °C, 5% CO2₂ выдержите в инкубаторе в течение 45 мин для полимеризации коллагена.
    6. Добавьте через четыре порта для среды полную питательную среду для культур клеток MCF-7/NK в соотношении 50:50.

3. Визуализация опухолево-иммунных взаимодействий

  1. Поместите собранное устройство внутрь предметного инкубатора, установленного на инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе для визуализации живых клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всего периода визуализации в предметном инкубаторе поддерживалась температура 37 °C и влажность примерно 50%.
  2. Накройте собранное устройство дополнительным защитным коробом для поддержания внутренней среды при температуре 37 °C, влажности 100% и содержании CO₂ 5% на протяжении всего периода визуализации.
  3. Подключите устройство к контроллеру давления с помощью пневматического трубопровода.
  4. Получите изображения опухолевых сфероидов в светлом поле и в канале GFP до приложения компрессии, чтобы иметь возможность оценить деформацию сфероидов после сжатия.
  5. Поддерживайте постоянное давление 120 mbar на протяжении всего периода визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение контроллера давления позволяет пользователю определять профиль и величину давления, прикладываемого во время эксперимента. На Дополнительном рисунке 1 представлена схема системы контроля давления.
  6. Начните таймлапс-визуализацию, получая изображения в светлом поле и в канале GFP каждые 10 min в течение 18 h.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения регистрировались в центральной Z-плоскости каждого опухолевого сфероида с использованием объектива 20× на инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе. Изображения в светлом поле и флуоресцентные изображения GFP были получены с временем экспозиции 200.1 ms и 298.9 ms соответственно.

Результаты

Для следующих экспериментов использовалось микрофлюидное устройство сжатия15 для моделирования взаимодействий между опухолью и иммунной системой в физиологически релевантной 3D-микросреде, позволяющее одновременно применять статическое и динамическое сжатие к опухолевым сфероидам (Рисунок 1). Компоненты устройства (Рисунок 1A1) и порядок их сборки (Рисунок 1A2) показаны на Рисунке 1A. Металлическая рама служит основанием устройства, внутри которой располагается слой с камерой для клеток (L1). Блок управления давлением, состоящий из плазменно-сплавленных слоев L2 и L3, размещается над L1, за ним следует коллектор (Рисунок 1A2). Вместе L1 и блок управления давлением образуют функциональное микрофлюидное устройство и зажимаются между металлической рамой и коллектором с помощью винтов. Коллектор содержит входные порты для жидкостных трубок, подающих давление в устройство, а также резервуары для среды, которые облегчают проведение экспериментов по длительной визуализации живых клеток.

Компоненты и схема микрофлюидного устройства; компрессия клеточной камеры; результаты эксперимента с клетками, экспрессирующими GFP.
Рисунок 1Микрофлюидное устройство для сжатия, предназначенное для изучения взаимодействий между иммунными клетками и опухолевыми сфероидами в условиях механического сжатия. (А1) Фотография компонентов, необходимых для сборки устройства; показаны слева направо: коллектор, блок регулировки давления (L2 + L3), слой с камерой ячейки (L1) и металлическая рама. (А2) 3D-схема компонентов устройства, показанных сверху вниз: коллектор, блок управления давлением (L2 + L3), слой камеры с клетками (L1) и металлическая рама. Слои ПДМС L2 и L3 соединены методом плазменной склейки для формирования блока управления давлением, который расположен над камерой с клетками. Коллектор и металлическая рама фиксируют собранное устройство. (B1Схематический разрез устройства сжатия до и после компрессии. Опухолевые сфероиды, встроенные в внеклеточный матрикс (ВКМ), и NK-клетки помещаются в камеру для клеток. Начальное расстояние между нижней частью L1 и нижней частью L2 до сжатия обозначено как h. При приложении давления к блоку управления давлением L2 отклоняется вниз, в результате чего поршень из ПДМС сжимает опухолевый сфероид. Перемещение L2 вниз после сжатия обозначено как Δh.B2) Совмещенные изображения MCF-7 опухолевого сфероида с NK-клетками, полученные в светлом поле и в канале GFP, до (слева) и после (справа) компрессии. Клетки MCF-7 мечены GFP, NK-клетки не мечены. Репрезентативные NK-клетки обведены синим цветом, желтые контуры обозначают периферию опухолевых сфероидов. Масштабная линейка = 50 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

После сборки микрофлюидное устройство для компрессии может быть использовано для сжатия опухолевых сфероидов, как показано на Рисунке 1B. В данном случае опухолевые сфероиды с NK-клетками, иммобилизованные в коллагене, вводятся в камеру для клеток (L1). При подаче давления в камеру давления (L3) деформируемый мембранный слой (L2) прогибается вниз, в результате чего поршень из полидиметилсилоксана (PDMS) передает сжимающее усилие на сфероид. Камера давления контролируется внешним источником давления. Дополнительные сведения о конструкции, изготовлении и характеристиках микрофлюидного устройства для компрессии были ранее опубликованы в другом исследовании15.

Мы определяем расстояние между дном камеры для клеток (L1) и нижней стороной деформируемой мембраны (L2) как h (Рисунок 1B1, левая панель). До начала сжатия это расстояние составляет 20 µm. При подаче давления жидкости в блок управления давлением деформируемая мембрана прогибается вниз, уменьшая расстояние h на величину Δh (Δh; Рисунок 1B1, правая панель) и тем самым сжимая опухолевый сфероид, встроенный в коллаген. В данной системе деформация сжатия определяется как Δh/h, где h — начальное расстояние между L1 и L2 до сжатия, а Δh — смещение L2 вниз после сжатия. Смещение мембраны было предварительно откалибровано путем визуализации флуоресцентных микросфер, прикрепленных к нижней стороне L2. Подробное описание процедуры калибровки и расчетов деформации сжатия приведено в предыдущем исследовании17. Пример калибровочной кривой представлен на Дополнительном рисунке 2.

Рисунок 1B2 демонстрирует репрезентативные совмещенные изображения в светлом поле и в канале GFP сфероида MCF-7 с внедренными NK-клетками в коллагене с концентрацией 1.5 mg/mL до (левая панель) и после компрессии (правая панель). Границы опухолевого сфероида обведены желтым цветом. После компрессии наблюдалось увеличение проекционной площади сфероида, что указывает на его деформацию в ответ на успешное приложение механической нагрузки. Для всех экспериментов, представленных в данной работе, мы использовали степень сжатия Δh/h = 50%. Отметим, что диаметр сфероида варьируется от 140 µm до 20 µm. Это означает, что фактическая степень сжатия сфероида несколько меньше 50%. В Дополнительном видео 1 и Дополнительном видео 2 показаны репрезентативные Z-стеки в плоскости X-Y, полученные в канале GFP-флуоресценции для сфероида MCF-7, внедренного в коллаген 1.5 mg/mL, соответственно до и после приложения 50% сжимающей нагрузки.

Микрофлюидное устройство для компрессии использовали для исследования влияния NK-клеток, компрессии и их сочетания на гибель опухолевых сфероидов (Рисунок 2). Это стало возможным благодаря конструкции устройства, которое содержит 12 культуральных лунок. Из этих лунок шесть могут подвергаться компрессии, в то время как остальные шесть служат в качестве некомпрессионного контроля. Такая конфигурация позволяет реализовать четыре экспериментальных условия (Рисунок 2A): только сфероиды без компрессии (sp), сфероиды с NK-клетками без компрессии (+NK), сфероиды, подвергнутые компрессии (+comp), и сфероиды, подвергнутые одновременно компрессии и воздействию NK-клеток (+comp+NK).

Таймлапс-микроскопия интенсивности GFP; график, диаграмма рассеяния с анализом нормированных данных GFP.
Рисунок 2Механическое сжатие модулирует опосредованное NK-клетками уничтожение опухолевых сфероидов. (A) Флуоресцентные изображения MCF-7 сфероидов, имплантированных в коллаген (1,5 мг/мл), полученные методом тайм-лапс микроскопии при четырех условиях: контрольная группа только со сфероидами (sp), сфероиды с NK-клетками (+NK), сфероиды с компрессией (+comp) и сфероиды с компрессией и NK-клетками (+comp+NK). Флуоресценция GFP маркирует жизнеспособные опухолевые клетки MCF-7. Желтым контуром обозначена область интереса (ROI), определенная по изображению через 18 часов и примененная ко всем временным точкам для количественного анализа флуоресценции. Для последующего анализа измерялась общая интенсивность флуоресценции GFP внутри ROI. Масштабная линейка = 50 µm. (B) Общая интенсивность флуоресценции GFP одного сфероида в динамике при 4 условиях. Каждая цветная линия представляет общую интенсивность флуоресценции отдельного сфероида, нормированную по его начальной интенсивности при t = 0. Черная линия представляет собой полиномиальную аппроксимацию второго порядка данных об интенсивности флуоресценции, объединенных для 7 сфероидов, культивируемых в контрольных условиях; она использовалась в качестве эталона для расчета потери опухолевых клеток на графике (C).C) Нормализованная потеря ГФП для условий +comp, +NK и +comp+NK была рассчитана путем вычитания интенсивности ГФП в каждой сфероиде при t = 18 ч из контрольной линии только со сфероидами (sp). Таким образом, каждая точка данных представляет собой нормализованную потерю ГФП одного сфероида. Планки погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эффекты NK-клеток, компрессии и их комбинации на опухолевые сфероиды можно визуализировать на репрезентативных изображениях сфероидов MCF-7 в 1,5 mg/mL коллагена (Рисунок 2A). Поскольку клетки MCF-7, использованные для создания опухолевых сфероидов, были мечены GFP, жизнеспособность опухоли можно было контролировать по изменению флуоресценции GFP. Изображения в GFP-канале и в светлом поле получали каждые 10 min в течение 18 h с помощью инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа. Примечательно, что сфероиды, подвергнутые компрессии, имели большую проекционную площадь, чем нескомпрессированные сфероиды, что подтверждает успешную передачу механической нагрузки от деформируемой мембраны к опухолевому сфероиду. Со временем в условиях +NK и +comp+NK наблюдалось прогрессирующее снижение флуоресценции GFP (Рисунок 2A), что указывает на опосредованное NK-клетками уничтожение опухолевых клеток.

Мы используем потерю флуоресценции GFP в качестве показателя гибели опухолевых клеток. Клетки MCF-7, меченные GFP и использованные в данном исследовании, были получены методом лентивирусной трансдукции. Вкратце, лентивирусный вектор использовался для введения экспрессионной кассеты усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) под управлением промотора фактора элонгации-1α (EF1α), а также гена устойчивости к пуромицину под управлением промотора вируса саркомы кур (RSV). После инфицирования лентивирусные экспрессионные кассеты интегрировались в геномную ДНК клеток MCF-7, что привело к стабильной экспрессии GFP. Последующий отбор пуромицином использовался для элиминации нетрансдуцированных клеток. Мечение клеток MCF-7 GFP позволило количественно оценивать жизнеспособность опухолевых клеток путем мониторинга изменений интенсивности флуоресценции GFP с течением времени (Рисунок 2B). Ранее была установлена сильная корреляция между потерей флуоресценции GFP и общепринятыми маркерами гибели клеток, включая маркер живых/мертвых клеток пропидий иодид (PI) и маркер апоптоза аннексин-V18, что подтверждает возможность использования потери флуоресценции GFP в качестве суррогатного показателя гибели опухолевых клеток.

Для количественной оценки влияния четырех экспериментальных условий на жизнеспособность опухоли в каждой временной точке измеряли общую интенсивность флуоресценции GFP каждого опухолевого сфероида, вычитали фоновый сигнал и нормировали полученные значения относительно исходного уровня (Рисунок 2B). Общая флуоресценция сфероида рассчитывалась в заранее определенной области интереса (ROI). Эта область ROI была получена путем ручного обведения границы опухолевого сфероида на изображении, сделанном через 18 ч (желтый контур на панели 18 ч, Рис. 2A), с использованием собственного скрипта MATLAB. Затем для каждой временной точки рассчитывали общую интенсивность флуоресценции внутри этой ROI и корректировали ее, вычитая среднюю интенсивность фоновой флуоресценции, измеренную в отдельной ROI, выбранной в другом месте изображения. Полученные значения флуоресценции с поправкой на фон впоследствии нормировали по начальной интенсивности флуоресценции сфероида.

Каждая цветная кривая на рисунке 2B представляет собой нормализованную интенсивность GFP отдельного сфероида при определенном экспериментальном условии. Кривая получена путем аппроксимации экспериментальных данных полиномом второй степени. Фиолетовые кривые соответствуют сфероидам, подвергнутым только компрессии (+comp, рисунок 2B), красные кривые — сфероидам с NK-клетками (+NK, рисунок 2B), а синие кривые — сфероидам, подвергнутым одновременно и компрессии, и воздействию NK-клеток (+comp+NK, рисунок 2B). Напротив, черная кривая представляет собой аппроксимацию данных семи сфероидов, культивируемых в контрольном условии (только сфероиды) полиномом второй степени (sp, рисунок 2B). Для наглядности на рисунке 2B представлены только данные аппроксимации полиномом, а не экспериментальные точки. Примечательно, что интенсивность флуоресценции GFP в условиях «только сфероиды» (sp) и «сфероиды + компрессия» (+comp) демонстрировала общую тенденцию к росту с течением времени (рисунок 2B), что соответствует продолжению роста опухоли или сохранению жизнеспособности. В отличие от них, в условиях +NK и +comp+NK наблюдалось прогрессирующее снижение интенсивности флуоресценции GFP (рисунок 2B), что указывает на гибель опухолевых клеток.

Кумулятивную потерю опухолевых клеток количественно определяли путем вычитания аппроксимированной нормализованной интенсивности флуоресценции GFP каждого сфероида при заданном условии (+comp, +NK или +comp+NK) из показателей контрольного условия через 18 ч (Рисунок 2C). В результате каждая точка данных представляет собой нормализованную потерю GFP отдельного сфероида относительно контроля (только сфероиды) (Рисунок 2C). Соответственно, условие +comp отражает потерю GFP, вызванную только компрессией (фиолетовый цвет, Рисунок 2C), условие +NK отражает потерю GFP, вызванную только NK-клетками (красный цвет, Рисунок 2C), а условие +comp+NK отражает потерю GFP, возникшую в результате комбинированного воздействия компрессии и NK-клеток (синий цвет, Рисунок 2C). В условии +comp наблюдалась наименьшая степень потери GFP (Рисунок 2C), что свидетельствует о минимальном влиянии одной лишь компрессии на жизнеспособность сфероидов. Напротив, в условиях +NK и +comp+NK наблюдалась значительно большая потеря GFP, чем в условии +comp (Рисунок 2C), что указывает на то, что NK-клетки являются основным фактором гибели опухолевых клеток. Хотя в условии +comp+NK средняя потеря GFP была выше, чем в условии +NK, эта разница не достигла статистической значимости (Рисунок 2C). Эти результаты позволяют предположить, что компрессия не препятствует опосредованному NK-клетками уничтожению опухолевых клеток. В совокупности данные результаты демонстрируют, что микрофлюидное устройство для компрессии может быть успешно использовано для количественной оценки независимого и комбинированного воздействия компрессии и NK-клеток на жизнеспособность опухолевых сфероидов в физиологически релевантной 3D-среде.

Напротив, субоптимальные результаты могут возникнуть, если (1) сфероиды расположены за пределами границы поршня, (2) сфероиды расположены слишком близко к границе поршня и (3) несколько сфероидов находятся на расстоянии менее одного диаметра сфероида друг от друга (Рисунок 3). В этих случаях соответствующие поля следует исключить из анализа.

Эффект сжатия клеток; BF, флуоресценция GFP; до и после; результаты таймлапс-микроскопии за 18 часов.
Рисунок 3Репрезентативный пример последовательности изображений сфероидов, исключенных из анализа. Представлены таймлапс-изображения сфероидов MCF-7 с NK-клетками в коллагене (1,5 мг/мл), полученные в светлом поле (BF), в режиме флуоресценции GFP, а также совмещенные изображения до сжатия (левый столбец) и после сжатия (два правых столбца). Изображения до сжатия были получены за 20 минут до приложения давления и за 10 минут до начала таймлапс-съемки. В дальнейшем изображения собирались каждые 10 минут в течение 18 часов, где 0 ч соответствует первому изображению, полученному сразу после сжатия, а 18 ч — окончанию эксперимента. Синяя стрелка указывает на край поршня из ПДМС (L2). Данное поле обзора было исключено из анализа, так как в области сжатия находились два сфероида, расположенных слишком близко к границе поршня. В результате количественная оценка деформации сфероидов и интенсивности флуоресценции GFP в процессе сжатия не могла быть проведена достоверно. Масштабный отрезок = 50 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

(1) Сфероиды, расположенные за пределами границы поршня, не подвергаются сжатию, так как давление прикладывается только в области поршня. Следовательно, такие сфероиды следует исключить как из группы сжатия, так и из контрольной группы. (2) Сфероиды, расположенные на границе поршня или вблизи неё (Рисунок 3, верхний сфероид), следует исключить, так как такой сфероид подвергается неоднородной механической нагрузке. (3) Сфероиды, находящиеся на расстоянии менее одного диаметра сфероида от соседних сфероидов, следует исключить (Рисунок 3). Близкое расположение сфероидов затрудняет количественную оценку интенсивности флуоресценции GFP, поскольку область интереса (ROI) определяется по конечной временной точке. Со временем границы сфероидов могут стать неразличимыми, что затруднит выделение ROI, которая точно охватывала бы только один сфероид. Эти проблемы можно минимизировать, обеспечив центрирование сфероидов в области сжатия во время загрузки устройства. Тщательный контроль распределения и позиционирования сфероидов, а также настройки устройства необходимы для достижения равномерного сжатия и получения надежных, воспроизводимых результатов эксперимента.

КомпонентыКонцентрация
Среда α-MEM
Фетальная бычья сыворотка (FBS)10%
Пенициллин/стрептомицин1%

Таблица 1: Полная среда для MCF-7.

КомпонентыКонцентрация
среда α-MEM
Мио-инозитол0,2 мМ
2-меркаптоэтанол0,1 мМ
Фетальная бычья сыворотка (ФБС)12.50%
Фолиевая кислота0,02 мМ
Сыворотка лошади (HS)12.50%
Пенициллин/стрептомицин1%

Таблица 2: Полная среда для NK-клеток.

Дополнительная фигура 1: Схема системы контроля давления. Воздушный компрессор подает сжатый воздух (до 20 psi) в контроллер давления. Контроллер давления регулирует давление воздуха, подаваемого в резервуар давления, в соответствии с заданными пользователем настройками. Контроллер имеет максимальное рабочее давление 20 mbar, стабильность давления 0,05% от полной шкалы (FS), разрешение по давлению 0,03% FS и время отклика 9 ms, что обеспечивает точный и воспроизводимый контроль давления. Контроллер подключен к компьютеру через универсальную последовательную шину (USB), что позволяет пользователю программировать величину и профиль приложенного давления с помощью соответствующего программного обеспечения. ПО поддерживает несколько форм волны сжатия, включая постоянное, синусоидальное, треугольное и периодическое сжатие. На данной схеме давление установлено на уровне 120 mbar, и сжатый воздух при этом давлении подается в резервуар под давлением через пневматическую трубку. Резервуар под давлением содержит 50 mL деионизированной (DI) воды и служит для преобразования пневматического давления в гидравлическое давление. После создания давления резервуар вытесняет жидкость через трубку подачи жидкости в блок управления давлением микрофлюидного устройства сжатия (подробности об устройстве см. на Рисунке 1), где гидравлическое давление используется для создания сжатия опухолевого сфероида. Обратите внимание, что для предотвращения появления пузырьков воздуха в устройстве из PDMS используется давление жидкости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Калибровочная кривая для микрофлюидного устройства сжатия, показывающая зависимость между смещением поршня (, µm) и давлением, приложенным к камере управления давлением (KPa). Экспериментальные измерения представлены точками, а сплошная линия соответствует симуляции в COMSOL. Планки погрешностей указывают стандартную ошибку среднего (SEM) по восьми независимым экспериментальным измерениям, однако они слишком малы, чтобы быть видимыми. Этот рисунок воспроизведен из работы Suh et al.15 с разрешения Royal Society of Chemistry. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 1: X-Y z-стек GFP-маркированного сфероида MCF-7 перед сжатием. Сфероид был иммобилизован в коллагене с концентрацией 1,5 mg/mL внутри микрофлюидного устройства для сжатия; визуализация проводилась в канале флуоресценции GFP с шагом по оси z 1 µm. Затем для повышения контрастности был использован ImageJ. Масштабная линейка = 50 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 2: Затем к сфероиду MCF-7, меченному GFP и погруженному в коллаген с концентрацией 1.5 mg/mL, была приложена компрессионная деформация 50% (Δh/h = 50%). После сжатия в канале флуоресценции GFP был получен z-стек в плоскости X–Y с шагом 1 µm, который затем был обработан в ImageJ для повышения контрастности. Масштабная линейка = 50 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В данном методе описывается использование микрофлюидного устройства для компрессии с целью изучения влияния сжимающего стресса на взаимодействия между опухолью и иммунными клетками. Эта система позволяет осуществлять контролируемое механическое сжатие опухолевых сфероидов, встроенных в трехмерный коллагеновый матрикс. Стеклянная подложка, образующая основание клеточной камеры (L1), обеспечивает визуализацию живых клеток с высоким разрешением, что делает данную платформу подходящей для исследований, направленных на количественную оценку подвижности, инфильтрации и цитотоксической активности иммунных клеток. Важно отметить, что система сохраняет межклеточные взаимодействия и взаимодействия клеток с матриксом, позволяя при этом точно контролировать механическую среду. Напротив, многие существующие экспериментальные подходы к изучению сжимающего стресса требуют компромисса между клеточными взаимодействиями, опосредованными внеклеточным матриксом9,13, и визуализацией с высоким разрешением14.

В настоящем исследовании в качестве модельной системы использовались NK-клетки и сфероиды опухоли молочной железы MCF-7. Однако применение микрофлюидного устройства для компрессии не ограничивается данными типами клеток. На сегодняшний день платформа была успешно применена к нескольким моделям клеток молочной железы, включая сфероиды опухоли молочной железы MDA-MB-231 и сфероиды MCF-10A15,17. Платформа может быть легко адаптирована для изучения опухолево-иммунных взаимодействий в различных других моделях опухолей, включая сфероиды опухолей головного мозга и легких. Аналогично, платформа совместима с широким спектром популяций иммунных клеток, помимо NK-клеток, что позволяет исследовать разнообразные опухолево-иммунные взаимодействия в условиях механического сжатия. Кроме того, устройство не ограничивается исследованиями на основе сфероидов и может быть адаптировано для экспериментов с отдельными клетками. В совокупности эти особенности делают платформу универсальным инструментом для изучения того, как механические силы регулируют поведение клеток в широком диапазоне биологических контекстов и при различных заболеваниях.

Еще одним преимуществом данной системы является точный контроль величины и характера сжатия, прикладываемого к образцам. В настоящем исследовании на протяжении всего эксперимента применялась статическая деформация сжатия 50%. Однако уровень деформации может быть легко изменен в зависимости от целей эксперимента. Кроме того, с помощью внешней системы управления давлением к сфероидам можно прикладывать динамическое сжатие с различными формами волны, включая прямоугольные и синусоидальные. Прямоугольное сжатие предполагает чередование интервалов сжатия и расслабления17, в то время как синусоидальное сжатие характеризуется постепенным увеличением и уменьшением степени сжатия с течением времени15. Эти возможности в сочетании с количественной визуализацией и прогнозным моделированием могут быть использованы для изучения влияния динамического сжатия на эффективность иммунного уничтожения.

Отметим, что данное устройство для компрессии было изначально разработано для характеристики механических свойств опухоли17Путем включения in situ датчик силы, слой полиакриламидного (PAA) геля под сфероидом опухоли, механические свойства сфероида, такие как жесткость и вязкоупругость, могут быть количественно охарактеризованы15,17Данная модификация расширяет возможности платформы, позволяя использовать её не только для моделирования компрессионного стресса, но и для прямого измерения механического поведения опухоли.

В целом, микрофлюидное устройство для компрессии имеет широкий спектр применения: от измерения механических свойств сфероидов до исследования взаимодействий между опухолью и иммунной системой в условиях механической модуляции среды. Однако для успешной работы устройства необходимо выполнить несколько критически важных этапов. Сфероиды опухоли следует располагать близко к центру каждой лунки, чтобы обеспечить равномерное сжатие. Блок управления давлением должен быть правильно совмещен со слоем камеры для клеток (L1) для обеспечения точной передачи давления. При установке блока управления давлением поверх L1 могут появиться пузырьки воздуха, что может отрицательно сказаться на качестве визуализации и результатах эксперимента. Чтобы предотвратить эту проблему, следует соблюдать осторожность, чтобы не допустить попадания пузырьков при загрузке коллагеновой смеси; в каждую лунку следует добавить 8 µL коллагеновой смеси, чтобы слегка переполнить камеру перед установкой блока управления давлением. Это помогает обеспечить полный контакт между слоями и снижает вероятность образования воздушных пробок.

В заключение следует отметить, что данное устройство позволяет осуществлять контролируемое моделирование компрессионного стресса в физиологически релевантном трехмерном коллагеновом матриксе, который поддерживает взаимодействие между опухолью и иммунными клетками. Эта платформа предоставляет инструмент для исследования того, как статические и динамические механические силы регулируют иммуноопосредованное уничтожение клеток и поведение опухоли в микроокружении опухоли. В настоящее время мы устанавливаем молекулярный механизм, лежащий в основе механической модуляции иммунного уничтожения опухолевых клеток. Эти исследования могут привести к поиску новых потенциальных мишеней для терапевтических препаратов.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

Данная работа поддерживается грантом Национального института рака (Grant R01CA221346), стипендией имени Лэнса Р. Коллинза от Инженерного колледжа Корнеллского университета, предоставленной FM, а также Фондом обеспечения устойчивости исследований проректора Корнелла, предоставленным FM. Часть этой работы была выполнена в Центре наноразмерных технологий Корнелла (Cornell NanoScale Facility), который является участником Национальной скоординированной инфраструктуры нанотехнологий (NNCI) и поддерживается Национальным научным фондом (Grant NNCI-2025233).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 н. NaOHSigma-Aldrich797247 µL
10× среда M199Sigma-AldrichM0650200 µL
2-меркаптоэтанолThermoFisher313500100
Воздушный компрессорElveflowКомпрессор Jun-Air модель 3
Автоматизированный предметный столик микроскопа с перемещением по осям X-YПрикладное научное приборостроениеMS-2000
ПЗС-камераHamamatsu PhotonicsORCA-R2
Фетальная бычья сыворотка (FBS)GeminiBioS11150
Трубки для подачи жидкостиEleveflowЗапасной рулон ПТФЭ-трубок1/16 дюйма по внешнему диаметру
Источник флуоресцентного светаExcelitas Technologies Блок управления ПК серии X-Cite 120
Фолиевая кислотаSigmaF7876
Глутаровый альдегидЭлектронная микроскопия в науке 160190.10%
Плазменный очиститель HarrickHarrick PlasmaPDC-001-HPВысокая мощность (45 Вт)
сыворотка лошади (HS)ThermoFisher16050-122
Инвертированный эпифлуоресцентный микроскопOlympusIX81объектив с 20-кратным увеличением (NA = 0,25), управляемый с помощью программного обеспечения Olympus CellSens
МаскаArtusАлюминиевые прокладки (листы) 10 шт.Толщина составляет 0,0125" (0,75 мм)
Стабильная клеточная линия MCF-7/GFP (пуромицин)GenTarget IncSC050-G
Металлическая рамаИзготовлено на заказ Изготовлено на заказ 
Микрофлюидный резервуарEleveflowмикрофлюидный резервуар объемом 50 мл 
Микроскоп OlympusCKX41объектив с 4-кратным увеличением              (NA = 0,1)
Мио-инозитолСигмаI7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
Пенициллин/стрептомицинGibco 15140122
Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) ThermoFisher 10010072
Пневматическая трубкаEleveflowвходная прозрачная трубка из полиэфирного полиуретана (PUR)4" внешний диаметр, мм
Полиэтиленимин (ПЭИ)Sigma-AldrichP31431%
Контроллер давленияElveflowOB1 NK4Управление осуществляется с помощью программного обеспечения Elveflow Smart Interface
Коллаген I типа из хвоста крысы Corning35424931.3 µL из стокового раствора коллагена с концентрацией 9,6 мг/мл
ВинтыФиллипсВинт M2.5 с полукруглой головкой12 винтов
Инкубатор для предметного столикаПрецизионный пластикИзготовленный на заказ
ШприцBecton Dickinson303134В паре с соединителем Luer-lock с интегрированным замком (папа) на 3/32" OD Barb от Eleveflow
αсреда MEMThermoFisher12561056

Ссылки

  1. Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.
  2. Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.
  3. Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.
  4. Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.
  5. Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.
  6. Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.
  7. Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.
  8. Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.
  9. Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.
  10. Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.
  11. Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.
  12. Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.
  13. Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.
  14. Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.
  15. Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.
  16. Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.
  17. Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.
  18. Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.

Перепечатки и разрешения

Теги

Immunology and InfectionMicrofluidicsMechanobiologyCancer ImmunologyNatural Killer cellsImmune cellsCompression
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.