Методическая статья

Модифицированный метод экстракции зубов для повышения эффективности и воспроизводимости процедуры в модели заживления лунки зуба нижней челюсти у мышей

23 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72974

⸱

8 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

В этой статье

Краткое содержание

Описан модифицированный подход к удалению первого моляра нижней челюсти у мышей, который сравнивается с традиционным подходом для оценки эффективности и воспроизводимости процедуры. Модифицированный подход повышает согласованность выполнения процедуры и снижает технические сложности при создании модели заживления лунки зуба нижней челюсти у мышей.

Аннотация

Модель заживления лунки зуба (TSHM) является широко используемой животной моделью для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе регенерации кости. Хотя модель TSHM в нижней челюсти мыши ценна для изучения специфических патологических процессов нижней челюсти, создание этой модели остается технически сложной задачей из-за анатомических и биомеханических особенностей области моляров нижней челюсти. В данном протоколе описывается модифицированный подход к удалению первого моляра нижней челюсти у мышей и приводится сравнение его эффективности с традиционным методом для повышения эффективности и воспроизводимости процедуры. В контролируемых экспериментальных условиях модифицированный подход позволил значительно сократить среднее время удаления с 29 до 10 min. Кроме того, в модифицированной группе наблюдалось меньше осложнений, связанных с удалением, включая переломы корня и альвеолярной кости, что свидетельствует о повышении стабильности процедуры. Анализ с помощью микрокомпьютерной томографии (μCT) дополнительно продемонстрировал лучшую сохранность архитектуры лунки после удаления на ранних этапах заживления. Эти результаты показывают, что модифицированный подход к удалению повышает эффективность и воспроизводимость процедуры, снижая технические сложности, связанные с удалением зубов нижней челюсти у мышей. Данный протокол может способствовать более стабильному созданию моделей заживления лунок зубов нижней челюсти мышей, особенно для исследователей с ограниченным опытом микрохирургических операций.

Введение

Модель заживления лунки зуба (TSHM) является классической моделью для изучения регенерации костной ткани1. Эта модель создает сложную, но субкритическую травму в альвеолярной кости, что обеспечивает благоприятное естественное заживление без дополнительного вмешательства1. Мыши широко используются в качестве модельных организмов благодаря их генетическому фону, сходству метаболизма костной ткани с человеческим, относительно низким затратам на разведение и простоте содержания2. За последние несколько десятилетий стремительный прогресс в технологиях редактирования генов сделал мышей незаменимыми для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе регенерации кости3. Следовательно, удаление моляров у трансгенных мышей широко применяется для создания TSHM с целью изучения регуляторных механизмов регенерации костной ткани4,5,6.

В большинстве предыдущих исследований модель TSHM у мышей создавалась на основе верхней челюсти4,5,6, поскольку нижняя челюсть механически более жесткая и менее податливая, чем верхняя7, что повышает техническую сложность удаления зуба. Кроме того, операционное поле при удалении верхних моляров относительно более доступно, а верхнюю челюсть легче стабилизировать, чем нижнюю, что делает процедуру технически менее трудоемкой. Несмотря на эти сложности, изогнутая и увеличенная апикальная морфология корней первого моляра нижней челюсти мыши усиливает механическую фиксацию в окружающей альвеолярной кости8,9, что дополнительно затрудняет экстракцию (Рисунок 1). Тем не менее, модели удаления зубов из нижней челюсти остаются незаменимыми для изучения специфических патологических процессов нижней челюсти, включая остеомиелит, лекарственный остеонекроз челюсти, остеоинтеграцию имплантатов и регенерацию кости с использованием биоматериалов10,11,12. Таким образом, воспроизводимый и надежный метод удаления моляров нижней челюсти у мышей имеет важное значение для исследований, требующих моделей заживления лунок зубов именно в нижней челюсти.

Диаграмма анатомии зуба: срезы, показывающие эмаль, дентин, цемент; A, B, C обозначают стадии.
Рисунок 1. Схематическое сравнение морфологии зубов человека и мыши. 
(A) Схематическое изображение зуба взрослого человека. (B) Схематическое изображение первого моляра нижней челюсти мыши подросткового возраста. (C) Схематическое изображение первого моляра нижней челюсти взрослой мыши. На диаграммах выделены различия в морфологии корня и распределении цемента, которые способствуют повышенной механической фиксации первых моляров нижней челюсти взрослых мышей в альвеолярной кости. Эмаль, дентин и цемент обозначены соответствующими цветами, указанными в легенде. Анатомические особенности основаны на опубликованных описаниях8,9,15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ранее разработанный нашей исследовательской группой метод удаления зубов предполагает использование шприцев, модифицированных в стоматологические элеваторы13. Хотя этот метод позволяет успешно удалить первый моляр нижней челюсти справа у мышей, он требует высокой технической точности и длительного периода обучения с необходимостью интенсивной практики. Неопытные операторы могут непреднамеренно нанести повреждения прилегающим анатомическим структурам. Кроме того, удаление первого моляра нижней челюсти слева требует дополнительного обучения по принципу «зеркального отображения» для достижения процедурного мастерства. Эти сложности могут нарушить целостность лунки зуба, снизить воспроизводимость результатов заживления у животных и ограничить доступность данной модели для исследователей с ограниченным опытом микрохирургических операций.

В данном протоколе описывается модифицированный подход к экстракции первого моляра нижней челюсти у мышей для улучшения доступности и воспроизводимости процедуры. Протокол был валидирован на самцах мышей линии C57BL/6 в возрасте 8 недель для создания модели TSHM первого моляра нижней челюсти. Модифицированный подход систематически сравнивался с традиционной техникой для оценки эффективности процедуры, успеха экстракции и осложнений, связанных с процедурой. Кроме того, были проанализированы распространенные технические ошибки, возникающие при освоении метода, чтобы предоставить практические рекомендации исследователям, создающим модель TSHM нижней челюсти у мышей.

Протокол

Все процедуры были одобрены Этическим комитетом Стоматологического колледжа Западного Китая при Сычуаньском университете (WCHSIRB-D-2025-188) и проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными.

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте самцов мышей линии C57BL/6 в возрасте 8 недель с массой тела 22–29 g. Содержите животных на стандартном корме с неограниченным доступом к воде в стандартных условиях содержания (21°C–24°C, влажность 40%–60% и 12-часовой цикл свет-темнота). Используйте материалы и инструменты, перечисленные в Таблице материалов. Для сравнительной оценки и представления неудачных случаев используйте 24 мыши. Для обучения оператора перед началом сравнительного эксперимента используйте дополнительных мышей.

1. Предоперационная подготовка

  1. Подготовка инструментов
    1. Подготовьте иглы для шприцев 25 G для использования в качестве элеваторов (опционально). Согните скошенным концом каждую иглу под углом примерно 20°–40°13.
    2. Подготовьте зубчатые офтальмологические пинцеты для использования в качестве зубных щипцов. Осмотрите зубчатый кончик под увеличением, чтобы убедиться, что зубцы правильно расположены и не деформированы.
    3. Соберите роторасширитель, используя одну резинку и четыре иглы для шприцев 25 G. Подготовьте пенопластовую или картонную доску в качестве операционной платформы, клейкую ленту для фиксации конечностей мыши и налобный фонарь для освещения операционного поля.
    4. Подготовьте грелку для послеоперационного восстановления и предварительно прогрейте ее примерно до 38°C перед операцией. Подготовьте ватные тампоны для гемостаза и достаточное количество физиологического раствора для очистки ротовой полости.
    5. Подготовьте напальчник, чтобы закрыть большой палец и защитить оператора во время процедуры удаления.
    6. Положите стерильный нетканый материал на рабочую поверхность и грелку для поддержания стерильности поля.
  2. Подготовка анестезии
    1. Продезинфицируйте брюшную полость мыши с помощью ватного тампона, смоченного антисептическим раствором повидон-йода. Введите 1% раствор пентобарбитала натрия (50 mg/kg) внутрибрюшинно14. Оцените глубину анестезии с помощью теста на щипковый рефлекс пальца ноги и при необходимости введите дополнительную анестезию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если щипковый рефлекс возвращается или процедура приближается к ожидаемой длительности действия анестетика, прекратите процедуру и введите дополнительную анестезию в соответствии с утвержденным ветеринарным протоколом учреждения.
    2. Сразу после проведения анестезии нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь на оба глаза для предотвращения пересыхания роговицы.
  3. Подготовка к дезинфекции и стерилизации
    1. Продезинфицируйте операционную платформу, грелку, клейкую ленту, напальчник и прилегающую рабочую зону 75% этанолом. Для каждой мыши используйте новые стерильные ватные тампоны, нетканый материал, резинки и иглы. Перед использованием стерилизуйте зубчатые пинцеты и физиологический раствор в соответствии со стандартным протоколом паровой стерилизации учреждения.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: 75% этанол легко воспламеняется. Используйте его в хорошо проветриваемом помещении вдали от источников тепла, искр, открытого огня и других источников возгорания. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты. Дайте инструментам и поверхностям, обработанным этанолом, полностью высохнуть перед началом процедуры.
    2. Соблюдайте гигиену рук перед началом процедуры. Наденьте чистый хирургический костюм, стерильную хирургическую шапочку, хирургическую маску и стерильные перчатки.

2. Хирургический процесс

  1. Фиксация и очистка полости рта мыши
    1. Поместите мышь в положение на спине на фиксирующую пластину и закрепите конечности лентой. Вставьте две иглы 25 G в пенопластовую доску на уровне орбитально-ушной плоскости и вставьте две дополнительные иглы 25 G под нижнюю челюсть.
    2. Наденьте резинку на иглы поверх резцов, чтобы зафиксировать рот в открытом состоянии. Осторожно отведите язык и поместите его на сторону, противоположную месту удаления, чтобы предотвратить перекрытие операционного поля. В данном протоколе в качестве репрезентативного примера используется первый моляр правой нижней челюсти.
    3. Удалите остатки пищи и другие инородные материалы из полости рта с помощью небольшого ватного тампона, смоченного физиологическим раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно отожмите ватный тампон, чтобы удалить излишки раствора и не допустить попадания жидкости в полости рта, что может вызвать удушье.
  2. Устранение дистального и мезиального сопротивления (опционально)
    1. Используйте пинцет в левой руке, чтобы оттянуть правый угол рта и полностью обнажить первый моляр правой нижней челюсти, а также окружающие щечные и язычные мягкие ткани.
    2. Держите пинцет правой рукой. Затем, удерживая иглу 25 G в левой руке, осторожно введите иглу в щечную периодонтальную связку рядом с дистальным корнем для создания пространства в периодонтальной связке.
    3. Медленно продвигайте иглу к периапикальной области, вращая ее мезиально и лингвально в сторону моляра, чтобы ослабить фиксацию корня в альвеоле.
    4. Введите иглу 25 G в область фуркации корня с щечной стороны и приподнимите ее окклюзально левой рукой. Второй иглой 25 G правой рукой введите ее в язычную периодонтальную связку рядом с мезиальным корнем для создания пространства в периодонтальной связке, затем поверните иглу дистально и буккально.
    5. Извлеките обе иглы из операционного поля после завершения предварительного ослабления периодонтальной связки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте предварительное ослабление периодонтальной связки только в том случае, если зуб обладает минимальной подвижностью и выраженным сопротивлением после первоначального расшатывания щипцами.
  3. Расшатывание и экстракция
    1. Стабилизируйте голову мыши, используя указательный и средний пальцы левой руки. Положите большой палец, обернутый в напальчник, на резцы нижней челюсти для опоры, удерживая пинцет правой рукой.
    2. Держите кончики пинцета перпендикулярно окклюзионной плоскости и параллельно продольной оси зуба. Поместите зазубренные кончики в область фуркации корня для обеспечения стабильного захвата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не захватывайте корень зуба пинцетом напрямую, так как это может привести к перелому корня.
    3. Захватите коронку пинцетом и примените осторожные букко-лингвальные расшатывающие движения. Ограничьте угол буккального отклонения до 30°, а лингвального — до 50°. Выполняйте одно расшатывающее движение каждые 1–1.5 с.
    4. Осуществляйте тракцию вдоль продольной оси моляра от верхушки к коронке, при этом создавая устойчивую контр-опору подушечкой левого большого пальца против резцов нижней челюсти для стабилизации нижней челюсти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте непрерывную стабильную контр-опору, избегая чрезмерного сжатия или смещения резцов и прилегающих мягких тканей.
    5. Продолжайте расшатывающие движения до тех пор, пока зуб постепенно не станет подвижным, а окклюзионная поверхность заметно не приподнимется над соседними молярами. На протяжении всей процедуры держите кончики пинцета параллельно продольной оси зуба, затем извлеките зуб, как только будет достигнута достаточная подвижность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед приложением окончательного усилия для экстракции оцените подвижность зуба, осторожно расшатывая коронку в букко-лингвальном направлении. Приступайте к экстракции только тогда, когда коронка смещается с минимальным сопротивлением, а амплитуда букко-лингвального движения достигает примерно половины ширины коронки. Непосредственно перед полным извлечением повторно оцените глубину анестезии. При необходимости введите дополнительную анестезию (Рисунок 2).

Сравнение методов экстракции зубов, схема и результаты; традиционный и модифицированный методы с извлеченными корнями.
Рисунок 2. Сравнение традиционного и модифицированного методов экстракции первого моляра нижней челюсти у мышей. 
(A) Схематическая иллюстрация традиционного метода экстракции, при котором согнутая игла 25 G вводится в периодонтальную связку и используется в качестве рычага для люксации зуба. (B) Схематическая иллюстрация модифицированного метода экстракции, при котором зубчатый офтальмологический пинцет захватывает коронку и создает тягу параллельно продольной оси зуба. (C) Репрезентативное изображение согнутого кончика иглы 25 G, используемой в качестве элеватора. (D) Репрезентативное изображение зубчатого офтальмологического пинцета, используемого в качестве микроэкстракционного щипца. (E) Репрезентативное интраоперационное изображение лунки сразу после экстракции первого моляра нижней челюсти; пунктирные контуры обозначают лунки экстракции. (F) Вид со щечной стороны успешно извлеченного первого моляра нижней челюсти. (G) Вид с язычной стороны того же извлеченного первого моляра нижней челюсти. Масштабные отрезки = 2 mm (C,D) и 400 µm (E–G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Осмотр извлеченных зубов и лунок после удаления

  1. Осмотрите извлеченный зуб, чтобы подтвердить его полное удаление и структурную целостность. Убедитесь, что морфология корня сохранена: мезиальный корень более длинный, дистальный корень более короткий, наблюдается апикальное расширение15. Проверьте, чтобы к извлеченному зубу не было прикреплено фрагментов альвеолярной кости.
  2. Осмотрите лунку после удаления, чтобы убедиться, что она чистая и в ней нет остатков фрагментов корня (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в процессе удаления возникло подозрение на наличие сохранившегося или переломившегося корня, избегайте повторных манипуляций, так как чрезмерные попытки могут усугубить дефекты лунки. Осмотрите место удаления под увеличением, чтобы подтвердить наличие остаточных фрагментов корня. Случаи с сохранившимися или переломившимися корнями регистрируйте как неудачные удаления и исключайте их из последующей оценки модели. Обращайтесь с этими животными в соответствии с утвержденным протоколом работы с животными.

4. Послеоперационный уход

  1. Приложите сухую вату для достижения гемостаза. Очистите ротовую полость с помощью небольшого ватного тампона, смоченного в физиологическом растворе, затем верните язык в исходное положение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смачивайте ватный тампон минимальным объемом стерильного физиологического раствора, необходимым для увлажнения поверхности без образования излишков жидкости.
  2. Введите карпрофен (5 mg/kg, подкожно) после операции для послеоперационного обезболивания.
  3. Поместите животное на грелку и обеспечьте непрерывное наблюдение до полного восстановления сознания.
  4. После выхода из наркоза в течение 3 дней предоставляйте на дне клетки размягченный стандартный корм или гелевую диету; вода должна быть доступна ad libitum. Вернитесь к стандартному рациону после подтверждения нормального пищевого поведения.
  5. С определенными интервалами контролируйте потребление пищи, массу тела, активность, поведение при уходе за собой, наличие отека морды, кровотечения из полости рта, а также признаки боли или дистресса.

5. Обучение операторов

  1. Случайным образом распределите двух операторов, не имеющих предыдущего опыта работы с моделями регенерации твердых тканей мышей, в группу традиционного или модифицированного извлечения. Обучайте операторов по отдельности под руководством одного и того же инструктора, владеющего обоими подходами к извлечению — традиционным и модифицированным.
  2. В течение первой недели поручите каждому оператору отработать назначенную процедуру извлечения на трупах мышей, чтобы ознакомиться с последовательностью хирургических действий.
  3. В течение второй недели контролируйте обучение на живых мышах для оценки и совершенствования практического применения каждой методики. Отслеживайте каждую процедуру, чтобы обеспечить адекватную анестезию и предотвратить непреднамеренные хирургические осложнения, включая случайное повреждение окружающих мягких тканей из-за неправильного манипулирования инструментами или повреждение альвеолярных структур. Подтвердите компетентность оператора, когда он сможет самостоятельно выполнить три последовательных успешных извлечения. После завершения контролируемого обучения перейдите к сравнительным экспериментам по извлечению.

6. Подготовка образца

  1. Усыпите мышей методом цервикального вывиха. Отделите нижние челюсти от головы и удалите прилегающие мягкие ткани.
  2. Зафиксируйте нижние челюсти в 4% растворе параформальдегида в течение 48 ч. Храните образцы в PBS перед проведением µCT-сканирования.

7. µКТ и анализ

  1. Просканируйте мандибулы с помощью µCT сканер. Установите параметры сканирования: 80 кВ, 500 µA, 10 µm воксельное разрешение и послойное сканирование.
  2. Откалибруйте µCT система с использованием фантома из гидроксиапатита. Просканируйте фантом и экспортируйте реконструированные изображения с помощью программы DataViewer.
    1. Проанализируйте изображения фантома с помощью ПО CTAn. Постройте калибровочную кривую, сопоставив измеренные значения КТ-аттенюации вставок фантома с их известной минеральной плотностью, чтобы перевести значения аттенюации в показатели минеральной плотности кости (МПК).
    2. Применяйте идентичные параметры сканирования и реконструкции для всех образцов.
    3. Реконструируйте все наборы данных, используя стандартизированный рабочий процесс реконструкции в CTAn, связанный с µCT системы. Примените идентичные настройки реконструкции, определение области интереса (ROI) и критерии количественного анализа ко всем образцам. Выполните трехмерную реконструкцию отдельно с использованием программы Mimics Research для репрезентативной визуализации, следуя тому же определению ROI, которое использовалось при количественном анализе методом микро-КТ (CTAn).
  3. Определите область интереса (ROI), выбрав дистальную область корня экстрагированного первого моляра нижней челюсти. Соберите 100 последовательных поперечных срезов, extending апикально от цементно-эмалевого соединения соседнего второго моляра.
    1. Вручную определите границы области интереса (ROI) на каждом срезе вдоль края новообразованной альвеолярной кости вокруг лунки после экстракции. Выполните последующую обработку изображений и количественный анализ с помощью программного обеспечения CTAn, используя идентичные параметры анализа для всех образцов.
  4. Выполните трехмерную реконструкцию с помощью Mimics Research. Рассчитайте частоту переломов корня и дефектов стенки лунки как долю образцов нижней челюсти с каждым из этих состояний относительно общего количества образцов нижней челюсти.
  5. Выполните все статистические анализы и постройте графики с помощью GraphPad Prism v10.1.2. Оцените нормальность распределения непрерывных переменных с помощью критерия Шапиро–Уилка.
    1. В качестве экспериментальной единицы для всех видов анализа определить каждую отдельную мышь и соответствующую ей лунку извлечения зуба.
    2. Сравните время экстракции, МПК (минеральную плотность кости) и BV/TV (отношение объема костной ткани к общему объему) между группами с помощью двухвыборного двухстороннего t-критерия Стьюдента t тест. Сравните частоту переломов корня и дефектов стенки лунки с помощью точного критерия Фишера.
    3. Обозначьте статистическую значимость следующим образом: *, p < 0.05; **, p < 0,01; и ***, p < 0,001. Используйте «ns» для обозначения отсутствия статистически значимого различия между двумя группами.

Результаты

Анатомические особенности, имеющие значение при удалении первого моляра нижней челюсти, проиллюстрированы на рисунке 1, а традиционный и модифицированный подходы к удалению показаны схематично на рисунке 2A,B. Репрезентативные изображения подготовленной иглы и зубчатого офтальмологического пинцета, свежих лунок после удаления, а также удаленного первого моляра нижней челюсти представлены на рисунке 2C–G. Полный рабочий процесс процедуры обобщен на рисунке 3. Для сравнения эффективности и согласованности двух подходов два оператора с эквивалентным опытом работы с мышами были случайным образом распределены для выполнения удаления первого моляра нижней челюсти с использованием либо традиционного, либо модифицированного метода. Все мыши были самцами линии C57BL/6 в возрасте 8 недель. Время удаления и осложнения, связанные с процедурой, фиксировались сразу после экстракции, в то время как состояние лунок оценивали с помощью µCT через 2 недели заживления. Время удаления фиксировалось в ходе процедуры и, следовательно, не могло быть оценено в «слепом» режиме; удаленные зубы и наборы данных µCT были закодированы перед оценкой, чтобы оценивающий не знал, какой метод удаления применялся.

Схема процесса удаления зуба у мыши; анестезия, стерилизация, экстракция, послеоперационный уход.
Рисунок 3. Алгоритм стандартной и модифицированной процедур удаления первого нижнего моляра у мышей. 
Рабочий процесс начинается с подготовки инструментов, проведения анестезии, дезинфекции и стерилизации, а также фиксации мыши. Затем протокол разделяется на стандартный и модифицированный методы удаления. Стандартный подход включает последовательное устранение дистального и мезиального сопротивления перед извлечением зуба, тогда как модифицированный подход предусматривает опциональное предварительное расшатывание периодонтальной связки с последующими раскачивающими движениями и извлечением зуба с помощью зубчатого офтальмологического пинцета. Оба подхода завершаются осмотром удаленного зуба и лунки, после чего следует послеоперационный уход. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Репрезентативные изображения µCT, полученные непосредственно после экстракции и после 2 недель заживления, представлены на Рисунке 4A–D. Модифицированный подход значительно сократил среднее время экстракции по сравнению с традиционным подходом (10 min против 29 min, p = 0.0006; Рисунок 4E). Перелом корня произошел у 2/6 мышей (33,3%) в модифицированной группе и у 4/6 мышей (66,7%) в группе традиционного подхода, при этом статистически значимых различий между группами не наблюдалось (p = 0.5455; Рисунок 4F). Дефекты стенок лунки наблюдались у 0/6 мышей в модифицированной группе и у 4/6 мышей (66,7%) в группе традиционного подхода; эта разница не была статистически значимой (p = 0.0606; Рисунок 4G). После 2 недель заживления анализ µCT показал значительно более высокие значения BMD и BV/TV в модифицированной группе, чем в группе традиционного подхода (p = 0.0188 и p = 0.0253 соответственно; Рисунок 4H,I). Эти результаты демонстрируют сокращение времени экстракции при использовании модифицированного подхода и свидетельствуют о повышении стабильности результатов экстракции в протестированных экспериментальных условиях.

Стоматологическая визуализация и анализ с гистологическими срезами и столбчатыми диаграммами, сравнивающими традиционный (Conv) и модифицированный (Mod) методы, с отображением результатов времени экстракции, частоты переломов и плотности костной ткани.
Рисунок 4Сравнение традиционного и модифицированного подходов к удалению первого нижнего моляра у мышей и последующему заживлению лунки зуба. 
(A–D) Репрезентативные изображения микрокомпьютерной томографии (µCT) изображения лунок после удаления зубов непосредственно после операции (A,B) и через 2 недели после удаления (C,D) при использовании традиционного (A,C) или модифицированного (B,D) подхода. Панели 1–3 демонстрируют сагиттальную, корональную и трансверзальную проекции соответственно, а панель 4 — соответствующую трехмерную реконструкцию. Красным пунктиром обведены исходные контуры корня. Белый пунктир и красные стрелки указывают на дефекты стенок лунки. Сплошные оранжевые линии на изображениях A1, B1, C1 и D1 указывают на соответствующие позиции поперечных срезов. Синим пунктиром на изображениях C1, C2, D1 и D2 отмечена область новообразованной костной ткани в лунке. Новообразованная кость выделена красным цветом на трехмерных реконструкциях (C4,D4). (E–I) Количественное сравнение эффективности удаления и раннего заживления лунок, включая время удаления (E), частоту переломов корня (F), частоту дефектов стенок лунки (G), минеральную плотность кости (BMD; H) и отношение объема костной ткани к объему ткани (BV/TV; I). Для процедурных результатов (E–G), н = 6 мышей в группе; для µCT анализ заживления лунки (H,I), n = 3 мыши в группе. В качестве экспериментальной единицы рассматривались отдельная мышь и соответствующая лунка после экстракции. Непрерывные показатели на графиках E, H и I представлены как среднее значение ± SD; сравнение проводилось с использованием двухстороннего t-критерия Стьюдента для независимых выборок. t тест. Категориальные результаты на графиках F и G представлены в виде абсолютных значений и процентов; их сравнение проводилось с помощью точного критерия Фишера. Перелом корня наблюдался у 4/6 мышей (66,7%) в контрольной группе и у 2/6 мышей (33,3%) в модифицированной группе. Дефекты стенки лунки наблюдались у 4/6 мышей (66,7%) в контрольной группе и у 0/6 мышей в модифицированной группе. Статистическая значимость: *, p < 0.05; ***, p < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в увеличенном размере.

Успешным извлечением считалось полное удаление первого моляра нижней челюсти без остаточных фрагментов корня с сохранением архитектуры альвеолы для последующей оценки заживления, как показано на Рисунке 4A–D. Извлечение считалось неудачным, если неполное удаление зуба или повреждения, возникшие в ходе процедуры, затрудняли последующую оценку заживления лунки. Репрезентативные примеры неудачных исходов представлены на Рисунке 5A–F. Перелом коронки показан на Рисунке 5A, перелом дистального корня — на Рисунке 5B, а дефект мезиального корня — на Рисунке 5C. Остаточные фрагменты корня и перелом верхушки корня показаны на Рисунке 5D,E соответственно. Структурное повреждение в области канала нижнего альвеолярного нерва показано на Рисунке 5F. Эти неудачные исходы были связаны с неправильным контролем угла или глубины введения иглы, ненадлежащей траекторией извлечения, применением чрезмерной силы или избыточными манипуляциями. Включение как успешных, так и субоптимальных результатов демонстрирует спектр возможных исходов при реализации данного протокола и предоставляет критерии для интерпретации успеха или неудачи извлечения.

Анализ переломов зубов, КТ-сканирование, схема с повреждениями корня и коронки, оценка структурных повреждений.
Рисунок 5. Типичные примеры неудачного удаления первого моляра нижней челюсти мыши. 
(A–F) Репрезентативные изображения µCT и трехмерные реконструкции, иллюстрирующие распространенные осложнения, связанные с удалением. (A) Перелом коронки. (B) Перелом дистального корня. (C) Дефект мезиального корня. (D) Остаточный фрагмент корня. (E) Перелом верхушки корня. (F) Повреждение окружающих анатомических структур. Красные пунктирные линии очерчивают исходные контуры корня. Белые пунктирные линии обозначают костные дефекты или прилегающие анатомические структуры. Красные стрелки указывают на места повреждений или сохранившиеся фрагменты корня. Переломанные корни и соседние зубы выделены красным цветом на трехмерных реконструкциях, представленных на панелях A, B, D и E. Панели C и F содержат репрезентативные поперечные срезы трехмерных реконструкций. Все образцы были собраны через 2 недели после удаления зуба. Масштаб = 200 µm. Сокращение: µCT, микрокомпьютерная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Успешное создание TSHM требует полного удаления зуба при сохранении окружающей архитектуры альвеолы, так как повреждения, связанные с экстракцией, могут нарушить последующую регенерацию кости16. Следовательно, воспроизводимость процедуры удаления является критическим фактором надежности модели17. В данном исследовании модифицированный подход к удалению первого моляра нижней челюсти с использованием щипцов систематически сравнивался с традиционным методом с использованием рычага в условиях стандартизированного обучения. Модифицированный метод продемонстрировал повышенную эффективность и воспроизводимость процедуры, что выразилось в значительном сокращении времени экстракции и меньшем количестве осложнений, связанных с удалением. В частности, после одинакового двухнедельного периода обучения среднее время экстракции сократилось с 29 min при использовании традиционного подхода до 10 min при использовании модифицированного подхода. Более того, в модифицированной группе не наблюдалось дефектов стенок альвеолы, тогда как в традиционной группе это осложнение встречалось часто. Хотя частота переломов корня существенно не различалась между группами, более низкая частота, наблюдаемая при модифицированном методе, указывает на улучшение стабильности процедуры в данных экспериментальных условиях. Кроме того, лучшее сохранение архитектуры лунки после удаления было связано с ускоренным ранним заживлением кости через две недели. В совокупности эти результаты показывают, что модифицированная методика может снизить зависимость вариабельности при создании модели от оператора.

Прямого осмотра извлеченного зуба и лунки достаточно для рутинного выявления очевидных переломов корня и серьезных дефектов лунки. В данном сравнительном исследовании µCT использовалась в качестве инструмента объективной валидации для выявления оставшихся фрагментов корня и незначительных дефектов стенок лунки, а также для количественной оценки результатов раннего заживления лунки. Повышение эффективности модифицированного подхода может быть обусловлено различиями в механической стратегии, используемой при экстракции зуба. Традиционные методы экстракции из нижней челюсти мышей при TSHM обычно основаны на процедурах люксации13,18, при которых механическое усилие передается через инструменты, вводимые вокруг моляра, и постепенно прикладывается для расшатывания зуба. Однако, поскольку первые моляры нижней челюсти мышей имеют расширенную морфологию апикальной части корня и ограниченную хирургическую доступность9, такие процедуры могут создавать локальное механическое напряжение в месте введения инструментов и окружающих структурах альвеолы. Напротив, модифицированный подход переносит основную точку приложения силы с области корня на более стабильную коронку. Прикладывая контролируемую тягу параллельно продольной оси зуба при одновременной стабилизации нижней челюсти, эта стратегия может способствовать постепенному расширению лунки экстракции и снизить неконтролируемую концентрацию напряжений. Важно отметить, что данная модификация также упрощает основной этап контроля силы при экстракции, что потенциально снижает технический порог для исследователей с ограниченным опытом микрохирургических операций.

Несмотря на эти преимущества, для успешной реализации данного протокола остаются важными несколько технических аспектов, поскольку результат по-прежнему зависит от техники исполнения оператора. Во-первых, необходимо поддерживать направление прилагаемого усилия параллельно продольной оси зуба, чтобы улучшить захват коронки и минимизировать ненужную концентрацию напряжений и риск перелома корня, связанных с приложением силы под углом к оси. Во-вторых, следует избегать чрезмерной глубины погружения зубчатого пинцета или избыточных манипуляций, так как и то, и другое может нарушить целостность лунки после экстракции. В-третьих, при выполнении необязательного этапа предварительного расшатывания периодонтальной связки вводите иглу параллельно продольной оси корня зуба, чтобы минимизировать повреждение окружающей альвеолярной кости, что согласуется с предыдущим отчетом авторов13. Таким образом, хотя модифицированный подход улучшает доступ к процедуре, надлежащее обучение и стандартизированные методы работы остаются необходимыми для достижения стабильных результатов.

При интерпретации этих результатов следует учитывать несколько ограничений. Во-первых, размер выборки для оценки методом µCT был относительно ограниченным. Следовательно, наблюдаемые различия в раннем заживлении кости следует рассматривать как подтверждающие данные об улучшении создания модели, а не как окончательное доказательство усиленного заживления. Во-вторых, в данном исследовании приняли участие только два оператора. В результате оценка межоператорской вариабельности была ограничена, что могло привести к возникновению систематической ошибки, связанной с действиями оператора. В-третьих, протокол был валидирован только на правых нижних первых молярах самцов мышей в возрасте 8 недель. Количественные сравнения успеха экстракции, осложнений, связанных с процедурой, и заживления лунки в различных возрастных группах не проводились. Соответственно, вопрос о том, можно ли распространить наблюдаемые преимущества на животных другого возраста или пола, требует дальнейшего изучения.

Таким образом, в данной работе представлен оптимизированный подход к удалению первого моляра нижней челюсти мыши, эффективность которого подтверждена путем прямого сравнения с традиционным методом. Модифицированный метод способствует более воспроизводимому созданию модели заживления лунки зуба нижней челюсти у мыши, при этом снижая первоначальный технический порог для начинающих исследователей. Полученные результаты служат практическим руководством для исследователей, создающих модели заживления лунок зубов нижней челюсти.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант № 82571084) и Программой науки и технологий провинции Сычуань (грант № 2024JDKXJ0001).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Иглы для шприцев 25 GBeyotimeFS802-30pcsОдноразовые иглы для шприцев, используемые для роторатора полости рта и опционального предварительного ослабления периодонтальной связки
4% раствор параформальдегидаSolarbioP11104% раствор параформальдегида, используемый для фиксации образцов
75% этанолOuse Medical Devices StoreN/A75% медицинский этанол, используемый для дезинфекции поверхностей
Мыши C57BL/6Charles River213Самцы мышей C57BL/6 в возрасте 8 недель, весом 22–29 g
КаропрофенSolarbioC5350Послеоперационный анальгетик, вводимый подкожно в дозе 5 mg/kg
Ватные шарикиOuning Medical DevicesN/AСтерильные ватные шарики, используемые для очистки полости рта и гемостаза
CTAn v1.18.4.0+SkyScanN/AПрограммное обеспечение для анализа изображений μКТ
DataViewer v1.5.6.2SkyScanN/AПрограммное обеспечение для просмотра и экспорта реконструированных изображений μКТ
НапальчникиLeSu OfficeMEKU-1/2/3BНапальчники, используемые для защиты больших пальцев во время экстракции
Пенопластовая плитаDongguan Lijianglong Industrial Co., Ltd.N/AПенопластовая плита, используемая в качестве операционной платформы и платформы для фиксации
Гелевая диетаReadyDietechJ10001Послеоперационная диета, предоставляемая на дне клетки в течение 3 дней (при необходимости)
GraphPad Prism v10.1.2GraphPadRRID: SCR_002798Программное обеспечение для статистического анализа и построения графиков
Налобный фонарьBazhou Pengen Protective Equipment FactoryN/AНалобный фонарь, используемый для освещения операционного поля
ТермоковрикShijiazhuang Jianuan Electrical Appliances Co., Ltd.N/AТермоковрик, предварительно нагретый примерно до 38 °C для послеоперационного восстановления
Фантом из гидроксиапатитаQRMQRM-70127Калибровочный фантом, используемый для преобразования значений КТ-аттенюации в минеральную плотность кости
Увеличительное устройствоOlympus CorporationSZX10Устройство, используемое для осмотра кончиков зубчатых пинцетов и лунки экстракции под увеличением
МаскаSenlun Medical Devices Specialty StoreN/AХирургическая маска
Микрокомпьютерный томографBruker SkyScanSkyScan 1276μКТ-сканер, используемый при 80 kV, 500 μA и разрешении вокселя 10 μm
Mimics Research v21.0MaterialiseRRID: SCR_015802Программное обеспечение для трехмерной реконструкции
Пентобарбитал натрияSigma-AldrichP3761Соль пентобарбитала натрия, используемая в виде 1% анестезирующего раствора
Фосфатно-солевой буферный растворSolarbioP1010Порошок 0.01 M фосфатно-солевого буфера, pH 7.2–7.4
Антисептический раствор повидон-йодаBelkon Pharmacy Flagship StoreN/AРаствор повидон-йода, используемый для дезинфекции брюшной полости
РезинкиFoshan Puli Rubber Products FactoryN/AРезинки, используемые для сборки роторатора полости рта
ФизрастворThermo FisherBR0053GТаблетки физиологического раствора, используемые для приготовления раствора для очистки полости рта
Стандартный кормовой рационJiangsu Xietong Pharmaceutical and Biotechnology Engineering Co., Ltd.XTC01WC-001Стандартный корм, используемый при обычном содержании и размягчаемый для послеоперационного кормления
Паровой стерилизаторInstitutional facilityN/AОборудование, используемое для стерилизации зубчатых пинцетов и физраствора
Стерильные ватные палочкиKangbailai Medical Devices StoreN/AОдноразовые стерильные ватные палочки
Стерильные перчаткиSenlun Medical Devices Specialty StoreN/AСтерильные латексные перчатки
Стерильный нетканый материалShandong Xinhua Infection Control Supplies Hangzhou StoreN/AСтерильный нетканый материал, используемый для покрытия операционной поверхности и термоковрика
Стерильная хирургическая шапочкаSenlun Medical Devices Specialty StoreN/AСтерильная хирургическая шапочка
Хирургическая одеждаSenlun Medical Devices Specialty StoreN/AЧистая хирургическая одежда, надеваемая во время процедуры
ЛентаThermo Fisher15947Адгезивная лента, используемая для фиксации конечностей мыши
Зубчатый офтальмологический пинцетBeyotimeFS229Зубчатый офтальмологический зажим, используемый в качестве стоматологического пинцета
Ветеринарная офтальмологическая мазьDechra Veterinary Products143-16Офтальмологическая мазь, наносимая после анестезии для предотвращения высыхания роговицы

Ссылки

  1. Chavez MB, et al. Bone sialoprotein is critical for alveolar bone healing in mice. J Dent Res. 2023;102(2):187-196.
  2. Guan B, Liu L, Liu Y. Application and characterisation of four genetically engineered animal models (mouse/zebrafish/rhesus monkey/drosophila) in acute myeloid leukemia. Gene. 2025;963:149607.
  3. Varshney GK, Burgess SM. Crispr-based functional genomics tools in vertebrate models. Exp Mol Med. 2025;57(7):1355-1372.
  4. Phanrungsuwan A, Donnelly B, Millán JL, Foster BL. Targeted alkaline phosphatase therapy enhances alveolar bone healing in X-linked hypophosphatemia in mice. J Periodontal Res. 2026;61(3):309-322. doi:10.1111/jre.70044.
  5. Mohamed FF, et al. Dentoalveolar defects and impaired alveolar bone healing in a neural crest-directed conditional knockout mouse model of hypophosphatasia. Bone. 2025;198:117538.
  6. Oka H, et al. Subset of the periodontal ligament expressing leptin receptor contributes to part of hard tissue-forming cells. Sci Rep. 2023;13(1):3442.
  7. Chen S, Rittel D, Shemtov Yona K. The normal stiffness of the edentulous alveolar process. Bone Rep. 2021;14:101066.
  8. Lungová V, et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. J Anat. 2011;218(6):699-716.
  9. Iwama H, et al. Acellular extrinsic fiber cementum is invariably present in the superficial layer of apical cementum in mouse molar. J Histochem Cytochem. 2024;72(2):109-120.
  10. Hadad H, et al. Rodents as an animal model for studying tooth extraction-related medication-related osteonecrosis of the jaw: Assessment of outcomes. Arch Oral Biol. 2024;159:105875.
  11. Mouraret S, et al. A pre-clinical murine model of oral implant osseointegration. Bone. 2014;58:177-184.
  12. Yu F, Liu L, Xia L, Fang B. Establishment of a C57BL/6 mandibular critical-size bone defect model. J Craniofac Surg. 2021;32(7):2562-2565.
  13. Yu C, Yu F, Li F, Ye L. The establishment of a murine mandibular molar extraction socket healing model. J Vis Exp. 2023;(191). doi:10.3791/64855.
  14. University of Michigan Unit for Laboratory Animal Medicine. Guidelines on anesthesia and analgesia in mice. Updated January 23, 2026. Available at: https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice/. Accessed August 5, 2026.
  15. Qiu Y, et al. Investigation of the furcation morphology of permanent mandibular first molars by using micro-computed tomography. BMC Oral Health. 2024;24(1):1150.
  16. Vieira AE, et al. Intramembranous bone healing process subsequent to tooth extraction in mice: Micro-computed tomography, histomorphometric and molecular characterization. PLoS One. 2015;10(5):e0128021.
  17. Jiang J, Mou J, Wang S, Liu J. Protocol for establishing a mouse model of bilateral maxillary first molar extraction to study alveolar bone healing. STAR Protoc. 2026;7(1):104366.
  18. Liang B, Zhang W, Xue Y. Observation and analysis of tooth extraction wound healing process of maxillary first molars in C57BL/6 mice. Chin J Pract Stomatol. 2019;12(232):e6.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.